Морфофункціональна характеристика сперматозоїдів при порушенні фертильності

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕРМАТОЗОЇДІВ ПРИ ПОРУШЕННІ ФЕРТИЛЬНОСТІ

СПЕЦІАЛЬНІСТЬ: Гістологія, цитологія, ембріологія

СТОЙКА БОГДАНА РОСТИСЛАВІВНА

Київ, 2005 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Неплiдність - це стан, який супроводжує цілу низку хвороб статевих орґанiв та системнi захворювання жiночого або чоловiчого орґанiзмiв. За різними джерелами від неплідності у світі потерпає близько 50-100 мільйонів людей, а 10-20% подружніх пар має проблеми з отриманням потомства під час свого репродуктивного перiоду. Причини близько 20% випадків подружньої неплiдності пов'язують із чоловiком, 32% - із жiнкою, у 21% - проблема стосується обох партнерiв, у решті 27% випадків - причина точно не встановлена (Semczuk M. et al., 1999). В Україні нараховують близько 1 мільйона подружніх неплідних пар. (Гойда Н.Т., 1998). Наведені дані свідчать про актуальність дослідження проблеми неплідності, зокрема, зумовленої чоловічим фактором.

Проаналізовано причини неплідності серед людських пар репродуктивного віку, класифіковано випадки неплідності, наведено дані про частоту їх появи та механізми виникнення. Особливу увагу звернено на випадки, пов'язані з комбінованою дією множинних антиспермальних антитіл (АСА). Результатом такої дії є іммобілізація і/чи аґлютинація сперматозоїдів, перешкоди у взаємодії сперматозоїдів із яйцеклітиною, пригнічення імплантації і/чи зупинка розвитку ембріона (Bronson R.A. & Fusi F.M., 1994, Koide S.S. et al., 2000).

Із літератури відомо, що гормони щитоподібної залози впливають на нормальний ріст, статевий розвиток та репродуктивну функцію тварин і людини (Johnson C.A., 2002, Weber G. et al., 2003).

У неплідних чоловіків виявлено кореляцію поміж рівнем гормонів щитоподібної залози та присутністю антитіл до неї, з одного боку, та особливостями спермограми, з іншого боку, зокрема, підвищений рівень антитироїдних антитіл поєднувався із зниженням рухливості сперматозоїдів (Trummer H. et al., 2003). Результати проведених досліджень виявили, що чоловіки із гіпертироїдизмом мають патологічні зміни у спермограмі, причому найчастіше знижується рухливість сперматозоїдів (Krassas G.E. et al., 2002). Серед осіб, які протягом тривалого часу працювали у Чорнобильській зоні, переважали чоловіки віком 21-49 років, імунна та репродуктивна системи яких вважаються найбільш радіочутливими (Бебешко та ін., 2001). У пацієнтів із Чорнобильської зони виявлено підвищену частоту автоімунних захворювань, зокрема тироїдиту (Заставна Д.В. та ін., 2003), що може вказувати на появу антиґенно-чужих клітин в орґанізмі цих пацієнтів.

Вплив наслідків Чорнобильської аварії на стан репродуктивної системи чоловіків вивчений недостатньо.

З цього приводу існують лише поодинокі повідомлення про зниження в означених осіб рівня фертильності з недостатнім поясненням механізмів виникнення такого стану (Бебешко В.Г. та ін., 2001).

Відомо, що поверхня сперматозоїдів покрита глікокаліксом, до складу якого входять оліго- та дисахариди, які модифікуються під час запліднення. Перерозподіл глікокон'югатів поверхні сперматозоїдів здійснюється також упродовж сперматогенезу у звивистих сім'яних канальцях, при проходженні сім'явивідними шляхами, а також після еякуляції у статевих шляхах жінки. Сперматозоїди з порушеною структурою поверхневих глікокон'югатів розпізнаються та елімінуються імунокомпетентними клітинами статевих шляхів жінки (Луцик А.Д. та ін., 1989).

Експериментально доведено, що вуглеводні детермінанти мають важливе значення на різних етапах запліднення. Зокрема, зміни у плазматичній мембрані, які відбуваються in vitro під час капацитації та акросомної реакції, супроводжуються видаленням або появою специфічних глікопротеїнів (Jimenez I. et al., 2002). Взаємодія сперматозоїда й яйцеклітини реалізується за умов стереохімічної відповідності вуглеводних детермінант поверхні яйцеклітини та активних центрів ендогенних лектинів сперматозоїдів (Луцик А.Д. та ін., 1989).

У літературі описано використання окремих лектинів для дослідженнях морфофункціональних особливостей сперматозоїдів, проте майже усі ці роботи стосуються cперматозоїдів різних видів тварин і, крім того, в них наведені неоднозначні висновки (Marti J.I. et al., 2000, Verini-Supplizi A. et al., 2000, Jimenez I. et al., 2002, Kawakami E. et al., 2002, Muramatsu T., 2002). Оскільки більшість дослідників, які вивчали механізми виникнення подружньої неплідності, переважно застосовували у своїх роботах цитохімічні, або молекулярні підходи, отримані з цього приводу дані часто є суперечливими і не дозволяють зробити обгрунтованих висновків щодо патогенезу порушення фертильності та потенційних шляхів його корекції. Тому ми використали у нашій роботі різні підходи для морфофункціональної характеристики сперматозоїдів при порушенні фертильності.

