Размещено на http://allbest.ru

Інститут гігієни та медичної екології

імені о. м. марзеєва АМН УКРАЇНИ

УДК 616.155.32:612.017

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

РАДІОІНДУКОВАНИЙ ЦИТОГЕНЕТИЧНИЙ ЕФЕКТ І ЙОГО МОДИФІКАЦІЯ IN VITRO В ЛІМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ ОСІБ, ЯКІ ПОСТРАЖДАЛИ ВІД ДІЇ ФАКТОРІВ ЧОРНОБИЛЬСЬКОЇ АВАРІЇ

03.00.15 - Генетика

Педан Людмила Ростиславівна

КИЇВ - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України (м. Київ)

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор ПІЛІНСЬКА МАРІЯ АНДРІЇВНА, Інститут експериментальної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України, завідувач лабораторії цитогенетики відділу медичної генетики (м. Київ)

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, провідний науковий співробітник відділу радіобіології Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України Дьоміна Е. А.

доктор біологічних наук, головний науковий співробітник Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України Обухан К.І.

Провідна установа: Київський національний Університет ім. Т. Г. Шевченка, кафедра загальної і молекулярної генетики, МОН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “ 29 “ вересня 2005 р. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д26.604.12 Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України за адресою: 02660, м. Київ-94, вул. Попудренка, 50

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзєєва АМН України за адресою: 02660, м. Київ-94, вул. Попудренка, 50

Автореферат розісланий “ 10 “ серпня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради Омельченко Е. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У зв'язку з постійним погіршенням стану навколишнього середовища, пов'язаним з господарською діяльністю, наприкінці ХХ ст. виникла реальна небезпека зростання патології з генетичною компонентою, обумовлена мутагенною дією різних антропогенних забруднювачів довкілля на спадковість людини.

Чорнобильська катастрофа значно ускладнила і без того досить несприятливу екологічну ситуацію в Україні і на тлі вже існуючого техногенного забруднення навколишнього середовища сприяла розширенню контакту значної частини населення з одним із найпотужніших універсальних мутагенів - іонізуючим випромінюванням, здатним індукувати пошкодження геному у всіх живих організмів, включаючи людину.

Результати майже 20-ти-річних цитогенетичних обстежень критичних верств населення, які постраждали від дії факторів Чорнобильської катастрофи в Україні, Росії та Бєларусі, свідчать про дестабілізацію хромосомного апарату соматичних клітин людини, а також про можливість модифікації індукованого цитогенетичного ефекту при спільній дії іонізуючої радіації та інших мутагенних чинників (М.А. Пилинская и соавт., 2000; Н.А. Мазник, В.А. Винников, 2002; И.Е. Воробцова, 2002; А.В. Севанькаев, 2002; И.Б. Моссэ, 2002). Доведено, що у віддалені строки після аварії на ЧАЕС на перший план виступають не тільки прямі мутагенні ефекти в клітинах-мішенях, але й так звані “дисгеномні ефекти”, зокрема, - генетична нестабільність та адаптивний відгук (С. Mothersill, С. Seymour, 2000; В.К. Мазурик, В.Ф. Михайлов, 2001; W.F. Morgan, 2003; Кузьмина Н.С., Сусков И.И, Шевченко В.А., 2004). Як визначено в останнє десятиліття, мутагенний пресинг, в залежності від його інтенсивності і тривалості, може модифікувати індивідуальну реакцію геному на дію генотоксичних факторів, що і проявляється у вигляді адаптивного відгуку або генетичної нестабільності - в результаті підвищення чи зниження чутливості геному до подальшої дії мутагенів, відповідно (S. Wolff et al, 1988; И.И. Пелевина и др., 1999; Г.Д. Засухина, 1999; И.И. Сусков, Н.С. Кузьмина, 2001; Н.С. Кузьмина, И.И. Сусков, 2002).

Зважаючи на вищезазначене, проблема оцінки стабільності геному людини в так званий після Чорнобильський період вважається однією з найбільш актуальних і розробляється вельми інтенсивно, в тому числі - і в методичному відношенні. Показано, що обидва вказаних феномена (адаптивний відгук і т.з. прихована генетична нестабільність) можуть бути виявлені на хромосомному рівні в лімфоцитах периферичної крові людини за допомогою провокуючого (тестучого, проявляючого, експресуючого) мутагенезу - додаткового мутагенного навантаження in vitro (Tedeschi B. et al., 1995; И.Е. Воробцова, 2002). Наша робота, що виконана з використанням даного методичного підходу, також є однією із спроб визначити можливі зміни стабільності хромосомного апарату соматичних клітин людини в результаті дії іонізуючої радіації in vivo.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано в структурі комплексних Державних програм ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС, планових науково-дослідних робіт лабораторії цитогенетики відділу медичної генетики ІЕР НЦРМ АМН України:

1). 1987-1990 рр. - у рамках наукової програми “Дети Чернобыля” науково-дослідна робота “Исследование состояния хромосомного аппарата соматических клеток лиц, подвергшихся радиационному воздействию различной интенсивности” (Шифр теми 022, шифор завдання С27, 02, 01, 04. 01.). мутагенний хромосомний чорнобильський

2). 1990-1992 рр. - у рамках Союзнореспубліканської Програми негайних заходів на 1990-1992 рр. по ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС “Дослідження стану генетичного апарату лімфоцитів периферичної крові осіб, опромінених у зв'язку з аварією на ЧАЕС, при додатковому мутагенному навантаженні”, № держреєстрації 09701.9.10047755.

3). 1993-1996 рр. - у рамках державної науково-технічної програми “Захист генофонду населення України” (Шифр 01.01.01/ 011).

