Протекторна дія пектину при надходженні в організм ртуті в малих дозах (до проблеми мікромеркуріалізму)

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ МЕДИЦИНИ ПРАЦІ

АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Протекторна дія пектину при надходженні в організм ртуті в малих дозах (до проблеми мікромеркуріалізму)

Козлов Костянтин Павлович

14.02.01-Гігієна

Київ - 2005

Анотація

Козлов К.П. Протекторна дія пектину при надходженні в організм ртуті в малих дозах (до проблеми мікромеркуріалізму). - рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.02.01 - гігієна. - Інститут медицини праці АМН України, Київ, 2004.

У роботі досліджено дію різних пектинових препаратів для виведення ртуті з організму з урахуванням вікових аспектів, вивчено порівняльну цитопротекторну дію пектинових екстрактів, отриманих з різних рослинних джерел, обґрунтовано механізм взаємодії іонів ртуті з карбоксильними групами полігалактуронових кислот пектинів.

На основі квантово-хімічних розрахунків установлено, що в утворенні комплексу з гідратованими іонами ртуті беруть участь тільки карбоксильні групи залишків галактуронової кислоти, при цьому додаткова координація центрального іона з утворенням хімічного зв'язку з карбоксилами чи гідроксилами сусідніх піранозних кілець неможлива через стеричні утруднення.

Введення щурам хлориду ртуті (ІІ) у дозі ¹/₅₀ та ¹/₁₀₀ ЛД₅₀ спричиняло накопичення металу у крові та органах, при цьому максимальне накопичення у печінці спостерігалось на другий тиждень з поступовим спаданням до п'ятого тижня, а додавання до раціону щурів бурякового пектину чинило проективний ефект різного ступеню ефективності залежно від дози.

Виявлені певні вікові особливості дії хлориду ртуті (ІІ) у дозі ¹/₁₅₀ ЛД₅₀ та протекторної дії пектинових препаратів за показниками вмісту ртуті в крові та органах, а також результатами біохімічних та морфологічних досліджень. Буряковий пектин за більшістю показників виявився найефективнішим для щурів середньої вікової групи, тоді як для щурів старшої вікової групи - пектин-вітамінне драже, що може пояснюватись неспецифічним характером дії за рахунок впливу біологічно активних речовин (вітамінів, ессенціальних мікроелементів) як складників композиції, на загальні реакції організмового рівню.

Ключові слова: ртуть, пектин, біологічна профілактика, вікові аспекти.

Summary

Kozlov K.P. Protecting action of pectin under exposure to mercury in low doses (towards the problem of micromercurialism) - Manuscript.

Thesis in search of a scientific degree of Candidate of biological sciences by specialty 14.02.01 - Hygiene - Institute for occupational health of Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004.

This thesis deals with the problem of mercury pollution and exposure to low doses of this metal, which remains important, especially in those areas where large industrial complexes are located. The basic goal of the research was to justify pectin prophylaxis under mercury exposure in low doses taking into account age peculiarities, to study the comparative cytoprotective action of pectin and to elucidate the mechanism of mercury binding to carboxyl groups of galacturonic acids.

Cytoprotective action of pectin was studied in vitro on a HeLa culture using sugar beet, apple and carrot pectin extracts and showed a statistically significant decrease of cytotoxic mercury action decreasing in range apple > carrot > sugar beet pectin extract.

Equilibrium spatial structure of monomer and some polymers of -D-galacturonic acid, its methoxylated forms and complexes with Hg²⁺ ion has been studied by the DFT method using GAMESS program. Partial methylation of carboxyl groups of galacturonic acid residues on the one hand, decreases the number of possible binding sites, on the other hand, leads to increase of acidity of those carboxyl groups, which remain non-etherified. This in turn facilitates the increase of stability of binding of hydrated metal ions. Only carboxyl groups of galacturonic acid bind to hydrated mercury ions. The most stable mercury galacturonates are formed in the first coordination sphere of carboxyl groups, which belong to different molecules of polygalacturonic acid.

In vivo experiments were performed on white male rats injected intraperitoneally with 0.6 and 0.3 mg/kg HgCl₂, another group received 0.05 g of sugar-beet pectin. Accumulation of mercury was observed in blood and tissues, followed by biochemical and morphological changes with stages corresponding to bicameral model of mercury distribution. Pectin treatment showed protective action, which was more expressed in case of 0.3 mg/kg HgCl₂.

In another experiment animals were divided into five groups with first group being intact, second injected with 0.2 mg/kg HgCl₂, three other groups received corresponding pectin (sugar-beet, apple, and pectin dragee with vitamins). Each group was divided into three subgroups according to age - young, mature and old. Mercury accumulation in blood, kidney and liver was studied as well as the efficiency of pectin treatment after 10 weeks. Measurements were taking using atomic absorption spectroscopy method. Taking into account that mercury blocks sulfhydryl groups (SH-groups) measurements of SH-groups in liver and kidney tissues were also carried out. Mercury chloride caused different changes in SH-groups content in liver tissues. Old rats showed significant increase of SH-groups content comparing to intact, mature rats showed tendency to increase and young rats showed decrease in total SH-groups content which is more characteristic for mercury action. Decrease in thiol content can be explained by accumulation of free radicals as by-products of cell metabolism causing SH-equilibrium to shift towards increase of disulfide level. Administration of pectin caused different changes with sugar-beet pectin showed the increase in total SH-groups content followed by statistically significant increase of non-protein SH-groups content in liver tissues, while apple pectin and dragee caused statistically significant decrease of total SH-groups content in liver tissues of old rats with increase of non-protein, in case of mature and young rats SH-groups content remained at the same level just as of intact.

Mercury content was significantly higher in the blood of rats injected with inorganic mercury alone than in the blood of rats treated with pectin. Mercury also accumulated in the liver and kidneys. At the same time certain age peculiarities were revealed. Statistically significant decrease was observed in all groups of rats that received pectin except of mercury content in kidney of young rats, which remained at the same level. This can probably be explained that compensatory processes are not well developed in kidneys of young rats. Pectin-vitamin dragee showed much higher efficiency for older rats, which can be explained by unspecific action due to influence of biologically active substances such as vitamins and microelements on different reaction of older organism. Therefore, the efficiency of pectin and pectin types differs with age and thus should be taken into account when applying to humans.

