Цитотоксична дія лімфоцитів на пухлинні клітини хворих на колоректальний рак

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

ЦИТОТОКСИЧНА ДІЯ ЛІМФОЦИТІВ НА ПУХЛИННІ КЛІТИНИ ХВОРИХ НА КОЛОРЕКТАЛЬНИЙ РАК

14.01.07 - онкологія

ПАХОЛЮК ТЕТЯНА ДМИТРІВНА

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є Кавецького НАН України

Науковий керівник - доктор медичних наук, професор Бережна Нінель Михайлівна, пров. наук. співр. відділу біології пухлинної клітини Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є Кавецького НАН України

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Глузман Данило Фішелевич, завідувач відділу імуноцитохімії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України;

доктор медичних наук, професор Гриневич Юрій Якимович, заступник директора по науковій роботі, керівник відділу клінічної імунології Інституту онкології АМН України.

Провідна установа Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, кафедра онкології, м. Київ

Захист дисертації відбудється “26“ жовтня 2005 р. о 13³⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є Кавецького НАН України за адресою: 03022, Київ, вул. Васильківська, 45

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Автореферат розісланий “23” вересня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук Н.В. Бородай

АНОТАЦІЯ

Пахолюк Т.Д. Цитотоксична дія лімфоцитів на пухлинні клітини хворих на колоректальний рак. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ, 2005.

Дисертаційна робота присвячена визначенню значення кількості і функціональної активності НК і НКТ клітин ПК хворих на КРР у протипухлинному захисті, особливостей пухлинних клітин (проліферативна активність, ступінь диференціювання, експресія білка р53) і обгрунтуванню можливості використання цих показників для оцінки прогнозу захворювання.

На основі обстеження 53 хворих на колоректальний рак (КРР) II стадії (T_2-3N_0-1M₀G_1-3) встановлено, що цитотоксична активність лімфоцитів ПК до оперативного втручання нижча, ніж у практично здорових донорів, більш низька по відношенню до клітин аутологічної пухлини, ніж до клітин лінії К562; пригнічується у присутності аутологічної сироватки. Пригнічуючий вплив аутологічної сироватки залежить від об'єму новоутворення, ступеня диференціювання пухлинних клітин та концентрації РЕА у сироватці крові.

Цитотоксична активність лімфоцитів ПК по відношенню до клітин лінії К562 асоційована з кількістю НК-клітин з фенотипом CD3^-CD56⁺CD16⁺, а по відношенню до аутологічних пухлинних клітин - з вмістом НК-клітин і НКТ з фенотипом CD3⁺CD56⁺CD16⁺. Встановлена негативна кореляція цитотоксичності з рівнем проліферативної активності пухлинних клітин. У 53,4% хворих на КРР знайдена експресія білка р53 більш, ніж у 30% пухлинних клітин, кореляції з цитотоксичною активністю лімфоцитів ПК не спостерігалось.

Через 6 міс. після операції у 35 хворих спостерігали підвищення рівня цитотоксичної активності, що було асоційовано із безрецидивним дворічним перебігом захворювання. У хворих з рецидивом захворювання рівень цитотоксичної активності не змінився, або зменшився. Ці попередні дані свідчать, що відновлення рівня цитотоксичності у післяопераційний період можна віднести до факторів прогнозу перебігу КРР.

Ключові слова: колоректальний рак, цитотоксична активність, аутологічні пухлинні клітини, натуральні кілери, натуральні кілерні Т-лімфоцити, проліферативна активність, білок р53, антиген Ki-67.

АННОТАЦИЯ

Пахолюк Т.Д. Цитотоксическое действие лимфоцитов на опухолевые клетки больных колоректальным раком. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.07 - онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена определению значения количества и функциональной активности ЕК и ЕКТ клеток периферической крови больных КРР в противоопухолевой защите, выяснению ряда особенностей опухолевых клеток (пролиферативная активность, степень дифференцировки, экспрессия белка р53) и обоснование возможности использования полученных результатов для оценки прогноза заболевания.

На основании обследования 53 больных колоректальным раком (КРР) II стадии (T_2-3N_0-1M₀G_1-3) установлено, что цитотоксическая активность лимфоцитов периферической крови больных до оперативного вмешательства существенно ниже, чем у практически здоровых доноров, максимально проявляется при соотношении лимфоцит/клетка-мишень = 40:1, ниже по отношению к клеткам аутологичной опухоли, чем к клеткам линии К562; угнетается в присутствии аутологичной сыворотки.

В большинстве случаев при использовании в качестве мишеней клеток линии К562 цитотоксическая активность была ассоциирована с числом естественных киллеров (ЕК-клетки с фенотипом CD3^-CD56⁺CD16⁺), а в отношении клеток аутологичной опухоли - с содержанием ЕК-клеток и естественных киллерных Т-лимфоцитов (ЕКТ с фенотипом CD3⁺CD56⁺ CD16⁺). В периферической крови больных КРР число ЕК-клеток было увеличено по сравнению с донорами (15,58 + 1,95% и 9,71 + 1,32%, соответственно; p<0,05), тем не менее цитотоксичность в отношении клеток линии К562 снижена (47,84 + 2,46 и 77,91 + 2,49, соответственно; p<0,05) и зависит от объема первичной опухоли (r =-0,357; p<0,05) и концентрации РЭА в сыворотке крови (r = -0,481; p<0,05).

