Вплив кріоконсервованих продуктів ембріофетоплацентарного комплексу на процеси апоптозу при аутоімунних захворюваннях

Размещено на http://allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

03.00.19. -- Кріобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Вплив кріоконсервованих продуктів ембріофетоплацентарного комплексу на процеси апоптозу при аутоімунних захворюваннях

Рассоха Ірина Вікторівна

Харків - 2005

Дисертацiєю є рукопис.

Робота виконана в Iнститутi проблем крiобiологiп i крiомедицини НАН Украпни

Науковий керiвник: член-кореспондент НАН Украпни,

доктор медичних наук, професор

Гольцев Анатолiй Миколайович, Iнститут проблем крiобiологiп i крiомедицини НАН Украпни, заст. директора з наукової роботи ІПКіК НАН України, м. Харків

Офiцiйнi опоненти: доктор бiологiчних наук, професор

Жегунов Геннадiй Федорович, Харкiвська

державна зооветеринарна академiя МАП Украпни, завiдувач кафедри хiмiп i бiохiмiп, м. Харків

доктор медичних наук, професор

Кайдашев Iгор Петрович,Українська медична

стоматологічна академія МОЗ України, завiдувач Центральноп науково - дослідної лабораторії та кафедри внутрішніх хвороб з доглядом за хворими, м. Полтава

Провiдна установа: Нацiональний медичний унiверситет iм. О.О. Богомольця МОЗ України, відділ експери-ментальноп та клiнiчноп iмунологiп, м. Кипв.

Захист вiдбудеться “- 24----” --------травня--------- 2005 року о -1330-годинi на засiданнi спецiалiзованоп вченоп ради Д 64.242.01. при Iнститутi проблем крiобiологiп i крiомедицини НАН Украпни,61015, Харкiв - 15, вул. Переяславська, 23

З дисертацiєю можна ознайомитися у бiблiотецi ІПКiК НАН Украпни за адресою: 61015, Харкiв - 15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розiсланий “----23------” ----------квiтня------------- 2005 р.

Вчений секретар

спецiалiзованоп вченої ради,

член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення протягом тривалого часу властивостей і характеристик продуктів ембріофетоплацентарного комплексу (ПЕФПК) продемонструвало широкий спектр їхньої біологічної активності та затребуваність для лікування рiзноманiтних патологій людини [Грищенко В.И. и др., 1996, 2002; Гольцев А.Н. и др., 2003]. Гідне місце у цих роботах займає кріобіологічний вектор, у якому можна виділити два ключових моменти: по-перше, розробка ефективних методів кріоконсервування зазначених біооб'єктів та, по-друге, вивчення особливостей механізмів реалізації їхнього терапевтичного ефекту після кріоконсервування.

Усе менше викликає сумнівів той факт, що традиційне застосування імуносупресивних препаратів при аутоімунних захворюваннях (АІЗ) є малоефективним методом їх лікування. Механізми зриву імунологічної толерантності при АІЗ, зокрема при ревматоїдному артриті (РА), до цього часу до кінця не з'ясовані, однак вже зараз очевидна необхідність перегляду стратегії лікування цієї патології. У патогенезі РА істотною є зміна балансу регуляторних популяцій імунокомпетентних клітин (ІКК) i експансія запальних цитокінів внаслідок дисфункції кооперативно реалізуємого Т-клітинно-моноцитарно-макрофагального механізму [Dinarello C.A. et al., 2000; Насонов Е.Л., 2001; Koshy P.J. et al., 2002]. Лише нещодавно пригорнула до себе увагу як одна з можливих причин розвитку РА проблема генетичних та метаболічних порушень ініціації й реалізації апоптозу [Burger D., 2000; Eguchi K., 2001; Catrina A.I. et al., 2002].

Апоптоз є універсальним фізіологічним процесом, що відіграє фундаментальну роль у підтримці структурно-функціональної сталості як окремих органів та тканин, так і організму в цілому [Kerr J. F et al., 1972; Afford S. et al., 2000; Райхлин Н.Т. и др., 2002; Ярилин А.А. и др., 2004]. Порушення механізмів клітинної загибелі є патогенетично значною ланкою розвитку багатьох патологічних станів [Чехун В.Ф., 1999; Lenardo M. еt al., 2002; Жданов А. В. и др., 2003]. Ілюстрацією щодо важливості апоптозу для підтримки нормального рівня функціонування організму можуть бути імунопатології, при яких аутореактивні ІКК “уникають” його [Eguchi K., 2001]. У зв'язку з цим виникає питання, що має як теоретичну, так і практичну значущість, а саме: наскільки змінюється при РА збалансоване співвідношення проліферації й апоптозу? Не менш важливою є також оцінка структурно-функціональних характеристик лімфогемопоетичного комплексу (ЛГПК), оскільки за умов зміни цитокінового профілю при РА існує висока вірогідність модифікації мембранних маркерів, що відповідають за каскадні про- та протизапальні процеси, які мають безпосереднє відношення до апоптозу. До актуальних задач сучасної медицини відноситься розробка ефективних технологій корекції імунокомпетентної сфери під час розвитку АІЗ, зокрема застосування імуномодулюючих препаратів. До них, безумовно, можна віднести ПЕФПК, які, виступаючи у ролі природних біомодуляторів, здійснюють корекцію міжсистемних взаємодій та надсистемну регуляцію нейроімуноендокринної сфери [Гольцев А.Н. и др., 1999; Грищенко В.И., 2002]. Здатність ПЕФПК коригувати стан регуляторних субпопуляцій клітин імунної системи, що забезпечують становлення та підтримку толерантності [Гольцев А.Н., 2000], теоретично обґрунтовує можливість керування як загальним станом ІКК при аутоімунних патологiях у цілому, так і окремих механізмів їх розвитку, тобто апоптозом. Однак особливості проявлення та реалізації цих процесів за умов розвитку АІЗ до і після застосування ПЕФПК потребують подальшого вивчення. Виходячи з того, що при АІЗ виникають умови, які призводять до пригнічення апоптозу, особливий інтерес представляє інформація щодо здатності ПЕФПК відтворювати баланс між проліферацією й апоптозом. Ці дані дозволять у більшому ступені розкрити патогенетичні основи розвитку та підтримки АІЗ, зокрема РА, а також оптимізувати методи терапії цієї патології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі кріопатофізіології в рамках планових тем НДР ІПКіК НАН України: № 2.2.6.76. “Вивчення патофiзiологiчних основ застосування нативних та крiоконсервованих продуктiв фетоплацентарного комплексу (ПФПК) в лiкуваннi аутоiмунних захворювань” № держреєстрації 0202U000832 і теми № 2.2.6.6. “Вивчення механiзмiв коригуючоп дiп продуктiв фетоплацентарного комплексу на лiмфогемопоетичну систему в умовах розвитку аутоiмунних захворювань при старiннi” № держреєстрації 0102U002023.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - встановити особливості впливу кріоконсервованої й нативної суспензії плаценти (КСП, НСП), на виразність апоптозу в ІКК і модифікацію стану структур ЛГПК при розвитку АІЗ у вигляді ад'ювантного артриту (АА).