4). 1993-1995 р. - у рамках Державної Програми з медико-біологічних проблем ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС “Використання генетичних методів досліджень для оцінки доз опромінення осіб, які зазнали впливу радіації в зв'язку з аварією на ЧАЕС”, № держреєстрації 0193V032306.

5). 1998-2000 рр. - науково-дослідна робота “Особливості пошкодження хромосомного апарату соматичних клітин людини у віддалені строки після Чорнобильської аварії”, № держреєстрації 0198U004902.

Мета і задачі досліджень. Метою даної роботи є встановлення особливостей реакції хромосомного апарату лімфоцитів периферичної крові людини на тестуюче мутагенне навантаження in vitro на тлі попереднього радіаційного впливу різної інтенсивності in vivo.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні основні задачі:

1. Дослідити частоту різних типів аберацій хромосом у лімфоцитах периферичної крові осіб, що не зазнали мутагенного впливу in vivo (умовно

контрольні групи).

2. Визначити частоту різних типів аберацій хромосом у лімфоцитах периферичної крові ліквідаторів Чорнобильської аварії, включаючи осіб, що перехворіли на гостру променеву хворобу (ГПХ).

3. Вивчити частоту різних типів аберацій хромосом у лімфоцитах периферичної крові дітей, що мешкають на забруднених радіонуклідами територіях.

4. Дослідити особливості цитогенетичного ефекту, індукованого модельними мутагенами (діматіф, гама-опромінення) in vitro в лімфоцитах периферичної крові осіб, які перехворіли на ГПХ.

5. Дослідити особливості цитогенетичного ефекту, індукованого діматіфом in vitro в лімфоцитах периферичної крові осіб з хронічним опроміненням малої інтенсивності (ліквідатори наслідків аварії на ЧАЕС; діти, які проживають в місцевостях, забруднених радіонуклідами).

6. Зпівставити реакції хромосомного апарату лімфоцитів периферичної крові в обстежених групах на тестуючу мутагенну дію in vitro.

Об'єкт дослідження - культура лімфоцитів периферичної крові людини.

Предмет дослідження - цитогенетичний ефект в культурі лімфоцитів периферичної крові осіб, які постраждали від дії факторів Чорнобильської аварії, та його модифікація модельними мутагенами - хімічним (діматіф) та фізичним (гама-радіація від джерела ¹³⁷Cs).

У роботі були використані наступні методи дослідження: культивування лімфоцитів периферичної крові осіб з контрольних та експонованих груп; обробка культур лімфоцитів модельними мутагенами in vitro; одержання та фарбування препаратів метафазних хромосом; класичний цитогенетичний аналіз рівномірно забарвлених хромосом з груповим каріотипуванням; статистична обробка отриманих даних з оцінкою вірогідності за t-критерієм Стьюдента з використанням персонального комп'ютера Genuinelntel Intel® Celeron™ і пакетів програм: Statgraphics версії 3.0 фірми Statistical Graphics Corporations (США); Exel версії for Windows Me 4.90.3000 фірми Microsoft.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено, що особи, опромінені внаслідок Чорнобильської катастрофи, відрізняються від контрольних індивідів по реакції на додаткове мутагенне навантаження in vitro за середньогруповими цитогенетичними показниками, яка залежить від інтенсивності та типу опромінення.

Показано, що група осіб, перехворівших на ГПХ, являється більш чутливою до тестуючої мутагенної дії in vitro (прихована радіоіндукована хромосомна нестабільність); групи осіб з хронічним опроміненням малої інтенсивності (ліквідатори аварії на ЧАЕС; діти - мешканці забрудненої радіонуклідами місцевості) виявилися більш стійкими до додаткового мутагенного впливу (адаптивний відгук).

В усіх обстежених групах встановлено значну міжіндивідуальну варіабельність надспонтанного цитогенетичного ефекту, який не корелював з вихідним рівнем аберантних клітин, що може бути відображенням генетично обумовлених та/чи радіаційно-індукованих адаптаційних можливостей організму.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані підтвердили можливість визначення змін стабільності геному соматичних клітин людини (що експресуються у вигляді адаптивного відгуку або генетичної нестабільності) в результаті дії іонізуючого випромінювання in vivo. Результати роботи можуть бути використані для поповнення бази даних щодо рівня хромосомних мутацій в українській популяції після Чорнобильської аварії, а також для оцінки індивідуальних особливостей стабільності каріотипу, зокрема, при профпідборі осіб, що контактують з потенційними мутагенами, включаючи іонізуюче випромінення.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проведено аналіз актуальності теми роботи, вибір і відпрацьовування методики досліджень, аналіз і узагальнення відповідних даних літератури. Особисто здобувачем виконані всі експериментальні дослідження - постановка вихідних і експонованих in vitro культур лімфоцитів периферичної крові від обстежених осіб, приготування і забарвлення препаратів хромосом, цитогенетичний аналіз, статистична обробка отриманих даних.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені на Республіканській науковій конференції “Актуальні питання радіаційної медицини” (м. Київ, 1989); І Міжнародній конференції “Біологічні і радіоекологічні аспекти наслідків аварії на Чорнобильській атомній станції” (Зелений мис, 1990); Науковій конференції “Здоров'я та відтворення народу України” (м. Київ, 1991); Всесоюзній конференції “Радіобіологічні наслідки аварії на ЧАЕС” (м. Мінськ, 1991); Радіобіологічному з'їзді (м. Пущино, 1993); Науковій конференції молодих вчених “Проблеми радіаційної медицини” (м. Київ, 1993); Науково-практичному семінарі “Медичні наслідки Чорнобильської катастрофи” (м. Київ, 1996); Ш науковому симпозиумі “Діагностика та профілактика негативних наслідків радіації” (м. Київ, 1997); Міжнародній конференції “Проблеми радіаційної генетики на рубежі століть” (м. Москва, 2000); ІІІ з'їзді з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія) (м. Київ, 2003).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 20 наукових робіт, у тому числі: 10 - в журналах і збірниках наукових праць, рекомендованих ВАК України, решта - тези і матеріали міжнародних з'їздів, конференцій, симпозиумів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 141 сторінці друкованого тексту (109 сторінок основного тексту), має 42 таблиці і 13 рисунків. Складається зі вступу, 4-х розділів, висновків, списку літератури з 181 джерела (111 - українською та російською мовами, 70 - латиницею) .