Keywords: mercury, pectin, age aspects, biological prophylaxis.

Аннотация

Козлов К.П. Протекторное действие пектина при поступлении в организм ртути в малых дозах (к проблеме микромеркуриализма). - рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.02.01 - гигиена - Институт медицины труда АМН України, Киев, 2004.

В работе исследовано действие различных пектиновых препаратов для выведения ртути из организма с учетом возрастных аспектов, изучено сравнительное цитопротекторное действие пектиновых экстрактов, полученных из различных источников, обосновано механизм взаимодействия ионов ртути с карбоксильными группами полигалактуроновых кислот пектинов.

На основе квантово-химических расчетов установлено, что в образовании комплекса с гидратированными ионами ртути принимают участие только карбоксильные группы остатков галактуроновой кислоты, при этом дополнительная координация центрального иона с образованием химической святи с карбоксилами или гидроксилами соседних пиранозных колец невозможна из-за стерических затруднений.

Введение крысам хлорида ртути (ІІ) в дозе ¹/₅₀ и ¹/₁₀₀ ЛД₅₀ приводило к накоплению металла в крови и органах, при этом максимальное накопление в печени наблюдалось на вторую неделю с постепенным уменьшением до пятой недели, а добавление к рациону крыс свекловичного пектина давало протекторный эффект разной степени эффективности в зависимости от дозы.

Выявлены некоторые возрастные особенности действия хлорида ртути (ІІ) в дозе ¹/₁₅₀ ЛД₅₀ и протекторного действия пектиновых препаратов за показателями содержания ртути в крови и органах, а также результатами биохимических и морфологических исследований. Свекловичный пектин по большинству показателей был наиболее эффективным для животных средней возрастной группы, тогда как для крыс старшей возрастной группы - пектин-витаминное драже, что может объясняться неспецифическим характером действия за счет влияния биологически активных веществ (витаминов, эссенциальных микроэлементов) как составных частей композиции, на общие реакции организменного уровня.

Ключевые слова: ртуть, пектин, возрастные аспекты, биологическая профилактика.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Несприятлива екологічна ситуація в Україні характеризується високим рівнем шкідливих факторів довкілля різної природи, при цьому хімічне забруднення часто є домінуючим (Сердюк А.М., 1998, 2004; Кундиев Ю.И., Трахтенберг И.М., 1997, 2003; Трахтенберг И.М., 2004). Значну групу токсикантів серед хімічних забруднювачів утворюють метали та їхні сполуки. Техногенне надходження важких металів як результат бурхливого розвитку промисловості спричинило їхнє накопичення у повітрі робочих приміщень, атмосферному повітрі, воді та ґрунтах. Тому сьогодні ВООЗ відносить ці речовини до глобальних стабільних забруднювачів (WHO, 1991). Серед них одне з чільних місць посідають ртуть та її сполуки (UNEP, 2002). Аналіз даних, одержаних у процесі гігієнічних досліджень, проведених на ряді підприємств України, де основною професійною шкідливістю є ртуть, свідчить про те, що незважаючи на суттєве зменшення сфери використання ртуті та її сполук у національній економіці України, пошук альтернативних рішень, які витісняють ртуть з обігу, цей метал все ще широко застосовується у різних галузях, що супроводжується надходженням ртуті до виробничого та навколишнього середовища (Трахтенберг И.М., Коршун М.Н., 1990; Clarkson T.W. et al., 1988). Зараз завдяки антропогенному забрудненню рівні вмісту ртуті в об'єктах довкілля суттєво перевищують природні фонові. Тому цей хімічний фактор є небезпечним для здоров'я не лише осіб, що контактують з ним на виробництві, але й населення, яке проживає поблизу таких підприємств або у великих промислових містах, що підтверджується численними даними літератури (Ларионова Т.К., 2000; Falandysz J. et al., 2001; Паранько Н.М. и др., 2002, Кацнельсон Б.А. и др., 2004).

Звідси випливає, що важливою є не лише гігієнічна оцінка забруднення ртуттю довкілля та виявлення її впливу на стан здоров'я людей. Все більшої актуальності набуває розробка та наукове обґрунтування методів вивчення особливостей токсичної дії малих доз важких металів, зокрема ртуті, їх накопичення у тканинах і органах а також методів детоксикації організму (Головкова Т.А., 2002, Nesterenko V.B. et al., 2004).

При скринінгових пошуках недостатньо використовуються альтернативні методи дослідження in vitro, які в світовій науковій практиці широко впроваджуються в інших напрямках медико-біологічних досліджень завдяки своїй високій чутливості, інформативності, а також у зв'язку зі збільшенням зацікавленості науковців та громадськості у гуманнішому ставленні до тварин і скороченні їх використання в експериментах (принцип трьох R). Отже, актуальними є подальші клініко-експериментальні дослідження, кінцевою метою яких є підвищення ефективності індивідуальної профілактики професійної та екозалежної патології, що спричинена зокрема металами (Кацнельсон Б.А. и др. 1999). При цьому речовинам природного походження і препаратам, створеним на їхній основі, приділяється зростаюча увага, оскільки їх застосування дає змогу позбутися ряду істотних недоліків, що притаманні синтетичним протекторам, зокрема, токсичних властивостей і пов'язаного з ними обмеженого часу їх використання. Вельми важливим є той факт, що біологічно активні компоненти природних речовин, у т.ч. і рослинного походження, ближчі людському організму за своєю природою, легко включаються в процеси життєдіяльності, а відтак є біодоступнішими.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексних наукових тем, які виконувались лабораторією промислової токсикології Інституту медицини праці протягом 1996-2003 рр. “Інтегральні критерії норми, адаптаційних реакцій та передпатологічних порушень екзогенної хімічної генези (експериментально-клінічні дослідження)” (номер держреєстрації 0196U009090) та “Вплив важких металів - свинцю, ртуті, марганцю, заліза як токсичних факторів зовнішнього середовища на вікові зміни адаптації та тривалості життя (експериментальні та клініко-гігієнічні дослідження)” (номер держреєстрації 0100U002246).

