Застосування методу біохемілюмінесценції в токсикологічних дослідженнях

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ТАВРІЙСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Застосування методу біохемілюмінесценції в токсикологічних дослідженнях

При цьому нами введені наступні параметри: Іеф - величина інтенсивності біохемілюмінесценції наприкінці середньо-ефективного часу загибелі тварин (ЕТ50); tm - час досягнення максимальної інтенсивності світіння; tg , tg * - тангенси кутів нахилу висхідних і спадних ділянок динамічних кривих до вісі часу; tк. - час досягнення контрольних значень інтенсивності; Sк - світлосума світіння за час tк.; к - коефіцієнт токсичності, що визначається для кожного із ксенобіотиків за формулою к = tк / tm2, де tm й tк - відповідно час досягнення максимального й контрольного значень інтенсивності біохемілюмінесценції. Причому, варто звернути особливу увагу на той факт, що при впливі певних доз досліджуваних ксенобіотиків, інтенсивність Іеф мала приблизно одне й теж значення для всіх ксенобіотиків, що дозволяє виділити цей параметр як критеріально значущий, за яким ми й визначали ступінь інтоксикації: 1) абсолютно смертельний (при одержанні дози ДЛ100) інтенсивність (Іеф) БХЛ фоновим значенням інтенсивності (50100 імп/с); 2) дуже важкий (при одержанні дози ДЛ50) - інтенсивність світіння (Іеф 300 імп/с) приблизно в 2 рази менше інтенсивності світіння контрольної групи тварин (Ік); 3) важкий (при одержанні дози Ѕ ДЛ50) інтенсивність світіння (Іеф 600 імп/с) приблизно дорівнює інтенсивності світіння Ік; 4) середній (при одержанні дози 1/5 ДЛ50) - інтенсивність світіння (Іеф 900 імп/с) більше інтенсивності Ік приблизно в 1,5 рази; 5) легкий ступінь (при одержанні дози 1/10 ДЛ50) - інтенсивність світіння (Іеф 1500 імп/с) більше Ік приблизно в 2,3 рази. Встановлено, що існує чітка залежність параметрів динамічних кривих від дози, тобто при збільшенні дози кожного із ксенобіотиків збільшується величина tg * і зменшуються величини Іеф, tк, к й Sк.

Якщо розташувати ксенобіотики в ряд за мірою збільшення їхньої токсичності: Л-402; МЦ; АФ9-12; 12-краун-4, то tm, ЕТ50, tк й Sк за час tк мають тенденцію зменшуватися, а tg , tg * і коефіцієнти токсичності к - збільшуватися.

Показано, що введений нами коефіцієнт токсичності к є дозозалежним. При цьому залежність дози кожного ксенобітика від коефіцієнта токсичності описується лінійним регресійним рівнянням: D = ai - bi к, де ai й bi - константи, величини яких залежать від виду хімічної речовини, причому величина аi для кожної речовини приблизно відповідає подвоєному значенню ДЛ100, bi = ДЛ100/ к. З рис. 2 видно, що кожний ксенобіотик характеризується своїми величинами швидкості наростання й спаду висхідної та спадної ділянок кінетичних кривих, тобто різними величинами тангенсів кутів нахилу (tg б ) і (tg б*); різним часом, через який спостерігається максимальне значення інтенсивності (tm); різним часом виходу кривих на контрольні значення ( tк ); різними світлосумами світіння до виходу на контроль (Sк).

При обґрунтуванні органів-мішеней показано, що поряд з гістологічними дослідженнями метод біохемілюмінесценції виявляє органи, системи й функції організму, які найбільш ушкоджуються при токсифікації організму. Так, усі випробувані ксенобіотики найбільше підвищували інтенсивність БХЛ гомогенатів нирок, печінки й серця. При цьому їхня інтенсивність ХЛ збільшувалася в середньому в 1,5 рази в порівнянні з контрольними величинами. Результати досліджень показали, що для кожного органа характерна висока субстратна специфічність хемілюмінограми. Установлені також особливості дії кожного ксенобіотика, що виражалося в зміні інтенсивності БХЛ гомогенатів різних внутрішніх органів і тканин піддослідних тварин: лапроксид Лд-703 у порівнянні з іншими сполуками істотно підвищував інтенсивність гомогенатів селезінки, тимуса й лімфатичних вузлів (в 1,8 рази); метилцелозольв - головного мозку (в 1,6 рази); макроциклічний ефір 12 краун-4 - наднирників (в 1,7 рази) і головного мозку (в 1,6 рази).