ЗМІСТ РОБОТИ

Об'єкт і методи дослідження. Вибір осіб для цитогенетичного обстеження з числа дорослого і дитячого населення визначався задачами роботи. В залежності від інтенсивності і типу радіаційного впливу, обстежили три радіаційно експоновані групи:

пацієнтів, які перенесли гостру променеву хворобу (ГПХ) першого ступеня важкості в результаті аварії на ЧАЕС, тобто одержали ідентичне радіаційне навантаження in vivo (модель гострого опромінення у високих дозах) - 11 осіб, усі чоловіки віком від 27 до 42 років на момент аварії;

ліквідаторів Чорнобильської аварії (модель пролонгованого опромінення в помірних дозах, що не перевищували 25 сГр) - 12 осіб, усі чоловіки віком від 25 до 46 років на момент аварії ;

дітей шкільного віку (30 осіб - 12 і 18 хлопчиків і дівчаток, обстежених з інтервалом в один рік), які мешкали у с. Виступовичі Овруцького району Житомирської області з щільністю забруднення ґрунту ізотопом ¹³⁷Cs - 14,9 Ku/км² (модель хронічного опромінення в малих дозах).

В якості умовного контроля обстежили 10 практично здорових дітей шкільного віку і 7 дорослих (всі чоловіки) віком від 20 до 40 років, які мешкали у м. Києві.

Експоновані та контрольні групи формували ідентично, беручи до уваги відсутність свідомого контакту з відомими чи можливими мутагенними чинниками (за винятком іонізуючої радіації), інфекційних захворювань (в останні 3 місяці) і діагностичного рентгенівського опромінення протягом останнього року.

Матеріалом цитогенетичного дослідження була венозна кров, отримана від осіб з вищевказаних груп у клініці НЦРМ АМН України (пацієнти з ГПХ, ліквідатори наслідків ЧА) або на місці мешкання в експедиційних умовах (діти). Кров гепаринізували і зберігали в холодильнику не більше 24-х годин до постановки культури.

Лімфоцити культивували за напівмікрометодом Хангерфорда з модифікаціями, прийнятими в лабораторії цитогенетики НЦРМ АМН України (Hangerford D.A., 1965; Пилинская М.А., 2000).

Культуральна суміш не містила антибіотиків і ембріональної телячої сироватки і складалася з наступних компонентів: 1 частина цільної крові + 9 частин середовища Ігла чи RPMI 1640 (Sigma, США) + 0,02 мл фітогемагглютиніну (Difco “P”, США).

Культуру інкубували в термостаті при 37,5^о С протягом 48-50-ти годин, що дозволяло аналізувати клітини, які знаходяться переважно в першому мітозі (Захаров А.Ф., Бенюш В.А. и др., 1982).

Для зупинки розподілу клітин на стадії метафази до кожної культури додавали колхіцин (Sigma, США) - за 2 години до фіксації, у кінцевій концентрації 0,5 мкг/мл. Гіпотонічну обробку клітин проводили виготовленим ex tempore та нагрітим до 38^оС 0,075М розчином хлористого калію - протягом 10 хвилин при 37^оС, після чого клітинний осад фіксували свіжовиготовленою охолодженою сумішшю етанолу та крижаної оцтової кислоти (3:1) із триразовою зміною фіксатора.

Для приготування препаратів хромосом 5-7 крапель клітинної суспензії наносили на знежирене, вологе, охолоджене скло, яке потім підсушували на термостолику при 45^оС. Препарати фарбували 2% розчином барвника Гімза (Giemsa stain, Merk, Німеччина) протягом 10-15 хв. та зашифровували.

Для оцінки стабільності хромосомного апарату лімфоцитів проводили додаткову обробку отриманих культур мутагеном-провокатором (хімічним або радіаційним) in vitro.

В якості основного мутагена-провокатора вибрали діматіф (диетиленімід амідотіофосфорної кислоти), що відноситься до алкілуючих сполук, який вводили в культуру лімфоцитів у кінцевій концентрації 0,4 мкг/мл на стадії G₁ мітотичного циклу (через 2 години від початку інкубації) і залишали до кінця культивування.

Через затримку мітотичного циклу в результаті дії діматіфу експоновану культуру інкубували довше - протягом 53-х годин до введення колхіцину.

На відміну від дії іонізуючого випромінювання in vivo, яке призводить до утворення в лімфоцитах аберацій хромосомного типу, діматіф індукує in vitro аберації переважно хроматидного типу, діючи на стадії синтезу ДНК (S) і постсинтетичній (G₂) стадії клітинного циклу, що дозволяє розрізняти кластогенний ефект від обох досліджуваних факторів (М.А. Пилинская, 1985; А.В.Севанькаев, 2002). Діматіфом обробляли культури лімфоцитів, отримані від всіх обстежених контингентів.

Крім того, на прикладі осіб, що перенесли ГПХ першого ступеня важкості, в якості мутагена-провокатора використали гама-радіацію від джерела ¹³⁷Cs у дозі 50 сГр (на установці “Ігур”, при потужності дози 100 сГр за хвилину) за годину до початку культивування (на пресинтетичній G_o стадії клітинного циклу), при температурі 37^о С.