Нами також досліджено механізми, які могли призвести до порушення фертильності, що виявлені (див. Горпинченко И.И. и др., 1995) у пацієнтів Чорнобильського контингенту.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано в рамках теми “Лектинові маркери та цитоплазматичні сигнальні молекули у процесі клітинної диференціації і проліферації” (номер державної реєстрації №0102U007224).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було вивчити:

1) цитоморфологічну характеристику лектинових рецепторів сперматозоїдів пацієнтів за умов подружньої неплідності та сперматогенних клітин щурів із експериментальним гіпертироїдизмом;

2) зв'язок між проявом автоімунного тироїдиту у пацієнтів Чорнобильського контингенту та експресією у них антиспермальних антитіл, властивих пацієнтам із порушеною фертильністю.

Для досягнення поставленої мети вирішували наступні завдання:

- дослідити реактивність сперматозоїдів з лектинами різної вуглеводної специфічності у чоловіків із діагнозом неплідності у подружжі;

- вивчити характер зв'язування флуоресцентних барвників (акридиновий оранжевий, етидію бромід, Хехст 33342) сперматозоїдами пацієнтів із діагнозом неплідності у подружжі;

- отримати лектиноцитохімічну характеристику сперматогенних клітин щурів із експериментальним гіпертироїдизмом;

- дослідити експресію антиспермальних антитіл, які взаємодіють із імуноглобулінами класів A, M, G, на поверхні сперматозоїдів пацієнтів iз порушеною фертильністю;

- визначити рівень експресії антиспермальних антитіл у сироватці крові пацієнтів Чорнобильського контингенту із діагностованим автоімунним тироїдитом та у пацієнтів без ознак цієї патології;

- визначити наявність антиспермальних антитіл у сироватці крові пацієнтів Чорнобильського контингенту з діагнозом автоімунного тироїдиту та встановити молекулярну масу білкових спермальних антигенів, які взаємодіють із цими антиспермальними антитілами.

Об'єкт дослідження - сперматозоїди пацієнтів із порушеною фертильністю, сперматогенні клітини щурів із експериментальним гіпертироїдизмом, сироватка крові пацієнтів Чорнобильського контингенту із діагностованим автоімунним тироїдитом та без ознак цієї патології.

Предмет дослідження - експресія поверхневих та внутрішньоклітинних антигенів сперматозоїдів пацієнтів із порушеною фертильністю, поверхневих глікокoн'югатів сперматогенних клітин щурів із експериментальним гіпертироїдизмом, а також експресія антиспермальних антитіл у сироватці крові пацієнтів Чорнобильського контингенту із діагностованим автоімунним тироїдитом та без ознак цієї патології і деякі властивості білкових спермальних антигенів, які взаємодіють із цими антиспермальними антитілами.

Методи дослідження.

У роботі використовували:

а) цито- і гістохімічні методи із застосуванням гематоксиліну й еозину, лектинів різної вуглеводної специфічності, мічених пероксидазою хрону, а також деяких флуоресцентних барвників і поліакриламідних кульок, кон'югованих з імуноглобулінами класів A, M, G;

б) імунохімічні методи (імуноензимний аналіз вмісту антиспермальних антитіл та електрофоретична ідентифікація білкових антигенів сперматозоїдів).

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі вперше застосовано комплексний підхід із використанням цитологічного, гістологічного та імунохімічного досліджень з метою морфофункціональної характеристики сперматозоїдів пацієнтів із порушеною фертильністю, сім'яників щурів із експериментальним гіпертироїдизмом та дослідження антиспермальних антитіл сироватки крові чоловіків Чорнобильського контингенту з діагнозом автоімунний тироїдит. Виявлено, що сперматозоїди людини володіють високою реактивністю щодо лектинів зародків пшениці (WGA), рицини (RCA) та квасолі (PHA).

Разом з тим за характером зв'язування лектинів сперматозоїди пацієнтів із діагнозом подружньої неплідності суттєво не відрізняються від сперматозоїдів контрольної групи, незважаючи на відмінності в їхніх спермограмах. Сперматозоїди, отримані від пацієнтів із порушеною фертильністю, мають подібний спектр зв'язування флуоресцентних барвників (акридиновий оранжевий, етидію бромід, Хехст 33342), як і сперматозоїди пацієнтів контрольної групи. Клітини епітеліального вистелення протоки придатка сім'яників щурів із експериментально індукованим гіпертироїдизмом характеризуються підвищеним вмістом рецепторів лектину виноградного слимака (HPA) при одночасному прояві дегенеративних змін сперматогенних клітин звивистих сім'яних канальців, що вказує на діагностичне значення експресії глікокон'югатів лектину HPA при дисфункції щитоподібної залози.

