Гепатопротектори в фармакологічній корекції функціонального стану імунної системи при експериментальному токсичному гепатиті

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ГЕПАТОПРОТЕКТОРИ В ФАРМАКОЛОГІЧНІЙ КОРЕКЦІЇ ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ ІМУННОЇ СИСТЕМИ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ ТОКСИЧНОМУ ГЕПАТИТІ

Шевченко Ігор Михайлович

14.03.05 - фармакологія

Одеса - 2005

Анотація

Шевченко І.М. Гепатопротектори в фармакологічній корекції функціонального стану імунної системи при експериментальному токсичному гепатиті. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2005.

Дисертація присвячена вивченню імуномодулюючої дії гепатопротектора гептрала і біологічно активної речовини з встановленими гепатозахисними властивостями МІГУ-1 на фоні експериментального токсичного гепатиту. Розглянуто динаміку змін показників імунного статусу при експериментальному токсичному гепатиті у імунізованих та неімунізованих тварин, показано імунотоксичну дію чотирихлористого вуглецю, який призводить до суттєвого пригнічення (в 3 рази) імунної відповіді і хвилеподібних змін показників імунного статусу протягом 21 доби спостережень. Зроблено імунофармакологічну оцінку впливу гептралу і МІГУ-1 на показники імунної відповіді при курсовому введенні інтактним та імунізованим тваринам. Імунотропний ефект виявлявся при введенні гепатопротекторів в значних дозах. Показано імуномодулюючу дію гепатопротекторів МІГУ-1 і гептрала в порівнянні з есенціалє при експериментальному токсичному гепатиті, що виявлялось в швидкій стабілізації і нормалізації (7-10 доба) показників імунної відповіді. Вперше встановлений кореляційний зв'язок між динамікою лазерних кореляційних спектрів і зміною інтегральних показників імунологічної резистентності в умовах експериментального токсичного гепатиту.

Ключові слова: гепатопротектори, МІГУ-1, гептрал, есенціалє, імунний статус, токсичний гепатит.

Аннотация

Шевченко И.М. Гепатопротекторы в фармакологической коррекции функционального состояния иммунной системы при экспериментальном токсическом гепатите. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Одесский государственный медицинский университет МЗ Украины, Одесса, 2005.

Диссертация посвящена изучению иммуномодулирующего действия гептрала и биологически активного вещества с гепатозащитными свойствами МИГУ-1 на фоне экспериментального токсического гепатита.

Рассмотрена динамика изменения некоторых показателей иммунного статуса при экспериментальном токсическом гепатите у иммунизированных и неиммунизированных животных, показано иммунотоксическое действие четыреххлористого углерода. При экспериментальном токсическом гепатите наблюдается существенное угнетение функциональной активности имунной системы, что выражалось в снижении содержания в крови и лимфоидных органах Т- и В- лимфоцитов, а также их рецепторной активности в 3 раза, снижении поглотительной и бактерицидной функции фагоцитов в 3-5 раз. Функция имунной системы не восстанавливалась до 21 сут. наблюдений на фоне нормализации биохимических и морфологических критериев функций печени. При этом наблюдались волнообразные изменения показателей иммунного статуса.

Введение гепатотропного яда одновременно с иммунизацией крыс приводит к существенному угнетению формирования иммунного ответа на чужеродный антиген. Снижается количество антителообразующих клеток, уровень гемолизинов, при этом отмечается также снижение количества Т- и В- лимфоцитов и их активности более чем в 3 раза. Это объясняется двойной нагрузкой на иммунную систему, которая одновременно вынуждена реагировать на чужеродный антиген и собственные антигены печени.

Дана иммунофармакологическая оценка влияния гептрала и МИГУ-1 на показатели иммунного ответа при курсовом предварительном введении интактным и иммунизированным животным. МИГУ-1 в дозе 10 мг/кг, гептрал в дозе 20 и 40 мг/кг, эссенциале в дозе 80 мг/кг при курсовом введении не оказывали негативного действия на иммунный статус интактных и иммунизированных животных. В более высоких дозах (для МИГУ-1 - 74 и 147 мг/кг, для гептрала - 80 мг/кг) изучаемые вещества показали дозозависимый иммуносупрессивный эффект, что выявилось в уменьшении количества клеток иммунной системы и их функциональной активности в 2-3 раза.

Показано иммуномодулирующее действие МИГУ-1 и гептрала в сравнении с эссенциале при экспериментальном токсическом гепатите, что выразилось в быстрой стабилизации и нормализации показателей иммунного ответа. Изученные показатели иммунной системы достигают контрольных значений на 7-10 сутки наблюдений. При иммунизации отравленных животных курсовое введение МИГУ-1 и гептрала приводит к увеличению количества антителообразующих клеток и уровня антител в селезенке и лимфоузлах.

Установлена связь между динамикой лазерных корреляционных (ЛК) спектров и изменением интегральных показателей иммунологической резистентности в условиях експериментального токсического гепатита. Динамика ЛК-спектров совпадает с динамикой иммунологических и биохимических критериев течения токсического гепатита.

Ключевые слова: гепатопротекторы, МИГУ-1, гептрал, эссенциале, иммунный статус, токсический гепатит.

Annotation

Shevchenko I.M. Hepatocorrectors in the pharmacological correction of the functional state of the immune system at the experimental toxic hepatites. - Manuscript.

Thesis for the degree of the kandidate of Science in Biology. Specialty 14.03.05 -pharmacology. - Odessa State Medical University, Odessa, 2005.

The dissertation is devoted to studying the immunomodulating action of heptral and biologically active substances with the hepatoprotecting properties of MIGU-1 against the background of the experimental toxic hepatitis. There was considered the dynamics of altering indicators of the immune status at the experimental toxic hepatitis at the immunized and non-immunized animals. Immunotoxic action of carbon tetrachloride was shown. Which resulted in a substantial inhibition of the immune response and wavelike alterations of the immune status indicators during 21 days of observations. There was made an immunopharmacological estimation of the influence of heptral and МIGU-1 on the indicators of the immune response at the course injection to the intact and immunized animals. Immunotropic effect manifests at the hepatoprotecors injections in substantial doses. Immunomodulating action of the hepatoprotectors МIGU-1 and heptral was shown in comparison with essentialae at the experimental toxic hepatitis, which manifested in rapid stabilization and normalization of the immune response. For the first time there was ascertained correlative connection between the dynamics of laser correlativ spectrums and alteration of the integral indicators if immunological resistance in the conditions of the experimental toxic hepatitis.