Мета і завдання досліджень. Обґрунтування пектинопрофілактики як складової частини комплексу попереджувальних заходів при дії ртуті та її сполук на організм з урахуванням вікових аспектів, розробка методичних принципів та рекомендацій при впровадженні біологічної профілактики з застосуванням пектинових препаратів при дії ртуті.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

Проведення оцінки цитотоксичності хлориду ртуті (ІІ) (HgCl₂) стосовно перещеплюваної культури клітин HeLa (карцинома шийки матки) у модельному експерименті in vitro та порівняльна характеристика цитопротекторних властивостей кількох пектинових екстрактів.

Побудова моделі взаємодії ртуті з карбоксильними групами молекул пектинів на основі квантово-хімічних розрахунків з оцінкою енергії гідратації-дегідратації іонів ртуті у водних розчинах.

Дослідження накопичення і розподілу ртуті за умов тривалого надходження її у низьких дозах, при використанні різних видів пектинових препаратів та з урахуванням вікових аспектів.

Об'єкт дослідження. Лабораторні тварини, культура клітин, сироватка крові, тканини печінки, нирок.

Предмет дослідження. Токсична, у т.ч. цитотоксична, дія хлориду ртуті (ІІ), протекторна дія пектинів.

Методи дослідження. Хіміко-аналітичні, квантово-хімічні, токсикологічні, біохімічні, морфологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів:

· експериментально підтверджено та поглиблено уявлення про роль біологічної профілактики шкідливих впливів малих доз ртуті за допомогою пектинових препаратів з урахуванням вікових аспектів;

· показано, що водні екстракти пектинових препаратів (бурякового, морквяного, яблучного) виявляють протекторну дію різного ступеню вираженості щодо цитотоксичного впливу хлориду ртуті (ІІ);

· на основі квантово-хімічних розрахунків обґрунтовано, що у механізмі детоксикації, а саме в утворенні комплексу з гідратованими іонами ртуті беруть участь тільки карбоксильні групи залишків галактуронової кислоти, а найміцніші галактуронати ртуті утворюються при входженні в першу координаційну сферу карбоксильних груп, які належать різним молекулам полігалактуронових кислот;

· показано, що захисний ефект пектинових препаратів на фоні багаторазових введень хлориду ртуті (ІІ) у дозі ¹/₁₅₀ ЛД₅₀ залежить від віку тварин та типу пектинів; при цьому за біохімічними та морфологічними показниками, а також за розрахованими коефіцієнтами ефективності для тварин середньої вікової групи ефективнішим був буряковий пектин, а для старшої - пектин-вітамінне драже.

Теоретична цінність одержаних результатів полягає у з'ясуванні можливого механізму взаємодії іонів ртуті з карбоксильними групами полігалактуронових кислот пектинів та обґрунтуванні протекторної дії препаратів на їх основі, що пропонуються з метою виведення ртуті з організму з урахуванням вікових аспектів; вивченні порівняльної цитопротекторної дії пектинових екстрактів, отриманих з різних рослинних джерел.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати можуть бути використані у роботі фахівців - гігієністів і профпатологів, практичних працівників державної санітарно-епідеміологічної служби, що забезпечують профілактику впливу малих доз екзогенних токсикантів. отримані експериментальні дані відображені у розробленому за нашої участі проекті методичних вказівок “Визначення вмісту ртуті в об'єктах навколишнього середовища і біологічних матеріалах”, “Застосування вітамінного пектиновмісного засобу “Яблопект” для профілактики виробничо обумовленої патології у робітників промислових підприємств гірничо-металургійного комплексу” та інформаційних листів „Применение пектиносодержащих энтеросорбентов в целях профилактики нарушения здоровья при сочетанном действии тяжелых металлов, пестицидов и радиации” (№ 004-97 та № 126-97).

Особистий внесок здобувача. Здобувачем проведено ретельний патентно-інформаційний пошук на етапах планування роботи. При подальшому проведенні досліджень здобувач був безпосереднім виконавцем експериментальної роботи з визначення токсичної дії ртуті та оцінки ефективності пектинових препаратів та узагальнення результатів досліджень. Ним також проведено статистичну обробку даних, проаналізовано та інтерпретовано результати токсикологічних, фізико-хімічних, біохімічних, морфологічних, квантово-хімічних досліджень як в лабораторіях Інституту медицини праці АМН України, так і в лабораторіях Буковинської державної медичної академії та Інституту хімії поверхні НАН України.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи були повідомлені та обговорені у доповідях на конференціях молодих вчених Інституту медицини праці АМН України (2000-2002), в матеріалах на конференціях Fogarty Environmental Research Forum (Lviv, 1997), 1^st International Conference on Children Health and Environment (Amsterdam, 1998), VII Конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Ужгород, 1998), 10^th International Symposium on Trace Elements in Man and Animal (Evian, France, 1999), І та ІІ з'їздах токсикологів України (Київ, 2001, 2004), Сьомій Міжнародній науково-технічній конференції “Пріоритетні напрями впровадження в харчову промисловість сучасних технологій, обладнання і нових видів продуктів оздоровчого та спеціального призначення” (Київ, 2001), Науковій конференції „Актуальні проблеми профілактичної медицини” (Львів, 2002), Науково-практичній конференції „Актуальні питання гігієни та екологічної безпеки України” (Київ, 2002), International Symposium “Industrial Toxicology `03”, (Bratislava, 2003), ІІ з'їзді токсикологів Росії (Москва, 2003), The 2^nd Asian International Conference on Ecotoxicology and Environmental Safety (Songkla, Thailand, 2004).

