Розробка складу та технології нового комплексного природного препарату з антимікробними та імуномодулюючими властивостями

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я україни

Національний фармацевтичний університет

Шпичак Олег Сергійович

УДК: 615.23:615.014.24:615.32:616.002.5

РОЗРОБКА СКЛАДУ ТА ТЕХНОЛОГІЇ НОВОГО КОМПЛЕКСНОГО ПРИРОДНОГО ПРЕПАРАТУ З АНТИМІКРОБНИМИ ТА ІМУНОМОДУЛЮЮЧИМИ ВЛАСТИВОСТЯМИ

15.00.01 - технологія ліків та організація фармацевтичної справи

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі аптечної технології ліків Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник:

заслужений діяч науки і техніки України, доктор фармацевтичних наук, професор

ТИХОНОВ ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ

Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри аптечної технології ліків

Офіційні опоненти:

доктор фармацевтичних наук, професор

СПИРИДОНОВ ВОЛОДИМИР МИКОЛАЙОВИЧ

Державне підприємство "Державний науковий центр лікарських засобів", замісник головного редактора журналу "Фармаком"

доктор фармацевтичних наук, професор

ГЛАДИШЕВ ВІТАЛІЙ ВАЛЕНТИНОВИЧ

Запорізький державний медичний університет, кафедра технології ліків

Провідна установа:

Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика, кафедра промислової фармації

Захист відбудеться "18" березня 2005 року о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01. при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002. м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий "15" лютого 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук, професор Л.М. Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

комплексний препарат бджолина вогнівка

Актуальність теми. Розширення асортименту готових лікарських засобів має першорядне значення у справі медичного забезпечення населення високоефективними препаратами для лікування ряду захворювань. Вирішенню цієї проблеми сприяє пошук і впровадження нових оригінальних лікарських засобів та науково обґрунтована технологія їх виготовлення на підставі останніх досягнень науки і техніки. Важливу роль у цьому відношенні відіграють сполуки природного походження, зокрема, продукти бджільництва, особливо біомаса великої бджолиної вогнівки (БВБВ) препарати якої виявляють виражену імуномодулюючу та антимікробну активність.

З даних літератури відомо, що на початку ХХ століття видатний російський вчений І.І. Мечников досліджував личинки бджолиної вогнівки з метою створення протитуберкульозної вакцини. Дослідження І.І. Мечникова були продовжені його учнем проф. С.І. Метальниковим, який, вивчаючи імунітет бджолиної вогнівки, продемонстрував надзвичайно високу стійкість її личинок по відношенню до мікобактерій туберкульозу та деяких інших патогенних мікроорганізмів.

В літературних джерелах є також відомості про застосування в терапії органів дихальної системи та деяких форм туберкульозу лікарської рослинної сировини (ЛРС), яка підсилює фармакологічну дію препаратів означеної направленості та знижує їх побічні ефекти.

У зв'язку з цим, розробка складу та технології нового природного комплексного препарату у вигляді складної настойки на основі БВБВ та ЛРС є актуальною.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідницьких робіт Національного фармацевтичного університету (№ держреєстрації 0103U000476) та за пріоритетним Державним замовленням МОЗ України "Створення та впровадження в медичну практику протитуберкульозних препаратів на основі похідних хіноліну, його фторованих аналогів і прополісу" (№ держреєстрації 0102U0041197).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є теоретичне і експериментальне обґрунтування складу та розробка технології комплексного лікарського препарату на основі БВБВ та ЛРС у формі складної настойки.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

§ проаналізувати і узагальнити сучасні дані літератури щодо застосування природних імуномодулюючих засобів в терапії захворювань верхніх дихальних шляхів та туберкульозу;

§ розробити та затвердити технічні умови на БВБВ;

§ провести біофармацевтичні дослідження з метою обґрунтування оптимального складу комплексного препарату;

§ розробити технологію лікарського препарату у вигляді складної настойки на основі БВБВ та ЛРС;

§ вивчити фізико-хімічні властивості, провести якісне та кількісне визначення біологічно-активних речовин, встановити термін, умови зберігання та стабільність настойки;

§ розробити проекти аналітичної нормативної документації (АНД) та технологічного регламенту на лікарський препарат;

§ провести фармакологічні та мікробіологічні дослідження комплексного препарату: визначити імуномодулюючу, антимікробну, протитуберкульозну дію, та гостру і хронічну токсичність досліджуваного лікарського препарату.

Об'єкт дослідження. Об'єктом дослідження є комплексний препарат у формі складної настойки на основі БВБВ та ЛРС.

Предмет дослідження. Предметом дослідження є розробка складу та технології комплексного препарату з імуностимулюючою, антимікробною та протитуберкульозною дією.

Методи дослідження. Визначення фізико-хімічних, технологічних, мікробіологічних та статистичних показників одержаного препарату проводили за загальновизнаними методиками. Для ідентифікації препарату використовували методи паперової, тонкошарової, рідинної та газорідинної хроматографії, атомно-адсорбційної спектроскопії, УФ-спектроскопії, кольорові та осадові реакції; для кількісного визначення суми основних діючих речовин - метод спектрофотометрії.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше теоретично і експериментально обґрунтовано склад та технологію нового комплексного лікарського препарату з антимікробними та імуномодулюючими властивостями на основі біологічно активних речовин БВБВ та ЛРС під умовною назвою "Мелофіт", а також вивчено фізико-хімічні властивості, якісний склад і кількісний вміст основних діючих біологічно-активних речовин одержаного препарату.

Якісними реакціями та методами паперової, тонкошарової, рідинної, газорідинної хроматографії, УФ-спектроскопією, атомно-адсорбційною спектроскопією встановлено склад груп біологічно активних речовин одержаного препарату: амінокислоти, екдистероїди, жирні кислоти, фенольні сполуки (флавоноїди, дубильні речовини, прості феноли та ін.), мікроелементи, пігменти (хлорофіли та каротиноїди), а також визначено їх спектральні характеристики.