The key words: hepatoprotectors, МIGU-1, heptral, essentialae, immune status, toxic hepatites.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. В процесі еволюції ссавців та людини між печінкою та імунною системою виник тісний функціональний зв'язок. Печінка відіграє суттєву роль як в кровотворенні, так і в імуногенезі (І.Н. Алексеєва та співав., 1991; Ю.І. Бажора та співав., 2001). Оскільки печінка приймає участь в багатьох процесах обміну, на неї діють багато ендо- та екзогенних факторів, до яких належать алкоголь та медикаменти, а також різноманітні токсиканти.(І.В. Карбушева та співав., 2003; М.Г. Голубєва, 2003). Біля 50 % шлунково-кишкових хвороб пов'язано з дією на печінку екзогенних токсикантів (С.Д. Подимова, 1996).

Процеси, які відбуваються в печінці, діють на імунологічну реактивність організму. Їх порушення впливає на функціональну активність імунокомпетентних клітин, оскільки печінка синтезує цілу ниску біологічно активних речовин (БАР), які мають імунотропний вплив (І.Н. Алексєєва та співав., 1991). Дослідженнями встановлені зміни клітинного та гуморального імунітету на тлі різноманітних хвороб печінки (Е.В. Чернушенко та співав., 1995; С.В. Плахотник, 1997; А.О. Буєверов, 1998; К.П. Майер, 1999; Ю.І. Бажора та співав., 2001). Вищезазначені факти є підставою для застосування в гепатології імунокоригуючої терапії, але результати використання імуномодуляторів виявилися нерівнозначними (С.Д. Подимова, 1996). В зв'язку з цим при створенні, випробуванні та для ефективного використання нових імуномодуляторів високої специфічності необхідне подальше вивчення ролі печінки в функціюванні імунної системи з метою отримання в перспективі імуномодуляторів спрямованої дії (А.С. Логінов, 1991; А.С. Саратиков та співав., 1996; Ю.І. Бажора та співав., 2001).

Багато питань зв'язку між печінкою та імунною системою з'ясовуються саме в експерименті при моделюванні патологічного процесу за допомогою гепатотоксичних речовин. Вирішення цієї проблеми має важливе значення для дослідження механізмів патогенної дії гепатотоксичних речовин, поширення арсеналу лікарських засобів, багато з яких можуть мати імунокоригуючу дію. Слід звернути увагу, що імуномодулюючі властивості гепатопротекторів мало вивчені.

В публікаціях останніх років доведена висока біологічна активність елементу германію (І.Й. Сейфулліна, 1991, 1997; Chen et. al., 1992; Barnard D.L., 1997; Hongo R., 1998; О.Д. Немятих, Л.В. Савченкова, 2002). Германій виявлено в багатьох лікарських рослинах (Hara S. et. al., 1990). Біологічно активні речовини (БАР) на основі германію, що мають різноманітну дію, в тому числі гепатопротекторну, були розроблені та проходять доклінічне вивчення на кафедрі загальної та клінічної фармакології Одеського державного медичного університету (В.В. Годован, 1998; К.Ф. Шемонаєва, 2004). Одним з таких БАР є МІГУ-1, сполука германію з нікотиновою кислотою. Імуномодулююча дія цих речовин не вивчена. В клінічній практиці застосовуються також перспективні гепатопротектори, зокрема гептрал (А.С. Логінов, 1996; В.А. Горьков та співав., 2001; В.В. Горбаков та співав., 2004), імуномодулююча дія котрого залишається невідомою.

Вивченню імуномодулюючих властивостей МІГУ-1 та гепатопротектора гептралу в умовах відтворення токсичного гепатиту присвячена ця робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Матеріали дисертаційної роботи є фрагментами науково-дослідних програм в рамках цільового завдання МОЗ України “Методи ранньої діагностики інфекційних та запальних захворювань на основі використання молекулярно-генетичних і біофізичних технологій” (№ держреєстрації 0196U001839) та “Розробка методів діагностики та оцінки ефективності фармакотерапії специфічних і неспецифічних інфекційно-запальних процесів на основі молекулярно-генетичних та біофізичних технологій” (№ держреєстрації 0199U000262). Дисертант є співвиконавцем даних тем.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановлення наявності та з'ясування особливостей імунотропної дії МІГУ-1 і гептралу при експериментальному токсичному гепатиті. Для досягнення вказаної мети вирішували наступні задачі:

1. Вивчити динаміку стану Т-, В- і фагоцитарної ланок імунної системи у тварин з експериментальним токсичним гепатитом.

2. Оцінити стан Т-, В- і фагоцитарної ланок імунної системи в умовах різних схем гетероімунізації при експериментальному токсичному гепатиті та визначити особливості формування імунної відповіді за умов одночасного навантаження чужорідним антигеном.

3. Встановити дію МІГУ-1 і гептралу, які використовували в різних дозах, на показники імунної системи у інтактних та імунізованих тварин.

4. З'ясувати вплив МІГУ-1 та гептралу на показники імунної системи в умовах токсичного гепатиту та встановити наявність у них імуномодулюючих властивостей.

5. Провести порівняльний аналіз імуномодулюючих властивостей МІГУ-1 та гептралу з відомим гепатопротектором есенціалє, а також обгрунтувати доцільність іх використання в якості імуномодуляторів.

6. Обґрунтувати використання методу лазерної корреляційної спектроскопії (ЛКС) сироватки крові для оцінки ефективності вивчаємих лікарських речовин в умовах гетероімунізації та токсичного ураження печінки тварин.