Для досягнення мети були поставлені такі задачі:

Провести порівняльне вивчення структурно-функціональної організації центральних та периферичних органів ЛГПК при АА до i після застосування КСП і НСП.

Вивчити виразність апоптотичних та антиапоптотичних процесів у ІКК органiв ЛГПК експериментальних тварин за фізіологічних умов, а також за умов розвитку АА. кріоконсервування апоптоз аутоімунний захворювання

Дослідити у порівняльному аспекті вплив КСП і НСП на ступiнь розвитку апоптотичних та антиапоптотичних процесів у ІКК тварин з АА.

Оцінити особливості впливу різних режимів кріоконсервування на апоптоз-індукуючий потенціал суспензії плаценти та зіставити його зі зміною її клітинного складу.

Об'єкт дослідження. Апоптотичні й антиапоптотичні процеси у ІКК органів ЛГПК тварин з АА до и після застосування КСП і НСП.

Предмет дослідження. Кріоконсервована та нативна суспензія плаценти.

Методи дослідження. У роботі було використано імунологічні, морфологічні, цитологічні та біохімічні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше встановлено, що за умов розвитку АА як КСП, так й НСП знижують рівень експресії антиапоптотичного білка Bcl-2 та підсилюють апоптоз ІКК. На підставі морфологічної оцінки, кількісного урахування Хехст+-клітин і електрофоретичного аналізу фрагментації ДНК, показано, що у період маніфестації основних клінічних проявiв АА відзначається виразне пригнічення апоптозу ІКК як у центральних - тимусі, так і периферичних - пахових лімфовузлах, перитонеальній порожнині та периферичній крові, компартментах iмунноп системи.

У результаті виконаних досліджень отримані нові дані, що свідчать про особливості коригуючої активності КСП і НСП щодо апоптотичних та антиапоптотичних процесів у ІКК. Істотним є встановлений факт більш виразного апоптоз-індукованого потенціалу КСП у порівнянні з НСП. Однак у віддалені строки посттрансплантаційного періоду проапоптозна активність КСП знижувалась. Встановлено, що така феноменологія проявлення функціональної активності КСП детермінується зміною її клітинного складу після кріоконсервування, а саме зниженням вмісту клітин Кащенко-Гофбауера (ККГ).

Уперше в порівняльному аспекті оцінено імунокоригуючий ефект КСП і НСП. Показано, що у динаміці розвитку АА застосування суспензії плаценти купірує у мишей-реципієнтів клінічні ознаки артриту, стимулює гемопоез та інгібує розвиток гіперплазії тимусу, селезінки і лімфатичних вузлів.

Практичне значення одержаних результатів. Використання різних режимів кріоконсервування продемонструвало роль компонентного складу суспензії плаценти (СП) у проявленні її багатовекторної функції. Розроблено метод кріоконсервування СП, що забезпечує високе збереження її клітинного складу. Кріоконсервована у відповідності до цього методу СП виявляла пролонгований апоптоз-індукований потенціал в організмі реципієнта та зберігала імунокоригуючий ефект. Одержані дані доповнюють знання щодо молекулярних механізмів розвитку АІЗ, реалізації апоптозу, а також сприяють розшифровці терапевтичної дії ПЕФПК. Представлені результати можуть бути використані при розробці нових та оптимізації існуючих методів ефективного лікування патологій, у розвитку яких патогенетичну значущість мають порушення процесів апоптозу. Встановлені факти підкреслюють перспективність застосування СП як препарату-коректору імунокомпетентної сфери організму при патологічних станах аутоімунної природи, а саме аутоімунних артритах.

Особистий внесок здобувача полягає в розробці методів, ініціюванні та здійсненні усієї представленої серії досліджень щодо вивчення особливостей впливу КСП і НСП на виразність апоптозу в ІКК і модифікацію стану структур ЛГПК при розвитку АІЗ у вигляді АА.

В опублікованих із співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

у роботах [1, 8, 9, 13] в участі у теоретичній та практичній розробці методів вивчення стану органів ЛГПК експериментальних тварин при АА до та пiсля введення нативних і кріоконсервованих препаратів плаценти; в обґрунтуванні можливості використання ПЕФПК як коректорів АІЗ;

у роботах [2, 3, 5, 6,] в оцінці рівня фагоцитарної активності клітин та зміни гематологічних показників у тварин на етапах розвитку АА; здiйснено криоконсервування СП та пп введення експериментальним тваринам;

у роботах [4, 7, 10] в проведенні аналізу апоптозу ІКК методами світлової мікроскопії шляхом фарбування цитологічних препаратів азур-еозином-ІІ та методом люмінесцентної мікроскопії з використанням ДНК-тропного барвника Хехст-33342; у вивченні інтенсивності апоптотичних процесів за допомогою аналізу міжнуклеосомної фрагментації ДНК тимоцитів методом пульс-електрофорезу та аналізу антіапоптотичних процесів за рівнем експресії антиапоптотичного білка Вс1-2;

у роботах [9, 11, 12] у здійсненні індукції АА та аналізу структурно-функціональних показників тимусу до та після введення НСП i КСП тваринам з патологією; у проведенні узагальнення результатів дослідження.

Апробація результатів диссертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на конференціях молодих учених ІПКіК НАН України “Холод у бiологiп i медицинi” (м. Харків, 2002 і 2003 рр.), міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія ”, (м. Харків, 2003 р.), науково-практичній конференції “Сучасні напрямки розвитку ендокринології (Другі Данілевські читання)” (м. Харків, 2003 р.), науково-практичній конференції “Фундаментальнi питання експериментальноп та клiнiчноп ендокринологiп (Четвертi Данiлевськi читання)”, (м. Харків, 2005 р.).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опублiковано 6 статтей у фахових виданнях, 6 тез, отримано патент на корисну модель.