Рис. 2. Динаміка інтенсивності біохемілюмінесценції (I, імп/с) сироватки крові білих мишей з часом під дією різних ксенобіотиків із дозою ДЛ100. (tg , tg * - тангенси кутів нахилу висхідних і спадних ділянок динамічних кривих до вісі часу).

Визначення ступеня кумуляції досліджуваних хімічних речовин провадилося за параметрами динамічних кривих біохемілюмінесценції сироватки крові лабораторних тварин, токсифікованих дозами 1/5 ДЛ50 й 1/10 ДЛ50 у підгострому досліді. Здійснювалося виявлення й формалізація двох систем залежностей: доза - ефект і час впливу - ефект. На рис.3, як приклад, наведена динамічна крива, що отримана для ксенобіотика 12-краун-4. Для інших досліджуваних ксенобіотиків були побудовані динамічні криві, яки мали аналогічний вигляд, але специфічні особливості. Виявлено, що динамічні криві біохемілюмінесценції характеризуються послідовними трьома фазами: 1) різке наростання світіння до максимальних значень за час tm (від 0 до tm); 2) різкий спад інтенсивності біохемілюмінесценції впродовж часу tс (від tm до tс), причому, tm+tс відповідає середньому ефективному часу загибелі тварин (ЕТ50); 3) повільне зменшення інтенсивності до значень інтенсивності світіння в контрольній групі протягом часу tк*.

Рис.3. Динаміка інтенсивності біохемілюмінесценції сироватки крові білих щурів при дії 12-краун-4 дозою 1/5 ДЛ50.

Часовий інтервал від початку спостереження до досягнення контрольних значень інтенсивності характеризується часом tк = tm + tс + tк*. Установлено, що при впливі ксенобіотиками, які мають слабкі кумулятивні властивості, подовжуються часи фаз швидкого наростання (tm) і швидкого спаду (tс) інтенсивності світіння; збільшуються величини tg в спадної ділянки на динамічній кривій і світлосума (S) світіння за одну добу; скорочується час (tк*) фази повільного зниження інтенсивності біохемілюмінесценції до контрольних значень у порівнянні з надзвичайно кумулятивними ксенобітиками (табл. 1). Вище зазначені параметри динамічних кривих дозволяють судити про ступінь кумуляції ксенобіотиків (табл.2).

Таблиця 1

Параметри динамічних кривих біохемілюмінесценції сироватки крові білих щурів при дії ксенобіотиків дозою 1/5 ДЛ50

Таблиця 2

Визначення ступеня кумуляції ксенобіотиків за параметрами динамічних кривих

Оцінюючи динаміку інтенсивності світіння при дозі 1/5 ДЛ50, можна припустити, що час tm досягнення максимуму біохемілюмінесценції пов'язаний із часом стрес-реакції організму на токсифікацію, яка супроводжується напругою захисно-компенсаторних механізмів, ушкодженням частини структурно-функціональних одиниць клітинного апарата та виходом антиокислювачів у кров'яне русло. Наслідком цього є наступне різке падіння рівнів БХЛ протягом часу аж до ЕТ50. Надалі в організмі, ймовірно, встановлюється стійке співвідношення оксидантно-антиоксидантної взаємодії, відображенням якого виступає наближення значень інтенсивності БХЛ до величин контрольної групи. Уведені нами кількісні показники фаз швидкого підйому, швидкого зниження біохемілюмінесценції, а також повільного зниження інтенсивності світіння до рівня контрольних величин можуть указувати, з одного боку, на різну швидкість надходження речовин у клітину через плазматичні мембрани, а з іншого боку - на насичення клітини ксенобіотиком, що активує оксидантно-антиоксидантні взаємодії на молекулярному рівні. Характер динаміки кривих біохемілюмінесценції під впливом 1/5 ДЛ50 й 1/10 ДЛ50 підтверджує істотні розходження токсикодинаміки, токсикокінетики та відповідно структурно-метаболічних процесів, що відбуваються в умовах токсифікації організму різними дозами ксенобіотиків.