Об'єкт дослідження: імунний статус імунізованих та уражених токсичним гепатитом щурів.

Предмет дослідження: основні закономірності та зсуви формування імунної відповіді при експериментальному токсичному гепатиті на тлі курсового введення гептралу, МІГУ-1, есенціалє.

Методи дослідження: фармакологічні, імунологічні, цитохімічні, біохімічні, біофізичні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчена щодобова динаміка змін показників основних ланок імунної системи при разовому введенні чотирихлористого вуглецю (ССl₄) інтактним та імунізованим тваринам, показано його імунотоксичну дію, яка призводить до суттєвого пригнічення (більш ніж втрічі) імунної відповіді і хвилеподібних змін показників імунного статусу протягом 21 доби спостережень. Доведено, що введення гепатотропної отрути одночасно з антигенним навантаженням призводить до більш значних змін імунного статусу, що пов'язано з подвійним навантаженням на імунну систему, яка одночасно реагує на чужорідний антиген і власні антигени зруйнованної печінки.

Вперше досліджена динаміка змін імунного статусу в умовах застосування МІГУ-1 і гептралу в різних дозах в умовах моделювання токсичного гепатиту у імунізованих та неімунізованих тварин, показана імуномодулююча дія цих речовин, яка виявилася в швидкій стабілізації та нормалізації (до 7-10 доби) показників імунної відповіді, при відсутності хвилеподібних змін показників.

Вперше проведена імунофармакологічна оцінка імуномодулюючих властивостей МІГУ-1 і гептрала при їх застосуванні в різних дозах і визначено дози, які дають оптимальний імунокоригуючий ефект, для МІГУ-1 - 10 мг/кг, для гептралу 20 і 40 мг/кг.

Вперше здійснено порівняльний імунофармакологічний аналіз ефективності МІГУ-1, гептрала і есенціалє при експериментальному токсичному гепатиті, та доведена доцільність використання досліджених речовин в якості імуномодуляторів.

Вперше за допомогою методу ЛКС проведена комплексна оцінка динаміки імунного гомеостазу у тварин з експериментальним токсичним гепатитом на тлі антигенного навантаження, в умовах застосування МІГУ-1, гептралу і есенціалє та встановлен зв'язок між динамікою ЛК-спектрів та змінами показників імунного статусу.

Практичне значення отриманих результатів. На основі запроваджених імунологічних досліджень теоретично обґрунтована та експериментально доведена можливість використання в якості імуномодуляторів МІГУ-1 та гептралу.

На адекватній моделі токсичного гепатиту визначено нові, раніше невідомі імуномодулюючі властивості МІГУ-1 і гептралу, що має важливе практичне значення для розширення існуючих уявлень про властивості цих препаратів.

Обґрунтовано доцільність застосування методу лазерної кореляційної спектроскопії сироватки крові для оцінки динаміки імунного гомеостазу за умов розвитку токсичного ураження печінки та проведення імунотерапії цих уражень.

Виявлено особливості формування імунної відповіді при токсичному ураженні печінки в умовах антигенного навантаження, відроблені дози та строки введення МІГУ-1 та гептралу, які дають позитивний імуномодулюючий ефект.

Основні результати дисертаційної роботи були впроваджені у навчальний процес на кафедрах клінічної імунології, генетики і медичної біології; загальної і клінічної фармакології; патологічної анатомії; загальної та клінічної патологічної фізіології Одеського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто був здійснений патентно-інформаційний пошук, визначені мета і задачі дослідження, методичні підходи, опрацьовані моделі, за якими особисто виконані експериментальні дослідження. Здійснена математична обробка отриманих результатів та оформлення їх у вигляді таблиць і графіків, аналіз отриманих результатів, сформульовані висновки роботи, опубліковані основні матеріали дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені і знайшли позитивну оцінку на V Національному російському конгресі “Человек и лекарство” (Москва, 1998); 67 підсумковій конференції студентів і молодих вчених ОДМУ (Одеса, 1998); ХІV Міжнародній школі-семінарі “Spectroscopy of Molecules and Crystals” (Одеса, 1999); науково-практичній конференції “Биофизические стандарты и информационные технологии в медицине” (Одеса, 2002); VII З'їзді всеукраїнського лікарського товариства (Тернопіль, 2003); IV Конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004); науковій конференції ІІІ-і читання ім. В.В. Підвисоцького (Одеса, 2004); науково-практичній конференції з міжнародною участю “І.М. Сєченов та Одеська школа фізіологів” (Одеса, 2004); міжнародній науково-практичній конференції “Наукові дослідження. Теорія та експеримент” (Полтава, 2005).

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Роботу виконано на 995 статевозрілих щурах обох статей лінії “Вістар”, вагою 180-250 г.

Експериментальне токсичне ураження печінки одержували одноразовим введенням ССl₄ в шлунок (A. Watanabe et al. 1976).

В експериментах досліджували гептрал (Knoll, Germany) і МІГУ-1 (координаційну сполуку германію з нікотиновою кислотою), синтезовану на кафедрі загальної хімії та полімерів ОНУ ім. І.І. Мечникова (І.Й. Сейфулліна, 1991). Вибір доз введення для гептралу визначався на підставі даних літератури щодо токсичності та терапевтичної ефективності (А.С. Логінов та співав., 1996). Дози склали 20, 40 та 80 мг/кг маси тварини. Дози введення МІГУ-1 розраховувались на основі попереднього вивчення токсичності (В.В. Годован, 1998) і склали 10 мг/кг (1/135 ЛД₅₀) - терапевтична доза, 74 мг/кг та 174 мг/кг (1/10 ЛД₅₀). Як препарат порівняння використовували есенціалє (80 мг/кг), імуномодулюючі властивості якого відомі (Б.С. Утєшев та співав., 1997-1998). Речовини вводили внутрішньоочеревинно (в/о) один раз на добу протягом 7 діб, інтактним та імунізованим тваринам для вивчення імуномодулюючого ефекту. Тваринам з токсичним гепатитом препарати вводили починаючи з моменту отруєння. Імунізацію проводили в/о введенням 0,5 мл 50 % взвісі еритроцитів барана (ЕБ). Контрольній групі вводили в/о по 0,5 мл 0,9 % фізіологічного розчину.