У 20% обстежених чоловіків iз порушенням фертильної функції на поверхні сперматозоїдів виявлено антиспермальні антитіла, які взаємодіють із імуноглобулінами класів A, M, G. У сироватці крові 78% обстежених чоловіків Чорнобильського контингенту із діагностованим автоімунним тироїдитом та у 50% таких чоловіків без ознак цієї патології має місце підвищений рівень експресії антиспермальних антитіл (АСА). У сироватці крові жінок Чорнобильського контингенту з діагнозом автоімунного тироїдиту рівень експресії АСА у сироватці крові становить всього 11%. АСА, які містяться у сироватці крові пацієнтів Чорнобильського контингенту з діагнозом автоімунного тироїдиту, взаємодіють із антигенами сперматозоїдів із молекулярною масою, подібною до маси білкових антигенів, виявлених іншими у сироватці крові неплідних чоловіків. На підставі отриманих даних можна стверджувати, що підвищений рівень АСА у сироватці крові чоловіків Чорнобильського контингенту з діагностованим автоімунним тироїдитом є важливим у патогенезі зниженої фертильності.

Практичне значення роботи. Отримані здобувачем результати дозволяють стверджувати, що підвищений рівень антиспермальних антитіл у сироватці крові чоловіків Чорнобильського контингенту з діагностованим автоімунним тироїдитом є важливим у патогенезі зниженої фертильності. Це дозволить рекомендувати шляхи імунокорекції даного порушення. Підтверджено значення лектиноцитохімічного вивчення клітин сім'яників при дослідженні патологічних змін у репродуктивних органах. Результати досліджень використовуються також як теоретичний і демонстраційний матеріал на заняттях із гістології, цитології та ембріології для студентів Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького. Крім того, результати дослідження можуть бути використані при виданні монографій, навчальних посібників і підручників з цитології і цитохімії, зокрема розділів, які стосуються чоловічої репродуктивної системи.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно зібрала літературу за темою дисертації, виконала експериментальну частину роботи, провела статистичний аналіз результатів імуноензимного аналізу (ELISA), сформулювала основні висновки і підготувала до друку основні матеріали за результатами дисертаційної роботи. Визначення головних завдань роботи, а також обговорення результатів досліджень здійснено спільно з науковим керівником. При здійсненні електрофоретичного аналізу та ELISA спермальних антигенів дисертант отримувала консультації від професора М. Курпіша - завідувача лабораторії біології репродукції Інституту генетики людини Польської Академії наук. Лектиноцитохімічне дослідження сім'яників щура виконано при консультативній допомозі доцента Ященко А.М. При здійсненні люмінесцентної мікроскопії сперматозоїдів консультативна допомога надавалася співробітниками відділу регуляції проліферації клітин Інституту біології клітини НАН України.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на ІІІ-му з'їзді медичних генетиків України (Львів, 2002), Міжнародній школі імені Джона Гамфрі Європейської Федерації імунологічних товариств (Закопане, Польща, 2002), 1-му Українському Конгресі з клітинної біології (Львів, 2004) та розширених наукових семінарах кафедри гістології, цитології, ембріології Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького (Львів, 2002, 2003, 2004).

Публікації. Результати досліджень висвітлені у 9 друкованих працях, в тому числі у 6 статтях, опублікованих у фахових журналах, та 3 тезах матеріалів наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертаційної роботи.

Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини (матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження, аналізу і узагальнення результатів), а також із висновків та списку використаної літератури, що налічує 120 джерел.

Роботу викладено на 114 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 32 рисунками і 7 таблицями.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи. Для дослідження використовували:

а) сперму чоловіків із діагнозом подружньої неплідності;

б) гістологічні зрізи сім'яників щурів із експериментальним гіпертироїдизмом та в нормі;

в) сироватку крові пацієнтів Чорнобильського контингенту з діагнозом автоімунний тироїдит та без такого діагнозу.

Дослідження проводили протягом 2001-2004 років. Досліджувані групи:

1) пацієнти з автоімунним тироїдитом (віком від 19 до 64 років), які постраждали внаслідок Чорнобильської аварії (32 пацієнти, з яких 23 чоловіки та 9 жінок);

2) чоловіки без автоімунного тироїдиту (віком від 24 до 42 років), які постраждали внаслідок Чорнобильської аварії (6 чоловіків), у період обстеження пацієнти обох груп перебували на обліку у Львівському державному спеціалізованому диспансері радіаційного захисту населення;

3) чоловіки (10 пацієнтів репродуктивного віку) із непліддям у подружжі з факторами ризику в анамнезі щодо експресії АСА;

4) чоловіки (43 особи) із непліддям у подружжі із патологічними змінами у спермограмі віком 21-47 років: із спермаглютинацією - 12 осіб, олігозооспермія - 4 особи, олігоастенотератозооспермія - 10 осіб, астенотератозооспермія - 12 осіб, астенозооспермія - 5 осіб;

5) чоловіки (5 осіб), в яких не виявлено відхилень у спермограмі віком 23-48 років.