З використанням сучасних фізико-хімічних методів аналізу запропоновано методики якісної ідентифікації та кількісного визначення вмісту основних діючих речовин розробленого препарату, вивчено його імуностимулюючу, антимікробну та протитуберкульозну активність, визначено умови та термін зберігання, а також обґрунтовано розділи аналітичної нормативної документації, які регламентують їх якість.

Встановлено, що розроблений комплексний препарат "Мелофіт" за своїми характерними фармакологічними властивостями поєднує широкий спектр антимікробної активності на грампозитивні та грамнегативні бактерії, мікобактерії туберкульозу та патогенні гриби. Антимікробні властивості поєднуються з імуностимулюючим впливом на системи неспецифічної резистентності та імунореактивності.

Експериментально обґрунтована доцільність використання комплексного препарату "Мелофіт" як імуномодулятора при специфічній профілактиці туберкульозу вакциною БЦЖ.

Новизна досліджень підтверджена пріоритетними висновками на заявки до патентів (№ 20040402784 від 04.06.2004 "Спосіб одержання протитуберкульозного засобу "Гретавоск"; № 20040806453 від 22.09.2004 "Фармацевтична композиція "Мелофіт" з протитуберкульозною та імуномодулюючою дією").

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено склад та технологію комплексного природного препарату з імуностимулюючою, антимікробною та протитуберкульозною дією у формі складної настойки на основі біологічно активних речовин БВБВ та ЛРС.

Розроблено проекти аналітичної нормативної документації (АНД) та технологічного регламенту на комплексний препарат під умовною назвою "Мелофіт", а також затверджено ТУ У 01.2-00729557.002-2002 на біомасу великої бджолиної вогнівки (Galleria Mellonella).

Розроблено та апробовано технологію одержаного лікарського препарату в умовах лабораторного і промислового виробництва, що викладено в технологічних інструкціях та технологічному регламенті на виробництво препарату, які апробовані в умовах ТОВ "Фармацевтична компанія "Здоров'я".

Проведено доклінічні фармакологічні та мікробіологічні дослідження розробленого препарату. Фрагменти роботи впроваджено до навчального процесу кафедри технології ліків Запорізького Державного медичного університету, кафедри технології ліків і біофармації Львівського Національного медичного університету ім. Данила Галицького, кафедри аптечної та промислової технології ліків Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця (м. Київ), кафедри технології ліків інституту Української асоціації народної медицини (м. Київ) та кафедри технології ліків Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського. Впровадження підтверджені відповідними актами впровадження.

Особистий внесок дисертанта. Автором особисто проведено:

аналіз сучасних даних літератури щодо застосування природних імуномодулюючих засобів в терапії захворювань верхніх дихальних шляхів та туберкульозу, а також проаналізовано сучасні літературні джерела, що стосуються епідеміологічної ситуації з туберкульозу на Україні та за її межами;

обґрунтовано склад і розроблено оптимальну технологію нового комплексного природного препарату у вигляді складної настойки з БВБВ та ЛРС для виготовлення в промислових умовах;

розроблено методики контролю якості одержаного препарату;

на підставі проведених експериментальних досліджень розроблено проекти АНД та технологічного регламенту на виробництво настойки "Мелофіт";

узагальнено результати експериментальних досліджень та сформульовано висновки.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи доповідалися на: науково-практичній конференції "Ліки - людині" (м. Харків, 2002 р.), Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених "Вчені майбутнього" (м. Одеса, 2002 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції "Фармація XXI століття" (м. Харків, 2002 р.), науково-практичній конференції "Интеграция образования, науки и производства в фармации" (м. Ташкент, 2002), II з'їзді Апітерапевтів України (м. Харків, 2002 р.), міжобласній науково-практичній конференції "Актуальні проблеми фармації" (м. Запоріжжя, 2003 р.), міжвузівській науковій конференції студентів та молодих вчених (м. Харків, 2003 р.), ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції "Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія" (м. Харків, 2003 р.), науково-практичній конференції з міжнародною участю "Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок" (м. Тернопіль, 2004 р.) та на Всеукраїнському науково-практичному семінарі "Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії" (м. Харків, 2004 р.).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 18 робіт, у тому числі 6 статей в наукових фахових журналах та 12 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 165 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, огляду літератури (розділ 1), розділу, що присвячений обгрунтуванню загальної концепції і методів досліджень (розділ 2), експериментальної частини (розділи 3-5), загальних висновків, списку використаних літературних джерел та додатків. Робота ілюстрована 13 рисунками і 35 таблицями. Список використаних джерел містить 171 найменування, у тому числі 31 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Розробка складу та технології комплексного препарату на основі біологічно активних речовин БВБВ та ЛРС

На першому етапі створення препарату нами були проведені дослідження зі стандартизації БВБВ та встановлено її основні показники якості: зовнішній вигляд, колір, масову частку сухих речовин, концентрацію іонів водню (рН) водного розчину біомаси, мікробіологічні показники, вміст токсичних елементів, вміст залишкових кількостей пестицидів та радіоактивних нуклідів. На основі проведених експериментальних досліджень, було розроблено та затверджено технічні умови на БВБВ.

Наступним етапом нашої роботи було проведення досліджень по обґрунтуванню складу комплексного препарату з БВБВ та ЛРС, а також вибору оптимальних параметрів екстрагування природної сировини.

На даний час для виробництва настойок на хіміко-фармацевтичних підприємствах застосовують статичні рівноважні способи екстрагування - мацерацію і ремацерацію, та динамічні способи екстрагування - перколяцію та вакуум-фільтраційну екстракцію.

Аналізуючи ці способи та враховуючи сучасний стан хіміко-фармацевтичного виробництва, а також хімічний склад досліджуваної сировини, ми зупинились на вивченні зазначених вище методів отримання настойок.