Відповідно до поставлених задач були сформовані 34 групи тварин (табл. 1). Дослідження проводили в динаміці на 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 21 добу після отруєння.

Для оцінки загальної реакції імунної системи на різні умови експерименту в селезінці підраховували відносний вміст клітин. Імунний статус обстежених тварин вивчали, досліджуючи вміст і функціональну активність основних популяцій лімфоцитів в периферичній крові, селезінці та регіонарних лімфовузлах. Популяції лімфоцитів (Т- и В- клітини) визначали за кластерами детермінації: Т- клітини за маркером CD3+, В- клітини - CD22+, за методом непрямої імунофлуоресценції (А.Н. Чередєєв та співав., 1999) з використанням моноклональних антитіл (МКАТ) (Becman Coulter, США). Функціональну активність визначали в тесті розеткоутворення (К.А. Лебедєв, І.Д. Понякіна, 1991). Лімфоцити виділяли за методом А. Бейум (1980). Фагоцитарну активність оцінювали в тесті поглинання нейтрофілами вбитих нагріванням пекарських дріжджів та за вмістом катіонних білків в лейкоцитах крові (В.Д. Драгомирецький та співав., 1986 ), НСТ-тесті (Ю.І.Бажора та співав., 1987).

Таблиця 1 Експериментальні групи та кількість тварин, використаних в роботі

№ гр.	Назва групи	Кількість тварин
1	Інтактні (контроль)	5
2	Імунізовані	5
3-9	Інтактні +препарати (різні дози)	35
10-16	Імунізація+препарати в різних дозах (ім. на фоні введення)	35
17-23	Імунізація+препарати в різних дозах (ім. після введення)	35
24	Гепатит	80
25	Гепатит+імунізація (імунізація до введення CCl4)	80
26	Гепатит+імунізація (імунізація одночасно з введенням CCl4)	80
27-30	Гепатит+препарати	320
31-34	Гепатит+імунізація+препарати	320

Антитілоутворюючу функцію імунної системи оцінювали за вмістом антитілоутворюючих клітин (АУК) в селезінці та регіонарних лімфовузлах, а також за рівнем гемолізинів в сироватці периферичної крові. ЛКС сироватки крові проводили за раніше описаним методом (Ю.І. Бажора, та співав., 1996). Одночасно з імунологічними дослідженнями вивчали активність ферментів цитолізу - аспартатамінотрансферази (АСТ) і аланінамінотрансферази (АЛТ), та холестазу - лужної фосфатази (ЛФ) і гаммаглутамілтрансферази (ГГТ) в сироватці крові. Всі дані обробляли за допомогою загальноприйнятих для медико-біологічних досліджень методів статистичного аналізу на комп'ютері із застосуванням стандартних пакетів програми “Statistics 5.0”.

Результати досліджень та їх обговорення. При токсичному гепатиті спостерігались суттєві зміни в імунній системі дослідних тварин, у щурів відбувалися достовірні зсуви в співвідношенні і абсолютній кількості клітин селезінки - одного з основних органів імунної системи, яка практично завжди реагує на різні токсичні впливи, в тому числі і на гепатотоксичні речовини.

Найбільш значні зсуви в імунному статусі спостерігаються на 2 і 3 добу токсичного гепатиту: різко пригнічувалися фагоцитарна та клітинна ланки імунної системи, знижувалась фагоцитарна активність нейтрофільних лейкоцитів, що можливо пояснити порушенням структури їх мембранного комплексу, ймовірним ушкодженням великої кількості лейкоцитів периферичної крові та їх накопиченням в органі-мішені. В циркуляцію потрапляють молоді клітини, які відрізняються неповною спроможністю фагоцитарної активності. Фагоцитарна ланка імунної системи починає відновлюватися з 5 доби токсичного гепатиту і досягає показників контрольної групи на 10-14 добу спостережень.

Одночасно зменшується відносний вміст Т- і В- лімфоцитів у крові, селезінці, лімфовузлах; протягом 1-21 діб змінення цих показників має хвилеподібний характер (рис. 1). Паралельно з падінням вмісту загальної популяції Т- клітин спостерігається різке пригнічення їх рецепторної активності, що проявилося в суттєвому знижені кількості середньоактивних клітин, вірогідно, за рахунок втрати клітинами частини рецепторів та переходу в малоактивні Т- лімфоцити. Рецепторна активність В- лімфоцитів також знижується. Показники клітинного імунітету відновлюються повільно, кількість Т- і В- лімфоцитів в крові, селезінці, лімфовузлах навіть на 14 добу не досягає показників контрольної групи; лише на 20 добу після отруєння ці показники майже відповідають нормі. Можна заключити, що ураження печінки чотирихлористим вуглецем найбільше торкається стану клітинної ланки імунної системи. Це можна пов'язати з порушенням синтезу в печінці імунорегуляторних факторів.

Дні досліджень

Рис. 1. Динаміка деяких показників імунної системи при експериментальному токсичному гепатиті

Зміна активності ферментів (АЛТ, АСТ, ГГТ, ЛФ) при токсичному гепатиті була односпрямованою та полягала в збільшенні їх активності (р0,05). Це свідчить про виражене ушкодження печінкової паренхіми, а саме цитолізі і вимиванні ферментів в кровоток. Відновлення показників відбувалося на 7 добу досліджень. Імунологічні і біохімічні зміни добре порівнюються між собою, слід відмітити, що біохімічні показники відновлюються скоріше, ніж імунологічні.