Для цитогенетичного аналізу відбирали метафази, що відповідали необхідним стандартним вимогам (Захаров А.Ф., Бенюш В.А. и др., 1982). Цитогенетичний аналіз проводили з груповим каріотипуванням на рівномірно пофарбованих препаратах метафазних хромосом. Від кожної особи аналізували не менш як 200 метафаз без тестуючого мутагенного впливу і не менш як 100 метафаз при додатковій мутагенній обробці культур in vitro. Враховували всі аберації хроматидного і хромосомного типів, за винятком пробілів.

Маркерами радіаційного впливу вважали аберації хромосомного типу - вільні парні фрагменти, ацентричні кільця, дицентричні і кільцеві хромосоми, аномальні моноцентрики (сформовані в результаті транслокацій і інверсій). За маркери хімічного мутагенного впливу приймали аберації хроматидного типу - одиночні фрагменти, симетричні й асиметричні хроматидні обміни.

Результати досліджень та їх обговорення. В результаті проведених досліджень на основі аналізу більш як 25 тис. метафаз отримали наступні основні дані.

Вихідна середньогрупова частота хромосомних порушень у осіб, які перехворіли на ГПХ, складала 3,51+0,64 на 100 клітин, що вірогідно (P<0,01) перевищило аналогічний показник в контролі (1,45+0,36 на 100 клітин) (рис.1.).

При додатковому мутагенному навантаженні діматіфом in vitro середньогрупова частота аберацій хромосом у осіб, які перехворіли на ГПХ, зросла до 24,05+6,91 на 100 клітин (переважно, за рахунок аберацій хроматидного типу), що виявилось вірогідно (P<0,01) вищим, ніж в контрольних культурах, оброблених діматіфом (7,14+1,44 на 100 клітин) (рис.1).



1. - контроль м. Київ 4. - ГПХ + Д 6. - ліквідатори 2. - контроль + Д 5. - ГПХ + Р 7. - ліквідатори + Д 3. - ГПХ

Рис. 1. Частота аберацій хромосом у ліквідаторів і осіб, які перехворіли на ГПХ, в інтактних культурах і в культурах з тестуючим мутагенним навантаженням in vitro (Д - діматіф, Р - радіація)

Додаток до вихідного рівня хромосомних аберацій (надспонтанний рівень) у осіб, які перехворіли на ГПХ, складав 20,5 на 100 метафаз, а у осіб з контрольної групи - 5,7 на 100 метафаз.

Таким чином, в цілому експонована група виявилась більш чутливою до діматіфу, ніж контрольна, причому не тільки за інтегральним, але й за специфічним для його кластогенної дії показником (частотою хроматидних обмінів), що свідчить про експресію прихованої хромосомної нестабільності в лімфоцитах обстежених осіб, перехворівших на ГПХ, ймовірно, в результаті попереднього опромінення in vivo.

При тестуючій радіаційній дії in vitro середньогрупова частота аберацій хромосом у осіб, які перенесли ГПХ, підвищилась до 7,67+1,23 на 100 клітин, що вірогідно не відрізнялось (P>0,05) від результатів, отриманих в опромінених контрольних культурах (5,75+1,25 на 100 клітин) (рис.1).

1. - м. Київ (контроль, дорослі) 4. - м. Київ (контроль, дорослі) + Д

2. - ГПХ 5. - ГПХ + Д 3. - ліквідатори 6. - ГПХ + Р 7. - ліквідатори + Д

Рис. 2. Частота маркерів кластогенної дії діматіфа (симетричні і асиметричні хроматидні обміни) (1, 2, 3) та нестабільних маркерів радіаційного впливу (діцентрики + центричні кільця) в обстежених групах дорослих з додатковим навантаженням in vitro (4, 5, 6, 7). (Р - радіація, Д - діматіф)

Разом з тим, спектр пошкоджень хромосом після опромінення культур зсунувся в бік аберацій хромосомного типу, в основному, за рахунок підвищення частоти нестабільних (дицентрики + центричні кільця) і стабільних (аномальні моноцентрики) обмінів, що характерно для кластогенної дії гама-радіації на пресинтетичній стадії мітотичного циклу.

Тому за специфічним радіоіндукованим цитогенетичним показником (сумарною частотою всіх обмінних аберацій хромосомного типу, яка складала 4,29 на 100 метафаз при 2,75 на 100 метафаз в опромінених контрольних культурах) група пациєнтів з ГПХ виявилась більш радіочутливою, ніж контрольна, що, як і при дії діматіфу in vitro, може свідчити про порушення стабільності хромосомного апарату лімфоцитів в результаті попереднього опромінення in vivo.

Порівняльний аналіз специфіки цитогенетичного ефекту, індукованого двома мутагенами-провокаторами в культурах від хворих на ГПХ, показав, що сумарна частота хромосомних аберацій в більшій мірі зростала при дії діматіфу, ніж при дії радіації, що може бути зумовлено величиною обраних для тестування доз мутагенів.

Діматіф індукував аберації переважно хроматидного типу, в той час як при опроміненні переважали аберації хромосомного типу, що відображає специфіку кластогенної дії агентів, використаних нами для експресії хромосомної нестабільності in vitro.

При аналізі міжіндивідуальних варіацій цитогенетичних ефектів, індукованих in vitro, не виявили позитивної кореляції між індивідуальною чутливістю до хімічного (діматіф) і фізичного (гама-опромінення) мутагенів-провокаторів.

У ліквідаторів наслідків ЧА середньогрупова частота хромосомних аберацій складала 1,57+0,32 на 100 клітин і вірогідно не відрізнялась від контрольних показників (1,45+0,36 на 100 клітин). Сумарна частота пошкоджень хромосом у ліквідаторів з тестуючим навантаженням діматіфом in vitro зросла до 5,90+1,27 на 100 метафаз (рис.1.), що, втім, вірогідно не відрізнялось від такої ж в оброблених діматіфом контрольних культурах (7,14+0,44 на 100 клітин) (рис.1.).