Эффективность лизиса опухолевых клеток лимфоцитами больных КРР также зависела от содержания в периферической крови В-лимфоцитов - выявлена отрицательная корреляция с цитотоксичностью в отношении клеток линии К562 (r = - 0,548; p<0,05) и аутологичной опухоли (r = -0,591; p<0,05). Повышение содержания числа В-клеток у больных КРР по сравнению с донорами (14,11 + 1,72% и 8,25 + 1,25%, соответственно; p<0,05) сочеталось с повышением содержания в сыворотке крови IgA. Кроме того, при анализе клинических показателей установлена зависимость между концентрацией IgA и прорастанием опухолью мышечного слоя стенки кишечника (r = 0,430; p <0,05).

Пролиферативная активность опухолевых клеток больных КРР варьировала от 1-2% до 60% (определено по числу позитивно реагирующих клеток с моноклональными антителами Ki-67), в зависимости от степени их дифференцировки (r = -0,532; p<0,05).

Обнаружена негативная корреляция уровня пролиферативной активности опухолевых клеток и цитотоксичности по отношению к клеткам линии К562 (r = -0,350; p<0,05) и аутологичной опухоли (r = -0,312; p<0,05), что свидетельствует о значении клеток-эффекторов иммунной системы в контроле опухолевого роста.

У 53,4% больных КРР выявлена экспрессия белка р53 более, чем в 30% опухолевых клеток, однако корреляции с цитотоксической активностю лимфоцитов не отмечено.

Через 6 мес. после операции у 35 больных при повторном исследовании цитотоксичность лимфоцитов повысилась по сравнению с исходным уровнем (42,26 + 4,85% и 58,44 + 2,38%, соответственно; p <0,05), что было ассоциировано с длительностью безрецидивного периода на протяжении последующего наблюдения в течение двух лет (r = 0,46; p<0,01). У больных, умерших на протяжении периода наблюдения (49,36 + 3,96% и 46,30 + 5,16%, соответственно; p>0,05) и с рецидивом заболевания (50,66 + 4,35% и 52,87 + 3,93%, соответственно; p>0,05) уровень цитотоксической активности не изменился. Эти предварительные данные свидетельствуют, что восстановление уровня цитотоксической активности в послеоперационный период можно отнести к числу факторов прогноза течения КРР.

Ключевые слова: колоректальный рак, цитотоксическая активность, аутологичные опухолевые клетки, естественные киллеры, естественные киллерные Т-лимфоциты, пролиферативная активность, белок р53, антиген Ki-67.

SUMMARY

Pacholyuk T.D. Cytotoxic activity of peripheral blood lymphocytes on colorectal cancer patients' tumor cells. - Manuscript.

Dissertation for degree of candidate of medical science in speciality 14.01.07 - oncology. R.E. Kavetsky Institute for Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology, National Academy of Sciences, Ukraine. Kyiv, 2005.

Thesis is devoted to evaluation of significance the quantity and functional activity of NK and NKT cells from colorectal cancer patients for antitumor protection; some features of tumor cells (proliferative activity, differentiation, p53 expression) and the possibility of their using for prognosis of disease.

On the basis of observation of 53 colorectal cancer patients (T_2-3N_0-1M₀G_1-3) it was established that cytotoxic activity of peripheral blood lymphocytes in cancer patients before operation was lower than in donors, lower against autologic cancer cells than K562 cell line, and inhibited by autologic serum. Inhibited action of autologic serum was depended on tumor size, differentiation of tumor cells and CEA concentration.

Cytotoxic activity of peripheral blood lymphocytes against K562 cell line was associated with quantity of NK cells with phenotype CD3^-CD56⁺CD16⁺, аnd against autologic cancer cells - with quantity of NKT cells with phenotype CD3⁺CD56⁺CD16⁺. Negative correlation between cytotoxic activity and proliferative activity of tumor cells was revealed. The expression of p53 more than 30% of tumor cells was found in 53,4% cancer patients, but the correlation of this parameter with cytotoxic activity of peripheral blood lymphocytes was insufficient.

The cytotoxic activity of peripheral blood lymphocytes of 35 colorectal cancer patients in six months after operation was raised in comparison with initial level that associated with unrelapsed two-years course of disease. The cytotoxic activity of relapsed patients didn't change or diminished. These preliminary data suggest that the recovery of cytotoxic activity of peripheral blood lymphocytes after operation may be used as prognostic factor for colon cancer patients.

Key words: colorectal cancer, cytotoxic activity, autologic tumor cells, natural killers, natural killer T cells, proliferative activity, p53, Ki-67 antigen.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальность проблемы. Рак ободової і прямої кишки (колоректальний рак, КРР) відноситься до найпоширених онкологічних захворювань. Його частота в країнах Європейського Союзу досягає 53 випадків, а рівень смертності - 30 на 100.000 населення. В Україні ці показники складають 33,4 і 28 випадків на 100.000 населения відповідно. Результати епідеміологічних досліджень свідчать, що захворюваність на КРР неухильно зростає (Bleiberg H. et al., 1998; Федоренко З.П. и др., 2000). Незважаючи на постійне удосконалення хірургічних і хіміотерапевтичних методів лікування, смертність хворих залишається достатньо високою, а загальна 5-річна виживаність не перевищує 60% (Аксель Е.М., Бармина А.В., 1999; Бондарь Г.В. и др., 2001; Кикоть В.О. та співавт., 2002; Шалимов С.А. и др., 2003).