Крім того, у роботі було використано 10 статевозрілих щурів-самців із гіпертироїдизмом, індукованим введенням L-тироксину, та 10 інтактних щурів-самців.

Для лектиноцитохімічного дослідження сперматозоїдів пацієнтів із діагнозом подружньої неплідності суспензію сперматозоїдів фіксували у розчині метанол:ацетон:формалін (19:19:2).

Локалізацію вуглеводних детермінант, що зв'язували лектини, мічені пероксидазою хрону, виявляли у присутності субстрату для пероксидази (160 мкл 3% Н2О2 і 25 мг. хромогену діамінобензидину тетрагідрохлориду в 50 мл. забуференого фізіологічного розчину). При використанні флуоресцентних барвників сперматозоїди інкубували протягом 30 хв. у присутності акридин оранжевого (0,3 мкг/мл), Хехст 33342 (0,1 мкг/мл), або етидію броміду (1,0 мкг/мл). Мікроскопію і підрахунок сперматозоїдів здійснювали із використанням люмінесцентного мікроскопа ЛЮМАМ-Р2 (ЛОМО, Російська Федерація) в областях збудження та емісії, як рекомендовано Крищишин Н.В., Луцик М.Д., 1979, Darzynkiewicz Z. et al., 1992. Для лектиногістохімічного дослідження сім'яників щурів із експериментьнльним гіпертироїдизмом, викликаним введенням щурам із їжею L-тироксину у дозі 150 мкг/кг маси тіла протягом 2 тижнів, тварин вбивали під ефірним наркозом і сім'яники та придатки фіксували у 4% нейтральному формаліні. Зрізи фарбували гематоксиліном і еозином для оцінки загальної морфології, або лектинами, міченими пероксидазою, - для ідентифікації глікокон'югатів.

Для біотестування експресії антиспермальних антитіл на поверхні сперматозоїдів використовували поліакриламідні кульки із приєднаниими до них антитілами до імуноглобулінів людини (Immunobead reagent rabbit anti-human IgAIgMIgG, BIO-RAD, Richmond, USA). Під фазово-контрастним мікроскопом (Axiolab, Carl Zeiss Jena) підраховували відсоток клітин із приєднаними до них імунокульками.

Детекцію антиспермальних антитіл (АСА) у сироватці крові пацієнтів Чорнобильського контингенту здійснювали за допомогою імуноензимного аналізу (ELISA) у плоскодонних 96-лункових полістиролових планшетках (Nunc, Roskildle, Denmark), покритих сумішшю сперматозоїдів, отриманими щонайменше від 3-х клінічно здорових донорів.

Концентрацію білка в екстрактах клітин визначили за допомогою методу Лоурі (1951). Електрофорез білків сперматозоїдів у 10% поліакриламідному гелі за денатуруючих умов здійснювали здійснювали за класичним методом, описаним Леммлі (1970). Білки електрофореграми переносили на нітроцелюлозну мембрану (Millipore, Bedford, USA), використовуючи метод електропереносу. Для детекції білків на мембрані використовували сироватки крові пацієнтів із підвищеним титром АСА (попередньо визначено за допомогою ELISA).

У кожному досліді використовували паралельні зразки клітин. Цифрові дані результатів досліджень аналізували за допомогою методів варіаційної статистики (Деркач М.П. та ін., 1977). Для обчислень застосовували пакет програм Microsoft Excel для персонального компютера типу Pentium. Під час статистичного аналізу використовували стандартний t-критерій Стьюдента, а величину P < 0,05 вважали показником вірогідної різниці результатів.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

Лектиноцитохімічне дослідження сперматозоїдів при подружній неплідності. Проводячи це дослідження, ми враховували, що антиспермальні антитіла (АСА) головним чином утворюються до білкових антигенів поверхні сперматозоїдів (Semczuk М. et al., 1999) і, крім того, переважна більшість цих поверхневих антигенів є глікопротеїнами (Луцик А.Д. і ін., 1989). Тому ми вважали доцільним використати лектини (білки неімунного походження, що мають здатність зворотньо і вибірково зв'язувати вуглеводи і вуглеводні детермінанти біополімерів без зміни їхньої ковалентної структури (Луцик М.Д. і ін., 1981, Франц Х., 1980), як цитохімічний інструмент для вивчення особливостей поверхні сперматозоїдів пацієнтів із діагнозом подружньої неплідності. Дослідженню підддавалися сперматозоїди чоловіків, які проходили обстеження з приводу подружньої неплідності. Обстеження пацієнтів було здійснене у центральній лабораторії Львівської обласної клінічної лікарні. У результаті лектиноцитохімічного дослідження, проведеного у нашій лабораторії, встановлено, що сперматозоїди пацієнтів із нормальною спермограмою та пацієнтів із патологічними змінами у спермограмі мають подібний спектр вуглеводних детермінант у глікокаліксі спермальних клітин. Показано відсутність глікокон'югатів із термінальною D-маннозою (рецептори Con A) та N-ацетил-D-галактозамін (рецептори HPA) у ділянці передньої частини головки та основної і термінальної частин хвоста сперматозоїда.