Алергійна дія хімічних речовин була виявлена за імунологічними тестами (РСЛЛ, РСАЛ, РСУБ) і методом біохемілюмінесценції сироватки крові лабораторних тварин. Установлено, що внутрішньо-шкіряна дія хімічних речовин, які мають різний ступінь алергійної дії, приводить до різного посилення інтенсивності світіння хемілюмінесценції сироватки крові, що може бути пов'язано з порушенням вільнорадикальних процесів, накопиченням в організмі продуктів перекисного окислення ліпідів, тобто появою вільнорадикальної патології. Так, ксенобіотики, що не мають алергійної дії (Л-402), не викликають достовірного підвищення індукованої БХЛ, тоді як алергійно небезпечний Лд -703, що підвищує імунологічні показники в 6-7 разів, приводить до збільшення інтенсивності БХЛ в 2,2 рази в порівнянні з контролем. Показано, що для виявлення сенсибілізуючих й алергійних властивостей хімічних речовин окрім індукованої БХЛ можна використовувати також і метод спонтанної БХЛ сироватки крові тварин. Установлено, що при імунологічному тестуванні в підгострому досліді сильні алергени лапроксиди (Лд-703, Лд-503, Лд-303) при введенні внутрішньо-шлунково в дозах 0,01 й 0,001 ДЛ50 протягом 60 діб приводять до зміни імунобіологічної реактивності організму: імунологічні показники РСАЛ, РСЛЛ, РСУБ істотно підвищувалися в порівнянні з контролем, а доза 0,0001 ДЛ50 була недіючою. Інтенсивність БХЛ сироватки крові тварин, токсифікованих дозами 0,01 ДЛ50, 0,001 ДЛ50 і навіть 0,0001 ДЛ50, зростала в середньому більше, ніж в 2,0 рази порівняно з контролем. Це дозволяє вважати дозу 0,0001 ДЛ50, визначену за методом БХЛ, діючою. Імунологічне тестування простих поліефірів (Л-402, Л-1502) не виявило їхньої алергенної дії. Однак інтенсивність БХЛ сироватки крові тварин, токсифікованих цими речовинами в дозі 0,01 ДЛ50 й 0,001 ДЛ50, збільшувалася в порівнянні з контролем у середньому, відповідно, в 1,7 і в 1,6 рази, що підтверджує високу чутливість даного біофізичного методу та дозволяє використовувати його з метою встановлення порогів алергійної дії та виявлення ефекту сенсибілізації організму.

У дослідженнях шкіряно-резорбтивної дії ксенобіотиків при нашкірних аплікаціях біохімічними методами й методом БХЛ показано, що метод БХЛ виявляє ефект шкіряно-резорбтиної дії досліджуваних речовин вже на 10 добу, у той час як біохімічні тести виявили симптоми інтоксикації тільки на 30 добу, що вказує на більш високу чутливість даного методу в порівнянні з біохімічними. При цьому аналіз біохімічних показників крові експериментальних тварин свідчить про зниження рівнів вмісту гемоглобіну, еритроцитів і кількості SH-груп, тобто про наростання патологічного процесу й інгібірування антиоксидантної системи. І навпаки, одержане підвищення активності каталази, церулоплазміну й холінестерази, певно, обумовлено активацією ферментативної системи організму у відповідь на токсичний вплив ксенобіотиків. Доведено, що зміни у вільнорадикальному окисленні, які спостерігаються за методом БХЛ, передують функціональним зрушенням показників периферичної крові й ферментативних систем.