В останній час збільшилась кількість робіт, пов'язаних з дослідженням стану системи імунітету хворих на КРР (Midgley R.S., Kerr D.J., 2003; Koesters R. et al., 2004). Загальна оцінка отриманих результатів свідчить про їх неоднозначність, що може бути обумовлено обстеженням хворих на різних стадіях пухлинного процесу і використанням різних методів імунологічного дослідження. В переважній більшості випадків представлена інформація про кількісний вміст тих чи інших популяцій лімфоцитів (Oliver R.T., Nouri A.M., 1992; Rosenberg S.A., 1997; Vermorken J.B., 2000). Поряд з цим значно менше робіт, які б характеризували функціональну активність цитотоксичних клітин, наприклад натуральних кілерів (НК). Як відомо в теперішній час, ці клітини представлені окремими субпопуляціями, що мають різний фенотип. Основна кількість робіт присвячена дослідженню НК-клітин, що експресують CD16⁺ або CD56⁺ антигени (Akagi J. et al., 2002; Bonehill A. et al., 2003; Cabrera C.M. et al., 2003). Між тим, згідно інших даних, саме клітинам з подвійним фенотипом CD16⁺56⁺ притаманна найбільша цитотоксичність (Chakraborty A. et al., 1995; Koda K. et al., 2003; Kondo E. et al., 2003). Практично відсутні роботи по вивченню функціональної активності натуральнх кілерних Т-лімфоцитів (НКТ) (Sasatomi T. et al., 2002).

Разом з тим НК-клітини і НКТ розглядаються як важливі компоненти протипухлинного захисту, і деталізація ролі окремих субпопуляцій цитотоксичних клітин у пухлинному процесі, насамперед при КРР, вважається обгрунтованою за багатьма міркуваннями, в тому числі і з метою визначення можливості використання для оцінки перебігу захворювання (Tartter P.I. et al., 1987; Rigg K.M. et al., 1991; Liljefors M. et al., 2003).

До теперішнього часу практично відсутні роботи, присвячені динаміці цитотоксичної активності НК-клітин і НКТ; мало відомо про характер їх дії на аутологічні і алогенні пухлинні клітини. Також відсутні відомості про залежність цитотоксичної активності НК-клітин і НКТ від проліферативної активності, ступеня диференціювання пухлинних клітин, експресії білка р53.

Все вищезазначене і зумовило інтерес до вивчення НК-клітин і НКТ, а саме вмісту у периферичній крові, функціональної активності клітин по відношенню до аутологічних і алогенних пухлинних клітин; виявлення можливої залежності між цитотоксичною активністю кілерних клітин і загальних показників, що характеризують стан імунної системи хворих на КРР. Це визначає актуальність даної роботи і її відповідність вимогам сучасної онкології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно плану науково-дослідних робіт Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України “Вивчення протипухлинної активності лімфоцитів по відношенню до хіміорезистентних пухлинних клітин” (№ держ.реєстрації - 0100U000705; 2001-2002 рр.) та державної програми “Онкологія”.

Мета дослідження - на основі вивчення кількості і функціональної активності НК-клітин і НКТ хворих на КРР в динаміці (до операції і через 6 міс. після оперативного втручання) визначити закономірності змін цитотоксичності вказаних клітин з урахуванням впливу таких властивостей пухлинних клітин, як їх проліферативна активність та ступень диференціювання, і обгрунтувати можливість використання цих показників для прогнозу перебігу захворювання.

Задачі дослідження:

1. Дослідити цитотоксичну активність лімфоцитів периферичної крові хворих на КРР по відношенню до алогенних, а також аутологічних пухлинних клітин в динамиці захворювання при різних клінічних особливостях перебігу хвороби.

2. Визначити вплив аутологічної сироватки на активність кілерних клітин, які досліджуються.

3. Провести порівняльну оцінку рівня цитотоксичності НК-клітин і НКТ залежно від проліферативної активності пухлинних клітин, ступеня їх диференціювання і експресії білка р53.

4. Вивчити деякі особливості клітинного і гуморального імунітету хворих на КРР, вміст раково-ембріонального антигену (РЕА) у сироватці крові.

5. Дослідити можливе прогностичне значення рівня цитотоксичності НК-клітин і НКТ периферичної крові хворих на КРР.

Об'єкт дослідження - хворі на КРР, здорові донори і хворі з хронічними непухлинними захворюваннями органів шлунково-кишкового тракту.

Предмет дослідження - цитотоксична активність лімфоцитів периферичної крові по відношенню до клітин лінії К562 і клітин аутологічної пухлини; субпопуляційний склад лімфоцитів периферичної крові; концентрація імуноглобулінів у сироватці крові; експресія антигену проліферації Ki-67 і білка р53; тривалість життя хворих на КРР протягом двох років після операції.

Методи дослідження - загальноклінічні, імунологічні, морфологічні, імуногістохімічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше досліджені НК-клітини з фенотипом CD3^-CD56⁺CD16⁺ і НКТ з фенотипом CD3⁺CD56⁺CD16⁺ в периферичній крові хворих на КРР по відношенню до алогенних та аутологічних пухлинних клітин і виявлені зміни в кількості і функціональній активності вказаних клітин в залежності від особливостей клінічного перебігу процесу. Показано, що збільшення кількості клітин кілерів в периферичній крові хворих на КРР може асоціюватись зі зниженням їх цитотоксичної активності, а сироватка крові цих хворих гальмує кілерну активність лімфоцитів периферичної крові в системі in vitro.

Вперше виявлено, що рівень цитотоксичної активності лімфоцитів периферичної крові залежить від ступеня проліферації і диференціювання пухлинних клітин, об`єму первинної пухлини і концентрації РЕА у сироватці крові. Зміни функціональної активності НК-клітин і НКТ в більшості випадків відбуваються на тлі збільшення кількості CD8⁺, зниження CD4⁺ клітин і підвищення концентрації IgA у сироватці крові. Встановлено, що відновлення функціональної активності клітин кілерів після закінчення комплексного лікування корелює з поліпшенням стану хворих, тривалістюю безрецидивного перебігу захворювання (r = 0,46; p<0,01) і тому може бути використано в комплексі з іншими критеріями для прогнозування перебігу захворювання.