Таблиця 1. - Характеристика лектинів, які використовували для цитохімічного дослідження сперматозоїдів:

Таблиця 2. - Зв'язування лектинів зі структурними компонентами сперматозоїдів пацієнтів з діагнозом подружньої неплідності:

Як видно з даних, наведених у табл. 2, глікокон'югати із детермінантами N-ацетил-D-глюкозаміну та сіалової кислоти (рецептори WGA), а також D-галактози та сіалової кислоти (рецептори RCA) локалізовані на передній частині головки (акросома), у плазмолемі головки та у хвостовому відділі (проміжна, основна і термінальна частини) сперматозоїдів. Рецептори PHA (зв'язують залишки N-ацетил-D-глюкозаміну), виявлені у складі глікокаліксу сперматозоїдів, а саме, у складі плазмолеми головки, акросомі, шийці, в меншій мірі - у проміжній та основній частині хвоста і в незначній кількості - на термінальній частині хвоста сперматозоїдів.

Рецептори HPA (специфічні до N-ацетил-D-галактозаміну) виявлені на плазмолемі головки, шийці та проміжній частині хвоста, але були відсутні в акросомі, основній та термінальній частині хвоста сперматозоїдів.

Рецептори Con A (специфічні в основному до D-маннози) локалізовані на поверхні плазмолеми задньої (пришийкової) частини головки та на проміжній частині хвоста сперматозоїдів, тоді як передня частина головки сперматозоїдів була ареактивна з цими лектинами.

Експресія рецепторів PSA (специфічні до D-маннози) переважала на плазмолемі головки, шийки та проміжної частини хвоста і була слабше вираженою на акросомі та термінальній частині хвоста сперматозоїдів.

Лектин бульби картоплі (STA) зі специфічністю до N-ацетил-хітотріози взаємодіяв із сперматозоїдами подібно до лектину насіння гороху (PSA).

Рецептори LABA із специфічністю до L-фукози виявлені на глікокаліксі у ділянці акросоми, плазмолеми головки, шийкової та проміжної частини хвоста сперматозоїдів.

Лектин омели зі специфічністю до D-галактози зв'язувався з рецепторами плазмолеми головки та хвоста, за винятком термінальної частини хвоста сперматозоїдів.

Отже, аналіз результатів лектиноцитохімічного дослідження сперматозоїдів пацієнтів із патологічними змінами у спермограмі свідчить про відсутність виражених відмінностей в експресії вуглеводних детермінант на поверхні сперматозоїдів цих пацієнтів порівняно з контролем.

Використання флуоресцентних барвників (акридиновий оранжевий, етидію бромід, Хехст 33342) у дослідженні сперматозоїдів осіб із діагнозом подружньої неплідності. При дослідженні внутрішньоклітинних компонентів сперматозоїдів пацієнтів із нормальною спермограмою та з патологічними змінами у спермограмі використали флуоресцентні барвники (акридиновий оранжевий, етидію бромід, Хехст 33342), беручи до уваги, що останні здатні взаємодіяти із нуклеїновими кислотами, у першу чергу, з ДНК (Крищишин Н.В., Луцик М.Д., 1979, Darzynkiewicz Z. et al., 1992).

Оскільки патогенетичні механізми багатьох захворювань пов'язані з проявами апоптозу клітин окремих тканин і органів і порушеннями структури ДНК, можна було припустити, що зміни у спермограмі обстежуваних пацієнтів також супроводжуються порушеннями ДНК та апоптичними процесами у складі сперматозоїдів.

Підставою для такого припущення служать результати проведеного нами контрольного експерименту, що засвідчив суттєві зміни у флуоресцентній картині лімфоцитів периферичної крові людини (поява оранжево-червоного свічення акридинового оранжевого в цитоплазмі, фрагментація ядра і цитоплазми, зменшення розмірів клітин), в яких було індуковано апоптоз за допомогою етопозиду.

Аналіз мікрофотографій сперматозоїдів обстежуваних пацієнтів після фарбування цих клітин згаданими флуорохромами не виявив виражених цитопатологічних змін у спермограмі, рівно ж як і відмінностей між сперматозоїдами пацієнтів із нормальною та зміненою спермограмою.

Лектиноцитохімічне дослідження клітин сім'яника щурів за умов експериментального гіпертироїдизму. У переважній більшості досліджень сперматозоїдів із застосуванням методів лектиноцитохімії автори використовували тканини і клітини експериментальних тварин (Lutjen P. et al., 1986, Marti J.I. et al., 2000, Verini-Supplizi A. et al., 2000, Jimenez I. et al., 2002). Тому нам здавалося доцільним співставити отримані результати лектиноцитохімічного вивчення сперматозоїдів чоловіків із діагнозом подружньої неплідності з даними лектиноцитохімічного дослідження щурів за умов експериментального гіпертироїдизму. При цьому ми виходили з того, що захворювання щитоподібної залози можуть вести до суттєвого порушення репродуктивних функцій як у жіночому (Гофман Дж., 1994, Johnson C.A., 2002), так і в чоловічому (Гофман Дж., 1994, Trummer H. et al., 2003, Weber G. et al., 2003) організмах.