В ЛК-спектрах значно зменшується внесок в світлорозсіяння часточок в діапазоні від 10 до 100 нм, в порівнянні з контролем, з'являються понадвеликі часточки (1000 нм і більше), що характерно для некробіозу та дистрофії, коли переважають процеси розпаду. Таким чином, ЛКС дозволяє реєструвати початкові зміни гомеостазу (рис. 2). Порушення ЛК- спектрів не є специфічними, вони характеризують загальний стан гомеостазу організму. Зміни розміру часток сироватки крові та їх відсоткового внеску у гістограми попереджають зсувам показників імунної системи, що дає можливість діагностувати гепатит на ранніх термінах перебігу хвороби. За допомогою ЛКС можливо більш чітко прослідкувати динаміку розвитку гепатиту.

Вже через добу після отруєння тварин ССl₄ відбуваються суттєві зсуви як у відносному, так і в абсолютному вмісті клітин селезінки, що свідчить про пригнічення процесів проліферації і диференціювання, які можливо охарактеризувати як відповідь на токсичну дію гепатотропної отрути. Таким чином, ССl₄ поряд з гепатотоксичною дією має виражений імунотоксичний ефект, пригнічуючи імунну відповідь у всі фази її формування. Хоча неможливо виключити ареактивність системи імунітету, викликану одночасним викидом великої кількості різних антигенів: гетероантигенів (антигени ЕБ) і аутоантигенів (різні комплекси з ушкоджених гепатоцитів). Ця перебудова в селезінці, вірогідно, віддзеркалюється на функціональному стані клітин, що беруть участь у формуванні імунної відповіді на чужорідний антиген (ЕБ), а також забезпечують захисні механізми від аутоагресії, викликаної антигенами власних клітин печінки, які уражуються при токсичній дії ССl₄. Дійсно, зіставлення динаміки накопичення АУК в селезінці та регіонарних лімфовузлах, а також титрів гемолізинів в сироватці крові у двох дослідних групах, показало, що введення ССl₄ на 4 добу після імунізації (пік накопичення АУК) призводить до пригнічення кількості АУК як в селезінці, так і в регіонарних лімфовузлах, та відповідно до зниження титру специфічних антитіл. Більш виражений пригнічуючий ефект спостерігався в групі тварин, яким одночасно вводили ССl₄ і ЕБ.

Таким чином, введення гепатотропної отрути одночасно з імунізацією щурів призводить до порушень у всіх трьох основних ланках імунної системи. Ці зміни охоплюють не тільки регіонарні лімфовузли, але й селезінку, яка бере участь в системній імунній відповіді, а також торкаються вмісту та функцій циркулюючих в периферичній крові клітин імунної системи. Проведені дослідження свідчать про суттєве зниження імунної відповіді отруєних тварин на чужорідний антиген, а також, посередньо, на масований викид аутоантигенів із зруйнованих гепатоцитів, що припускає складний супресорний механізм впливу на імунну систему. При цьому суттєвих відмінностей активності ферментів цитолізу та холестазу в імунізованих групах, в зрівнянні з групою без імунізації, виявлено не було.

Результати ЛКС-метрії підкреслюють закономірності, які виникають в функціонуванні імунної системи. Характер ЛК- спектрів свідчить про збільшення в периферичній крові великої кількості великодисперсних часток вже в 1 добуспостережень, що, ймовірно, пов'язано з ушкодженням мембран гепатоцитів та інших клітин печінки. Закономірності ЛК- спектрів на 5-10 добу досліджень вказують на внесок імунної системи в характер зсувів гістограм вліво за рахунок гуморальних факторів імунітету - зокрема ЦІК.

Аналізуючи імунологічні та біохімічні дані, які були отримані при курсовому введенні МІГУ-1 і гептралу інтактним тваринам в широкому діапазоні доз, можна зробити наступне заключення. При введенні інтактним тваринам в терапевтичних дозах досліджувані речовини і препарат порівняння не мали негативного впливу на імунний статус і біохімічні показники сироватки крові. Це має важливе значення, тому що стимуляція нормально функціонуючої імунної системи може привести до небажаних наслідків, наприклад, сприяти активації аутоімунного процесу.

Великі дози МІГУ-1 (74 та 147 мг/кг) пригнічують активність ферментів цитолізу (в більшій мірі АЛТ ніж АСТ) у сироватці крові інтактних тварин при введенні протягом 7 діб. МІГУ-1 в дозі 10 мг/кг і гептрал у всіх вивчених дозах не змінювали активності в сироватці крові. Це свідчить про їх нетоксичність. Обидва препарати у високих дозах проявляють імунодепресивні властивості, що може бути корисним для блокування аутоімунних реакцій при токсичному гепатиті.

При введенні препаратів після імунізації ЕБ біохімічні показники схожі з показниками у інтактних тварин. МІГУ-1 в дозах 74 і 147 мг/кг приводив до зниження активності ферментів, гептрал і есенціалє ймовірно не змінювали активності ферментів. Введення препаратів одночасно з імунізацією також не змінювало активності ферментів.

При курсовому введенні МІГУ-1 на фоні імунізації збільшувалася кількість АУК в селезінці з прямим дозозалежним ефектом. Встановлено, що МІГУ-1 має імунотропний вплив на гуморальну ланку імунної системи. Ця властивість більш виражена при введенні МІГУ-1 в дозах від 10 до 74 мг/кг тваринам, імунізованим на тлі введення БАР. У великих дозах МІГУ-1 має слабкий імуносупресивний ефект на антитілоутворюючу функцію. МІГУ-1 виявляє більш значний вплив на гуморальну імунну відповідь у імунізованих тварин, ніж гептрал і препарат порівняння есенціалє. Дія на клітинну ланку імунної системи у вказаних дозах була менш значною. Спостерігалося зменшення кількості Т-лімфоцитів та їх активності в селезінці і лімфовузлах. Активація функціональної активності нейтрофільних лейкоцитів у імунізованих тварин, які отримували МІГУ-1, була незначною. Дозозалежного ефекту не виявлено.