Таблиця 1. Вплив концентрації екстрагенту і співвідношення сировина:готовий продукт на вихід екстрактивних речовин та антимікробну активність витяжок з БВБВ (m=3)

Концентрація екстрагенту	Співвідношення	Вміст екстрактивних речовин після 7 діб настоювання	Антимікробна активність по відношенню до P. aeruginosa
		%	г екстрактивних речовин із 100 г сировини	діаметр зони затримки росту, мм	у перерахунку на 1,0 сухої речовини настойки, г
Спирт 40%	1:5	1,98±0,02	9,90±0,01	11,00±0,02	1,11±0,01
	1:10	1,26±0,02	12,60±0,02	не активна*	0,0
Спирт 70%	1:5	3,24±0,02	16,20±0,02	28,00±0,01	1,72±0,02
	1:10	1,64±0,01	16,40±0,01	22,00±0,02	1,34±0,03
Спирт 90%	1:5	3,63±0,02	18,15±0,02	18,00±0,05	0,97±0,01
	1:10	1,70±0,01	17,00±0,01	15,00±0,02	0,88±0,02
Примітка: * - активність знижена за рахунок розведення розчину

При вивченні умов екстракції БВБВ, як екстрагент було використано водно-спиртову суміш із вмістом 40, 70 та 90 відсотків спирту етилового. Співвідношення сировина : екстрагент складало 1:10.

В результаті експериментальних досліджень (табл. 1) було встановлено, що підвищення концентрації спирту етилового у витяжках з БВБВ приводить до збільшення виходу екстрактивних речовин: 40 %-ний спирт етиловий вилучає 1,26 %, 70 %-ний - 1,64 %; а 90 %-ний - 1,70 %.

Таким чином, оптимальним екстрагентом для приготування витяжки з БВБВ слід вважати спирт етиловий у концентрації 70 %, який за виходом екстрактивних речовин практично не поступається 90 %. Крім того, зразок, виготовлений на 70 %-ному спирті етиловому, за антимікробними властивостями має певні переваги над іншими зразками, особливо по відношенню до мікроорганізмів роду P. aeruginosa. Експериментальні дані наведені в табл. 2.

Таблиця 2. Визначення антимікробної активності експериментальних зразків з БВБВ методом дифузії в агар

Концентрація спирту етилового у витяжках, %	Діаметр зони затримки росту, мм
	S.aureus	E.coli	B.subtillis	P.aeruginosa	С.albicans
40	13±0,04	*	12±0,02	*	*
70	*	13±0,01	13±0,01	22±0,02	14±0,03
90	*	13±0,02	13±0,04	15±0,02	15±0,05
Примітка: * - активність відсутня

Як відомо, однією з умов максимального виснаження природної сировини разом з вибором екстрагенту є також вибір оптимального співвідношення сировини і екстрагенту. В зв'язку з цим, нами були приготовлені витяжки у традиційних для настойок співвідношеннях 1:5 та 1:10 з використанням як екстрагент водно-спиртової суміші із вмістом 40, 70 і 90 % спирту етилового (коефіцієнт поглинання сировиною спирту етилового складає 0,114). Експериментальні зразки витяжок готували в лабораторних умовах методом мацерації.

В отриманих витяжках з БВБВ визначали вміст екстрактивних речовин та піддавали дослідженням на антимікробну активність по відношенню до мікроорганізмів роду P. aeruginosa. Результати експерименту (табл. 1) показали, що максимальна кількість екстрактивних речовин (3,63 %) екстрагується 90 %-ним спиртом етиловим у співвідношенні 1:5. Зразок, який містить 70 % спирту етилового у співвідношенні 1:5, вилучає дещо меншу кількість екстрактивних речовин (3,24 %), але значно перевищує антимікробні властивості аналогічних зразків по відношенню до P. aeruginosa (діаметр зони затримки росту складає 28,00±0,01 мм).

Враховуючи динаміку вилучення екстрактивних речовин та антимікробні властивості зразків, слід зазначити, що оптимальним екстрагентом є спирт етиловий у концентрації 70 %. Співвідношення сировина: екстрагент - 1:5.

Для визначення оптимального терміну екстракції БВБВ, нами було приготовлено 11 серій зразків методом мацерації на 70 %-ному спирті етиловому. В ході експерименту, через кожну добу відбирали одну серію витяжок та визначали в них вміст екстрактивних речовин і густину (табл. 3).

Таблиця 3. Вплив терміну екстракції на вихід екстрактивних речовин і густину витяжок з БВБВ (m=5)

Термін екстракції, добах	Концентрація екстрактивних речовин у витяжках, %	Густина, г/см3
1	0,05±0,01	0,9035±0,0004
3	1,02±0,04	0,9042±0,0002
5	1,28±0,03	0,9107±0,0003
7	1,57±0,02	0,9130±0,0002
9	1,55±0,02	0,9143±0,0003
11	1,56±0,02	0,9150±0,0002
13	1,56±0,03	0,9150±0,0004
15	1,57±0,02	0,9150±0,0003
17	1,56±0,03	0,9150±0,0002
19	1,57±0,03	0,9150±0,0004
21	1,57±0,02	0,9150±0,0001

Поступове збільшення концентрації екстрактивних речовин і густини у витяжках з БВБВ спостерігалось до 7-ї доби, що відповідно складає 1,57±0,02 % і 0,9130±0,0002 г/см³. Після зазначеного періоду, далі показники практично не змінювались.

Таким чином, було встановлено оптимальні параметри екстракції для розробленої витяжки з БВБВ: екстрагент - 70 % спирт етиловий; співвідношення сировина : екстрагент - 1:5; час настоювання - 7 діб; метод екстракції - мацерація.

Як відомо з літературних джерел, дія імуномодулюючих природних засобів дещо підсилюється за рахунок поєднання їх з ЛРС. З цією метою нами було відібрано 4 найбільш поширених зборів з ЛРС, які застосовуються при лікуванні захворювань органів дихальної системи та туберкульозу легень. Склади зборів з ЛРС наведені в табл. 4.