Разом з тим, надспонтанний рівень всіх типів пошкоджень хромосом в експонованій групі (4,33 на 100 клітин) виявився вірогідно (Р< 0,05) нижчим, ніж в контрольних культурах з діматіфом (5,69 на 100 клітин) - за рахунок вірогідного зменшення частоти хроматидних обмінів (0,5 і 1,3 на 100 метафаз, відповідно, рис.2.), котрі є специфічними абераціями, індукованими діматіфом, що може свідчити про зниження чутливості лімфоцитів ліквідаторів до дії мутагена-провокатора in vitro, можливо, за рахунок адаптивного відгуку.

1.- контроль м. Київ 4.- с. Виступовичі (первинне обстеження) + Д 2.- контроль + Д 5.- с. Виступовичі (повторне обстеження) 3.- с. Виступовичі (первинне обстеж.) 6.- с. Виступовичі (повторне обстеження) + Д

Рис. 3. Частота аберацій хромосом у дітей, які мешкали в с. Виступовичі Овруцького району Житомирської області, в інтактних культурах і в культурах з тестуючим мутагенним навантаженням in vitro (Д - діматіф)

Середньогрупова частота аберацій хромосом у дітей, що мешкають на забрудненій радіоцезієм території, при первинному обстеженні складала 3,75+0,46 на 100 клітин, що вірогідно не перевищувало аналогічний показник в контрольній групі дітей (3,50+0,50 на 100 метафаз, P>0,05) (рис. 3.)

В той же час, обидві групи вірогідно відрізнялись за сумарною частотою нестабільних цитогенетичних маркерів опромінення - дицентричних і кільцевих хромосом (0,46+0,17 на 100 метафаз та 0,15+0,10 на 100 метафаз, відповідно; Р<0,05), що являється біологічним індикатором впливу радіаційного чинника на дітей з с. Виступовичі (рис.4.).

Середньогрупова частота всіх типів аберацій хромосом, індукована діматіфом в культурах, отриманих від цих дітей, складала 14,91+6,26 на 100 клітин, що виявилось вірогідно (Р<0,01) нижче, ніж при обробці діматіфом контрольних культур (27,60+1,42 на 100 метафаз) (рис.3.). Обидві групи вірогідно розрізнялись також за надспонтанним рівнем хромосомних аберацій (11,16 і 24,10 на 100 клітин в експонованій і контрольній групах, відповідно; Р<0,01). Індивідуальні частоти хромосомних порушень, індукованих діматіфом, не залежили від їх фонового рівня в інтактних культурах.

Виявлені відмінності свідчать про зниження чутливості лімфоцитів дітей з с. Виступовичі до дії мутагена-провокатора in vitro.

Таку ж закономірність встановили в цій групі дітей і при повторному (через рік) цитогенетичному обстеженні.

В цілому за середньогруповими цитогенетичними показниками повторно обстежені діти вірогідно не відрізнялись від первинно обстежених як за фоновим рівнем аберацій (5,17+0,60 та 3,75+0,46, на 100 клітин, відповідно, Р>0,05), так і за реакцією на кластогенну дію діматіфу (19,94+2,23 та 14,91+6,26 на 100 клітин, відповідно, Р>0,05).

При обох обстеженнях добавка до середньогрупової вихідної частоти аберацій в експонованих групах (11,16 та 14,77 на 100 метафаз, при першому та другому обстеженнях, відповідно) була нижча, ніж в оброблених діматіфом контрольних культурах (24,10 на 100 клітин) за рахунок вірогідно більш низького рівня хромосомних ацентриків.

1.- м. Київ (контроль, діти) 4.- м. Київ (контроль, діти) + Д

2.- с. Виступовичі (діти, перв. обстеж.) 5.- с. Виступовичі (діти, перв. обстеж.) + Д 3.- с. Виступовичі (діти, повт. обстеж.) 6.- с. Виступовичі (діти, повт. обстеж.) + Д

Рис. 4. Частота маркерів кластогенної дії діматіфа (симетричні і асиметричні хроматидні обміни) (1, 2, 3) та нестабільних маркерів радіаційного впливу (діцентрики + центричні кільця) в обстежених групах дітей з додатковим навантаженням in vitro (4, 5, 6). (Д - діматіф)

Тобто, результати повторного цитогенетичного обстеження групи дітей з с. Виступовичі підтвердили зниження чутливості лімфоцитів периферичної крові до мутагенної дії діматіфу, очевидно, за рахунок адаптивного відгуку.

В усіх обстежених групах - як при професійному контакті з факторами Чернобильської аварії (пацієнти з ГПХ, ліквідатори), так і при контакті з ними як екологічними забруднювачими довкілля (діти - мешканці забрудненої радіонуклідами території) - спостерігали широкий розмах індивідуальних цитогенетичних показників - як фонових, так і індукованих мутагенами-провокаторами in vitro, що може бути зумовлено не лише особливостями генотипу, але й модифіковано попереднім радіаційним впливом in vivo.

Отримані дані підтвердили реальність зміни стабільності геному соматичних клітин людини в результаті дії іонізуючого опромінення і можливість її виявлення за допомогою тестуючого мутагенного навантаження in vitro.

ВИСНОВКИ

1. Підтверджено реальність радіаційно індукованої зміни стабільності геному лімфоцитів периферичної крові людини, яка, в залежності від інтенсивності та тривалості опромінення, експресується у вигляді хромосомної нестабільності або адаптивного відгуку.