Нами встановлено, що екзогенний гіпертироїдизм, викликаний введенням щурам із їжею L-тироксину в дозі 150 мкг/кг маси тіла протягом 2-х тижнів, веде до зменшення маси сім'яників із 9,03-0,05 г. (n = 10) у контролі до 8,30-0,02 г. (n = 10) у досліді.

При цьому також збільшувалась кількість звивистих сім'яних канальців із злущеними дегенеративними формами сперматогенних клітин.

За допомогою описаної вище лектинопероксидазної техніки ми виявили специфічне зв'язування лектинів із сперматогенними клітинами звивистих сім'яних канальців, елементами гематотестикулярного бар'єру, гормонпродукуючими клітинами, епітелієм протоки придатка. Встановлено характерне зв'язування лектину золотого дощу (LABA), специфічного до L-фукози, із малодиференційованими сперматогенними клітинами (сперматогоніями), хоч і не всі клітини базального поверху мали однакову спорідненість до LABA.

Рецептори лектину САВА-1 було виявлено як в окремих сперматогоніях, так і в складі зрілих сперматозоїдів. У сперматогоніях, в яких були відсутні рецептори L-фукозо-специфічного лектину золотого дощу, експресувалися рецептори САВА-1.

Очевидно ті сперматогонії, які вступали у фазу росту й підлягали подальшим перетворенням, нагромаджували рецептори лектину САВА-1, що підтверджується наявністю останніх у зрілих сперматозоїдах. В епітеліоцитах протоки придатка спостерігалась експресія рецепторів лектинів WGA, HPA, але найбільш інтенсивною була реакція із лектином HPA на поверхні клітин зі щіточковою облямівкою.

У щурів із експериментальним гіпертироїдизмом виявлено високу концентрацію рецепторів НРА у частині сперматогоній, сперматидах і сперматозоїдах. У придатку сім'яника відмічено більш інтенсиву експресію рецепторів НРА на поверхні клітин із облямівкою, що може вказувати на нагромадження біополімерів з детермінантами NАcDGal на їхній апікальній поверхні. Під впливом L-тироксину для сперматозоїдів був характерний підвищений вміст рецепторів НРА.

Отже, дисфункція щитоподібної залози (гіпертироїдизм) призводить до модифікації вуглеводних детермінант сперматогеного епітелію, а підвищений вміст NАcDGal у складі секрету протоки придатка може свідчити про незавершеність процесів кінцевого глікозування глікополімерів і служити дестабілізуючим фактором у життєдіяльності сперматозоїдів за цих умов. Детекція антиспермальних антитіл до антигенів поверхні сперматозоїдів за умов чоловічої неплідності. Крім лектинових рецепторів, на поверхні сперматозоїдів містяться антигени, що впізнаються специфічними антитілами (Naz R.K. et al. 1995, Semczuk М. et al., 1999). Тому одним із методів для діагностики імунологічного фактора чоловічої неплідності є використання імунних кульок, які є дрібними частинками поліакриламідного гелю з ковалентно приєднаними до них молекулами імуноглобулінів різних класів - IgA, IgM або IgG. Біотест із використанням імунних кульок вважається позитивним, якщо понад 20% сперматозоїдів взаємодіють із специфічними імунокульками через свої поверхневі антигени. Серед обстежених нами 10-ти пацієнтів із діагнозом подружньої неплідності у двох виявлено взаємодію їхніх сперматозоїдів із імунокульками, кон'югованими з IgА (1 пацієнт) та IgG (1 пацієнт).

Імуноензимний аналіз (ELISA) експресії антиспермальних антитіл (АСА) у сироватці крові пацієнтів Чорнобильського контингенту. Передумовою для проведення вищеозначеного дослідження послужило припущення, що серед антитіл, рівень яких підвищений у хворих на автоімунний тироїдит, можуть локалізуватися й АСА, тобто у цих хворих можливий підвищений ризик порушення фертильності. Ми застосували високочутливий імуноензимний аналіз (ELISA) для вивчення рівня експресії АСА у сироватці крові пацієнтів Чорнобильського контингенту з діагностованим автоімунним тироїдитом та без такого діагнозу.

