Вивчення функціонального стану лейкоцитів за допомогою кількісної люмінесценції із застосуванням акридинового оранжевого в комплексі імунологічних методів при різних патологіях

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03. 00. 09 - імунологія - Київський Національний університет ім. Т. Г. Шевченка. Київ, 2004.

Робота присвячена застосуванню люмінесцентної мікроскопії з акридиновим оранжевим в експериментальної та клінічної імунології.

Люмінесцентний метод визначення білок-синтетичної активності лейкоцитів за допомогою акридинового оранжевого (АО) адаптован для досліджень периферичної крові. З усіх показників люмінесценції найбільш інформативним є І 640 нм, який видбиває рівень одноланцюгових нуклеїнових кислот (РНК), накопичених при імуногенезі в периферичних органах імунної системи. Під час приготування препаратів для люмінесцентної мікроскопії запропонована заміна аутоплазми на ЕТС, введені індекси люмінесценції (ІЛ), запропонований метод мазків-відбитків. В адаптовану виді люмінесцентний метод з використанням АО в комплексі інших патогенетичних методів (цитогенетичний, цитоморфометричний та авідний розеточний методи) був впроваджений в клінічничних дослідженнях. За допомогою люмінесцентного метода були досліджені лейкоцитарні реакції на інтубаційний та операційний стрес в динаміці хірургічного лікування, з'ясовані міграційні особливості лімфоцитів периферичної крові в нозологічних групах (пухлини центральної та периферичної нервової системи; вертеброгенні та краніальні порушення; вісцеропатії). Визначені люмінесцентні показники лейкоцитів периферичної крові у онкохворих.

Патогенетичне значення люмінесцентного метода з АО було підтверджене в порівнянні з фенотипуванням лімфоцитів за допомогою моноклональних антитіл (МКАТ) к CD-структурам (CD-3, CD-4, CD-8, CD-16, CD-25) крові здорових донорів та в мітогенстимульованій культурі лімфоцитів. Розроблений люмінесцентний метод з АО в комплексі інших імунологічних методів може бути використований при тестуванні стану імунної системи людини при клінічних дослідженнях.

Ключові слова: люмінесценція, акридиновий оранжевий, нуклеїнові кислоти, лейкоцити, білок-синтетична активність.

Федотов Е.Р. Изучение функционального состояния лейкоцитов с помощью количественной люминесценции с применением акридинового оранжевого в комплексе иммунологических методов при различных патологиях. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук за специальностью 03.00.09 - иммунология - Киевский Национальный университет имени Тараса Шевченко. Киев, 2005.

Работа посвящена применению люминесцентной микроскопии с акридиновым оранжевым в экспериментальной и клинической иммунологии.

Люминесцентный метод определения белок-синтетической активности лейкоцитов с помощью акридинового оранжевого (АО) адаптирован для исследований периферической крови. Акридиновий оранжевый по своим физико-химическим свойствам отностся к двуволновым люминофорам, что позволяет оценивать метаболизм как одно- так і двуцепочечных молекул нуклеиновых кислот. Из всех показателей люминесценции (І 530 нм; І 640 нм; б-параметр) наиболее информативным является І 640 нм, который отображает уровень одноцепочечных нуклеиновых кислот (РНК), накопленных при иммуногенезе в периферических органах иммунной системы.

Во время приготовления препаратов для люминесцентной микроскопии предложена замена аутоплазмы на ЭТС, что позволяет контролировать люми-несценцию фона. Введены индексы люминесценции (ІЛ ₆₄₀ = І_{640 клітини} / І_{640 фону}; ІЛ ₅₃₀ = І_{530 клітини} / І_{530 фону}), использование которых позволяет сравнивать показатели люминесценции, которые были получены при разных показателях напряжения на ФЭУ, на разных люминесцентных микроскопах. Предложенный метод мазков-отпечатков разрешает оценивать суммарную белок-синтетическую активность 20 000 лимфоцитов на каждом препарате.