2. Показано, що в умовно контрольних групах дорослих та дітей середньогрупова частота аберантних метафаз складала 1,45+0,34 та 3,50+0,50%, відповідно, з переважанням простих аберацій хроматидного та хромосомного типів (одиночних фрагментів - 0,80+0,22 та 2,50+0,41 на 100 метафаз, відповідно; парних фрагментів 0,70+0,28 та 0,50+0,18 на 100 метафаз, відповідно), що характерно для спонтанного хромосомного мутагенезу.

3. Визначено вихідні частоти та спектр хромосомних аберацій в лімфоцитах периферичної крові людей, які постраждали від дії факторів Чорнобильської аварії - ліквідаторів аварії на ЧАЕС; осіб, які перенесли ГПХ; дітей, які мешкали на забрудненій радіонуклідами місцевості, що складали 1,57+0,32; 3,51+0,64; 5,17+0,60 на 100 метафаз, відповідно (із зсувом спектру пошкоджень хромосом в бік нестабільних та стабільних аберацій хромосомного типу) і в останніх двох групах вірогідно (Р<0,05) перевищували аналогічні показники в умовно контрольних групах.

4. Оцінено стабільність хромосомного апарату в усіх обстежених групах за допомогою тестуючого мутагенного навантаження (діматіф, гама-опромінення) in vitro. Показано, що експоновані групи за інтегральними і специфічними для кластогенної дії кожного з провокуючих мутагенних агентів показниками вірогідно (Р<0,01) відрізнялися від умовно контрольних груп по реакції на додаткове мутагенне навантаження in vitro.

5. Встановлено, що особи, які перехворіли на ГПХ, тобто одержали гостре опромінення в високих дозах, в цілому виявилися більш чутливими, ніж умовно контрольна група, до дії як радіаційного, так і хімічного мутагенів-провокаторів in vitro - середньогрупові надспонтанні рівні аберацій хромосом складали 5,69 та 20,54 на 100 метафаз в експонованій групі при 3,40 та 4,27 на 100 метафаз в умовно контрольній, що свідчить про наявність прихованої хромосомної нестабільності у осіб, перехворівших на ГПХ.

6. Доведено, що Чорнобильські контингенти, які піддаються радіаційному впливу малої інтенсивності (ліквідатори наслідків аварії на ЧАЕС і діти, які мешкають на забрудненій радіоцезієм місцевості), виявилися більш стійкими, ніж умовно контрольні групи, до додаткової мутагенної дії діматіфу in vitro - середньогрупові надспонтанні рівні аберацій хромосом в експонованих групах складали 4,33 та 11,16 на 100 метафаз при 5,69 та 24,10 на 100 метафаз в контрольних, що можна розцінювати як адаптивний відгук.

7. Виявлено суттєву міжіндивідуальну варіабельність надспонтанного цитогенетичного ефекту в усіх обстежених групах, який не корелював з вихідним рівнем хромосомних аберацій, що може бути відображенням генетично обумовлених та/чи радіаційно-індукованих адаптаційних можливостей організму.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Результаты цитогенетического обследования лиц, подвергшихся дополнительному радиационному воздействию разной интенсивности. / М.А. Пилинская, А.М. Шеметун, С.С. Дыбский, А.Ю. Бондарь, М.Н. Еремеева, Л.Р. Педан и др. // Республиканская научная конф. “Актуальные вопросы радиационной медицины”. - Киев.- 1989, С.164-165. Набір матеріалу, аналіз даних, підготовка до друку.

2. Біомоніторинг осіб, що потерпіли внаслідок аварії на ЧАЕС, за допомогою генетичних критеріїв / М.А. Пілінська, Г.М. Шеметун С.С. Дибський, Л.Р.Педан, Д.В. Редько // Матеріали наукової конференції “Здоров'я та відтворення народу України” 13-17 жовтня 1991, Київ. - 1991.- “Здоров'я”. - С.137-140. Цитогенетичне обстеження ліквідаторів ЧАЕС, аналіз даних, статистична обробка, підготовка до друку.

3. Роль острого и постоянного облучения в судьбе аберрантных лимфоцитов у лиц, пострадавших в результате аварии на ЧАЭС / М.А. Пилинская, А.М. Шеметун, С.С. Дыбский, Л.Р. Педан и др. // Радиобиологический съезд, Киев, 20-25 сентября 1993. - Пущино. - 1993, С.801-802. Цитогенетичний аналіз, статистична обробка, підготовка до друку.

4. Пилинская М.А., Дыбский С.С., Педан Л.Р. Модификация диматифом цитогенетического эффекта в лимфоцитах периферической крови детей, подвергающихся постоянному радиационному воздействию малой интенсивности // Цитология и генетика.-1993.-Т.27.- №4.- С.87-90. Цитогенетичний аналіз, статистична обробка, підготовка до друку.

5. Педан Л.Р. Чувствительность хромосом лимфоцитов периферической крови детей, проживающих в населенных пунктах с различной радиоэкологической обстановкой, к дополнительной мутагенной нагрузке // В сб. “Проблемы радиационной медицины”. Вып.5, Киев.- 1993. - С.194.

6. Педан Л.Р. Цитогенетика лимфоцитов периферической крови детей при дополнительном мутагенном воздействии, проживающих на территориях с различной радиоэкологической обстановкой: Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології (збірник наукових праць).- вип.3. - Київ-Луганськ.- 1997.- С.107-110.

7. Педан Л.Р. Цитогенетичний ефект в лімфоцитах периферичної крові осіб, опромінених у зв'язку з аварією на ЧАЕС, з додатковим мутагенним впливом // 3-ій симпозіум “Діагностика та профілактика негативних наслідків радіації”, Київ, 16-17 грудня 1997р.- Матеріали симпозіуму.-Київ.- 1997. - С.179-180.

8. Педан Л.Р. Определение чувствительности хромосом лимфоцитов периферической крови лиц, пострадавших от Чернобыльской аварии, к дополнительному мутагенному воздействию in vitro // Международная конференция “Проблемы радиационной генетики на рубеже веков”. Москва, 20-24 ноября 2000г.- Изд. Рос. универ. дружбы народов.- Москва.- 2000.- С.309.