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. Під час вибору речовин керувались такими міркуваннями: ртуть є представником важких металів - глобальних забруднювачів та шкідливих факторів виробничого середовища, присутність яких у навколишньому середовищі представляє пряму загрозу здоров'ю людини; крім того, ртуть є елементом, який за сучасними уявленнями не несе певної біологічної функції, тобто не є біоелементом, і наявність ртуті в організмі на рівнях, що перевищують фонові, найчастіше співпадає з порушенням нормальних процесів метаболізму; хлорид ртуті (ІІ) має високі показники гострої токсичності та вираженості кумулятивних властивостей. Ще одним важливим чинником є те, що з хімічної точки зору неорганічні похідні ртуті (ІІ), навіть за наявності аніону сильної кислоти, не є іонними сполуками (їхню формулу найправильніше записати у вигляді [HgCl₂]⁰), а утворюють ковалентні зв'язки між ртуттю та лігандом. Саме тому токсичність ртуті і розглядається у зв'язку зі здатністю іону ртуті до комплексоутворення. При цьому вибір саме хлориду ртуті (ІІ) обумовлений тим, що ця сполука є однією з найбільш використовуваних та токсичних неорганічних похідних ртуті, і свого часу саме вона була об'єктом досліджень при обґрунтуванні групового нормативу неорганічних сполук ртуті у повітрі робочої зони (Трахтенберг И.М. и др., 1981).

Внутрішньочеревний шлях введення токсичних речовин у найбільшому ступені забезпечує точність дозування, тому міжлабораторні відмінності у значеннях ЛД₅₀ при ньому мінімальні (Коршун М.Н., 1989). У результаті попередніх досліджень, проведених у лабораторії (Кундиев Ю.И. и др. 1996), показано, що хлорид ртуті (ІІ) у дозах ¹/₁₀₀ - ¹/₃₀₀ ЛД₅₀ при внутрішньочеревному введенні статевозрілим щурам середнього віку призводить до розвитку адаптаційних зсувів у системі регулювання рівня цукру в крові та неспецифічної антимікробної несприйнятливості за показниками фагоцитарної активності нейтрофілів та опсонізуючій активності сироватки крові. Зазначені зрушення мали місце після 30-45-кратного введення речовин піддослідним тваринам.

Що стосується тестів, за допомогою яких планувалося вивчати зсуви в організмі піддослідних тварин в експерименті, то вони мали відображати реакцію життєво важливих складних системних функцій організму - вміст металу в крові та органах, а також стан реактивних груп, біохімічні зсуви, морфологічні прояви і зміни цих показників внаслідок впливу пектинів. Оскільки маса тіла та поведінкові реакції є показниками, які інтегрально віддзеркалюють функціональний стан організму, вони також вивчались в експерименті, але дослідження поведінкових реакцій проводилось тільки в експерименті з урахуванням вікових аспектів.

Таким чином, два основних експерименти були проведені на щурах з інтраперитонеальним введенням водного розчину хлориду ртуті (ІІ) у різних дозах. Так, в експерименті, де досліджувались різні види пектинів, у тому числі, у віковому аспекті, доза становила ¹/₁₅₀ середньосмертельної (0,2 мг/кг), а сам експеримент охопив термін 70 діб (50 введень по п'ять введень речовини протягом тижня). Другий експеримент тривав 35 діб (25 введень), при цьому дози становили ¹/₁₀₀ (0,3 мг/кг) та ¹/₅₀ ЛД₅₀ (0,6 мг/кг). Вибір саме таких доз пов'язаний із задачами конкретних досліджень. Якщо у першому експерименті використовувалась доза, яка мала б викликати певні зсуви і спричинити видимі прояви ближче до завершення експерименту, то у другому випадку слід було враховувати кінетику розподілу ртуті, зокрема відому двокамерну модель (Безель В.С. и др., 1979). Крім того, доза ¹/₁₀₀ ЛД₅₀ покликана була змоделювати вплив ртуті у відносно невеликій концентрації (тут передбачалась ефективна дія пектинів), тоді як доза ¹/₅₀ ЛД₅₀ з урахуванням 25 введень була зорієнтована на моделювання хронічної ртутної інтоксикації (у цьому разі передбачалось, що пектини могли і не виявити такої ж ефективності, як за впливу невеликих доз речовини).

Інші експерименти були покликані встановити можливу цитопротекторну дію пектинових препаратів, а також допомогти з'ясувати механізм взаємодії іонів ртуті з карбоксильними групами полігалактуронових кислот пектинів.

Цитотоксична дія хлориду ртуті вивчалась методом двократних серійних розведень на перещеплюваній культурі клітин HeLa (карцинома шийки матки), яка була вирощена в стандартних умовах і утворювала моношар. Вибір даної культури клітин обумовлений її високою чутливістю до дії різноманітних хімічних речовин, достатньо високим ступенем відтворення отриманих результатів, походженням з клітин організму людини, порівняною легкістю культивування, а також позитивними результатами її попереднього використання при вивченні цитотоксичної дії цілого ряду сполук. Живильне середовище, в якому культивувалися клітини (середовище 199 - 45 %, середовище Ігла МЕМ - 45 %, ембріональна теляча сироватка - 10 %), заміщали середовищем, яке містило хлорид ртуті (ІІ) в концентраціях від 1,95 мкг/мл до 500 мкг/мл. Кожне розведення хімічного агенту досліджувалось у 3 паралельних серіях. Контролем служили клітини в середовищі без хімічної сполуки. Культуру клітин з внесеними концентраціями хлориду ртуті культивували впродовж 3 діб у термостаті при температурі 37 °С (Методические рекомендации по работе с клеточными культурами и средами, 1975).

Цитотоксична активність хлориду ртуті (ІІ) оцінювалась мікроскопічно за допомогою інвертованого мікроскопу. Облік проводився впродовж 2-3 діб після інкубації культури клітин з токсикантом у стандартних умовах.

Дослідження з встановлення ефективності застосування водних пектинових екстрактів як речовин, що проявляють цитопротекторну дію стосовно токсичного впливу сполук ртуті проводили в два етапи. Спочатку перевіряли відсутність цитотоксичної дії самих досліджуваних пектинових екстрактів, а потім вивчали їх можливу цитопротекторну дію щодо токсичного впливу хлориду ртуті. При цьому живильне середовище, в якому в стандартних умовах культивувалась культура клітин, заміщали середовищем, що містило в 1 мл 0,1 мл певного екстракту та концентрації хлориду ртуті (ІІ) 15,6 і 7,8 мкг/мл, які у передніх дослідах були визначені як такі, що мають цитотоксичну дію. Контролем була культура клітин із відповідною концентрацією хлориду ртуті.