Об'єм та структура дисертації. Матеріали викладено на 141 стор., з яких 116 стор. основного змісту. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень та їхнього обговорення, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел літератури у кількості 230 на 25 стор. Роботу проілюстровано 22 рисунками, 6 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження

Експериментальні дослідження проведено на мишах-самцях лінії СВА вагою 18-20 г, що утримувалися за стандартних умов віварію ІПКіК НАНУ. Тварини були розподілені на 5 груп. Контролем служила 1-а група здорових мишей. У тварин 2, 3, 4 та 5-ї групи індукували АА. Мишам 3 та 4-ї групи внутрішньовенно уводили відповідно НСП і КСП. У якості контролю специфічної дії СП тваринам 5-ї групи вводили клітини печінки дорослих тварин (КДП).

Усі маніпуляції з тваринами здійснювали згідно з положенням „Європейської конвенції захисту хребетних тварин, які використовуються з експериментальною та іншою науковою метою” (м. Страсбург, 1985).

Ад'ювантний артрит, що є експериментальною формою РА, індукували за методом Пiрсона субплантарним уведенням повного ад'юванту Фрейнда [Pearson C.M., 1963]. Уведення НСП і КСП 19-ї доби гестації проводили в день ініціації патології внутришньовенно в об'ємі 0,2 мл, що містив 1х106 кл/мл. КДП уводили в аналогічному СП об'ємі і концентрації клітин.

Суспензію плаценти готували згідно методичним рекомендаціям [Грищенко B.I. та ін., 1997]. Для цього виділену за стерильних умов плаценту, тричі відмивали від слизу та крові фізіологічним розчином, після чого отримували СП методом механічної дисоціаціі у гомогенізаторі Поттера у співвідношенні 1:2 (плацента: фізіологічний розчин) до отримання гомогенної маси. Одержану суспензію пропускали через капроновий фільтр та голки діаметру, що зменшуюється. Кількість клітин у суспензії підраховували у камері Горяєва. Для визначення морфологічного складу клітин плаценти робили мазки, фіксували їх метанолом та фарбували за методом Романовського [Меньшиков В.В., 1987].

Згідно даних літератури [Грищенко B.I. та ін., 1997], швидкість 10С/хв є оптимальною для заморожування СП. Виходячи з цього, у першій серії експериментів після 20 хв еквілібрації СП із кріопротектором при кімнатній температурі зразок заморожували зі швидкістю 10С/хв до -400С з подальшим занурюванням в рідкий азот (режим К1). У другій серії експериментів було використано аналогічний режим заморожування з деякими модифікаціями процесу підготовки зразку до кріоконсервування:

Замість перемішування клітини СП „нашаровували” на кріопротектор.

Приготований „сендвіч” клітини-кріопротектор без попередньої еквілібрації при кімнатній температурі поміщували до програмного заморожувача “Cryoson” (Німеччина), та охолоджували до 00С. При цьому швидкість охолодження підбиралася таким чином, щоб час проходження цього температурного інтервалу співпадав з рекомендованим терміном еквілібрації клітин СП із кріопротектором (режим К2).

Відігрівання СП здiйснювали у водяній бані при температурі 420С протягом 45-50 с при постійному перемішуванні до повного зникнення кристалів льоду.

Збереження клітин СП після гомогенізації та кріоконсервування оцінювали загальноприйнятим експрес-методом за допомогою 0,2% водного розчину трипанового синього [Костенко Е.А., 1968].

Для вивчення апоптозу було використано морфологічні та біохімічні методи дослідження. Апоптоз клітин перитонеальної порожнини та периферичної крові оцінювали за методом світлової мікроскопії [Меньшиков В.В., 1987]. Апоптотичні клітини в тимусі та пахових лімфовузлах вивчали за методом люмінесцентного аналізу, для чого клітини інкубували з ДНК-тропним барвником - Хехст 33342 [Belloc F. еt al., 1994]. Паралельно з зазначеними, для виявлення апоптотичних клітин було використано метод пульс-електрофорезу, який дозволяє визначити міжнуклеосомну фрагментацію ДНК [Allen P.D. еt al., 1998]. Електрофоретичне розділення фрагментів ДНК виконували в 1% агарозному гелі при напруженні 75 В протягом 8 годин. Візуалізацію результатів розділення ДНК, що було забарвлено етидіумом бромідом, проводили за допомогою ультрафіолетової лампи “Флускоп” при довжині хвилі 360 нм із подальшим виведенням інформації на монітор через відеокамеру “Panasonic”. Для кількісної оцінки вмісту апоптотичних клітин у тимусі, лімфовузлах, перитонеальній порожнині та периферичній крові використовували індекс апоптозу (ІАп), який розраховували за формулою:

[Фильченков А.А. и др., 1999].

Антиапоптозний потенціал ІКК визначали за рінем експресії в клітинах білка Вcl-2 за допомогою методу люмінесцентної мікроскопії [Hockenbery D., et a1. 1990].

Оцінку тяжкості перебігу АА проводили за клінічними ознаками (зміна ваги тіла тварин, динаміка набряку суглобів) на 7-у (гостра фаза) і 21-у (хронічна фаза) добу розвитку патології. Розмір набряку характеризував індекс артриту (ІА), що є відношенням кола дослідного суглобу до кола контрольного суглобу.

Дослідження ЛГПК експериментальних тварин проводили за допомогою імунологічних методів, а саме: вивчення адгезивної здатності та фагоцитарної активності клітин перитонеальної порожнини [Лобасенко Н.П., 1979], а також фагоцитарної активності клітин периферичної крові [Меньшиков В.В., 1987]. Стан гуморальної ланки імунітету оцінювали за концентрацією циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у сироватці крові [Стручков П.В. и др., 1985]

Також було використано гематологічні методи дослідження, що включають вивчення швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ), кількості лейкоцитів, еритроцитів та вмісту гемоглобіну [Меньшиков В.В., 1987].

Як додаткові методи оцінки стану ЛГПК застосовували індекси лімфовузлів, селезінки та тимусу, які розраховували за формулою:

Для об'єктивної оцінки терапевтичної ефективності КСП і НСП застосовували індекс сумарного ступеня відхилення показників (ССВ) [Гольцев А.Н. и др., 2004] та показник ступеня пригнічення запалення (СПЗ) [Саратиков А.С. и др., 1983].

Статистичну обробку отриманих експериментальних даних проводили за методом Ст'юдента-Фішера.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Субплантарне введення повного ад'юванту Фрейнда викликало у мишей дослідних груп розвиток експериментального АА, основними клінічними симптомами якого є поява еритематозності та набряку регіональних до місця введення ад'юванта суглобів [Давыдова Т.В. и др.,1978; Мiщенко О.Я. и др., 2001]. Перший максимальний пік набряку спостерігався на 6-у добу після ініціації патології (IА=1,6±0,10), що співпадало з гострим періодом перебігу захворювання; другий пік був більш виразним та приходився на 12-у добу (IА=1,7±0,12), характеризуючи початок хронічної фази запального процесу [Копьева Т.Н., 1973].