9. Пилинская М.А., Шеметун А.М., Дыбский С.С., Дыбская Е.Б., Педан Л.Р., Шеметун Е.В. Результаты 14-летнего цитогенетического мониторинга контингентов приоритетного наблюдения, пострадавших от действия факторов аварии на Чернобыльской АЭС // Вестник Российской Академии медицинских наук.- Москва - Медицина - 2001.- №10.- С.80-84. Набір матеріалу, цитогенетичний аналіз, статистична обробка, підготовка до друку.

10. Пілінська М.А., Шеметун Г.М., Дибський С.С., Дибська О.Б., Педан Л.Р., Шеметун О.В. Результати 15-ти-річного цитогенетичного моніторінгу за контингентами пріоритетного спостереження, які постраждали від дії факторів Чорнобильської аварії // Міжнародна конференція “П'ятнадцять років Чорнобильської катастрофи. Досвід подолання”.(тези доповідей).- Київ. - 2001. - С.3-12.

11. Пілінська М.А., Дибський С.С., Дибська О.Б. Педан Л.Р. Порівняння результатів цитогенетичного обстеження ліквідаторів наслідків Чорнобильської аварії, проведеного за допомогою традиційного цитогенетичного аналізу та методу FISH // Журнал АМН України.- 2003.- Т.9, №3.- С.465-475. Цитогенетичне обстеження ліквідаторів Чорнобильської аварії, статистична обробка, підготовка до друку.

12. Пілінська М.А., Дибський С.С., Дибська О.Б., Педан Л.Р. Результати цитогенетичного обстеження дітей, які мешкають на контамінованій радіонуклідами території зони зобної ендемії Рівненської області України // Цитологія і генетика. - 2003. - Т.37, №3. - С.55-60. Цитогенетичний аналіз, статистична обробка, підготовка до друку.

13. Пілінська М.А., Дибський С.С., Дибська О.Б. Педан Л.Р. Соматичний хромосомний мутагенез у дітей контамінованої радіонуклідами території України в постЧорнобильський період // Доповіді Національної Академії наук України. -2003. -№7. - С.176-182. Цитогенетичне обстеження дітей, аналіз даних, підготовка до друку.

14. Пілінська М.А., Дибський С.С., Дибська О.Б., Педан Л.Р. Порівняння результатів цитогенетичного обстеження ліквідаторів, проведеного у віддалені строки після Чорнобильської аварії за допомогою традиційного цитогенетичного аналізу та методу FISH // ІІІ з'їзд з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія). - Київ, 21-25 травня 2003р. (тези доповідей). - Київ. - Український фітосоціологічний центр. - 2003. - С.105. Цитогенетичне обстеження ліквідаторів Чорнобильської аварії, статистична обробка, підготовка до друку.

15. Пілінська М.А., Дибський С.С., Дибська О.Б. Педан Л.Р. Результати цитогенетичного обстеження дітей, які мешкають на контамінованій радіонуклідами території зони зобної ендемії Рівненської області України // ІІІ з'їзд з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія). - Київ, 21-25 травня 2003р. (тези доповідей). - Київ. - Український фітосоціологічний центр. - 2003. - С.106. Цитогенетичний аналіз, статистична обробка, підготовка до друку.

16. Пілінська М.А., Дибський С.С., Дибська О.Б. Педан Л.Р. Соматичний хромосомний мутагенез у дітей контамінованої радіонуклідами території України у віддалені строки після Чорнобильської аварії // ІІІ з'їзд з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія). - Київ, 21-25 травня 2003р. (тези доповідей). - Київ. - Український фітосоціологічний центр. - 2003. - С.107. Набір матеріалу, цитогенетичний аналіз, статистична обробка, підготовка до друку.

17. Педан Л.Р., Пілінська М.А. Результати дослідження радіаційно індукованого in vitro цитогенетичного ефекту у ліквідаторів Чорнобильської аварії, які перехворіли на гостру променеву хворобу: Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології (збірник наукових праць).- вип.1 (54). - Київ-Луганськ-Харків.- 2004.- С.31-38. Цитогенетичне обстеження осіб, які перехворіли на гостру променеву хворобу, аналіз даних, статистична обробка, підготовка до друку.

18. Педан Л.Р., Пілінська М.А. Оцінка стабільності хромосом лімфоцитів периферичної крові осіб, що постраждали від дії факторів Чорнобильської аварії, за допомогою тестуючого мутагенного навантаження in vitro: Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології (збірник наукових праць).- вип.7 (60). - Київ-Луганськ-Харків.- 2004.- С.299-306. Набір матеріалу, цитогенетичний аналіз, статистична обробка, підготовка до друку.

19. Педан Л.Р. Виявлення чутливості хромосом лімфоцитів периферичної крові ліквідаторів Чорнобильської аварії за допомогою додаткової мутагенної дії in vitro : Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології (збірник наукових праць).- вип.7 (60). - Київ-Луганськ-Харків.- 2004.- С.307-311.

20. Педан Л.Р., Пілінська М.А. Оцінка стабільності хромосом лімфоцитів периферичної крові осіб, постраждалих від дії факторів Чорнобильської аварії, за допомогою тестуючого мутагенного навантаження in vitro // Доп. Національної Академії наук України. - 2004. - №12. - C.175-179. Набір матеріалу, цитогенетичний аналіз, статистична обробка, підготовка до друку.

АНОТАЦІЯ

Педан Л.Р. Радіоіндукований цитогенетичний ефект і його модифікація in vitro в лімфоцитах периферичної крові осіб, які постраждали від дії факторів Чорнобильської аварії. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Науковий центр радіаційної медицини АМН України, Інститут експериментальної радіології, Київ, 2005.