Застосування гептралу в різних дозах після і на тлі імунізації також призводило до зміни імунної відповіді: збільшилась кількість АУК селезінки, фагоцитарна активність нейтрофільних лейкоцитів, спостерігалось невелике зменшення кількості Т- клітин в селезінці, лімфовузлах, крові. Дозозалежного ефекту при введенні гептралу імунізованим тваринам не виявлено. Аналогічний ефект у відношенні антитілоутворюючої функції відмічався також при введенні препарату порівняння есенціалє. Можна констатувати, що МІГУ-1 і гептрал мають дещо різний вплив на показники імунного статусу, МІГУ-1 більш вибірково впливає на гуморальну імунну відповідь, має дозозалежний ефект.



інтактні імунізовані

гепатит 1-а доба гепатит+імунізація 1-а доба

гепатит 2-а доба гепатит+імунізація 2-а доба

гепатит 3-я доба гепатит+імунізація 3-я доба

гепатит 5-а доба гепатит+імунізація 5-а доба

гепатит 7-а доба гепатит+імунізація 7-а доба

гепатит 10-та доба гепатит+імунізація 10-та доба

гепатит 14-та доба гепатит+імунізація 14-та доба

Рис. 2. Гістограми розподілу субфракцій світлорозсіюючих часток сироватки крові щурів при токсичному гепатиті та імунізації в різні строки.

Гептрал більш “м'яко” впливає на імунну відповідь, дозозалежного ефекту не спостерігається. Обидві сполуки не виявили суттєвого впливу на кисеньзалежну ланку бактерицидної системи нейтрофільних лейкоцитів.

ЛК-спектрометрія сироватки крові піддослідних тварин погоджується з даними імунологічного статусу та біохімічних досліджень. Введення вивчаємих сполук в терапевтичних дозах принципово не впливає на характер ЛК-спектрів. В той же час у імунізованих тварин на тлі курсового введення досліджуваних речовин встановлені відмінності в ЛК-спектрах, в порівнянні з імунізованими щурами. Виявлена односпрямована закономірність, котра полягає в суттєвому зменшенні внеску в світлорозсіяння понадвеликих часток (264 нм і більше). Ймовірно, це пов'язано з швидким розпадом та виведенням сформованих імунних комплексів.

Вплив досліджуваних БАР на перебіг експериментального токсичного гепатиту, за даними змін імунного статусу, було розглянуто в порівнянні з есенціалє. Вивчення впливу гепатопротекторів на імунний статус неімунізованих і імунізованих тварин за умов експериментального токсичного гепатиту показало наступне. Порівняння показників імунної системи групи з ГТГ, в якій використовували есенціалє, з групою, в якій лікування не проводилось, виявляє суттєві відмінності в динаміці вмісту і рецепторній активності Т- і В-лімфоцитів. Більш суттєві зсуви показників імунної відповіді спостерігаються у імунізованих тварин в селезінці та регіонарних лімфовузлах, але ці зміни проявляються в меншому ступені, ніж у тварин, яким лікування не проводили. Не спостерігається хвилеподібна картина динаміки показників імунної відповіді, яка характерна для токсичного гепатиту без лікування. Отримані нами результати свідчать про позитивний вплив есенціалє на фагоцитарну ланку імунної системи при ГТГ. Швидко відновлюються показники фагоцитарної активності, які досягають таких в контрольній групі на 5 добу після початку введення есенціалє. Ймовірно, з цим пов'язано швидке зниження рівня ЦІК, тому що відбувається їх елімінація фагоцитами. Показники фагоцитарної ланки на фоні антигенного навантаження в умовах використання есенціалє змінюються в меншому ступені. На 1 добу після введення CCl₄ фагоцитарне число і фагоцитарний індекс, показники НСТ тесту нейтрофільних лейкоцитів знижуються в 2 рази, після чого починається відновлювання фагоцитарної активності з нормалізацією показників на 3-5 добу після початку лікування. Таким чином, використання есенціалє пом'якшує і згладжує наслідки впливу CCl₄ на імунну систему, а також блокує прояв аутоімунних реакцій (рис. 3).

Дні досліджень

Рис. 3. Динаміка змін деяких показників імунної системи при експериментальному токсичному гепатиті на тлі використання есенціалє.

Аналізуючи в цілому показники імунної відповіді при ГТГ на фоні застосування гептралу в дозах 20 і 40 мг/кг без антигенного навантаження, можна заключити, що препарат має імуномодулюючу дію. Це виявляється в більш швидкому відновленні показників імунного статусу, відсутності хвилеподібної динаміки змін показників, що говорить про пригнічення аутоімунного компоненту у розвитку токсичного ураження печінки.

Динаміка показників фагоцитарної ланки імунної системи під час лікування тварин гептралом схожа з такою на фоні використання есенціалє. В умовах застосування гептрала всі показники фагоцитарної активності швидко досягають норми, а вже на 3-5 добу досліджень набувають контрольних значень.

В умовах антигенного навантаження відновлення імунного статусу відбувається повільніше. Динаміка показників імунної відповіді взагалі схожа з такою при використанні есенціалє. Можна вважати, що використання гептралу в дозі 40 мг/кг для лікування токсичного гепатиту має більший вплив на імунну систему, ніж введення препарату в дозі 20 мг/кг, стабілізація показників імунної відповіді відбувається швидше (рис. 4).

МІГУ-1 використовували для лікування тварин тільки у терапевтичній дозі (10 мг/кг), тому що ця доза не викликала змін імунного статусу у інтактних тварин. Аналізуючи в цілому показники імунної відповіді при ГТГ на фоні використання МІГУ-1 без антигенного навантаження, можна зробити заключення про його імуномодулюючу дію, що виявилось в стабілізації показників імунної відповіді і більш швидкому їх відновленні, ніж в групі, де лікування не проводилось. Швидше відновлення показників імунного статусу відбувається в периферичній крові, що пов'язано, ймовірно, з переміщенням частини Т- і В- клітин в периферійний кровоток із селезінки та лімфовузлів.

Дні досліджень

Рис. 4. Динаміка змін деяких показників імунної системи при експериментальному токсичному гепатиті на тлі використання гептралу (40 мг/кг).