Аналіз динаміки зміни клініко-лабораторних показників дав можливість встановити, що поряд зі збільшенням виразності клінічних проявів захворювання, а саме, з підвищенням ІА, у тварин з АА спостерігались закономірні зміни гематологічних показників. Так, на 7-у добу після індукції патології на тлі лейкоцитозу, який було зумовлено підвищенням кількості сегментоядерних нейтрофілів, відзначалося достовірне у порівнянні з контролем збільшення ШОЕ та ЦІК. У перитонеальній порожнині дворазове підвищення загальної кількості клітин супроводжувалось майже дворазовим збільшенням проценту адгезивних клітин. Виявлено активацію клітин моноцитарно-фагоцитарної системи перитонеальної порожнини i периферичної крові. На 14 та 21-у добу розвитку патології лейкоцитоз у крові зберігався, але відзначалась тенденція до зменшення його виразності та появлення ознак гіпохромної анемії. Зміни вмісту клітин у перитонеальній порожнині, їх фагоцитарної активністі та адгезивного потенціалу, а також динаміка фагоцитарної активності клітин периферичної крові відображали зниження активності запального процесу. Вміст ЦІК у сироватці крові залишався на високому рівні, як у гострий, так і у хронічний періоди розвитку захворювання.

Уведення повного ад'юванту Фрейнда індукувало імунопатологічні процеси, що призводили до структурних змін в органах імуногенезу. Так, на 7-14 доби розвитку АА відзначалась гіпоплазія тимусу, що характерно для постстресорного стану органу [Горизонтов П.Д. и др., 1983; Цейликман О.Б. и др., 2005]. На 21-у добу розвитку АА в тимусі розвивалась гіперплазія. У селезінці та лімфовузлах вона мала місце протягом усього терміну спостереження. Аналіз динаміки змін індексів цих органів дозволив встановити, що їх гіперплазія є наслідком розростання з'єднувально-тканинних структур строми органів.

Трансплантація мишам-реципієнтам препаратів плаценти призводила до нормалізації якісних і кількісних характеристик досліджених показників. На тлі зменшення ІА з'явилась тенденція до зниження загальної кількості лейкоцитів, підвищення кількості еритроцитів та вмісту гемоглобіну, а також зменшення рівня ЦІК. Поряд з цим, наприкінці дослідного періоду спостерігалась нормалізація фагоцитарної активності клітин моноцитарно-фагоцитарної системи. Трансплантація КСП і НСП попереджувала розвиток гіперплазії досліджених органів. При цьому треба відзначити, що дія КСП за низкою характеристик відрізнялась від дії НСП. Так, на 21-у добу спостерігання терапевтичний ефект КСП трохи знижувався у порівнянні з НСП, зокрема СПЗ після введення НСП складала на 21-у добу 13±0,99%, а після введення КСП 7,4±0,82%. Очевидно, що КСП и НСП реалізують свій функціональний потенціал не тільки по-різному в залежності від органу, але й у різному ступені в одному і тому ж органі ЛГПК. У першу чергу, це може свідчити про дозозалежний ефект регуляції стану органо-тканинних структур ЛГПК при розвитку в них патологічного процесу, а отже, про присутність різних концентрацій активних речовин у КСП і НСП.

Запальний процес при АА є відображенням причинно-наслідкових зв'язків, що проявляються у визначеному ланцюгу послідовних патологічних змін. Отже, розуміння того, що у даному випадку є причиною, а що наслідком, дозволить розкрити сутність тих патологічних процесів, які обумовлюють ті або інші показники. Таким чином, наступним етапом роботи з'явилось вивчення у порівняльному аспекті динаміки змін структурно-функціональних характеристик ЛГПК і механізму реалізації про- та антиапоптотичного каскаду в ІКК. Оскільки деструктивні зміни хряща при АА у першу чергу обумовлені лейкоцитарною інфільтрацією [Копьева Т.Н., 1980], нас цікавив ступінь залучення до апоптозу нейтрофільних гранулоцитів у периферичній крові та моноцитів/макрофагів у перитонеальній порожнині. Було відзначено, що на 7, 14 та 21-у добу після індукції патології у тварин із АА на тлі достовірного (у порівнянні з контролем) підвищення кількості нейтрофільних гранулоцитів у периферичній крові та моноцитів/макрофагів у перитонеальній порожнині відбувається дворазове, а іноді триразове зниження їх ІАп (рис.1). При цьому, на тлі зменшення ІАп дослідних клітин спостерігалось підвищення IА, відсотка адгезивних клітин та загальної кількостi лейкоцитів.

Трансплантація КСП і НСП достовірно підвищувала ІАп у порівнянні з нелікованими тваринами. У той же час зменшувалась активність запального процесу, що проявлялось у зниженні IА, проценту адгезивних клітин у перитонеальній порожнині та виразності лейкоцитозу.



Рис. 1. Динаміка запального процесу та апоптотичної активності клітин перитонеальної порожнини та периферичної крові при АА до та після введення КСП і НСП.

Примітки: 1. За 100% прийнято показники контрольної групи; 2. 1-АА,

2-АА+НСП, 3-АА+КСП, 4-АА+КДП.

Встановлено, що у перитонеальній порожнині та периферичнiй крові протягом перших двох тижнів після введення КСП спостерігався максимально виразний апоптоз-індукований ефект препарату. Суттєвим є й те, що ступінь активності кріоконсервованого матеріалу у цей період був вище у порівнянні з НСП. Це підкреслює, що після кріоконсервування СП набуває більш виразної проапоптозної активності. Однак, вже на 21-у добу спостерігання КСП виявилась менш ефективною щодо індукції апоптозу досліджених клітин. Згідно з думкою авторів [Гольцев А.Н. и др., 2003], це може бути наслідком, по-перше, модифікації антигенного спектру та імуногенних властивостей клітин СП після циклу заморожування-відігріву, по-друге, селективного впливу факторів кріоконсервування на клітини СП, та, відповідно, спектр продукованих ними регуляторних медіаторів.

У зв'язку з тим, що гіперплазія органів імуногенезу та хронізація запального процесу при АА є наслідком зміни нормального співвідношення проліферації та апоптозу, а нечисленні спроби встановити механізми, з якими пов'язана стійкість клітин до апоптозу, не призвели до однозначних висновків, ми дослідили ступінь і характер апоптотичних та антиапоптотичних процесів у ІКК тимусу та лімфовузлів (табл.1).