Практичне значення одержаних результатів. Визначення кількості НК-клітин і НКТ має суттєво важливе значення при загальній оцінці змін у системі імунітету при умові паралельного вивчення їх кількості і функціональної активності.

Рівень цитотоксичності вказаних клітин в післяопераційний період може мати певне прогностичне значення. На підставі встановленого лінійного взаємозв`язку між показниками цитотоксичності лімфоцитів периферичної крові проти клітин лінії К562 і аутологічної пухлини, визначення цитотоксичної активності по відношенню до алогенних пухлинних клітин може бути рекомендовано для використання з метою оцінки активності цитотоксичних лімфоцитів хворих на КРР.

Особистий внесок здобувача. Дисертант особисто сформулював мету та задачі дослідження, особисто провів пошук та аналіз літературних джерел. Автор самостійно проводив відбір хворих для дослідження, виділяв клітини з первинної пухлини, вивчав цитотоксичну активність лімфоцитів периферичної крові проти алогенних і аутологічних клітин, аналізував дані імунологічного обстеження хворих та проводив подальше спостереження за ними в динаміці захворювання. Здобувач особисто провів статистичну обробку отриманих даних, здійснив аналіз і узагальнення результатів дослідження, підготував до публікації основні матеріали дисертаційної роботи, сформулював основні положення, висновки та практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені та обговорені на науково-практичній конференції “Проблеми онкоімунології: наукові та прикладні аспекти” (Київ, 2003); науково-практичній конференції з міжнародною участю “ОНКОЛОГІЯ-XXI” (Київ, 2003); конференціях молодих вчених Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України (Київ, 2003; 2004).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 5 наукових праць, із них 3 статті у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України та 2 тези у матеріалах наукових конференцій.

Впровадження результатів роботи в практику. Результати дослідження впроваджені у практичну діяльність відділення абдомінальної хірургії та поліклініки Київської міської онкологічної лікарні.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота об'ємом 156 сторінок, складається із вступу, огляду літератури, п'яти розділів власних досліджень, узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій, списку використаної літератури, який включає 66 слов'яноязичних і 245 іноземних джерел. Робота ілюстрована 24 рисунками і 10 таблицями.

колоректальний рак пухлинний клітина

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Обстежено 53 хворих на КРР II-ої стадії (T_2-3N_0-1M₀G_1-3), які знаходились на лікуванні у відділенні абдомінальної хірургії Київської міської онкологічної лікарні. Серед них 27 жінок і 26 чоловіків у віці 47-82 роки (середній вік 64,5 + 1,0 роки). Клінічний діагноз верифікований на підставі фізикальних та спеціальних методів обстеження пацієнтів з онкологічною патологією. У 42 хворих діагностовано рак ободової кишки різних клінічних форм (23 - ентероколітична, 7 - диспептична, 6 - обтураційна, 4 - токсико-анемічна, 2 - псевдозапальна), у 11 - рак прямої кишки. Обстежена група не включала хворих з ускладненими формами пухлинного процесу (гнойно-некротичними та запальними змінами, значним больовим синдромом), а також з важкою супутньою соматичною патологією. Анемічний синдром на момент обстеження був усунений. До операції обстежені хворі не отримували специфічного лікування.

Сорока дев'яти хворим проведено радикальне оперативне втручання, 4 хворим - колоностомія. Післяопераційний період був неускладнений у 51 хворого, двоє хворих загинули внаслідок тромбоемболії легеневої артерії.

На момент обстеження та оперативного втручання віддалені метастази були відсутні, а метастатичне ураження регіонарних лімфатичних вузлів виявлено у 14 хворих. При морфологічному дослідженні видаленої пухлини у всіх хворих на КРР діагностовані аденокарциноми із ступенем диференціювання G₁-G₃: високодиференційована - у 8 хворих, помірно диференційована - у 24 та низькодиференційована - у 21 хворого.

Адьювантна хіміотерапія проведена 14 хворим (5-фторурацил у дозі 500-1000 мг/м² у поєднанні з лейковоріном у дозі 100 мг/м², внутрішньовенно крапельно протягом 8 годин в 1-5 дні курсу, повторний курс проведено через 21 день. Кількість курсів 2-4). Чотирьом хворим на рак прямої кишки була проведена післяопераційна променева терапія (1-2 курси) на ділянку малого тазу в сумарній вогнищевій дозі 30-60 Гр.

Цитотоксична активність лімфоцитів периферичної крові хворих по відношенню до клітин аутологічної пухлини та лінії К562 досліджена за допомогою МТТ-тесту (Шпак А.Р. и др., 2000). Лімфоцити отримували методом центрифугування в градієнті щільності фікол-верографіну (d = 1,077), клітини пухлин - шляхом механічної дезагрегації тканини видаленої пухлини з наступною обробкою 0,1% розчином колагенази та 0,25% розчином трипсину. В якості контроля була досліджена цитотоксичність лімфоцитів 10 практично здорових донорів віком 40 років та старше по відношенню до клітин лінії К562. При постановці тесту у 96-луночні планшети вносили 100 мкл суспензії лімфоцитів в концентрації 5 х 10⁴/мл та клітини-мішені у співвідношенні лімфоцит/клітина-мішень = 40:1; 20:1; 10:1. В частину лунок вносили тільки лімфоцити (клітини-ефектори) або тільки клітини-мішені. Культивування проводили протягом 16 год. при 37⁰С в атмосфері 5% СО₂. За 3 год. до закінчення культивування додавали 20 мкл МТТ (“Sigma”, США) в концентрації 5 мг/мл. Під впливом ферментів мітохондрій живих клітин МТТ (3-[4,5-диметілтіазол-2-іл]-2,5-дифеніл-тетразоліум бромід) окислювався з утворенням кристалів МТТ-формазану фіолетового кольору. По закінченні культивування проводили центрифугування планшет протягом 5 хв при 1500 об/хв., відбирали супернатант, додавали у лунки 150 мкл диметілсульфоксиду (“Serva”, Швеція) для розчинення кристалів формазану і вимірювали оптичну щільність (ОЩ) за допомогою спектрофотометра SUMAL-1 (Німеччина) при довжині хвилі 540 нм. Цитотоксичну активність (ЦА) визначали у відсотках за формулою:

ЦА = 100 - (ОЩ_{середнє для лунок мішені/ефектори} - ОЩ_{середнє для лунок ефекторів}/ОШ _{середнє для лунок мішеней}) х 100.