Розрахунки цитопатичних концентрацій хлориду ртуті проводились методом пробітаналізу, що використовує спосіб найменших квадратів з розрахунком регресивного рівняння (Прозоровский В.Б., 1962).

Квантово-хімічні розрахунки взаємодії іону ртуті з карбоксильними групами залишків -D-галактуронової кислоти проведені методом функціонала щільності (DFT) за програмою GAMESS з використанням функціоналу B3LYP, що включає градієнтні поправки до обмінного функціонала, а також функціонал LYP з нелокальними кореляціями. Такий підхід відповідає стандартному базису LANL2DZ для атомів вуглецю і кисню.

При дослідженні поведінкових реакцій використовувалася експериментальна установка “ЛАБІРИНТ” згідно методики М.А. Навакатікяна і Л.Л. Платонова (1968).

Дослідження вмісту сульфгідрильних груп в органах піддослідних тварин проводилися з початковою гомогенізацією тканини, а надалі використовували окремі методи для вимірювання загальних та небілкових сульфгідрильних груп (Sedlak J., Lindsay R.H., 1968).

Атомно-абсорбційне визначення вмісту ртуті у крові та органах експериментальних тварин проводилось за допомогою ртуть-гідридної приставки (метод „холодної пари”) на приладі фірми “Perkin-Elmer 5100-Z PC”.

Патогістологічні дослідження розпочинались з фіксації органів (печінка, нирки) декапітованих тварин в 10% нейтральному формаліні. Додатково проводили фіксацію окремих шматочків печінки в кальцій-формоловому фіксаторі Беккера для гістохімічного виявлення ліпідів, а також в рідині Карнуа для виявлення в печінці глікогену. Гістологічну і гістохімічну характеристику функціонального стану печінки доповнювали даними морфометрії, де проводили підрахунок числа гепатоцитів, двоядерних і багатоядерцевих клітин в 20 полях зору (Галицкая В.А., 1983). Достовірність відмінностей середньої величини дослідних і контрольної груп обчислювали за t-критерієм Стьюдента.

Результати досліджень та їх обговорення. Оцінка цитотоксичної дії хлориду ртуті (ІІ) та цитопротекторної дії пектинових екстрактів. Визначення цитотоксичної активності хлориду ртуті показало, що найбільший відсоток цитопатичних змін спостерігався при концентраціях 15,6 та 7,8 мкг/мл, тому вивчення цитопротекторної дії пектинових екстрактів здійснювалось саме для цих концентрацій.

У результаті було встановлено, що цитопротекторна дія спадає у ряді: морквяний > яблучний > буряковий пектинові екстракти. Так, морквяний пектиновий екстракт зменшував цитотоксичність хлориду ртуті в концентрації 15,6 мкг/мл з 79,67±1,20% до 71,33±2,03% (p<0,05), а в концентрації 7,8 мкг/мл з 34,67±1,20% до 30,00±0,58% (p<0,05). Відповідно яблучний пектиновий екстракт - в концентрації 15,6 мкг/мл з 79,67±1,20% до 74,67±0,88% (p<0,05), а в концентрації 7,8 мкг/мл - з 34,67±1,20% до 31,67±0,88%; тоді як буряковий - у концентрації 15,6 мкг/мл з 79,67±1,20% до 76,33±1,45%, а в концентрації 7,8 мкг/мл - з 34,67±1,20% до 32,0±0,58% (таблиця 1). Таким чином, можна дійти висновку, що екстракти пектинових препаратів виявляють різний ступінь вираженості протекторної дії стосовно токсичного впливу хлориду ртуті.

Таблиця 1. Визначення цитопротекторних властивостей пектинових екстрактів

* - дані достовірні стосовно групи, яка одержувала хлорид ртуті (p<0,05).

Цілком вірогідно, що такий позитивний вплив пектинових екстрактів може пояснюватись взаємодією іону ртуті з карбоксильними групами полігалактуронових кислот пектинів у водному розчині ще до надходження у мембрану клітин. Для обґрунтування цієї гіпотези були проведені квантово-хімічні розрахунки. Наявність у молекулах полігалактуронових кислот карбоксильної групи чітко визначає структуру координаційного вузла комплексу, проте й структурні гідроксильні групи можуть бути потенційними місцями зв'язування катіонів металів

На рис. 1. показана нумерація атомів у молекулі дигалактуронової кислоти (ДГК), що звичайно використовується в подібного роду розрахунках, відповідно до рекомендацій комісії ІUPAC з біохімічної номенклатури. У молекулі моногалактуронової кислоти (МГК) для діедричного кута , що визначає орієнтацію карбоксильної групи (кут О(5) - С(5) - С(6) - О(7)), знайдено два значення (140- 150) з різницею енергій відповідних конфігурацій 3,3 кдж/моль. Взаємна орієнтація двох піранозних кілець у молекулі ДГК відносно одне одного визначається двома торсійними кутами = О(5^/) - С(1^/) -О(4) - С(4) і = С(1^/) - О(4) - С(4) - С(5), рівноважні значення яких складають 76 і 103 відповідно при = 140. Значення = 76, = 103 і = 140 використовувалися при побудові молекул полігалактуронових кислот з великою кількістю тригалактуронових кислот (ТГК). Ці ж величини кутів застосовувалися і для молекул, які одержувались з неметилованих форм молекул полігалактуронових кислот шляхом заміни атома водню карбоксильних груп на групи СН₃.

Для комплексів іонів ртуті Hg²⁺ найбільше характерно координаційне число 4 незалежно від природи протиіону. Таким був обраний аніон хлору, виходячи з міркувань зручності та подальших експериментальних досліджень на тваринах, де використовувався хлорид ртуті (ІІ). З урахуванням того, що аніон Cl^? у комплексних сполуках ртуті входить у внутрішню координаційну сферу, при підрахунку енергії комплексоутворення в системі „сполука ртуті + полігалактуронова кислота” необхідно враховувати наявність у розчині іонів Hg(H₂O)₂⁺⁺, що утворять разом з протиіонами сполуку Hg[(H₂O)₂Cl₂], структура якої наведена на рис. 2.