Згідно даних, що представлені у табл. 1, у тварин із АА відзначалося достовірне у порівнянні з контролем зниження вмісту Хехст+- клітин (клітини, з характерним для апоптозу світінням) у тимусі на 7 і 14-у добу майже у 2 рази, на 21 добу - у 6 разів. У лімфоцитах лімфовузлів - відповідно у 3, 1,5 та 3 рази. Тобто, разом з хронізацією запального процесу кількість клітин, у яких розвивається апоптоз, значно знижувалась як у тимусі, так й у лімфовузлах, незважаючи на те, що динаміка та виразність цього процесу мали різницю у досліджених органах у різні строки. Якщо у тимусі спостерігалась чітка тенденція до мінімізації виразності апоптозу під час пролонгації терміну розвитку АА, то у лімфовузлах такої тенденції не відзначалося. Зниження кількості Хехст+-клітин у досліджених органах супроводжувалось підвищенням рівня клітин, що експресують білок Bcl-2. Цей факт свідчить на користь того, що пригнічення апоптозу у тестованих клітинах при АА відбувається на тлі активації антиапоптотичного каскаду, що підтверджується збільшенням вмісту антиапоптотичного білка Bcl-2. Можливо, що за цієї причини під час гель-електрофорезу нами не було виявлено фрагментації ДНК тимоцитів у тварин із АА.

Разом з цим, зіставлення кількісного вмісту в досліджених органах клітин у стані апоптозу при розвитку АА та виразності в них ступеня експресії Bcl-2 свідчить про відсутність чітких корелятивних зв'язків між цими показниками. Іншими словами, зниження вмісту Хехст+- клітин у тимусі з 7-ї по 21-у добу не співпадало з такою ж динамікою кількості клітин у лімфовузлах, більш того, не корелювала зі ступенем активації експресії Bcl-2 білка в клітинах цих органів. Даний факт, можливо, свідчить про те, що, по-перше, при аутоімунній патології, зокрема при АА, розвиваються різного ступеня порушення балансу між про- і антиапоптоз-індукованими сигнальними системами в різних органо-тканинних субстратах iмунноп системи. По-друге, відсутність зазначеної кореляції підтверджує існування альтернативних шляхів індукції та реалізації процесу апоптозу, так саме як й антиапоптотичних каскадів, крім участі Bcl-2 білка.

Таблиця 1

Динамика зміни кількості Хехст+- клітин і клітин, що експресують Bcl-2

при ад'ювантному артриті до и після введення НСП і КСП

доба	Досліджений показник	Досліджені клітини	1-а група	2-а група	3-я група	4-а група	5-а група
7 доба	Кількість Хехст+-клітин	тимоцити	100±4,6 #	56±2,3 *	120±5,4 *#"	83±3,8 *#	61±5,6 *
		лімфоцити лімфовузлів	100±5,1 #	33±1,2 *	75±4,3 *#"	90±8,8 #	35±2,5 *
	Кількість Bcl-2+- клітин	тимоцити	100±7,4 #	150±11,2 *	93±4,4 #"	120±5,3 *#	148±6,6 *
		лімфоцити лімфовузлів	100±3,2 #	178±7,4 *	102±3,1 #"	89±7,6 *#	180±2,4 *
14 доба	Кількість Хехст+-клітин	тимоцити	100±5,4 #	53±2,4 *	92±4,7 #"	80±5,6 *#	56±3,1 *
		лімфоцити лімфовузлів	100±2,5 #	66±3,8 *	130±9,2 *#"	150±7,1 *#	69±1,5 *
	Кількість Bcl-2+- клітин	тимоцити	100±4,8 #	125±2,6 *	110±6,3 #	110±7,8 #	125±5,3 *
		лімфоцити лімфовузлів	100±3,2 #	118±5,4 *	98±2,5 #	95±6,2 #	119±6,7
21 доба	Кількість Хехст+-клітин	тимоцити	100±8,2 #	17±1,1 *	90±5,4 #	81±3,6 *#	20±1,9 *
		лімфоцити лімфовузлів	100±2,7 #	34±2,8 *	107±4,3 #"	60±3,0 *#	38±2,6 *
	Кількість Bcl-2+- клітин	тимоцити	100±4,7 #	138±8,6 *	120±5,5 *#	110±6,3 #	139±4,3 *
		лімфоцити лімфовузлів	100±6,6 #	136±8,2 *	102±6,3 #	112±5,4 #	134±5,8 *

Примiтки:

*- різниця достовірна у порівнянні з контрольною групою (1-а група), що було прийнято за 100%;

# - різниця достовірна у порівнянні з показниками 2-ї групи;

" - різниця достовірна між 3 і 4-ю групами; при р<0,05

Після трансплантації КСП і НСП у мишей-реципієнтів відзначалась стимуляція апоптотичних процесів, яка морфологічно підтверджувалась підвищенням вмісту Хехст+-клітин у досліджених органах, а біохімічно - появленням міжнуклеосомної фрагментації ДНК. Важливо також, що після терапії препаратами плаценти до контрольних значень наближувалась експресія Bcl-2. На етапі хронічного розвитку АА (21-а доба) характер впливу введених препаратів мав свої особливості. Якщо НСП зберігала свою активність щодо здатності індукувати апоптоз в ІКК у віддалені строки посттрансплантаційного періоду, то активність КСП значно знижувалась як у тимусі, так і в лімфовузлах, що насамперед виявлялося у зниженні кількостi Хехст+- клітин та присутності дуже слабкої, можливо оборотної, фрагментації ДНК.

Таким чином, при вивченні апоптозу ІКК у тварин з АА було виявлено, що після кріоконсервування СП зберігає апоптоз-індукований потенціал, про що свідчить суттєве підвищення ІАп на 7 та 14-у добу після трансплантації. Однак, на 21-у добу розвитку патології спостерігалося зниження цього потенціалу поряд із наростанням виразності клінічних симптомів АА. У зв'язку з цим виникла необхідність дослідження причин, що призводять до зменшення коригуючого ефекту КСП, та відпрацювання режиму кріоконсервування СП, який дозволив би максимально зберегти функцію трансплантованого матеріалу. Функціональна повноцінність кріоконсервова-ного біологічного об'єкту, що представляє собою гетерогенну клітинну популяцію, по-перше, базується на збереженні його клітинного складу. Через те, що плацента містить клітини, що відрізняються за своїми морфологічними та функціональними характеристиками, тобто мають відмінності у резистентності до факторів кріопошкодження, ми переслідували мету збереження компонентного складу плаценти. Після аналізу клітин нативної плаценти було показано, що вона на 20-23% складається з високодиференційованих макрофагоподібних ККГ. Інші 77-80% - малодиференційовані мезенхімальні та плазматичні клітини, фібробласти, ретикулоцити. Функціональний статус ККГ говорить про те, що серед усієї популяції клітин плаценти саме вони є найбільш кріочутливими. У зв'язку з цим, першорядною задачею, яку ми поставили перед собою, було забезпечення збереження ККГ протягом кріоконсервування.