З метою вивчення впливу часу на процес екстракції та вилучення екстрактивних речовин з запропонованих складів з ЛРС (табл. 4), нами було виготовлено 11 серій витяжок. Як екстрагент використовували 70 % спирт етиловий. Співвідношення сировина : екстрагент - 1:10, метод екстракції - мацерація.

Експериментальні дані, які наведені в табл. 5 свідчать про те, що максимальне вилучення екстрактивних речовин для витяжок складу №№ 1, 2 та 4 - складає 11 діб, а для витяжки складу №3 - 13 діб.

Таблиця 4. Склади зборів з ЛРС, які застосовуються при захворюваннях органів дихальної системи та туберкульозу легень

№ складів	Склади витяжок з лікарської рослинної сировини	Кількість ЛРС, г	Кількість спирту етилового 70 %, мл
1.	Кореневища з коренями оману високого Кореневища лепехи звичайної Кореневища солодки голої	10,0 10,0 10,0	необхідна кількість, для одержання 300 мл настойки
2.	Трава фіалки триколірної Листи подорожника великого Квітки липи серцелистої Трава звіробою звичайного	10,0 10,0 10,0 10,0	необхідна кількість, для одержання 400 мл настойки
3.	Трава звіробою звичайного Кореневища солодки голої Трава фіалки триколірної	10,0 10,0 10,0	необхідна кількість, для одержання 300 мл настойки
4.	Кореневища з коренями оману високого Кореневища солодки голої	10,0 10,0	необхідна кількість, для одержання 200 мл настойки

Таблиця 5. Вплив терміну екстракції на концентрацію екстрактивних речовин витяжок з ЛРС (m=5)

Термін екстракції,в добах	Концентрація екстрактивних речовин у витяжках з ЛРС відповідно до їх складу, %
	1*	2	3	4
1	2,19±0,02	2,07±0,02	2,37±0,02	2,47±0,02
3	3,44±0,02	2,19±0,02	2,51±0,02	2,60±0,02
5	3,65±0,02	2,34±0,02	2,61±0,02	2,66±0,02
7	3,75±0,02	2,46±0,02	2,64±0,02	2,70±0,02
9	3,77±0,02	2,67±0,02	3,64±0,02	2,83±0,02
11	4,01±0,02	3,00±0,02	3,68±0,02	3,48±0,02
13	3,98±0,02	2,98±0,02	3,70±0,02	3,47±0,02
15	3,96±0,02	2,96±0,02	3,67±0,02	3,46±0,02
17	3,97±0,02	2,94±0,02	3,70±0,02	3,46±0,02
19	3,98±0,02	2,98±0,02	3,68±0,02	3,46±0,02
21	3,96±0,02	2,98±0,02	3,69±0,02	3,47±0,02
Примітка: *1,2,3,4 - склади витяжок, які наведені в табл. 4.

З метою вибору раціонального складу лікарського препарату, нами були приготовлені суміші витяжок з БВБВ та зборів з ЛРС у співвідношенні 1:1.

Таблиця 6. Визначення антимікробної активності витяжок з ЛРС методом двократних серійних розведень

№ складу витяжок	Мінімальна подавляюча концентрація, мг/мл
	S. aureus	E. coli	B. subtilis	P. aeruginosa
1	25 ± 3,1	25 ± 4,1	50 ± 6,2	25 ± 2,8
2	6,25 ± 1,30	25 ± 3,3	6,25 ± 1,10	25 ± 3,4
3	3,12 ± 0,48	50 ± 5,2	3,12 ± 0,96	25 ± 2,2
4	3,12 ± 0,83	50 ± 4,8	50 ± 3,8	50 ± 5,5

Результати антимікробної активності складних витяжок з БВБВ та ЛРС, які наведені в табл. 6 свідчать, що найбільшу антибактеріальну активність по відношенню до грампозитивних мікроорганізмів проявляє витяжка складу № 3.

Необхідно зазначити, що проведеними дослідженнями з використанням методу мацерації, нами було лише встановлено склад та співвідношення компонентів комплексного препарату:

- Кореневищ з коренями солодки голої 10,0

- Трави фіалки триколірної 10,0

- Трави звіробою звичайного 10,0

- Спирту етилового 70 % достатня кількість, для одержання 300 мл витяжки з ЛРС

- Витяжки з біомаси великої бджолиної вогнівки 300 мл

Комплексного препарату "Мелофіт" 600 мл

Відомо, що метод мацерації є тривалим і не дозволяє вилучити максимальну кількість БАР з ЛРС. Тому, подальші дослідження були направлені на вибір сучасного методу екстрагування рослинної сировини в умовах промислового виробництва фітохімічних засобів. З цією метою витяжки з ЛРС одержували методами мацерації, перколяції, та фільтраційної екстракції.

Фільтраційну екстракцію проводили в секторі хімії та технології фітохімічних препаратів на базі ДП ДНЦЛЗ під керівництвом д. хім. н., проф. В.І. Литвиненка. При мацерації - співвідношення сировина : екстрагент складало 1:10, а при перколяції та фільтраційній екстракції - 1:5.

За експериментальними даними (табл. 7), вихід екстрактивних речовин у витяжці з ЛРС, яку отримано методом вакуум-фільтраційної екстракції по відношенню до витяжки приготовленої методом мацерації збільшився майже в 6,3 рази, а по відношенню до витяжки, приготовленої методом перколяції - в 1,2 рази. Для визначення кількості зливів, в методі вакуум-фільтраційної екстракції проводили експеримент для кожного виду сировини. Результати досліджень, які наведені в табл. 8 показують, що сума екстрактивних речовин після 5-ти зливів становить близько 16 % в сумарній витяжці з ЛРС.

На підставі отриманих даних, нами була розроблена технологічна схема процесу одержання комплексного препарату "Мелофіт", яка наведена на рис. 1.