Рис. 1. Конфігурація рівноважної структури молекули дигалактуронової кислоти, нумерація атомів у ній і задавання діедричного і торсійних кутів та

Рис. 2. Рівноважна структура комплексу Hg[H₂OCl)₂]

Якщо моно- і полісахариди, які не містять карбоксильних груп, утворять з d-металами, до яких відноситься ртуть, найбільш стійкі комплекси з аксіально-екваторіально-аксіальною орієнтацією трьох послідовно розташованих гідроксильних груп у ліганді, то у випадку полігалактуронових кислот ситуація трохи складніше. З одного боку, наявність у молекулах полігалактуронових кислот карбоксильної групи немов би заздалегідь визначає структуру координаційного вузла комплексу, однак при цьому стає неясною роль структурних гідроксильних груп, що можуть бути потенційними місцями зв'язування катіонів металів. Задавання як вихідних структур, комплексів з розташуванням іонів ртуті в околі різних гідроксильних груп молекули МГК щоразу приводило в результаті оптимізації до системи, наведеної на рис. 3.

Рис. 3. Конфігурація рівноважної структури комплексу іону ртуті з МГК у водному розчині

З рис. 3. випливає, що в комплексі Hg[МГК* Cl* H₂O] іон ртуті зберігає своє координаційне число 4 із плоскою будовою координаційного вузла, а атоми кисню карбоксильної групи витісняють молекулу води й аніон хлору з внутрішньої координаційної сфери комплексу Hg[(H₂O* Cl)₂], утворюючи при цьому систему типу 1:1. Комплекси зі структурою Hg[МГК* (H₂O)₂] і Hg[МГК* Cl₂] виявилися менш стійкими.

Також було показано, що метилування карбоксильних груп впливає на структуру вузла, спричиняючи тільки зростання енергії комплексоутворення.

Щодо специфіки координації, то енергія утворення комплексів Hg[МГК* Cl* H₂O], Hg[ДГК* Cl* H₂O] і Hg[ТГК* Cl* H₂O] становила відповідно 376, 385 і 390 Кдж/моль. Схожість величин обумовлювалась тотожною будовою координаційного вузла в комплексах іона ртуті з МГК, ДГК і ТГК, а невеликі розбіжності можна пояснити реалізацією додаткових Ван-дер-Ваальсових взаємодій між центральним іоном і атомами кисню гідроксильних груп піранозних кілець, карбоксили яких не беруть участі в комплексоутворенні.

Забезпечити додаткову координацію центрального іона за рахунок карбоксильних чи гідроксильних груп другого піранозного кільця неможливо через стеричні ускладнення, які у свою чергу пов'язані з великими витратами енергії, що перевищують виграш за рахунок комплексоутворення. Це підтверджується енергіями утворення комплексів типу 1:2 Hg[(МГК)₂], Hg[(ДГК)₂] і Hg[(ТГК)₂], які майже вдвічі перевищували енергії утворення комплексів типу 1:1 - відповідно 746, 755 і 750 Кдж/моль.

Отже, часткове метилування карбоксильних груп залишків галактуронової кислоти, з одного боку, зменшує кількість можливих місць зв'язування, а з іншого боку спричиняє збільшення кислотності карбоксильних груп, що залишилися неетерифікованими. Це у свою чергу сприяє зростанню міцності зв'язування гідратованих іонів металів. В утворенні комплексу з гідратованими іонами ртуті беруть участь тільки гідроксильні групи залишків галактуронової кислоти. Додаткова координація центрального іона з утворенням хімічного зв'язку з карбоксилами чи гідроксилами сусідніх піранозних кілець неможлива через стеричні утруднення.

Дослідження впливу пектину на розподіл та виведення ртуті з урахуванням вікових особливостей проводились на білих безпородних щурах-самцях у два етапи. При введенні хлориду ртуті (ІІ) у дозі ¹/₅₀ і ¹/₁₀₀ ЛД₅₀ спостерігалось підвищення маси тіла тварин усіх груп, яке сягало свого максимуму на третій (доза HgCl₂ ¹/₅₀ ЛД₅₀) або другий (доза HgCl₂ ¹/₁₀₀ ЛД₅₀) тиждень з подальшим спаданням. При цьому в обох випадках маса тіла щурів, які на фоні дії токсиканту одержували буряковий пектин (БП), була вищою, ніж у групі щурів, яка одержувала тільки хлорид ртуті (ІІ).

При дослідженні вмісту ртуті в крові та органах для групи, що одержувала БП та HgCl₂ в дозі ¹/₁₀₀ ЛД₅₀, було відзначене зростання концентрації з першого до другого тижня з подальшою стабілізацією, при цьому кількість ртуті в крові була нижчою, ніж у групи, яка не одержувала БП (таблиця 2).

Таблиця 2. Вміст ртуті в крові (мг/л) та органах (мкг/г) щурів при дії хлориду ртуті в дозі ¹/₁₀₀ та ¹/₅₀ ЛД₅₀, (Mm)

Дещо інша картина була одержана при дії ртуті в дозі ¹/₅₀ ЛД₅₀. У групи щурів, що одержували БП на другий тиждень, спостерігалось різке підвищення вмісту ртуті, при цьому подібна картина була характерна для печінки та нирок. У той же час це не постерігалось у групі, яка не одержувала пектин. Крім того, виявлене накопичення ртуті у печінці знову ж таки з максимумом на другий тиждень у всіх досліджуваних групах. Виявлено тенденцію до зниження рівня ртуті у печінці в групі щурів, що одержували пектини. Невелике зниження вмісту ртуті спостерігалось у групі, що одержувала БП порівняно з групою, яка одержувала тільки хлорид ртуті в дозі ¹/₁₀₀ ЛД₅₀, тоді як для дози ¹/₅₀ ЛД₅₀ таких змін виявлено не було.

Щодо вмісту SH-груп, то позитивний вплив пектину відзначався перш за все на вмісті небілкових SH-груп як у печінці, так і в нирках, при цьому найкращі результати досягались на другий тиждень експерименту. Такої дії не було виявлено для загальних SH-груп.