З цією метою було використано зразки сироватки крові 38-ми таких пацієнтів, які знаходилися на обліку у Львівському державному спеціалізованому диспансері радіаційного захисту населення. Діагностування автоімунного тироїдиту було здійснене на підставі комплексного обстеження пацієнтів із урахуванням показників їхнього імунного статусу, визначених у Львівському обласному діагностичному центрі. Як видно з результатів імуноензимного аналізу (ELISA), наведених на рис., у 19-ти із 38-ми обстежених пацієнтів Чорнобильського контингенту з діагностованим автоімунним тироїдитом мало місце достовірне підвищення рівня АСА. Пороговим значенням нормального рівня експресії АСА вважали 2,6 нг АСА в 1 мл. сироватки крові (Domagala A. et al., 2000). Отже, пацієнти-чоловіки Чорнобильського контингенту з діагностованим автоімунним тироїдитом, які характеризувалися підвищеним рівнем АСА, можуть мати знижену фертильність, оскільки високий рівень АСА в організмі веде до розвитку подружньої неплідності (Schlaff W.D., 1990). У літературі наведені дані (Панченко О.А. і ін., 2001) про стрімке зростання (у 16 разів) рівня загальної захворюваності серед пацієнтів Чорнобильського контингенту в порівнянні з 1987 роком. При цьому частота проявів ендокринних порушень зросла в 11 разів, а частота порушень функцій щитоподібної залози зросла в 15 разів. За останні 10 років захворюваність на автоімунний тироїдит в Україні зросла більше, ніж у 10 разів (Пилипенко Н.И., Афанасьева Н.И., 1995). Ми не виявили у доступній нам літературі даних щодо змін у стані фертильності серед пацієнтів цього контингенту, хоча отримані нами дані про суттєво підвищений вміст АСА у сироватці крові значної частини цих пацієнтів передбачає підвищену ймовірність їхньої неплідності.

Рис. 1. - Концентрація антиспермальних антитіл (АСА) у сироватці крові пацієнтів Чорнобильського контингенту:

Де:

А - менше норми (n = 19);

Б - більше норми (n = 19).

АСА-позитивними вважали зразки сироватки, в яких концентрація АСА перевищувала 2,6 нг/мл сироватки крові.

На рис. 2 наведені дані про відносну кількість (%) пацієнтів із підвищеним рівнем АСА у сироватці крові серед чоловіків-чорнобильців з діагностованим автоімунним тироїдитом і серед жінок-чорнобильців з таким діагнозом, а також серед чоловіків-чорнобильців без ознак автоімунного тироїдиту.

Електрофоретичний аналіз спермальних білкових антигенів, які взаємодіють із антиспермальними антитілами сироватки крові пацієнтів Чорнобильського контингенту з діагностованим автоімунним тироїдитом.

Для характеристики спермальних білкових антигенів, які взаємодіють із антиспермальними антитілами (АСА) сироватки крові пацієнтів Чорнобильського контингенту з діагностованим автоімунним тироїдитом використовували електрофоретичний аналіз таких антигенів із їх детекцією за допомогою антитіл сироватки крові цих пацієнтів із найвищим титром АСА.

Рис. 2. - Кількість пацієнтів (%) із підвищеним рівнем АСА у сироватці крові серед різних категорій пацієнтів-чорнобильців:

За допомогою означеного методу встановлено, що антигени сперматозоїдів клінічно здорових донорів взаємодіють із АСА, виявленими у сироватці крові пацієнтів Чорнобильського контингенту з діагностованим автоімунним тироїдитом. Встановлено молекулярну масу антигенів сперматозоїдів, із якими взаємодіють вищеописані АСА. Це - білки з молекулярною масою 140, 109, 104, 100, 97, 93, 84, 82, 76, 74, 70, 63, 60, 58, 53, 48, 36 кДа. Інші дослідники виявили, що з АСА взаємодіють такі спермальні антигени: 110, 95, 90, 87, 82, 72, 67, 62, 54, 50, 45, 44, 33, 26, 24, 19, 15, 14 кДа (Shai S., Naot Y., 1992), 85,2, 84,1, 65,9, 64,0, 63,3, 57,2, 52,9, 50,5, 29,9, 28,9, 27,9 кДа (Bohring C., Krause W., 1999), від 15 до 115 кДа (Domagala A. et al., 2000). сперматозоїд неплідність дегенеративний

Отже, встановлені нами величини молекулярних мас антигенів сперматозоїдів, які взаємодіють з АСА, наявними у сироватці крові чоловіків Чорнобильського контингенту з діагнозом автоімунний тироїдит, в цілому узгоджуються з даними доступної літератури стосовно молекулярної маси антигенів сперматозоїдів, які можуть бути пов'язані із фертильністю.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вперше застосовано комплексний підхід із використанням цитологічного, гістологічного та імунохімічного дослідження з метою морфофункціональної характеристики сперматозоїдів пацієнтів із порушеною фертильністю, сім'яників щурів із експериментальним гіпертироїдизмом та дослідження антиспермальних антитіл сироватки крові чоловіків Чорнобильського контингенту з діагнозом автоімунний тироїдит.