Рис. 1. Технологічна блок-схема виробництва комплексного препарату "Мелофіт"

Таблиця 7. Вихід екстрактивних речовин витяжки з ЛРС складу № 3, отриманої різними методами екстракції

Показники	Метод екстракції ЛРС
	Мацерація	Перколяція	Вакуум-фільтраційна екстракція
Вміст екстрактивних речовин, %	2,60±0,02	13,56±0,02	16,30±0,04
Густина, г/см3	0,9134±0,0008	0,9852±0,0007	0,9139±0,0008

Таблиця 8. Визначення суми екстрактивних речовин в досліджених зразках з ЛРС (m=5)

Зливи досліджуваних зразків з ЛРС	Концентрація екстрактивних речовин кожного зливу з ЛРС, %	Сума екстрактивних речовин 5 зливів
	1	2	3	4	5	в %
Трава фіалки триколірної	13,494	7,084	3,020	1,836	1,118	26,55±0,02
Трава звіробою звичайного	9,286	4,716	2,200	0,868	0,664	17,73±0,03
Кореневища з коренями солодки голої	5,488	6,074	6,242	5,564	3,734	27,10±0,02
Сумарна витяжка з ЛРС	6,360	5,094	3,006	1,380	0,463	16,30±0,04

Таким чином, найбільш раціональною та оптимальною технологією отримання витяжки з ЛРС є метод вакуум-фільтраційної екстракції.

Фізико-хімічні дослідження, та аналіз якісного складу і кількісного вмісту біологічно активних речовин розробленого комплексного препарату

Для розробки АНД на комплексний препарат "Мелофіт", нами було вивчено його органолептичні властивості, проведено фізико-хімічні дослідження, та аналіз якісного складу і кількісного вмісту біологічно-активних речовин (БАР).

За фізико-хімічними показниками настойка "Мелофіт" являє собою рідину темно-коричневого кольору, гіркого смаку з характерним спиртовим запахом. Вміст екстрактивних речовин складає - 16,30±0,04 %, відносна густина - 0,9139±0,0008, рН - 5,89±0,04, концентрація спирту етилового - 65±0,06 %.

За допомогою методів аналізу (паперової, тонкошарової, рідинної, газорідинної хроматографії, атомно-адсорбційної спектроскопії, спектрофотометрії) було встановлено якісний склад і кількісний вміст таких біологічно активних речовин як амінокислоти, екдистероїди, жирні кислоти, фенольні сполуки (флавоноїди, дубильні речовини, прості феноли та ін.), мікроелементи, пігменти (хлорофіли та каротиноїди).

Вивчення амінокислотного складу настойки "Мелофіт" проводили методами паперової, тонкошарової та рідинної хроматографії. Результати рідинної хроматографії (табл. 9) показали, що в препараті міститься 28 речовин, до складу яких увійшли замінні та незамінні амінокислоти, а також похідні амінокислот (сульфоамінокислоти, аміноспирти, амінопохідні адіпінової кислоти, фрагменти розщеплення білка - уреїди), що підкреслює його терапевтичну цінність.

Таблиця 9. Амінокислоти та їх похідні, які виявлено у комплексному препараті "Мелофіт" методом рідинної хроматографії

№ п/п	Речовини	мкм/мл	№ п/п	Речовини	мкм/мл
Амінокислоти:	17.	Серин	344
1.	Цистеїн	19	18.	Лізин	385
2.	Цистін	19	19.	Пролін	450
3.	Тирозин	50	20.	Гліцин	482
4.	Орнітин	53	21.	Аміонін	513,5
5.	Гістидин	112,5	22.	Глутамінова к-та	557
6.	Фенілаланін	124	23.	Аланін	996
7.	в-Аланін	125	Похідні амінокислот
8.	Цистатіонін	130,5	Сульфоамінокислоти:
9.	Аспарагінова к-та	131	24.	Турін	30
10.	в-Аміноізомасляна к-та	140,5	Аміноспирти:
11.	г-Аміномасляна к-та	150	25.	Етаноламін	50,5
12.	Валін	153	26.	Фосфоетаноламін	46,5
13.	Ізолейцин	197	Амінопохідні адіпінової кислоти
14.	Треонін	293	27.	б-Аміноадіпін	180
15.	б-Аміномасляна к-та	312	Фрагменти розщеплення білка, які мають у своєму складі амідогрупу
16.	Аргінін	337,5	28.	Уреїди	6300

Методом газо-рідинної хроматографії в розробленому препараті було визначено 7 насичених та 6 ненасичених вільних жирних кислот, з яких 3 - відносяться до незамінних. Вміст насичених жирних кислот складає - 31,2 %, а ненасичених - 68,8 % від усієї їх суми.

Мікроелементний аналіз комплексного препарату "Мелофіт" проводили методом атомно-адсорбційної спектроскопії. Експериментальні дані табл. 10 свідчать про те, що в настойці міститься 29 мікроелементів, переважаючими з яких є Na>K>Fe>Si>Mg>Ca.

Таблиця 10. Мікроелементний склад комплексного препарату "Мелофіт"

Елемент	Кількість в мг / %	Елемент	Кількість в мг / %	Елемент	Кількість в мг / %
Fe	1250	Ni	0.05	Sr	0.4
Si	890	Bi	<0.05	P	22
B	0.18	Mo	0.03	Ca	450
Mn	1.8	V	<0.02	Mg	620
Al	155	Cu	0.5	Ge	<0.05
Pb	0.03	Ti	0.35	Sb	<0.05
Cr	0.55	Ag	0.02	Cd	<0.05
Sn	0.04	Zn	26	As	<0.05
Ga	0.05	K	1860	Hg	<0.05
Co	<0.05	Na	4580

Сума екдистероїдів за спектрофотометричним методом у перерахунку на екдизон складає 0,28±0,02 %. Вміст суми флавоноїдів за спектрофотометричним методом у перерахунку на рутин - до 2 %.

Аналіз кількісного вмісту пігментів розробленого препарату, який проводили методом тримірної флуоресцентної спектроскопії свідчить про наявність у препараті 32,2 мг/г (3,2 %) хлорофілів А і В у перерахунку на хлорофіл А, та 28,8 мг/г (2,9 %) каротиноїдів у перерахунку на в-каротин.