Як видно з представлених даних (рис. 2), кількість клітин ККГ у НСП складала 23±1,9%. Кріоконсервування СП у режимі К1 не забезпечувало такого збереження ККГ, кількiсть яких була достовірно нижче у порівнянні з НСП та складала 9,5±2,3%.

Рис. 2. Вплив різних режимів кріоконсервування на кількісний вміст клітин Кащенко-Гофбауера та збереження клітин плаценти.

Примiтки:

* - різниця достовірна у порівнянні з НСП;

# - різниця достовірна у порівнянні з КСП-К2; (при р<0,05)

Режим К2 був більш ефективним щодо цього показника, кількість ККГ була на рівні 19,5±1,7%. При цьому і життєздатність клітин, кріоконсервованих за режимом К2, була на 12% вище у порівнянні зі збереженням клітин після використання режиму К1 (94±2,8% і 82±1,5% відповідно; р<0,05). Отже, кріоконсервування СП за запропонованим нами методом забезпечувало більш високе збереження як усієї популяції клітин плаценти, так і, зокрема, ККГ.

Очевидно, реалізація функції кріоконсервованого матеріалу за умов in vivo є надійним тестом щодо атестації повноцінності трансплантованого біологічного об'єкту. У зв'язку з цим, у подальшій серії експериментів було досліджено у порівняльному аспекті терапевтичну ефективність СП, кріоконсервованої за двома режимами щодо відновлення структурно-функціонального стану органів ЛГПК, а також її здатність модулювати апоптотичні процеси в ІКК у тварин з АА.

Як видно з наведених даних (рис. 3), після трансплантації мишам НСП (3-я група) відстежувалась чітка тенденція до зниження (у порівнянні з нелікованими тваринами) таких показників як: ІА, кількість адгезивних клітин, лейкоцитів та вмісту клітин у перитонеальній порожнині.

Рис. 3. Вплив трансплантації кріоконсервованої за різними режимами

СП на виразність запального процесу та апоптотичну активність клітин перитонеальної порожнини та периферичної крові при АА на 21-у добу спостереження.

Примітка. Показники контрольної групи тварин (1-а група) прийнято за 100%.

При цьому у перитонеальній порожнині i периферичній крові у тварин 3-ї групи достовірно (у порівнянні з нелікованими тваринами) підвищувався вміст клітин, що знаходились у апоптозі. Важливо відзначити, що ССВ вивчених показників (ІА, кількість адгезивних клітин, клітин у перитонеальній порожнині, лейкоцитів у периферичній крові) у тварин з АА складала 4,8 од., а після введення НСП - 1,3 од.

Лікування мишей СП, кріоконсервованих за режимом К1 (4-а група), призводило до недостовірного зниження ІА та кількості адгезивних клітин, а також достовірного - кількості лейкоцитів та клітин у перитонеальній порожнині. Разом з цим, трансплантація КСП-К1 підвищувала відсоток клітин, що знаходились у апоптозі. Однак, ІАп клітин у перитонеальній порожнині і периферичній крові у даній групі був нижче у порівнянні з групою мишей, яких лікували НСП. Незважаючи на це, ССВ досліджених показників у 4-й групі була значно менше, ніж у 2-й та складала 1,9 од. Після лікування тварин з АА КСП-К2 (5-а група) усі досліджені показники у найбільшому ступені наближувались до контрольних. При цьому, в даному випадку спостерігалась більш виразна їх корекція не тільки у порівнянні з 4-ю групою (КСП-К1), але і з 3-ю групою тварин (НСП). Це було чітко підтверджено зміною показника ССВ, який у 5-й групі був найменшим - 0,7 од. Особливої уваги потребує той факт, що ІАп після застосування КСП-К2 був хоч і незначно, але ж на 6-7% вище, ніж після введення НСП. Це підкреслює значущість компонентного складу СП у проявленні її апоптоз-індукуючої активності.

Таким чином, представлені дані демонструють, що запропонований нами метод кріоконсервування СП (режим К2) сприяє збереженню її клітинного складу i забезпечує не тільки збереження її коригуючого ефекту щодо виразності запального процесу при розвитку аутоімунної патології, але й підтримці протягом тривалого часу апоптоз-індукованого потенціалу препарату.

ВИСНОВКИ

Підвищення ефективності методів лікування патологій аутоімунного генезу є по теперішній час актуальною задачею, вирішення якої має суттєву значущість не тільки для біології та медицини, але й у соціальному плані. У зв'язку з цим, не викликає сумнівів необхідність проведення подальших досліджень, спрямованих на виявлення клітинних та молекулярних основ розвитку таких патологій.

У дисертаційній роботі оцінено стан ключових ланок процесу апоптозу в iмунокомпетентних клiтинах експериментальних тварин з ад'ювантним артритом i проведено порівняльний аналіз характеру впливу на них трансплантації суспензії клітин кріоконсервованої та нативної плаценти. Зiставлені ступінь розвитку апоптозу, стан клітинно-тканинних структур лiмфгемопоетичного комплексу та клінічна маніфестація патології до і після використання суспензії плаценти.

Комплексна оцiнка стану клiнiчного статусу, гематологiчних та iмунологiчних показникiв продемонструвала, що введення повного ад'юванту Фрейнда викликає значне збільшення значень індексу артрита на тлі лейкоцитозу, підвищення ШОЕ, вiдсотка адгезивних клітин, кількості ЦІК та збільшення фагоцитарної активності клітин моноцитарно-фагоцитарної системи, характерної для клінічних ознак розвитку ревматоїдного артриту в клініці.

Встановлені закономірності динаміки зміни структурної організації центральних та периферичних органiв імунної системи. Так, у тимусі на 7-у добу мала місце гіпоплазія, яка на 21-у добу змінювалась на гіперплазію. У селезінці та лімфовузлах гіперплазія розвивалась протягом усього періоду спостереження.

На підставі морфологічної оцінки, кількісного пiдрахунку Хехст+-клітин і електрофоретичного аналізу фрагментації ДНК, встановлено виразне пригнічення апоптотичної активності імунокомпетентних клiтин у тимусі, лімфовузлах, перитонеальній порожнині і периферичній крові у період маніфестації основних клінічних проявів ад'ювантного артриту.