Показники фагоцитарної ланки імунної системи змінюються незначно і швидко відновлюються. Слід відмітити, що введення тваринам МІГУ-1 для лікування токсичного гепатиту призводить до збільшення фагоцитарного індексу нейтрофільних лейкоцитів, що спостерігалось з 3 по 10 добу експерименту (рис. 5).

Дні досліджень

Рис.5. Динаміка змін деяких показників імунної системи при експериментальному токсичному гепатиті на тлі використання МІГУ-1 (10 мг/кг).

При введенні МІГУ-1 (10 мг/кг) в умовах антигенного навантаження динаміка змін показників імунної відповіді подібна до такої, коли використовували гептрал і препарат порівняння есенціалє. Есенціалє суттєво прискорює відновлення активності ферментів до рівня контрольної групи. Як правило, на 4-5 добу відновлювалась активність АЛТ, АСТ і ГГТ, активність ЛФ відновлювалась на 10 добу. При токсичному гепатиті на тлі застосування есенціалє в умовах антигенного навантаження відбувалися подібні, але більш виражені зсуви активності ферментів цитолізу і холестазу, що пояснюється значно важчим перебігом патологічного процесу при імунізації. В цьому випадку організм тварин несе подвійне навантаження: крім процесів детоксикації, він змушений реагувати на антигени власної зміненої печінки та чужорідний антиген (ЕБ). Можна зробити висновок, що препарат есенціалє має виражений гепатопротекторний ефект в обох розглянутих варіантах експерименту.

Застосування гептрала в дозах 20 і 40 мг/кг вірогідно змінює динаміку перебігу токсичного гепатиту, запобігає змінам активності ферментів АЛТ и АСТ, викликаних введенням СС1₄. Активність ферментів швидко відновлюється до рівня контрольної групи, на відміну від груп де лікування не проводилось. Виявлено гепатозахисний ефект гептрала при експериментальному токсичному гепатиті без імунізації, а також в умовах антигенного навантаження. Слід відзначити, що ефект дії гептралу не поступається показникам препарату порівняння есенціалє.

МІГУ-1 в дозі 10 мг/кг запобігає змінам активності ферментів цитолізу та холестазу, викликаних отруєнням СС1₄, що підтверджує його гепатозахисні властивості. Ефект дії МІГУ-1 і гептралу на активність ферментів при токсичному гепатиті приблизно однаковий і порівнюється з есенціалє.

ЛК-спектрометрія сироватки крові дослідних груп тварин співпадає з показниками імунного статусу та біохімічних досліджень. Найбільш суттєві зсуви гомеостазу сироватки крові спостерігаються на 2-3 добу після введення тваринам CCl₄ і виявляються в збільшенні внеску в світлорозсіяння наднизькомолекулярних та надвисокомолекулярних часток. В наступні строки спостережень гістограми ЛК-спектрів нормалізуються. Вже на 5 добу експерименту при застосуванні досліджуваних препаратів класифікаційний аналіз ЛК-спектрів не виявляє суттєвих різниць, зони дисперсії мають значні зони перекриття.

Необхідно підкреслити, що, за даними наших експериментів, введення всіх вивчених препаратів курсом в 7 діб не є достатнім, тому що в ці терміни все ж таки не відбувається повного відновлення всіх показників імунної відповіді. В зв'язку з цим можлива доцільність вивчити більш тривалий курс введення препаратів, що, вірогідно, призведе до прискорення стабілізації показників імунної системи.

В закінчення слід підкреслити, що за критеріями імунотропної і гепатотропної активності, за даними ЛКС-метрії, гептрал і МІГУ-1 не поступаються дії препарату порівняння есенціалє, мають виражену імуномодулюючу дію, яка виявляється в стабілізації показників імунної відповіді. Обидві сполуки підвищують фагоцитарну активність, внаслідок чого відбувається швидка елімінація імунних комплексів. Завдяки такій дії препаратів прискорюються регенеративні процеси і відновлюються функціональні можливості печінки.

імуномодулюючий гепатопротектор токсичний

Висновки

У дисертації наведене експериментальне та теоретичне вирішення важливої наукової задачі сучасної фармакології - вивчення нових імуномодулюючих властивостей гепатопротектора гептралу і БАР з відомими гепатозахисними властивостями МІГУ-1 при експериментальному токсичному гепатиті з антигенним навантаженням і без нього. Показана значна інформативність ЛКС крові для оцінки імунного гомеостазу.

1. При експериментальному токсичному гепатиті спостерігається суттєве пригнічення функціональної активності імунної системи, що характеризується достовірним (р<0,05) зниженням вмісту в крові і лімфоїдних органах Т- і В- лімфоцитів, а також їх рецепторної активності, зниженні поглинаючої і бактерицидної функції фагоцитів. Імунний статус не відновлювався до 21-ї доби спостережень на фоні нормалізації в цей час біохімічних і морфологічних критеріїв функції печінки.

2. Імунізація з одночасним введенням гепатотропної отрути призводить до суттєвого пригнічення формування імунної відповіді на чужорідний антиген (ЕБ). Кількість АУК знижувалась на 65 % (р<0,05), рівень гемолізинів на 60 % (р<0,05). При цьому знижувалась (р<0,05) кількість Т- і В- лімфоцитів та їх рецепторна активність.

3. МІГУ-1 в дозі 10 мг/кг, гептрал в дозі 20 і 40 мг/кг, есенціалє в дозі 80 мг/кг при курсовому введенні не виявляли негативного впливу на імунний статус інтактних і імунізованих тварин.

4. В більш великих дозах (для МІГУ-1 74 і 147 мг/кг, для гептралу - 80 мг/кг) вивчаємі препарати виявляли дозозалежний імуносупресивний ефект, що виявилося в зменшенні кількості клітин імунної системи і їх функціональної активності.

5. В терапевтичних дозах МІГУ-1 і гептрал усувають імуносупрессію при експериментальному токсичному гепатиті. Вивчені показники імунної системи досягають контрольних значень на 10 добу спостережень. При імунізації отруєних тварин курсове введення МІГУ-1 і гептралу збільшує кількість АУК і рівень антитіл в селезінці та лімфовузлах (р<0,05).