При вивченні стабільності ксенобіотиків (відсоткового вмісту ксенобіотиків у водяних розчинах) визначено зв'язок між рівнем стабільності, швидкістю гідролітичного окислення ксенобіотиків і параметрами їхньої токсичності (ДЛ50), а також значеннями інтенсивності хемілюмінесценції (ХЛ) їхніх водяних розчинів. Показано, що між дозою ДЛ50 (D, г/кг) й інтенсивністю світіння (I, імп/с) розчинів ксенобіотиків існує тісний кореляційний зв'язок (коефіцієнт кореляції Спірмена R = - 0,999), рівняння регресії для індукованої ХЛ має вигляд D = 88,8·exp(-0,01·I). При зменшенні ДЛ50, що означає збільшення ступеня токсичності ксенобіотиків, інтенсивність БХЛ їхніх водяних розчинів зростає. Результати дослідження зв'язку між параметром токсичності ДЛ50 і ступенем стабільності хімічних речовин показують, що стабільність ксенобіотиків збільшується при зменшенні їхньої токсичності, тобто при збільшенні ДЛ50 (рис. 4.а). Виявлена тісна кореляційна залежність із коефіцієнтом кореляції R = 0,998 між стабільністю й величиною дози ДЛ50.

а) б)

Рис. 4. а). Залежність стабільності водяних розчинів ксенобіотиків (%) від величини дози ДЛ50; б) залежність значень інтенсивності (імп/с) індукованій- Н2О2 хемілюмінесценції від ступеня стабільності водяних розчинів ксенобіотиків (%).

Причому, ступінь стабільності має логарифмічну залежність від величини дози ДЛ50: S = 87 + 7lg(D), де S - стабільність речовини у водяному розчині (%), D - величина ДЛ50 (г/кг). За допомогою лінійного регресійного аналізу визначені коефіцієнти кореляції Rс та Rі між рівнем інтенсивності спонтанної (Iс) та індукованої- Н2О2 (Iі) ХЛ водяних розчинів всієї групи ксенобіотиків і ступенем їхньої стабільності (S): Rс = - 0,999; Rі= - 0,998. Відповідно, рівняння регресії представлені лінійною залежністю виду: Iс = 1858 - 19S; Iі = 3425 - 34S. Графіки залежностей значень інтенсивності (імп/с) спонтанної та індукованої- Н2О2 хемілюмінесценції від ступеня стабільності водяних розчинів ксенобіотиків (%) представлені на рис.4.б.

Таким чином, установлено, що за рівнями інтенсивностей спонтанної та індукованої хемілюмінесценції тієї або іншої речовини можна визначити ступінь їх гідролітичної стабільності, тобто отримані значення інтенсивності хемілюмінесценції виступають як прогностичні критерії стабільності ксенобіотиків до гідролітичного окислення. Відповідно, пропонується використовувати метод хемілюмінесценції при орієнтовній оцінці ступеня токсичності, небезпеці й стабільності ксенобіотиків у токсикологічних дослідженнях.

Обґрунтовано використання методів біохемілюмінесценції, фосфоресценції та мікроелектрофорезу ядер клітин букального епітелію в оцінці стану здоров'я робітників хімічних виробництв як найбільш чутливих методів у токсиколого-гігієнічних дослідженнях впливу на організм чинників виробничого середовища. При вивченні люмінол-індукованої хемілюмінесценції та фосфоресценції сечі робітників різних вікових груп було виявлено, що у людей, які в процесі професійної діяльності знаходились під впливом несприятливих факторів виробничого середовища, інтенсивність світіння сечі робітників-апаратників у середньому перевищувала показники контрольної групи в 1,3 рази (на 300 імп/с) (рис. 5).

Це може бути пов'язано з посиленням обмінних процесів, вільнорадикального перекисного окислення ліпідів, зменшенням активності антиоксидантної системи. Рівні інтенсивності фосфоресценції сечі робітників-апаратників всіх вікових груп у середньому в 1,72 рази були вище в порівнянні з контролем, що, очевидно, обумовлено збільшенням у сечі концентрації ліпідів і білків, відповідальних за фосфоресценцію.

Аналіз результатів дозволяє зробити висновок, що існуючі умови виробництва досліджуваних ксенобіотиків стимулюють процеси вільнорадикального перекисного окислеання ліпідів і призводять до зниження імунобіологічної реактивності організму.