Субпопуляційний склад лімфоцитів периферичної крові оцінювали за допомогою двокольорового прямого імунофлуоресцентного тесту з використанням моноклональних антитіл (мкАТ) серії Leu (“Becton Dickinson”, США), кон'югованих з ФІТЦ або фікоеритрином, на протоковому цитофлуориметрі FACScan (“Becton Dickinson”, США) в програмі Lysis II.

Визначали субпопуляції CD3^-CD56⁺CD16⁺ (НК-клітини) і CD3⁺CD56⁺CD16⁺ (НКТ), а також кількість CD3⁺CD22^- Т-лімфоцитів, CD3^-CD22⁺ В-лімфоцитів, CD4⁺CD8^- Т-лімфоцитів, CD4^-CD8⁺ Т-лімфоцитів. Дослідження проведені сумісно з співробітниками Наукового центру радіаційної медицини АМН України Голярник Н.А. та Іллєнко І.А.

Концентрацію імуноглобулінів у сироватці крові визначали методом простої радіальної дифузії за Манчіні (1965). Порівняння показників клітинного та гуморального імунітету у хворих проведено з групою 25 практично здорових донорів та 39 хворих на непухлинні захворювання органів шлунково-кишкового тракту (хронічний ізольований коліт та коліт в поєднанні з хронічним панкреатитом, холециститом, гастритом).

У 30 хворих на КРР було проведено імуногістохімічне дослідження пухлинної тканини (у співробітництві з к.м.н. Захарцевою Л.М., зав. відділу патологічної анатомії Київської міської онкологічної лікарні).

Імуногістохімічні реакції проводили на депарафінізованих зрізах за домопогою мкАТ і авідин-біотин-стрептавідинового методу. Досліджували проліферативну активність пухлинних клітин за визначенням ядерного білка Ki-67 (мкАТ анти-Ki-67, клон MIB-1, “Dako Corporation”, США) та експресію білка р53 (мкАТ анти-р53, клон DO-7, “Dako Corporation”, США).

Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням t-критерію Стьюдента, ч²-критерію, кореляційного аналізу за допомогою пакету прикладних програм SPSS-11 (США). Дворічна загальна і безрецидивна виживаність хворих була проаналізована за методом Каплан-Мейєр (Двойрин В.В., 1982).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Отримані нами дані свідчать про те, що цитотоксична активність лімфоцитів периферичної крові (ПК) хворих і донорів по відношенню до клітин К562 залежить від співвідношення лімфоцит/клітина-мішень і є максимальною в пробах, де на одну пухлинну клітину припадало 40 лімфоцитів (рис. 1). Однак незалежно від співввдношення лімфоцит/мішень показники ЦА хворих на КРР значно нижчі порівняно з контролем (p<0,05).

Суттєвої залежності ЦА лімфоцитів ПК хворих на КРР від віку (r = 0,06; p>0,05), статі (r = -0,137; p>0,05), характеру росту пухлини - екзо- чи ендофітний (r = 0,055; p>0,05) не знайдено, але тенденція між рівнем цитотоксичності і метастатичним ураженням регіонарних лімфатичних вузлів (r = 0,226; p>0,05) та ступенем диференціювання пухлини (r = 0,250; p>0,05) спостерігалась. ЦА також не розрізнялась у хворих на рак ободової та прямої кишки (p>0,05) (табл. 1).

Рис. 1. Цитотоксична активність лімфоцитів периферичної крові хворих на КРР і практично здорових донорів (контроль) по відношенню до клітин лінії К562 залежно від співвідношення лімфоцит/клітина-мішень.

Таблиця 1. Цитотоксична активність лімфоцитів периферичної крові хворих на КРР і практично здорових донорів

Обстежені групи	Лімфоцит/клітини лінії К562	Лімфоцит/аутологічні пухлинні клітини
	40:1	20:1	10:1	40:1	20:1	10:1
Всі хворі на КРР, n = 53	47,84 + 2,46*	32,83 + 2,22*	21,12 + 1,71*	27,75 + 2,07#	13,02 + 1,09#	7,05 +1,56#
Рак ободочної кишки, n = 42	46,96 + 2,31*	32,78 + 1,88*	17,15 + 1,48*	27,71 + 1,41#	13,42 + 0,72#	7,23 + 1,34#
Рак прямої кишки, n = 11	49,46 + 2,28*	31,48 + 1,99*	14,74 + 1,96*	27,81 + 2,28#	12,46 + 1,21#	6,89 + 1,42#
Здорові донори, n = 10	77,91 + 2,49	55,43 + 1,74	37,24 + 1,16	-	-	-

Примітка: * p<0,05 порівняно з донорами; # - p<0,05 при порівнянні ЦА по відношенню до клітин К562 і аутологічної пухлини серед хворих на КРР, рак ободочної кишки і рак прямої кишки.