6. Між динамікою ЛК-спектрів і зміною показників імунної системи в умовах експериментального токсичного гепатиту існує зв'язок. Динаміка ЛК-спектрів, в певній мірі, співпадає з динамікою імунологічних і морфологічних критеріїв перебігу експериментального токсичного гепатиту.

7. Зміни ЛК- спектрів більш виражені і тривалі у тварин імунізованих одночасно з введенням CCl₄, спостерігається збільшення внеску надвисокомолекулярних часточок. Характер ЛК- спектрів при цьому не відновлюється до 21 доби спостережень.

8. Отримані результати дають уяву стосовно імунотропної активності вивчаємих речовин та розкривають перспективи їх подальшого вивчення і застосування в якості імуномодуляторів.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Шевченко І.М. Імуноморфологія токсичного гепатиту на фоні корекції гепатопротектором гептралом // Буковинський медичний вісник. - 2004. - №3. - С. 176-181.

2. Шевченко І.М., Пашолок С.П. Функціональний стан імунної системи при експериментальному токсичному гепатиті // Одеський медичний журнал. - 2004. - №5. - С. 23-27. (Внесок дисертанта: розробка загальної концепції та схеми дослідження, проведення експерименту, вивчення імунологічних показників, аналіз результатів).

3. Шевченко І.М. Лазерна кореляційна спектроскопія сироватки крові як інтегральний показник гомеостазу організму при експериментальному токсичному гепатиті і одночасному антигенному навантаженні // Досягнення біології та медицини. - 2004. - №3. - С. 31-38.

4. Шевченко І.М., Годован В.В. Корекція імунного статусу при токсичному гепатиті експериментальним гепатопротектором МІГУ-1 // Буковинський медичний вісник. - 2005. - №1. - С. 100-103. (Внесок дисертанта: розробка загальної концепції та схеми наукового дослідження, проведення експерименту, вивчення імунологічних показників, статистична обробка і аналіз результатів).

5. Шевченко І.М., Годован В.В., Пашолок С.П. Вплив курсового введення гептралу та БАР МІГУ-1 на імунний статус інтактних тварин // Одеський медичний журнал. - 2005. -№1. - С. 35-38. (Внесок дисертанта: розробка загальної концепції та схеми наукового дослідження, проведення експерименту, вивчення імунологічних показників, аналіз результатів).

6. Шевченко І.М., Бажора Ю.І. Вплив курсового введення біологічно активної речовини МІГУ-1 на імунний статус інтактних тварин // Клінічна та експериментальна патологія. - 2004.- Т. 3. - №2. - Ч. 2. - С. 384-386. (Матеріали IV Конгресу патофізіологів України, Чернівці. - 2004) (Внесок дисертанта: проведення експерименту, вивчення імунологічних показників, статистична обробка та участь в аналізі результатів).

7. Сивоконюк О.В., Шевченко І.М. Імуномодулююча дія гепатопротекторів при токсичному гепатиті // Нові технології у навчальному процесі, теоретичній та клінічній медицині (додаток до Одеського медичного журналу). - Одеса. - 1999. - С.286-288. (Внесок дисертанта: огляд імуномодулюючих властивостей гепатопротекторів).

8. Лазерная корреляционная спектроскопия плазмы крови как интегральный показатель состояния организма / Кресюн В.И., Бажора Ю.И., Годован В.В., Шевченко И.М., Волошенков Б.А. // Материалы V Национального Российского Конгресса “Человек и лекарство”. - Москва, 1998. - С. 498. (Внесок дисертанта: проведення експерименту, участь в аналізі результатів).

9. Шевченко І.М., Андронов Д.Ю. Вплив гепатопротекторів на гомеостаз сироватки крові у щурів // Матеріали 67 підсумкової студентської наукової конференції. - Одеса, 1998. - С. 100. (Внесок дисертанта: проведення експерименту, загальний аналіз результатів).

10. Andronov D., Shevchenko I., Voloshenkov B. Usage of the laser correlation spectroscopy for an estimation of a rat's homeostasis at an experimental pathology and its correction by drugs // Abstract ХІV Intern. School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”. - Odessa, 1999. - P. 134. (Внесок дисертанта: розробка схеми дослідження, проведення експерименту, участь в аналізі результатів).

11. Шевченко И.М., Сивоконюк О.В. Влияние гептрала на процессы иммунного ответа, гистоструктуру печени и органов иммуногенеза у крыс с экспериментальным токсическим гепатитом // Материалы научно-практической конференции „Биофизические стандарты и информационные технологии в медицине”. - Одесса. - 2002. - С. 45. (Внесок дисертанта: розробка схеми дослідження, проведення експерименту, аналіз імунологічних показників).

12. Шевченко І.М., Бажора Ю.І. Стан імунної системи при токсичному гепатиті в експерименті // Українські медичні вісті. - 2003. - Т. 5. - №1. - С. 137. (Матеріали VII з'їзду всеукраїнського лікарського товариства. - Тернопіль, 2003). (Внесок дисертанта: проведення експерименту, вивчення імунологічних показників, статистична обробка та участь в аналізі результатів).

13. Шевченко И.М. Динамика изменений иммунного статуса животных при экспериментальном токсическом гепатите // Матеріали наукової конференції ІІІ-і читання ім. В.В. Підвисоцького. - Одеса, 2004. - С. 91-92.

14. Шевченко І.М. Корекція імунного статусу при експериментальному токсичному гепатиті гепатопротектором гептралом // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю „І.М. Сєченов та Одеська школа фізіологів”. - Одеса, 2004. - С. 166-168.

15. Шевченко І.М. Використання сполуки германію з гепатозахисними властивостями МІГУ-1 для корекції імунного статусу при токсичному гепатиті // Матеріали міжнародної науково-практичної конференції “Наукові дослідження. Теорія та експеримент”. - Полтава, 2005. - С. 28-32.

Размещено на Allbest.ru

...