Пригнічення апоптозу iмунокомпетентних клiтин відбувається на тлі активації антиапоптотичного каскаду, що підтверджується збільшенням вмісту в них антиапоптотичного білка Bcl-2 та свідчить про присутність зворотної кореляції між цими процесами.

Трансплантація кріоконсервованої та нативної суспензії плаценти при ад'ювантному артритi супроводжувалась нормалізацією клінічних, гематологічних та імунологічних показників. Суспензія плаценти купіровала клінічні ознаки ад'ювантного артриту, стимулювала гемопоез та інгібувала розвиток гіперплазії тимусу, селезінки і лімфовузлів.

Розроблено метод кріоконсервування суспензiп плаценти, який забезпечує високе збереження в нiй клiтин Кащенко-Гофбауера. Встановлена участь клiтин Кащенко-Гофбауера у пролонгацiп апоптоз-iндукованого потенціалу та імуномодулюючого ефекту крiоконсервованоп суспензiп плаценти у віддалені строки посттрансплантаційного періоду.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Гольцев А.Н., Останкова Л.В., Рассоха И.В. Вклад апоптоза в патогенез ревматоидного артрита. Возможные пути управления процессом // Проблемы криобиологии. - 2002. - №3. - С. 52-59.

Рассоха И.В., Гольцев А.Н., Останкова Л.В., Михалин М.А. Показатели состояния клеток моноцитарно-фагоцитарной системы как характеристика изменения общей иммунореактивности организма после применения продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса // Проблемы криобиологии. - 2002. - №4. - С. 63-67.

Гольцев А.Н., Рассоха И.В., Луценко Е.Д., Дубрава Т.Г., Останкова Л.В. Межклеточные взаимодействия в иммунокомпетентной сфере при ревматоидном артрите после применения гемопоэтических клеток эмбриональной печени // Проблемы криобиологии. - 2003. - №3. - С. 45-54.

Гольцев А.Н., Грищенко В.И., Рассоха И.В., Останков М.В. Возможность использования продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса как корректора апоптотических процессов при аутоиммунных заболеваниях // Проблемы криобиологии. - 2003. - №4. - С. 41-49.

Рассоха И.В., Гольцев А.Н., Гурина Т.М. Влияние разных режимов криоконсервирования на способность суспензии плаценты проявлять иммунокорригирующую активность при лечении адъювантного артрита у мышей // Проблемы криобиологии. - 2004. - №1. - С. 21-29.

Рассоха И.В., Гольцев А.Н. Особенности проявления иммунокорригирующей активности суспензии плаценты при развитии адъювантного артрита у мышей // Пробл. мед. науки та освiти. - 2005. - №1. - С. 55-57

Декларацiйний патент № 4205, МПК 7 А61К35/50. Заявл.12.03.2004; Опубл.17.01.2005; Бюл. №1 / “Спосiб корекцiп апоптозу” Грищенко В.I., Гольцев А.М., Рассоха I.В.

Гольцев А.Н., Михалин М. А., Останкова Л.В., Дубрава Т.Г., Луценко Е.Д., Рассоха И.В., Горская А.Ю. Состояние лимфогемопоэтической системы организма после трансплантации продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса// Проблемы криобиологии. - 2001. - №3. - С. 40-41.

Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Бабенко Н.Н., Рассоха И.В., Горская А.Ю. Состояние тимуса в патогенезе аутоиммунных заболеваний и его коррекция продуктами эмбриофетоплацентарного комплекса // Тези доповiдей III Мiжнародної науково-практичної конференцiї ”Наука i соцiальнi проблеми суспiльства: медицина, фармацiя, бiотехнологiя”, Харкiв, Україна, 2003. - С. 252.

Гольцев А.Н., Рассоха И.В., Останкова Л.В. Дубрава Т.Г., Луценко Е.Д. Интенсивность апоптотических процессов как характеристика степени развития и эффективности лечения аутоиммунных заболеваний продуктами эмбриофетоплацентарного комплекса // Тези доповiдей III Мiжнародної науково-практичної конференцiї ”Наука i соцiальнi проблеми суспiльства: медицина, фармацiя, бiотехнологiя”, Харкiв, Україна, 2003. - С. 254

Гольцев А.Н., Рассоха И.В., Горская А.Ю., Бабенко Н.Н. Коррекция состояния центрального органа иммунитета - тимуса продуктами эмбриофетоплацентарного комплекса при аутоиммунных заболеваниях // Збiрник тез науково-практичної конференцiї ”Сучаснi напрямки розвитку ендокринологiї” (Другi Данилевськi читання), Харкiв, Україна, 2003. - С. 46.

Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Останкова Л.В., Луценко Е.Д., Рассоха И.В. Терапевтический потенциал ПФПК. Лечение аутоиммунного артрита. // Iмунологiя та алергологiя. - 2003. - №1. - С. 21-22.

Гольцев А.Н., Рассоха И.В. Перспективы использования препаратов плаценты как модуляторов апоптотических процессов при аутоиммунных заболеваниях // Збiрник наукових робiт науково-практичної конференцiї “ Сучаснi аспекти репродуктологiї, перiнатальної медицини та крiобiологiї ” Харкiв, Україна, 2003. - С. 24.

АНОТАЦІЇ

Рассоха I.B. “Вплив кріоконсервованих продуктів ембріофетоплацентарного комплексу на процеси апоптозу при аутоімунних захворюваннях”. - Рукопис.

Дисертацiя на здобуття наукового ступеня кандидата бiологiчних наук за спецiальнiстю 03.00.19. - крiобiологiя. - Iнститут проблем крiобiологiп i крiомедицини НАН Украпни, Харкiв, 2005 р.

Дисертаційну роботу присвячено встановленню особливостей впливу кріоконсервованої й нативної суспензії плаценти (КСП, НСП), на виразність апоптозу в iмунокомпетентних клітинах (ІКК) і модифікацію стану структур лiмфогемопоетичного комплексу (ЛГПК) при розвитку аутоiмунних захворювань у вигляді ад'ювантного артриту (АА).

При дослідженні динаміки та механізму розвитку патологічного процесу було встановлено, що у період маніфестації основних клінічних ознак АА відзначалось пригнічення апоптозу у всіх субстратах імунної системи. У роботі вперше показано, що пригнічення апоптозу в імунокомпетентних клітинах при АА відбувається на тлі активації антиапоптотичного каскаду, що підтверджувалось підвищенням вмісту в них антиапоптотичного білка Bcl-2. Препарати плаценти за умов розвитку дизрегуляторного стану імунокомпетентної сфери виявили високу імуномодулюючу активність. Трансплантація КСП і НСП сприяла підтримці клітинного та тканинного гомеостазу, що проявилось у здатності плаценти коригувати співвідношення між апоптотичними та антиапоптотичними процесами.