Фармакологічні та мікробіологічні дослідження комплексного препарату "Мелофіт"

Доклінічні дослідження імунобіологічних та мікробіологічних властивостей комплексного препарату "Мелофіт" проводились під керівництвом д.м.н., проф. І.Л. Дикого та д.ф.н., проф. Л.В. Яковлєвої.

В результаті проведених досліджень було встановлено, що препарат виявляє виражену імуностимулюючу дію на клітинну та гуморальну ланку імунітету в дозі 100 мг/кг, що дає змогу дійти висновку про перспективність його широкого використання як ефективного імуномодулятора.

Вивчення антимікробних властивостей комплексного препарату "Мелофіт" проводили у порівнянні з настойкою, розробленою з БВБВ.

У відповідності з вимогами Державної фармакопеї України (ДФУ), на скринінговому рівні в якості мікробіологічної моделі був використаний набір референтних тест-штамів грампозитивних, грамнегативних бактерій та С. al-bicans. Експериментальні дані по визначенню антимікробної активності розроблених препаратів (табл. 11) свідчать про те, що комплексний препарат "Мелофіт" за мікробостатичними властивостями є більш активним по відношенню до S. аureus, В. subtilis та E. сoli у 1,6 разів, а по відношенню до P. aeruginosa - відповідно у 1,8 разів. Одночасно, за мікробоцидними властивостями, настойка "Мелофіт" перевищує препарат порівняння у 1,5 рази.

Таблиця 11. Рівень антимікробної активності розроблених лікарських препаратів (m=6)

Тест-штам	Рівень антимікробної активності мкг/мл
	Настойка з БВБВ	Комплексний препарат "Мелофіт"
	МІК	МБК	МІК	МБК
S. aureus	105,2±6,6	119,4±4,8	67,4±8,2	83,7±5,4
В. subtilis	117,4±5,5	130,2±5,6	72,6±3,6	86,2±2,9
E. coli	135,7±6,3	150,8±7,0	82,4±5,2	102,5±7,7
P. aeruginosa	155,6±8,2	174,2±7,5	87,7±5,6	106,8±8,2
C. albicans	> 500	148,5±10,2	176,3±12,5
Примітка: МІК - мінімальна інгібуюча концентрація. МБК - мікобактерицидна концентрація.

Таким чином, проведеними мікробіологічними дослідженнями доведено, що комплексний препарат "Мелофіт" за механізмами антимікробної дії відноситься до природних антисептиків широкого спектру дії.

Результати експерименту також показали, що досліджуваний препарат виявляє певну антифунгальну активність по відношенню до мікроорганізмів роду C. albicans. Останнє дає підставу прогнозувати, що настойка "Мелофіт" може проявляти активність по відношенню до мікобактерій туберкульозу. Підтвердженням даного припущення є те, що C. albicans, як і M. tuberculosis, відноситься до кислотостійких мікроорганізмів.

У зв'язку з цим, доцільним стало провести мікробіологічне тестування протитуберкульозної здатності комплексного препарату "Мелофіт" по відношенню до референтного штаму M. academia.

При дослідженні протитуберкульозних властивостей, в якості мікробіологічного об'єкту був використаний набір референтних та клінічних штамів туберкульозних бактерій M. tuberculosis та M. Bovis.

Результати проведених досліджень узагальнені в табл. 12, з аналізу даних яких обґрунтованим висновком виходить те, що розроблений препарат у виявах притаманних антимікробних властивостей відрізняється наявністю протитуберкульозної активності, яка виявляється на рівні 0,12-0,20 мг/мл. При цьому також було встановлено, що клінічні варіанти відповідних референтних штамів з полірезистентністю до протитуберкульозних препаратів І та ІІ ряду однаково чутливі й до дії досліджуваного препарату.

На підставі даного висновку вважалося доцільним провести вивчення хіміотерапевтичної активності комплексного препарату "Мелофіт" при експериментальному туберкульозі морських свинок.

Таблиця 12. Протитуберкульозна здатність комплексного препарату "Мелофіт" (m=6)

Родова належність	Назва штаму	Мінімальна інгібуюча концентрація, мг/мл
M. bovis	Valle, e	референтний	0,13±0,02
		клінічний	0,17±0,05
	Bovinns-8	референтний	0,22±0,03
		клінічний	0,19±0,04
	Віноградов	референтний	0,15±0,02
		клінічний	0,20±0,06
M. tuberculosis	Academia	референтний	0,12±0,03
		клінічний	0,16±0,05
	ДТ/Str.	референтний	0,14±0,02
		клінічний	0,17±0,04
Примітка:Референтні та клінічні штами туберкульозних бактерій відповідно одержані з музеїв живих культур НДІМІ ім. І.І. Мечнікова та НДІ експериментальної та клінічної ветеринарії.

В результаті проведених досліджень встановлено, що розроблений препарат позитивно характеризується сполученням протитуберкульозних та імуномодулюючих властивостей. З урахуванням останнього, стає перспективним припущення про те, що попереднє або паралельне включення в існуючу схему протитуберкульозної вакцинації перорального застосування препарату "Мелофіт" може оптимізувати імуногенні властивості вакцини БЦЖ.

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ

1. Теоретично обгрунтовано та експериментально розроблено склад та технологію природного комплексного препарату на основі біологічно активних речовин біомаси великої бджолиної вогнівки та лікарської рослинної сировини.

2. Розроблені та затверджені технічні умови на біомасу великої бджолиної вогнівки (ТУ У 01.2-00729557.002-2002), технологія одержання якої використовується в Полтавській філії Інституту бджільництва ім. П.І. Прокоповича Української академії аграрних наук.

3. Встановлено оптимальні параметри екстрагування біологічно активних речовин при розробці технології одержання витяжки з біомаси великої бджолиної вогнівки: екстрагент - 70 % спирт етиловий; фаза розвитку личинок - 5-6 тижнів; співвідношення сировина : екстрагент - 1:5; час настоювання - 7 діб; метод екстракції - мацерація.