Аналізуючи вказані дані, слід не лише відзначити результати, пов'язані з ефективністю пектину, але й підкреслити, що зміни функціональних (реактивних) груп клітинних протеїнів (у даному разі сульфгідрильних) має місце й при вельми малих дозах введеної в організм ртуті. Це зайвий раз підкреслює концепцію токсичного впливу малих доз.

При внутрішньочеревному введенні хлориду ртуті (ІІ) у дозі ¹/₅₀ ЛД₅₀ протягом 5 тижнів у тварин спостерігались гемодинамічні порушення, відзначалась зерниста дистрофія цитоплазми гепатоцитів, клітин епітелію звивистих канальців нирок, вираженість яких зростає зі збільшенням терміну спостереження. За даними морфометрії адаптаційні процеси у печінці виражені слабко, про що свідчить достовірне збільшення числа гепатоцитів у полі зору. У селезінці в динаміці дії збільшується повнокров'я, а функціональний стан є низьким (зменшення розмірів лімфатичних вузликів). Додавання пектину посилює адаптаційні процеси в органах. При введенні хлориду ртуті у дозі ¹/₁₀₀ ЛД₅₀ адаптаційні процеси у печінці розвинуті слабко, про що свідчить збільшення числа гепатоцитів у полі зору, незначне зменшення числа двоядерних та багатоядерцевих клітин. Поруч з тим введення препарату спричиняло появу дрібноосередкової дистрофії цитоплазми гепатоцитів, клітин епітелію звивистих канальців нирок. У селезінці у динаміці спостереження відзначалось повнокров'я, а також незначне посилення функціональної активності. Додавання пектину спричиняло посилення адаптаційно-пристосувальних процесів у печінці, зменшення ступеню вираженості дистрофічних змін (печінка, нирки) та гемодинамічних розладів (печінка, нирки, селезінка).

В експерименті з урахуванням вікових аспектів та застосуванням трьох різних пектинів - бурякового (БП), яблучного (ЯП), пектин-вітамінного драже (ПВД), маса тіла молодих щурів достовірно збільшувалась з перебігом досліду, тоді як у щурів середного й старшого віку реєструвались декілька піків - перший відповідно на 5 і 6 тиждень та другий - на 8 тиждень. При цьому в усіх групах тварин маса тіла знижувалась на 9-й тиждень. Всі „пектинові групи”, як правило, посідали проміжне положення між контрольною групою і групою щурів, які одержували тільки хлорид ртуті (ІІ). Для поведінкових реакцій також було характерне проміжне положення всіх „пектинових” груп між контролем та групою, що одержувала хлорид ртуті (ІІ).

При введенні хлориду ртуті (ІІ) в тканині печінки контрольних щурів залежно від віку тварин (залежність обернено пропорційна) простежується невелике зниження вмісту як загальних SH-груп, так і небілкових. Водночас в тканині нирок було виявлено найвище значення у групи тварин середнього віку порівняно з контрольними тваринами як старого, так і молодого віку.

При введенні в організм тварин хлориду ртуті (ІІ) спостерігалися різноспрямовані зміни вмісту загальних SH-груп залежно від віку тварин (таблиця 3). Так, якщо у старших щурів простежувалося достовірне підвищення вмісту загальних SH-груп порівняно з контрольними величинами, у групи тварин середнього віку - тенденція до збільшення вмісту SH-груп, то у молодих - незначне зниження вмісту загальних SH-груп, що характерне для дії ртуті, при цьому подібна тенденція у змінах зберігалась і для БП. Натомість додавання ЯП і ПВД викликало достовірне зниження вмісту загальних SH-груп в тканині печінки у старших щурів на фоні підвищення небілкових, у тварин середнього віку і молодих - вміст загальних SH-груп залишався в межах контрольних величин.

Таблиця 3. Вміст SH-груп в тканині печінки та нирок, мкг/100г тканини (M±m)

Примітка. * - дані достовірні щодо контролю (p<0,05).

При введенні хлориду ртуті (ІІ) тваринам у старших щурів вміст загальних SH-груп у нирках залишався на рівні контрольних значень, у середнього віку - спостерігалася тенденція до зниження, а у молодих - до збільшення даного показника. Кількість небілкових SH-груп трохи знижувалася у старших тварин, була достовірно знижена - у середнього віку, і підвищена - у молодих. Аналогічні зміни, але у меншому ступені, були відзначені і при додаванні в корм тварин БП. При дії ЯП і ПВД у старших тварин було виявлено зниження вмісту загальних SH-груп і збільшення небілкових, у щурів середнього віку - вміст загальних SH-груп залишався в межах контрольних величин, а небілкових знижувалося, у молодих - незначне збільшення рівня загальних сульфгідрильних груп супроводжувалося незначним зростанням вмісту і небілкових SH-сполук.

Концентрація ртуті поступово зростала в крові молодих щурів, при цьому найбільша кількість ртуті зареєстрована у крові молодих щурів (0,0930,022 мг/л), а найменша - у старших (0,0370,015 мг/л). Спостерігалося також достовірне зниження рівня ртуті у крові молодих і старших щурів, котрі одержували всі три види пектинів порівняно з дослідною групою, що одержувала тільки ртуть та тенденція до зниження - у крові щурів середнього віку. Цікаво, що саме у крові тварин середньої вікової групи при призначенні пектинів було виявлено найменшу кількість ртуті (на рівні 0,007-0,008 мг/л залежно від виду пектину), тоді як у молодих і старших ця кількість була приблизно однаковою.

Також було виявлене накопичення ртуті у печінці тварин всіх досліджуваних груп, що було достовірним (Р0,05) стосовно контролю, причому у молодих щурів кількість ртуті у печінці (0,2580,048 мкг/г) у декілька разів перевищувала аналогічні показники тварин середнього (0,0850,037 мкг/г) і старшого віку (0,0810,001 мкг/г). Призначення пектинових препаратів сприяло зменшенню кількості ртуті у печінці, проте у незначних кількостях.