Розроблено метод кріоконсервування суспензiп плаценти, який забезпечує високе збереження в нiй клiтин Кащенко-Гофбауера. Встановлена участь клiтин Кащенко-Гофбауера у пролонгацiп апоптоз-iндукованого потенціалу та імуномодулюючого ефекту крiоконсервованоп суспензiп плаценти у віддалені строки посттрансплантаційного періоду.

Ключові слова: кріоконсервування, суспензія плаценти, апоптоз, ад'ювантний артрит, імунокомпетентні клітини, імунна система, лімфогемопоетичний комплекс.

Рассоха И.В. “Влияние криоконсервированных продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса на процессы апоптоза при аутоиммунных заболеваниях”.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2005.

Диссертационная работа посвящена установлению особенностей влияния криоконсервированной и нативной суспензии плаценты (КСП, НСП) на выраженность апоптоза в иммунокомпетентных клетках (ИКК) и модификацию состояния структур лимфогемопоэтического комплекса (ЛГПК) при развитии аутоиммунных заболеваний в виде адъювантного артрита (АА).

В результате проведенных экспериментальных исследований установлено, что в период острого (7-е сутки) и хронического (14-е и 21-е сутки) течения АА у мышей отмечались выраженные в разной степени изменения гематологических, иммунологических показателей, а также изменения в центральных и периферических органах ЛГПК.

При изучении динамики и механизма развития патологического процесса на основании морфологического анализа, количественного учета Хехст+-клеток и электрофоретического анализа фрагментации ДНК было установлено, что в период манифестации основных клинических признаков АА отмечалось угнетение апоптоза во всех субстратах иммунной системы. В частности, было зарегистрировано существенное снижение индекса апоптоза нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, моноцитов/макрофагов перитонеальной полости, а также уменьшение количества Хехст+-клеток (маркер апоптоза) в тимусе и в лимфатических узлах. Причем, по мере хронизации воспалительного процесса (14-е и 21-е сутки после индукции патологии) количество клеток, погибающих по типу апоптоза, значительно снижалось.

В работе впервые показано, что угнетение апоптоза в тестируемых клетках при АА происходит на фоне активации антиапоптотического каскада, что подтверждалось увеличением содержания в них антиапоптотического белка Bcl-2.

Применяемые в работе препараты плаценты, являющиеся природными биостимуляторами, в условиях развития дисрегуляторного состояния иммунокомпетентной сферы проявили высокую иммуномодулирующую активность: на фоне уменьшения индекса артрита отмечалась тенденция к снижению общего количества лейкоцитов, уменьшению степени экспрессии молекул адгезии, нормализации скорости оседания эритроцитов и снижению уровня циркулирующих иммунных комплексов; наблюдалась положительная динамика восстановления количества клеток в органах иммуногенеза за счет способности суспензии плаценты предотвращать развитие гиперплазии исследуемых органов. Трансплантация КСП и НСП способствовала поддержанию клеточного и тканевого гомеостаза, что проявилось в способности плаценты корригировать соотношение между апоптотическими и антиапоптотическими процессами. При этом проапоптозное действие суспензии плаценты реализовывалось посредством целенаправленного снижения экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2, что, соответственно, приводило к усилению апоптоза иммунокомпетентных клеток и биохимически подтверждалось появлением межнуклеосомной фрагментации ДНК.

Установлено, что клетки криоконсервированной плаценты на протяжении первых двух недель после введения, проявляли максимальный апоптоз-индуцирующий эффект по сравнению с НСП. Это четко подчеркивает, что КСП, в сравнении с НСП, обладает более выраженным проапоптозным действием. Однако КСП на 21-е сутки тестирования оказалась менее эффективной как в отношении интенсификации апоптоза иммунокометентных клеток, так и, соответственно, в отношении снижения проявлений основных клинических симптомов АА, что может быть следствием особенностей функциональной активности клеток после криоконсервирования.

Разработан метод криоконсервирования суспензии плаценты обеспечивающий высокую сохранность в ней клеток Кащенко-Гофбауэра. Установлено участие клеток Кащенко-Гофбауэра в пролонгации апоптоз-индуцирующего потенциала и иммунокорригирующего эффекта криоконсервированной суспензии плаценты в отдаленные сроки посттрансплантационного периода.

Ключевые слова: криоконсервирование, суспензия плаценты, апоптоз, адъювантный артрит, иммунокомпетентные клетки, иммунная система, лимфогемопоэтический комплекс.

Rassokha I.V. “The influence of cryopreserved products of embryo-feto-placental complex on apoptotic processes at autoimmune diseases” -Manuscript.

The thesis for obtaining the degree of candidate of biological sciences on the specialty 03.00.19 - cryobiology. - Institute for problems of cryobiology and cryomedicine of the National academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, 2005.

Revealing the peculiarities of the effect of cryopreserved and native placenta suspension (СSP, NSP) on apoptosis manifestation in immune-competent cells (ICC) and modification of the state of lymphohemopoietic complex at autoimmune diseases development manifested in adjuvant arthritis (AA) was the aim of the study.

During investigation of dynamics and mechanism of pathological process it was determined that apoptosis depression in all substrates of immune system occurred at a period of the manifestation of basic clinical presentations of adjuvant arthritis.

For the first time it was shown that, apoptosis depression in immunocompetent cells at adjuvant arthritis takes place on the background of antiapoptotic cascade activation that verified by the increase of antiapoptotic protein Bcl-2 content. Placenta preparations showed high immunomodulating activity in respect of the normalization of clinical-immunological indices under conditions of development of disregulative state of immunocompetent sphere. Transplantation of cryopreserved and native placenta suspension promoted the maintenance of cellular and tissue homeostasis that became apparent in placenta ability for correction of the ratio between apoptotic and antiapoptotic processes.

Theге was elaborated placenta suspension cryopreservation method, ensuring the high integrity of Kaschenko-Hoffbauer cells. Theге was established participation of these cells in the prolongation of apoptosis-inducing potential and immune-modulating effect of cryopreserved placenta suspension at distant posttransplantation terms.

Key words: cryopreservation, placenta suspension, apoptosis, adjuvant arthritis, immune-competent cells, immune system, lymphohemopoietic complex.

Размещено на Allbest.ru

...