Водночас ЦА хворих на КРР залежала від об'єму пухлини (r =-0,357; p<0,05) і концентрації у сироватці крові РЕА (r = -0,481; p<0,05). Показники ЦА у хворих з нормальним (до 4 нг/мл) та підвищеним (>4 нг/мл) вмістом РЕА достовірно розрізнялись: 52,06 + 1,67 и 42,26 + 1,78%, відповідно; p<0,05.

Заслуговує уваги той факт, що аутологічна сироватка (АС) хворих пригнічувала ЦА лімфоцитів (показники при співвідношенні лімфоцит/клітини К562 = 40:1 дорівнювали 47,46 + 2,87% без АС та 34,94 + 1,87% при додаванні АС, p<0,05). Показано, що інгібуюча дія сироватки асоційована зі ступенем диференціювання пухлинних клітин (r = 0,5098; p<0,05), об'ємом пухлини (r = 0,4857; p<0,05) і концентрацією РЕА (r = 0,6123; p<0,01). Додавання аутологічної сироватки до лімфоцитів донорів не впливало на їх ЦА: показники при співвідношенні лімфоцит/клітини К562 = 40:1 дорівнювали 77,9 + 2,49% без АС та 78,33 + 1,6% при додаванні АС, p>0,05.

Ці дані дають підставу вважати, що у хворих на КРР у сироватці крові з'являються фактори, що можуть блокувати функцію клітин з цитотоксичною активністю. Питання про їх походження остаточно не з'ясовано, але існують дані, що більшість з них є продуктами життєдіяльності пухлинних клітин: це низькомолекулярні сполуки, гліколіпіди та їх розчинні форми, онкофетальні білки, в тому числі і РЕА, спермін, гіалуронідаза, муцини та інші (Rivoltini I. et al., 1992; Inoue M. et al., 2003; Duff M. et al., 2003).

Визначення цитотоксичності лімфоцитів по відношенню до клітин аутологічної пухлини показало, що середні показники ЦА при всіх співвідношеннях лімфоцит/клітина-мішень були нижче в порівнянні з показниками при використанні в якості мішеней клітин лінії К562 (табл. 1). Таким чином, ЦА по відношенню до аллогенних та аутологічних пухлинних клітин була знижена. Однією з важливих причин цього може бути зниження щільності на їх поверхні молекул адгезії, які забезпечують зв'язування цитотоксичних лімфоцитів. Було також проведено дослідження субпопуляційного складу лімфоцитів ПК, що дало змогу охарактеризувати співвідношення між окремими лімфоїдними клітинами з урахуванням їх цитотоксичності (табл. 2).

Таблиця 2. Субпопуляційний склад лімфоцитів периферичної крові хворих на колоректальний рак (I група), донорів (II група) та хворих на непухлинні захворювання органів шлунково-кишкового тракту (III група), %

Группа обстежених	Субпопуляції лімфоцитів
	CD22+	CD3+	CD4+	CD8+	CD4+/CD8+	CD3-CD56+ CD16+	CD3+CD56+ CD16+
I	14,11 + 1,72	63,41 + 2,56	32,36 + 2,07	33,11 + 2,47	1,18 + 0,17	15,58 + 1,95	8,49 + 2,17
II	8,25 + 1,25	64,55 + 5,66	37,35 + 2,03	33,54 + 3,14	1,79 + 0,14	9,71 + 1,32	11,12 + 1,76
III	9,2 + 3,71	63,24 + 3,41	40,65 + 3,10	29,57 + 2,78	1,46 + 0,10	11,56 + 2,01	10,78 + 1,89
PI-II	<0,05	>0,05	>0,05	>0,05	<0,05	<0,05	>0,05
PI-III	<0,05	>0,05	<0,05	>0,05	>0,05	>0,05	>0,05
PII-III	>0,05	>0,05	>0,05	>0,05	>0,05	>0,05	>0,05

Найбільш характерним для хворих на КРР виявилось підвищення вмісту НК-клітин (CD3^-CD56⁺CD16⁺), виявлене у 44% обстежених хворих; кількості В-лімфоцитів (44% хворих) та зменшення імунорегуляторного індексу CD4⁺/CD8⁺ (80% хворих). На відміну від НК-клітин, підвищення кількості НКТ (CD3⁺CD56⁺CD16⁺) було виявлено тільки у 4 хворих.

ЦА лімфоцитів хворих на КРР по відношенню до клітин лінії К562 залежала від вмісту НК-клітин (r = 0,3657; p<0,05), така ж залежність спостерігалась і у донорів (r = 0,671; p<0,001). Однак, хоча у донорів вміст НК-клітин був нижчим, ніж у хворих на КРР, ЦА лімфоцитів проти алогенних пухлинних клітин була значно вища. У хворих на КРР ЦА була низькою порівняно з контролем, хоча кількість НК-клітин була високою. Така невідповідність кількісного складу лімфоцитів ПК та їх функціональних можливостей свідчить про наявність в організмі хворих на КРР механізмів, які гальмують активність імунної системи.

ЦА лімфоцитів ПК хворих на КРР проти клітин аутологічної пухлини асоційована з сумарним вмістом НК-клітин і НКТ (r = 0,341; p<0,05), але не з кількістю кожної з цих популяцій окремо. При підвищенні кількості клітин однієї популяції число клітин другої зменшувалось (r = - 0,4358; p<0,05). Не выявлено жодного хворого, у якого б у ПК одночасно знижувалась кількість і НК-клітин, і НКТ. На наш погляд, цей факт має принципове значення, оскільки свідчить про існування компенсаторних можливостей в реалізації цитотоксичного потенціалу клітин, що приймають участь у протипухлинному захисті. Пояснення цього факту, на нашу думку, полягає в тому, що у випадках низької експресії антигенів гістосумісності на пухлинних клітинах цитотоксичність переважно реалізується НК-клітинами, а при достатньому рівні експресії цих антигенів - більш ефективними є НКТ.