Дещо неоднозначні результати отримані при дослідженні вмісту ртуті у нирках. З одного боку, спостерігалось достовірне накопичення ртуті у нирках молодих (12,9591,322 мкг/г), середніх (10,3032,055 мкг/г) та старших (14,2022,263 мкг/г) щурів, що у 20-25 разів перевищувало контрольні величини, а з другого - картина дії пектинів суттєво відрізнялась. Так, впадає в око тенденція до збільшення вмісту ртуті у нирках молодих щурів при дії ЯП (18,1230,841 мкг/г) та ПВД (18,8381,553 мкг/г) та незначне зниження вмісту ртуті при дії БП (11,8551,062 мкг/г). У щурів середнього віку при дії всіх трьох пектинів спостерігалось зниження вмісту ртуті (відповідно для БП, ЯП та ПВД - 9,3990,740; 7,7670,677; 8,2830,484 мкг/г), а у старших на тлі суттєвого зростання порівняно з чистим контролем при введенні хлориду ртуті (ІІ) відзначалось також і суттєве зниження вмісту ртуті при дії пектинів, особливо БП (3,9370,681 мкг/г). Таке зниження при дії БП контрастує з даними морфологічних досліджень.

Патогістологічні дослідження показали, що при введенні хлориду ртуті осередкові дистрофічні зміни в цитоплазмі гепатоцитів (каламутне набухання) виявилися у щурів всіх вікових груп. Такий стан гепатоцитів є по суті пристосувальною реакцією цитоплазми на дану дію, воно не спричиняє за собою недостатності органу, а може лише свідчити про зниження окислювальних процесів внутрішньоклітинного дихання. Використання морфометричного методу дослідження дозволило виявити адаптаційні процеси в печінці щурів і особливості функціонального стану інтактної печінки, печінки після введення щурам хлориду ртуті (ІІ) і в умовах додавання до їхнього раціону різних пектинових препаратів. Так, при введенні хлориду ртуті знайдено достовірне збільшення (щодо контролю) кількості гепатоцитів в полі зору у тварин всіх вікових груп на фоні малої зміни кількості двоядерних і багатоядерцевих клітин. Це, можливо, свідчить про адаптаційні процеси в печінці, що найхарактерніше виявляється у молодих щурів. При додаванні пектинових препаратів адаптаційні процеси в печінці здійснювалися головним чином за рахунок гіпертрофії гепатоцитів, що виявляється зменшенням їх кількості в полі зору на фоні малого числа диплоїдних клітин.

ртуть пектин протекторний

Висновки

1. На основі квантово-хімічних розрахунків установлено, що в утворенні комплексу з гідратованими іонами ртуті беруть участь тільки карбоксильні групи залишків галактуронової кислоти. Додаткова координація центрального іона з утворенням хімічного зв'язку з карбоксилами чи гідроксилами сусідніх піранозних кілець неможлива через стеричні утруднення. Найміцніші галактуронати ртуті утворяться при входженні в першу координаційну сферу карбоксильних груп, що належать різним молекулам полігалактуронових кислот.

2. У дослідженнях in vivo, проведених на білих щурах-самцях, введення хлориду ртуті (ІІ) у дозі ¹/₅₀ та ¹/₁₀₀ ЛД₅₀ призводило до накопичення металу у крові та органах, що супроводжувалось біохімічними та морфологічними зсувами. Фази накопичення узгоджуються з двокамерною моделлю. Додавання до раціону щурів бурякового пектину чинило протекторний ефект різного ступеню ефективності залежно від дози. Найбільш виражений ефект виявлявся при дозі ¹/₁₀₀ ЛД₅₀ HgCl₂, що підтверджує дію пектину саме як профілактичного засобу при дії малих доз важких металів.

3. У дослідженнях in vitro, проведених на культурі клітини HeLa, водні екстракти пектинових препаратів (буряковий, морквяний, яблучний) виявляють з різним ступенем вираженості протекторну дію стосовно цитотоксичного впливу хлориду ртуті (ІІ). Такий позитивний вплив може пояснюватись взаємодією іону ртуті з карбоксильними групами полігалактуронових кислот пектинів у водному розчині ще до надходження ртуті у мембрану клітин.

4. Виявлені певні вікові особливості дії хлориду ртуті (ІІ) у дозі ¹/₁₅₀ ЛД₅₀ та протекторної дії пектинових препаратів за показниками вмісту ртуті в крові та органах, а також результатами біохімічних та морфологічних досліджень. Буряковий пектин за переважною більшістю показників виявився найефективнішим для щурів середньої вікової групи, тоді як для щурів старшої вікової групи найефективнішим виявилося пектин-вітамінне драже, що може пояснюватись неспецифічним характером дії за рахунок впливу біологічно активних речовин (вітамінів, ессенціальних мікроелементів) як складників композиції, на загальні реакції організмового рівню.

5. Значимість та доцільність отриманих експериментальних даних про ефективність дії пектинів як засобів біологічної профілактики мікромеркуріалізм узгоджуються з даними спостережень над контингентами осіб (у клініці та безпосередньо у виробничих умовах), що стикались у процесі професійної діяльності зі ртуттю у концентраціях переважно на рівні сотих та тисячних мг/м³.

6. Конкретні рекомендації щодо дослідження вмісту ртуті та використання різних видів пектинових композицій, зокрема дозування, рекомендації щодо певних вікових груп, знайшли відбиття у розроблених і переданих на затвердження у МОЗ України Методичних вказівок щодо визначення ртуті в об'єктах довкілля та біосередовищах, застосування пектинових препаратів для профілактики виробничо обумовленої патології у робітників промислових підприємств та Інформаційних листах, затверджених в установленому порядку.

Перелік публікацій за темою дисертації

Статті у наукових фахових виданнях, затверджених ВАК України:

1. Козлов К.П., Андрусишина І.М., Діденко М.М. Порівняльна оцінка ефективності пектинових композицій при дії ртуті // Современные проблемы токсикологии. -2004. -№ 3. -С. 58-62. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження вмісту ртуті, інтерпретацію одержаних результатів).

2. Козлов К.П., Лобанов В.В. Квантово-хімічне дослідження комплексоутворення пектинів з іонами ртуті у водних розчинах // Physics of the Alive. -2004. -Vol. 12. -No. 1. -P. 101-110. (Дисертантом сформульовано задачу, проведено аналіз літератури та одержаних результатів).