Аналіз отриманих результатів дозволив зробити наступні висновки:

1. Сперматозоїди людини виявляють високу реактивність щодо лектинів зародків пшениці (WGA), рицини (RCA) та квасолі (PHA), тоді як лектини омели (VAA), виноградного слимака (HPA), насіння гороху (PSA), кори золотого, бульб картоплі (STA) та конканавалін А (ConA) взаємодіють з поверхневими глікопротеїнами лише окремих ділянок сперматозоїдів. За характером зв'язування лектинів сперматозоїди пацієнтів із діагнозом подружньої неплідності суттєво не відрізняються від сперматозоїдів контрольної групи, незважаючи на відмінності в їхніх спермо грамах;

2. Сперматозоїди, отримані від пацієнтів із порушеною фертильністю, мають такий самий характер зв'язування флуоресцентних барвників (акридиновий оранжевий, етидію бромід, Хехст 33342), як і сперматозоїди пацієнтів контрольної групи;

3. Клітини епітеліального вистелення протоки придатку сім'яників щурів із експериментально індукованим гіпертироїдизмом характеризуються підвищеним вмістом глікокoн'югатів із термінальними залишками N-ацетил-D-галактозаміну рецепторів лектину виноградного слимака (HPA). Одночасно з цим мають місце дегенеративні зміни сперматогенних клітин звивистих сім'яних канальців, що вказує на діагностичне значення експресії глікокон'югатів лектину HPA при дисфункції щитоподібної залози;

4. У 20% обстежених чоловіків iз порушенням фертильної функції на поверхні сперматозоїдів виявлено антиспермальні антитіла, які взаємодіють із поліакриламідними кульками, кон'югованими з імуноглобулінами класів A, M, G;

5. Виявлено підвищений рівень експресії антиспермальних антитіл у сироватці крові 78% обстежених чоловіків Чорнобильського контингенту із діагностованим автоімунним тироїдитом та у 50% таких чоловіків без ознак цієї патології. У сироватці крові жінок Чорнобильського контингенту з діагнозом автоімунного тироїдиту рівень експресії антиспермальних антитіл у сироватці крові становить 11%;

6. У сироватці крові пацієнтів Чорнобильського контингенту з діагнозом автоімунного тироїдиту містяться антиспермальні антитіла, які взаємодіють із антигенами сперматозоїдів із молекулярною масою 140, 109, 104, 100, 97, 93, 84, 82, 76, 74, 70, 63, 60, 58, 53, 48, 36 кДа. Ці антигени подібні за своєю молекулярною масою до білкових антигенів, що виявлені іншими дослідниками у сироватці крові неплідних чоловіків;

7. Отримані нами результати дозволяють стверджувати, що підвищений рівень антиспермальних антитіл у сироватці крові чоловіків Чорнобильського контингенту з діагностованим автоімунним тироїдитом є важливим у патогенезі зниженої фертильності.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Стойка Б.Р., Луцик О.Д. Імуноцитохімічні аспекти чоловічої неплідності // Acta Medica Leopoliensia. - 2002. - Т. 8. - №2. - С. 52-60.

2. Білий Р.О., Стойка Б.Р., Стойка Р.С. Запрограмована смерть клітин (апоптоз) у репродуктивних органах ссавців // Біологія тварин. // 2002. - Т.4. - №1-2. - С. 31-43.

3. Stoyka B., Domagala A., Kurpisz M. Molecular targets for immunocontraception. // Archivum Immunologiae and Therapiae Experimentalis. - 2003. - №51. - N1. - Р. 45-49.

4. Стойка Б.Р., Ященко А.М., Фітьо І.С., Луцик О.Д. Лектиноцитохімічне дослідження сперматозоїдів при подружній неплідності. // Acta Medica Leopoliensia. - 2003. - Т. 9. - №2, С. 69-73.

5. Ященко А.М., Стойка Б.Р., Смолькова О.В., Наконечна О.В., Луцик О.Д. Гіпотетична роль рецепторів лектинів як маркерів апоптозу в клітинах сім'яника при тироїдній патології. // Таврический медико-биологический вестник. - 2003. - Т. 6. - №3. - С. 153-155.

6. Стойка Б.Р., Домагала А., Каменічна М., Курпіш М., Надюк З.О.. Гельнер Н.В., Заставна Д.В., Стойка Р.С., Луцик О.Д. Експресія спермальних антигенів та антиспермальних антитіл: імуноцитохімічне дослідження у чоловіків з порушенням фертильної функції та у пацієнтів Чорнобильського контингенту з діагнозом автоімунний тироїдит. Acta Medica Leopoliensia. - 2004. - Т. 10. - №3, С. 36-42.

7. Stoyka B., Domagala A., Kamieniczna M., Lutsik O., Kurpisz M. Expression of immunological infertility markers in Chernobyl patients. // John Humphrey's School. - 2002. - Abstracts, N11. - Zakopane, Poland.

8. Stoyka B., Domagala A., Kamieniczna M., Lutsik O., Kurpisz M. Immunologically mediated infertility: antisperm antibody detection in Chernobyl patients. // ІІІ з'їзд медичних генетиків України. - 2002. - Тези доповідей, 120Р. - Львів.

9. Stoyka В., Yashchenko A., Fityo I., Lutsik O. Differential expression of lectin receptors in sperm cells at human couple infertility. 1-ий Український Конгрес клітинної біології з міжнародним представництвом. - 2004. - Тези доповідей. - Львів. С. 279.

Размещено на Allbest.ru