Размещено на http://www.allbest.ru/

а)

Размещено на http://www.allbest.ru/

б)

Рис. 5. Діаграми інтенсивностей а) хемілюмінесценції та б) фосфоресценції сечі робітників виробництва простих поліефірів різних професійних груп і вікових категорій. Примітка: * - різниця з контролем достовірна, р 0,01

Проведені експерименти з мікроелектрофорезу ядер клітин букального епітелію виявили зниження в порівнянні з контролем електронегативності ядер (ЕНЯ) клітин букального епітелію у робітників наступних професійних груп: апаратники синтезу, окислення, гідратації (рис. 6).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6. Показник електронегативності (%) ядер клітин букального епітелію у робітників виробництва простих поліефірів різних вікових категорій. Примітка: * - різниця з контролем достовірна, р 0,05.

У середньому по контингенту апаратників, у порівнянні з контрольною групою ІТР, зниження ЕНЯ склало у вікових категоріях 21-30 років - 13,5%, 31-40 років - 10,3%, 41-50 років - 22,3%, 51-60 років - 21,4%. Проведено порівняння фактичного віку обстежених з їх біологічним віком, який визначався за еталонною номограмою показників ЕНЯ. Виявлено, що біологічний вік апаратників у віковій групі 21-30 років перевищує паспортний у середньому на 3,0 роки; у групі 31-40 років - відповідно на 4,5 роки; у групі 41-50 років - на 5,8 роки й у групі 51-60 років - на 6,9 роки. Таким чином, виділені показники (інтенсивність БХЛ та ЕНЯ), які відображають напруженість механізмів забезпечення гомеостазу, можуть виступати як моніторингові при оцінці шкідливого впливу чинників виробничого середовища на організм робітників.

ВИСНОВКИ

1. Науково обґрунтована доцільність застосування методу біохемілюмінесценції в оцінці токсичної дії нових ксенобіотиків на організми людини та експериментальних тварин. Показано, що метод біохемілюмінесценції дозволяє адекватно оцінити кумулятивні та алергійні властивості, ступінь токсичності, граничні та недіючі дози ксенобіотиків; порушення взаємодії антиоксидантної та оксидантної систем; ступінь окислення хімічних речовин та їх гідролітичну стабільність у воді водяних об'єктів, а також виявити органи, системи і функції організму, які найбільш ушкоджуються при токсифікації ксенобітиками.

2. Запропоновано новий кількісний підхід до аналізу та обробки експериментальних даних, отриманих за показниками спектрів біохемілюмінесценції сироватки крові лабораторних тварин. Встановлено, що цей метод дозволяє диференціювати ступені важкості інтоксикації ксенобіотиками організму експериментальних тварин за параметрами динаміки інтенсивності світіння. Розроблена класифікація рівнів важкості токсифікації тварин (абсолютно смертельний, дуже важкий, важкий, середній і легкий) за величиною інтенсивності світіння наприкінці середньо-ефективного часу ЕТ50 загибелі тварин. Показано чітку залежність параметрів динамічних кривих біохемілюмінесценції від ступеня токсичності ксенобіотиків. При збільшенні дози кожної з речовин збільшується tg * спадаючих ділянок динамічних кривих біохемілюмінесценції, зменшуються час досягнення контрольних значень інтенсивності (tк), коефіцієнт токсичності (к) і світлосума світіння (Sк) за час tк.

3. Встановлено, що використання методу біохемілюмінесценції дозволяє виявити органі-мішені для кожного досліджуваного ксенобіотика, які мають характерні тільки для них хемілюмінограми. Найбільшу інтенсивність світіння при запалі тварин 12 краун-4 мають гомогенати головного мозку; неонолом АФ 9-12 - гомогенати печінки й нирок; під впливом лапроксидів Лд-703 і Лд-503 - гомогенати селезінки, тимусу, лімфатичних вузлів. Ці дані були підтверджені й результатами морфологічних досліджень.