В адаптированном виде люминесцентный метод с использованием АО в комплексе с другими патогенетическими методами (цитогенетический, цитоморфометрический и авидный розеточный методы) был применён в клинических исследованиях. С помощью люминесцентного метода были исследованы лейкоцитарные реакции на эмоциональный, интубационный и операционный стресс в динамике хирургического лечения, отражающие участие иммунной системы в развитии общего адаптационного синдрома (ОАС). Кроме того, данные, полученные с помощью иммунологических методов были подтверждены динамикой концентрации основных стрессорных гормонов. Выяснены миграционные особенности активированных лимфоцитов периферической крови в нозологических группах (опухоли центральной и периферической нервной системы; вертеброгенные и краниальные нарушения; висцеропатии). Выяснено, что динамика количества активированных лимфоцитов определяется, кроме тяжести патологии и оперативного вмешательства, локализацией хирургического вмешательства. Определены люминесцентные показатели лейкоцитов периферической крови у онкологических больных. Выявлены критерии показателей люминесценции, диагностирующие сдвиг формулы крови “влево”, что в свою очередь свидетельствует о напряжении иммунной системы у обследованных лиц.

Патогенетическое значение люминесцентного метода с АО было подтверждено в сравнении с фенотипированием лимфоцитов с помощью моноклональных антител (МКАТ) к СD-структурам (CD-3, CD-4, CD-8, CD-16, CD-25) крови здоровых доноров и в митогенстимулированной культуре лимфоцитов. Разработанный люминесцентный метод с АО в комплексе с другими иммунологическими методами может быть использован при тестировании состояния иммунной системы человека при клинических исследованиях.

Ключевые слова: люминесценция, акридиновый оранжевый, нуклеиновые кислоты, лейкоциты, белок-синтетическая активность.

Fedotov E.R. Investigation of leukocytesґ functional state by quantitative luminescence with acridine orange in a complex of immunological methods under different pathologies. - Manuscript.

The thesis for the academic degree of the Candidate of Biological Sciences to the speciality 0.3.00.09 - immunology - Taras Shevchenkoґ Kyiv National University, Kyiv, 2005.

The dessertation is devoted to the use of the luminescent microscopy with acridine orange in experimental and clinical immunology. The luminescent method of determination of albumen-synthetic activity of the lymphocytes with acridine orange (AO), was adapted to the investigations of the peripheral blood, out of all indicase of the luminescence (I 530 nm; I 640 nm; б-parameter) the most informative is I 640 nm, reflecting a level of one-chain nucleic acids (RNA) accumulated during the immunogenesis in peripheral organs of the immune system. The substitution of the autoplasma for the calf's embrio serum was proposed during preparations for the luminescent microscopy. This allows to check the luminescence of the phone. The use of the introduced indices of the luminescence (LI) allows to compare the indices of the luminescence obtained under different effort indices on photoelectronic multiplier, or on different luminescent mycroscopies. The method of smears-touches proposed, permits to estimate an albumen-synthetic activity of 20000 lymphocytes in each preparation.

In an adapted state, the luminescent method with the use of AO in complex with other pathogenetic method (cytometric, cytomorphometric and avid-rosette methods), was introduced in clinical experiments. Owing to the luminescent method, leucocytal reactions on intubative and operations stress in dynamics of surgical treatment, were investigated. Migratory peculiarities of the lymphocytes of the peripheral blood in nosological groups (tumors of the central and peripheral nervous system, vertebrogenic and cranial disorders; visceropathes), were found out. The luminescent indices of the lymphocytes of the peripheral blood in oncological patients, were determined.

The pathogenic significance of the luminescent method with AO was proved in comparison with lymphocytes phenotyping with the help of monoclonal antibodies (MCAB) to CD-structures (CD-3, CD-4, CD-8, CD-16, CD-25) of blood of healthy donors, and in the mitogenstimulated culture of the lymphocytes. The luminescent method with AO elaborated in a complex with other immunological methods, can be used in testing the state of the human immune system during clinical investigations.

Key words: luminescense, acridin-orange, nucleic acids, leucocytes, albumen-synthetic activity.

Размещено на Allbest.ru