Відмічено, що ефективність лізісу лімфоцитами хворих на КРР клітин К562 (r = - 0,548; p<0,05) та аутологічної пухлини (r = -0,591; p<0,05) зворотньо залежала від кількості в ПК В-лімфоцитів. При дослідженні показників гуморального імунітету у хворих на КРР знайдено підвищення концентрації IgA у сироватці крові (табл. 3) та пряма кореляційна залежність концентрації IgA від кількості В-лімфоцитів (r = 0,675; p<0,05). Крім того, при аналізі клінічних показників встановлена залежність між концентрацією IgA та проростанням пухлиною м'язового слою стінки кишківника (r = 0,430; p <0,05).

Наявність таких залежностей можна пояснити змінами цитокінового профілю хворих на КРР. Відомо, що при КРР пухлинні клітини здатні до синтезу цитокінів, які активують популяцію Т-хелперів 2 типу, а ті, у свою чергу, сприяють проліферації та диференціюванню В-лімфоцитів. Водночас такий цитокіновий спектр пригнічує функціональну активність НКТ та НК-клітин, що має негативне прогностичне значення (Pellegrini P.et al., 1996; 1997).

Таблиця 3. Концентрація імуноглобулінів у сироватці крові хворих на колоректальний рак (I група), донорів (II група) та хворих на непухлинні захворювання органів шлунково-кишкового тракту (III група), г/л

Групи обстежених	IgA	IgG	IgM
I	2,81 + 0,23	11,33 + 0,75	1,15 + 0,06
II	2,34 + 0,07	10,96 + 1,04	1,05 + 0,09
III	2,01 + 0,16	9,62 + 0,93	0,98 + 0,07
PI-II	>0,05	>0,05	>0,05
PI-III	<0,05	>0,05	>0,05
PII-III	>0,05	>0,05	>0,05

Пухлинні клітини хворих на КРР істотно розрізнялись за інтенсивністю проліферації, рівень якої визначали за експресією антигену Ki-67. Кількість Ki-67⁺ клітин, що знаходились у різних фазах клітинного циклу (за виключенням фази G₀), варіювала від 1-2% до 60%.

Проліферативна активність пухлини корелювала з метастатичним ураженням регіонарних лімфатичних вузлів (r = 0,769; p<0,001), об'ємом пухлини (r = 0,351; p<0,05), концентрацією РЕА у сироватці крові до операції (r = 0,474; p<0,05), а також з ЦА по відношенню до клітин К562 (r = -0,350; p<0,05) та аутологічної пухлини (r = -0,312; p<0,05).

Більш ніж у половини хворих на КРР (53,4%) на момент оперативного втручання в пухлинних клітинах виявляли експресію білка р53, що співпадає з даними інших дослідників (Райхлин Н.Т. и др, 1995; Baker S.J. et al., 1989; Hamelin R., Laurent-Puig P., 1997). Це з високою імовірністю свідчить на користь наявності мутацій гену р53 (Райхлин Н.Т. и др, 2002). Однак кореляційної залежності між експресією білка р53 і другими дослідженими параметрами не виявлено.

При повторному дослідженні через 6 міс. після оперативного втручання (обстежено 51 хворий, всі - без ознак рецидиву захворювання) рівень ЦА по відношенню до клітин лінії К562 достовірно підвищився у 35 хворих (1 підгрупа). У 16 пацієнтів він не змінився (2 підгрупа). У жодного з пацієнтів аутологічна сироватка не пригнічувала ЦА лімфоцитів.

При характеристиці загальної і безрецидивної дворічної виживаності відмічено, що динаміка ЦА асоційована з прогнозом захворювання. Протягом двох років у групі 30 хворих на КРР від прогресії основного захворювання померло 7 осіб, ще у 8 виникли рецидиви. У хворих, що померли, кілерна активність лімфоцитів через 6 міс. після операції не тільки не підвищилась, але навіть мала тенденцію до зниження (49,36 + 3,96% і 46,30 + 5,16%, відповідно; p>0,05). Аналогічні дані спостерігались і у хворих з прогресією пухлинного процесу (50,66 + 4,35% і 52,87 + 3,93%, відповідно; p>0,05). Водночас, при відсутності ознак рецидива захворювання відмічено зростання показників ЦА порівняно з доопераційним рівнем (42,26 + 4,85% і 58,44 + 2,38%, відповідно; p <0,05). В цілому, зростання рівня ЦА в динаміці захворювання позитивно корелювало з тривалістю безрецидивного періоду (r = 0,46; p<0,01).

Оскільки для визначення ЦА через 6 міс. після операції в якості клітин-мішеней використовували клітини лінії К562, можна стверджувати, що досліджувана цитотоксичність в цей період переважно здійснювалась НК-клітинами. Це відповідає існуючим в онкології поглядам, що цитотоксичні клітини, в першу чергу НК-клітини, не тільки належать до першої лінії захисту проти малігнізованих клітин, але і контролюють ріст пухлини на всіх етапах її розвитку, включаючи метастазування.

Крім того, встановлена залежність тривалості безрецидивного періоду від метастатичного ураження регіонарних лімфатичних вузлів на момент операції (r = -0,698; p<0,001), проліферативної активності пухлини (r = -0,673; p<0,001), ступеня диференціювання пухлинних клітин (r = -0,402; p<0,05), проведення курсів хіміотерапії у післяопераційний період (r = 0,407; p<0,05). Ці отримані нами попередні дані свідчать, що відновлення рівня ЦА у післяопераційний період можна віднести до факторів прогнозу перебігу КРР. Вони можуть бути використані в подальшому при проведенні крупних багатоцентрових досліджень для створення моделі прогнозу КРР на основі комплексу клінічних параметрів захворювання і біологічних властивостей пухлини.