4. Уперше запропоновані нові якісні та кількісні параметри динамічних кривих інтенсивності біохемілюмінесценції, які дозволяють виявити ступені кумуляції ксенобіотиків. Розроблена класифікація ступенів кумуляції ксенобіотиків за параметрами динамічних кривих (tgв, tm+tc, tm), зокрема, таким, як час досягнення інтенсивності світіння сироватки крові токсифікованих тварин контрольних значень (tк).

5. Експериментально встановлено, що інтенсивність біохемілюмінесценції виступає як оціночний показник алергійної та шкіряно-резорбтивної дії ксенобіотиків при пероральній та нашкірній пробах. Показано, що метод БХЛ у порівнянні з імунологічними тестами (РСЛЛ, РСАЛ, РСУБ) має значно більшу чутливість виявлення впливу хімічних алергенів, ефектів сенсибілізації й установлення граничних доз у підгострих і хронічних експериментах, а також при оцінці ефекту проникнення речовин через неушкоджену шкіру.

6. Встановлено кореляційний зв'язок між інтенсивністю хемілюмінесценції, водяних розчинів ксенобіотиків та їхньою стабільністю з коефіцієнтом кореляції Ri = - 0,998. Розчини ксенобіотиків, які мають низькі рівні інтенсивності спонтанної й індукованої Н2О2 -ХЛ, є високо стабільними. Знайдено, що ступінь стабільності має логарифмічну залежність від величини дози ДЛ50. Значення інтенсивності індукованої та спонтанної хемілюмінесценції водяних розчинів ксенобіотиків є прогностичним критерієм оцінки стабільності ксенобіотиків до гідролітичного окислення та біологічної активності хімічних речовин.

7. Показано, що використані в роботі показники біохемілюмінесценції, фосфоресценції та електрокінетичних властивостей ядер клітин букального епітелію дозволяють дати комплексну оцінку впливу чинників виробничого середовища на організм робітників, виділити групи та фактори ризику, виступати як моніторингові.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Простые и макроциклические эфиры: научные основы охраны водных объектов: Монография / Жуков В.И., Попова Л.Д., Зайцева О.В., Кратенко Р.И., Антюфеева О.И. и др. - Х.: Торнадо, 2000. - 438 с. (Особистий внесок здобувача - проведення БХЛ досліджень при оцінці стану антиоксидантної системи, дії простих і макроциклічних ефірів на організм тварин, стану ВРО робочих хімічних виробництв; розділи 5, 7).

Зайцева О.В., Антюфеева О.И. Биохемилюминесценция в контроле кожно-резорбтивного действия новых групп поверхностно-активных веществ // Вісник проблем біології і медицини. - 2001. - Вып.1. - С. 104-109.

Рогозянская Л.М., Арсеньев А.В., Антюфеева О.И. Деякі методичні аспекти статистичної обробки медичної інформації у сучасних умовах // Експериментальна і клінічна медицина. - 2000. - № 4. - С. 133-135. (Особистий внесок здобувача полягає в обґрунтуванні обчислювальних програм з використанням сучасних статистичних пакетів, зокрема, регресійного аналізу).

Зайцева О.В., Жуков В.И., Антюфеева О.И., Щербань Н.Г., Нежина М.В. Прогнозирование безвредных уровней содержания новой группы поверхностно-активных веществ на основе алкилполифосфатов в воде водоемов // Довкілля та здоров'я. - 2002. - № 3 (22). - С. 30-33. (Особистий внесок здобувача складається з визначення стабільності водних розчинів ксенобіотиків).

Зайцева О.В., Жуков В.И., Щербань Н.Г., Антюфеева О.И. Гигиеническая оценка иммунотоксичности и аллергоопасности группы эпоксидсодержащих гликолей в связи с проблемой их нормирования в водных экосистемах // Проблеми екології та медицини. - 2002. - Т. 6, № 5. - С. 3-7. (Особистий внесок здобувача - участь в обробці експериментальних даних та встановленні недіючої дози лапроксидів).

Антюфеева О.И. Эколого-гигиеническая регламентация некоторых простых полиэфиров в воде водоемов // Проблеми екології та медицини. - 2003.-Т.7, № 3-4. - С. 3-5.