4. Проведено комплексні дослідження фізико-хімічних та технологічних властивостей ЛРС, що дозволило встановити найбільш оптимальну концентрацію екстрагенту для приготування витяжки - 70 % спирт етиловий та співвідношення сировина : екстрагент - 1:5. Визначено, що метод вакуум-фільтраційної екстракції дозволяє одержати витяжку з ЛРС в промислових умовах з найбільш високим вмістом екстрактивних речовин по відношенню до методу мацерації та перколяції.

5. Визначено якісний склад та кількісний вміст основних біологічно активних речовин комплексного препарату "Мелофіт". Встановлено, що діючими речовинами в настойці є комплекс амінокислот, вуглеводів, екдистероїдів, жирних кислот, фенольних сполук (флавоноїдів, дубильних речовин, простих фенолів та ін.), мікроелементів, пігментів (хлорофілів та каротиноїдів). Запропоновані методики закладені в основу проекту аналітично-нормативної документації. Експериментально доведена стабільність настойки при зберіганні протягом 2 років при кімнатній температурі.

6. Встановлено, що комплексний препарат "Мелофіт" проявляє антимікробну та імуностимулюючу активність. Обгрунтована доцільність використання настойки "Мелофіт" за імуномодулюючим призначенням при вакцинації БЦЖ з метою суттєвого підвищення рівнів специфічної профілактики туберкульозу.

7. Розроблено та апробовано технологію одержаного лікарського препарату в умовах лабораторного і промислового виробництва, що викладено в технологічних інструкціях та технологічному регламенті на виробництво препарату, які апробовані в умовах ТОВ "Фармацевтична компанія "Здоров'я".

8. Результати досліджень впроваджено у навчальний процес ряду вищих навчальних закладів України.

ТЕМА ДИСЕРТАЦІЇ ВІДОБРАЖЕНА В ПУБЛІКАЦІЯХ

Тихонов О.І., Шпичак О.С., Богуцька О.Є. Епідеміологічна ситуація з туберкульозу в Україні та пошук нових протитуберкульозних препаратів // Вісник фармації. - 2003. - № 1 (33) - С. 42-45. (Особистий внесок - особисто здобувачем проведено планування експерименту, виготовлення зразків, експериментальна частина, статистична обробка результатів, оформлення статті).

Шпичак О.С., Тихонов О.І., Богуцька О.Є. Фізико-хімічні дослідження нового протитуберкульозного препарату "Фіто-Гретевіск" // Вісник фармації. - 2003. - № 2 (34) - С. 35-38. (Особистий внесок - планування і здійснення експерименту, статистична обробка результатів, оформлення статті).

Шпичак О.С., Тихонов О.І., Богуцька О.Є. Хроматографічне дослідження амінокислотного складу настойки "Фіто-Гретевіск" // Фармаком. - 2003. - № 4. - С. 72-76. (Особистий внесок - планування експерименту, виготовлення зразків, узагальнення експериментальних даних, статистична обробка результатів, підготовка та оформлення статті).

Шпичак О.С., Тихонов О.І., Богуцька О.Є. Аналіз протитуберкульозних препаратів, представлених на фармацевтичному ринку України // Клінічна фармація. - 2003. - Том 7. - № 4. - С. 18-22. (Особистий внесок - аналіз і узагальнення сучасних літературних даних, підготовка та оформлення статті).

Tikhonov А.I., Shpichak O.S., Bogutskaya E.E. New approaches to the development of animal origin raw material use in tuberculosis treatment // International Scientific Conference "Pharmacy in contemporary society". Kaunas. - 2003 m. - lapkriиio 21 d. - P. 89-92. (Особистий внесок - планування і здійснення експерименту, статистична обробка результатів, оформлення статті).

Шпичак О.С., Тихонов А.И., Богуцкая Е.Е. Микроэлементный анализ настойки "Фито-Гретавоск" // Збірник наукових статей "Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики". - Випуск ХІІ. - Том ІІІ. - Запоріжжя. - 2004. - С. 99-105. (Особистий внесок - планування експерименту, виготовлення зразків, узагальнення експериментальних даних, статистична обробка результатів, підготовка та оформлення статті).

Тихонов О.І., Богуцька О.Є., Шпичак О.О. Розробка складу та технології нового протитуберкульозного препарату на основі лікарської рослинної сировини та продуктів бджільництва // Тез. докл. научно-практ. конфер. "Лекарства-человеку". - Харьков, 2002. - Том ХVII. - № 1. - С. 39-49.

Шпичак О.С., Тихонов О.І., Богуцька О.Є. Технологія та фізико-хімічні дослідження нового протитуберкульозного препарату на основі продуктів бджільництва // Фармація ХХІ століття: Матеріали Всеукр. наук.-практ. конф. (23-24 жовт. 2002 р., м. Харків) / Редкол.: В.П. Черних, І.С. Гриценко, В.М. Толочко. - Х.: Вид-во НФаУ: Золоті сторінки, 2002. - С. 67-68.

Шпичак О.С., Тихонов О.І., Богуцька О.Є. Перспективи створення протитуберкульозних препаратів на основі продуктів бджільництва // Тези доповідей Міжнародної науково-практичної конференції молодих вчених "Вчені майбутнього": (17-19 жовтня 2002 р.). - Одеса: Одес. держ. мед. ун-т, 2002. - С. 53.

Шпичак О.С., Тихонов А.И., Богуцкая Е.Е. К вопросу лечения туберкулёза // Сборник тезисов докладов научно-практической конференции "Интеграция образования, науки и производства в фармации". - Ташкент. - 2002. - С. 20-21.

Тихонов О.І., Шпичак О.С., Богуцька О.Є. Застосування продуктів бджільництва у створенні нових протитуберкульозних препаратів // Апітерапія: погляд у майбутнє: Матеріали ІІ з'їзду апітерапевтів України (31 жовт.-1 листоп. 2002 р., м. Харків) / Редкол.: В.П. Черних, О.І. Тихонов, Т.Г. Ярних та ін. - Х.: Вид-во НФаУ: Золоті сторінки, 2002. - С. 151-152.