При цитогенетичному обстеженні декільких груп осіб, які постраждали від дії факторів Чорнобильської аварії різної інтенсивності та тривалості - ліквідаторів, включаючи реконвалесцентів після гострої променевої хвороби (ГПХ) і дітей, які мешкали на забрудненій радіонуклідами місцевості України, провели додаткове мутагенне навантаження на культуру лімфоцитів периферичної крові in vitro.

Для тестуючої мутагенної дії використали еталонний хімічний мутаген діматіф (похідне етиленіміну) у кінцевій концентрації 0,4 мкг/мл та в окремих експериментах - гама-опромінення від джерела ¹³⁷Cs у дозі 50 сГр на стадії Go мітотичного циклу.

Виявили суттєві міжіндивідуальні і міжгрупові відмінності в чутливості клітин опромінених осіб до подальшої дії мутагена-провокатора. Показали, що частота індукованих аберацій як у окремих осіб, так і в групах в середньому не залежала від фонового рівня хромосомних мутацій і визначалась не лише індивідуальною реакцією на дію мутагена, але й попереднім радіаційним впливом.

Результати проведених досліджень показали реальність виникнення ”адаптивного відгуку” в групах дитячого населення забруднених радіонуклідами територій України та ліквідаторів Чорнобильської аварії, а також експресію хромосомної нестабільності у осіб, перехворівших на ГПХ.

Отримані дані підтвердили можливість виникнення радіаційно-індукованої модифікації чутливості хромосом соматичних клітин людини до подальшої дії мутагенних чинників.

Ключові слова: Чорнобильська аварія, цитогенетичні дослідження, лімфоцити периферичної крові, хромосомні аберації, іонізуюча радіація, мутагени-провокатори, адаптивний відгук, нестабільність геному.

АННОТАЦИЯ

Педан Л.Р. Радиоиндуцированный цитогенетический эффект и его модификация in vitro в лимфоцитах периферической крови лиц, пострадавших от действия факторов Чернобыльской аварии. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Научный центр радиационной медицины АМН Украины, Институт экспериментальной радиологии, Киев, 2005.

При цитогенетическом обследовании нескольких групп лиц, пострадавших от действия факторов Чернобыльской аварии разной интенсивности и продолжительности -ликвидаторов последствий аварии, включая реконвалесцентов после острой лучевой болезни (ОЛБ) и детей, проживающих на загрязненной радионуклидами территории Украины, провели дополнительную мутагенную нагрузку на культуру лимфоцитов периферической крови in vitro. Для тестирующего мутагенного воздействия использовали эталонный химический мутаген диматиф (производное этиленимина) в конечной концентрации 0,4 мкг/мл и в отдельных экспериментах - гамма излучение от источника ¹³⁷Cs в дозе 50 сГр на Go стадии митотического цикла.. Обнаружили существенные межиндивидуальные и межгрупповые отличия в чувствительности клеток облученных лиц к последующему воздействию мутагена-провокатора. Показали, что частота индуцированных хромосомных аберраций как у отдельных лиц, так и по группам в среднем не зависела от фонового уровня хромосомных мутаций и определялась не только индивидуальной реакцией на действие мутагена, но и предыдущим радиационным воздействием in vivo. Результаты проведенных исследований показали реальность возникновения “адаптивного ответа” в группах детского населения загрязненной радионуклидами территории и у ликвидаторов Чернобыльской аварии, а также экспрессию хромосомной нестабильности у лиц, перенесших острую лучевую болезнь. Полученные данные подтвердили возможность возникновения радиационно-индуцированной модификации чувствительности хромосом соматических клеток человека к последующему действию мутагенных факторов.

Ключевые слова: Чернобыльская авария, цитогенетические исследования, лимфоциты периферической крови, хромосомные аберрации, ионизирующая радиация, мутагены-провокаторы, адаптивный ответ, нестабильность генома.

ABSTRACT

Pedan L. R. Radioinduced cytogenetic effect and its modification in vitro in pheripheral blood lymphocites of persons exposed to Chernobyl accident factors. - Manuscript.

Thesis for biological Sciences Candidate Degree on the speciality 03.00.15 - genetics. - Research Centre for Radiation Medicine of the AMS of Ukraine, the Institute of Experimental Radiology, Kyiv, 2005.

Under cytogenetic examination of several groups of Chernobyl accident victims - liquidators including patients recovered from acute radiation sickness (ARS) and children lived in the contaminated by radionuclides region of Ukraine the additional mutagenic exposure to their lymphocytes in vitro had been used.

Powerful chemical mutagen dimatif (derivative of ethilenymin) in final concentration 0,4 mkg/ml and gamma-irradiation from ¹³⁷Cs source in dose 50 сGy in Go phase of mitotic cycle had been used for testing exposure.

Essential interindividual and intergroup fluctuations in sensitivity of irradiated persons cells to following provocative mutagenic exposure in vitro have been established.

It had been shown that frequency of induced chromosome aberrations as in individuals as well as in observed groups had not been depend on background level of chromosome mutations and had been caused not only by individual reaction to mutageic exposure, but also by preliminary in vivo irradiation.

Data received had been shown the reality of “adaptive response” origin to the additional mutagenic exposure both in the children lived in the Ukrainian regions contaminated due to radionuclides and in the clean-up workers as well as the hidden chromosome instability in the ARS group.

Results of cytogenetic researches confirmed the possibility of the radiation-induced modification of somatic cells chromosome sensitivity to mutagenic factors.

Key words: Chernobyl accident, cytogenetic researches, peripheral blood lymphocytes, chromosome aberrations, ionizing radiation, mutagens-provocateurs, adaptive response, genomic instability.

Размещено на Allbest.ru

...