ВИСНОВКИ

Дисертаційна робота присвячена визначенню значення кількісного вмісту і функціональної активності НК і НКТ клітин ПК хворих на КРР у протипухлинному захисті, деяких особливостей пухлинних клітин (проліферативна активність, ступінь диференціювання, експресія білка р53) і обгрунтуванню можливості використання виявлених змін параметрів, що характеризують цитотоксичну активність, для оцінки прогнозу захворювання.

1. Цитотоксична активність лімфоцитів-кілерів (НК-клітин і НКТ з фенотипом CD3^-CD56⁺CD16⁺ і CD3⁺CD56⁺CD16⁺ відповідно) в ПК хворих на КРР по відношенню до аутологічних і алогенних пухлинних клітин знижена при наявності кореляції рівня цитотоксичності по відношенню до різних клітин-мішеней.

2. Рівень цитотоксичної активності досліджуваних клітин кілерів знаходиться у залежності від проліферативної активності пухлинних клітин і об'єма пухлини. Більш висока цитотоксична активність лімфоцитів у ПК хворих на КРР характерна для пухлин з низькою проліферативною активністю.

3. Цитотоксична активність лімфоцитів ПК при використанні в якості клітин-мішеней лінії К562 у більшості випадків переважно асоційована з кількістю клітин CD3^-CD56⁺CD16⁺, а по відношенню до аутологічних пухлинних клітин - із вмістом клітин обох фенотипів (CD3^-CD56⁺CD16⁺ і CD3⁺CD56⁺CD16⁺). В ряді випадків зміни функціональної активності лімфоцитів не співпадали з кількістю вказаних клітин.

4. Аутологічна сироватка хворих на КРР пригнічує цитотоксичну активність лімфоцитів ПК (сироватка практично здорових донорів таких властивостей не має). Пригнічуючий вплив асоційований з підвищенням концентрації у сироватці крові хворих РЕА і залежав від ступеня диференціювання пухлинних клітин та об'єму пухлини.

5. Зміни цитотоксичності лімфоцитів в доопераційний період супроводжувались зниженням кількості у ПК CD4⁺ Т-лімфоцитів, підвищенням кількості CD8⁺ Т-клітин, В-лімфоцитів і зростанням концентрації IgA у сироватці крові.

6. Більш ніж у половини обстежених хворих на КРР має місце експресія білка р53 у пухлинних клітинах, однак кореляції з цитотоксичною активністю лімфоцитів не спостерігається.

7. При аналізі загальної і безрецидивної виживаності хворих на КРР встановлено, що відновлення цитотоксичної активності через 6 міс. після оперативного втручання пов'язано із сприятливим прогнозом захворювання, що дозволяє рекомендувати дослідження динаміці цитотоксичної активності лімфоцитів ПК як додатковий прогностичний маркер перебігу хвороби.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Паралельне визначення кількості НК-клітин і НКТ у ПК та їх функціональної активності є важливим критерієм оцінки імунологічного статусу хворих на КРР.

2. Дослідження динаміки цитотоксичної активності НК-клітин і НКТ (протягом 6 міс. після оперативного втручання) в комплексі з іншими критеріями може бути використане прогнозу перебігу захворювання. Для хворих на КРР з безрецидивним дворічним перебігом захворювання характерним є відновлення показників цитотоксичності до рівня здорових осіб відповідної вікової групи.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Пахолюк Т.Д., Кошель К.В., Олийниченко Г.П., Чумак А.А., Бережная Н.М. Фенотипические особенности лимфоцитов периферической крови и функциональная активность естественных клеток-киллеров у больных колоректальным раком // Онкология. - 2004. - Т.6, №1. - С. 23-26. (Дисертант самостійно проводив відбір хворих, оцінював результати імунофенотипування, проводив статистичну обробку даних).

2. Пахолюк Т.Д., Кошель К.В., Олийниченко Г.П., Бережная Н.М. Цитотоксическая активность лимфоцитов периферической крови больных колоректальным раком // Онкология. - 2004. - Т.6, №2. - С. 43-46. (Дисертант самостійно отримував лімфоїдні і пухлинні клітини, визначав цитотоксичну активність лімфоцитів, проводив обробку одержаних результатів).

3. Пахолюк Т.Д., Захарцева Л.М., Кошель К.В., Олийниченко Г.П., Бережная Н.М. Степень дифференцировки, уровень пролиферации опухолевых клеток и цитотоксическая активность лимфоцитов периферической крови больных колоректальным раком // Экспериментальная онкология. - 2004. - Т.26, №2. - С. 161-163. (Диссертант самостійно визначав цитотоксичну активність лімфоцитів хворих через 6 міс. після оперативного втручання, оцінював стан хворих за індексом Карновського, проводив обробку одержаних результатів).

4. Пахолюк Т.Д., Кошель К.В. Цитотоксическая активность лимфоцитов больных колоректальным раком // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участтю `ОНКОЛОГІЯ-XXI”. - Київ, 2003. - С. 64.

5. Пахолюк Т.Д., Кошель К.В. Динамика цитотоксической активности лимфоцитов периферической крови у больных колоректальным раком // Матеріали науково-практичної конференції “Проблеми онкоімунології: наукові і прикладні аспекти”: тези доповідей, 22-23 травня, 2003, Київ. - Онкология. - 2003. -Т.5, №2. - С. 162.

Размещено на Allbest.ru

...