Шпичак О.С., Тихонов О.І. Застосування продуктів бджільництва при лікуванні органів дихання // Апітерапія: погляд у майбутнє: Матеріали ІІ з'їзду апітерапевтів України (31 жовт.-1 листоп. 2002 р., м. Харків) / Редкол.: В.П. Черних, О.І. Тихонов, Т.Г. Ярних та ін. - Х.: Вид-во НФаУ: Золоті сторінки, 2002. - С. 160-163.

Вивчення антимікробної активності нового протитуберкульозного препарату, отриманого на основі продуктів бджільництва / О.І. Тихонов, І.Л. Дикий, О.Г. Гейдеріх, О.С. Шпичак, О.Є. Богуцька // Збірник наукових статей "Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики". - Випуск Х. - Запоріжжя. - 2003. - С. 107.

Tikhonov A.I., Shpichak O.S. Bogutskaya E.E. Modern problems in treatment of a tuberculosis // XL Naukowa konferencja pszczelarska. Puіawy, 11-12 marca. - 2003 r. - S. 136.

Шпичак О.С., Тихонов О.І. Проблема лікування хворих на туберкульоз та застосування препаратів на основі природної сировини // "Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія": Тези доповідей ІІІ Міжнар. наук.-практ. конф. Ч. І. - Х.: Вид-во НФаУ, 2003. - С. 346.

Тихонов О.І., Дикий І.Л, Шпичак О.С. Актуальність створення нових лікарських препаратів для лікування органів дихання та туберкульозу // Матеріали III з'їзду фтизіатрів і пульмонологів України. - Український пульмонологічний журнал. - 2003. - № 2 (40) - С. 375.

До питання створення нових лікарських препаратів / О.І. Тихонов, Г.Б. Ходарченко, О.С. Шпичак, І.В. Андрєєва // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю "Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок". - Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. - С. 214-216.

Создание препаратов природного происхождения с иммуномодулирующими, антимикробными и противотуберкулёзными свойствами / А.И. Тихонов, Е.Е. Богуцкая, О.С. Шпичак, А.И. Черкасова, И.А. Прохода // "Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії": Матер. наук.-практ. семінару (26 листопада 2004 р., м. Харків) / За ред. проф. О.І. Тихонова. - Х.: Вид-во НФаУ, 2004. - С. 24-29.

ШПИЧАК О.С. РОЗРОБКА СКЛАДУ ТА ТЕХНОЛОГІЇ НОВОГО КОМПЛЕКСНОГО ПРИРОДНОГО ПРЕПАРАТУ З АНТИМІКРОБНИМИ ТА ІМУНОМОДУЛЮЮЧИМИ ВЛАСТИВОСТЯМИ. - РУКОПИС

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.01 - технологія ліків та організація фармацевтичної справи. - Національний фармацевтичний університет, Харків, 2005.

Вперше теоретично і експериментально обґрунтовано склад та технологію нового комплексного лікарського препарату з антимікробними та імуномодулюючими властивостями на основі біологічно активних речовин біомаси великої бджолиної вогнівки та лікарської рослинної сировини, а також вивчено фізико-хімічні властивості, якісний склад і кількісний вміст основних діючих біологічно-активних речовин одержаного препарату.

Встановлено, що розроблений комплексний препарат "Мелофіт" у визначенні притаманних фармакологічних властивостей поєднує широкий спектр антимікробної активності на грампозитивні та грамнегативні бактерії, мікобактерії туберкульозу та патогенні гриби. Вияви антимікробних властивостей суміщаються з імуностимулюючим впливом на системи неспецифічної резистентності та імунореактивності.

Експериментально обґрунтовано доцільність використання комплексного препарату "Мелофіт" як імуномодулятора при специфічній профілактиці туберкульозу вакциною БЦЖ.

Ключові слова: біомаса великої бджолиної вогнівки, лікарська рослинна сировина, комплексний препарат, настойка.

ШПИЧАК О.С. РАЗРАБОТКА СОСТАВА И ТЕХНОЛОГИИ НОВОГО КОМПЛЕКСНОГО ПРИРОДНОГО ПРЕПАРАТА С АНТИМИКРОБНЫМИ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ. - РУКОПИС

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела. - Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2005.

Впервые теоретически и экспериментально обоснован состав и технология нового комплексного лекарственного препарата с антимикробными и иммуномодулирующими свойствами на основе биологически активных веществ биомассы большой пчелиной огневки (ББПО) и лекарственного растительного сырья (ЛРС).

При разработке технологии комплексного препарата изучены: влияние вида и концентрации экстрагента, соотношение сырья и готового продукта, времени экстракции на выход действующих веществ из ББПО и ЛРС. Изучены физико-химические и технологические свойства ББПО и ЛРС, а так же их влияние на выход основных действующих биологически активных веществ в процессе экстракции.

Доказана перспективность вакуум-фильтрационного метода экстракции ЛРС при получении вытяжки по сравнению с традиционными методами экстракции.

Качественными реакциями и методами бумажной, тонкослойной, жидкостной, газожидкостной хроматографии, УФ-спектроскопией, атомно-адсорбционной спектроскопией, установлен состав групп биологически активных веществ в разработанном препарате: аминокислоты, экдистероиды, жирные кислоты, фенольные соединения (флавоноиды, дубильные вещества, простые фенолы и др.), микроэлементы, пигменты (хлорофиллы и каротиноиды), а также определены их спектральные характеристики.

С использованием современных физико-химических методов анализа разработаны методики качественной идентификации и количественного определения основных веществ разработанного препарата, изучено его иммуностимулирующую, антимикробную и противотуберкулезную активность, определены условия и сроки хранения, а также обоснованы разделы аналитической нормативной документации, регламентирующие его качество.

Устан...