Патоморфологічні аспекти формування синдрому плацентарної недостатності при залізодефіцитній анемії вагітних

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

УДК: 611-013.85:618.39-021.3

ПАТОМОРФОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ ФОРМУВАННЯ

СИНДРОМУ ПЛАЦЕНТАРНОЇ НЕДОСТАТНОСТІ

ПРИ ЗАЛІЗОДЕФІЦИТНІЙ АНЕМІЇ ВАГІТНИХ

14.03.02 - патологічна анатомія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

ДАВИДЕНКО ІГОР СВЯТОСЛАВОВИЧ

Київ - 2006

АНОТАЦІЯ

Давиденко І.С. Патоморфологічні аспекти формування синдрому плацентарної недостатності при залізодефіцитній анемії вагітних. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.03.02 - патологічна анатомія. - Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ України, Київ, 2006.

Робота присвячена питанням формування плацентарної недостатності (ПН) при залізодефіцитній анемії вагітних (ЗДАВ).

Встановлено морфологічні прояви ПН при ЗДАВ в хоріальному дереві та матково-плацентарній ділянці (МПД), розкриті клітинні та молекулярні механізми порушення дозрівання хоріального дерева. Виявлена можливість розвитку вадного кола при ЗДАВ: ушкодження плаценти > поглиблення патології материнської крові > поглиблення ушкодження плаценти і т.д. Висунута гіпотеза про адаптивний характер перебудови плаценти при ПН. Показано, що її сутність полягає в гальмуванні росту плаценти в товщину, але підсиленні росту по площі МПД. Перебудова є морфологічною основою спроб плаценти щодо оптимізації кровообігу в інтервільозних просторах при збереженні загального масиву структур. Відсутність перебудови при ЗДАВ ІІІ ст. може бути одним із чинників прогресування патологічних змін у хоріальному дереві. На підставі отриманих результатів вирішена проблема гестаційної патоморфологічної діагностики ПН при ЗДАВ. Обґрунтовано новий науковий напрям: "Гестаційні механізми формування ПН при акушерській та екстрагенітальній патології".

Ключові слова: залізодефіцитна анемія вагітних, синдром плацентарної недостатності, плацента, хоріальні ворсини, матково-плацентарна ділянка.

АННОТАЦИЯ

Давыденко И.С. Патоморфологические аспекты формирования синдрома плацентарной недостаточности при железодефицитной анемии беременных. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора медицинских наук по специальности 14.03.02 - патологическая анатомия. - Национальный медицинский университет имени О.О.Богомольца МЗ Украины, Киев, 2006.

Работа посвящена вопросам формирования структурной составляющей синдрома плацентарной недостаточности при железодефицитной анемии беременных на протяжении гестационного периода. Методами макроскопии и микроскопического исследования с гистометрическим, цитометрическим, гистостереометрическим компьютерным анализом, а также с широким использованием гистохимии, иммуногистохимии, лектиноиммуногистохимии, хемилюминесценции в сочетании с компьютерной денситометрией и спектральным анализом исследовано хориальное дерево плаценты, пуповина, плодные оболочки, маточно-плацентарная область, форменные элементы материнской крови. Поставлен эксперимент на лабораторных животных с моделированием железодефицитной анемии и последующим морфологическим исследованием плаценты. Использованы различные адекватные методы статистики, включая методы непарных и парных сравнений, дисперсионный анализ (включая повторные измерения), методы множественных сравнений средних, регрессионный анализ (линейный и нелинейный), кластерний анализ, методы бинарной и канонической корреляции и др. Впервые установлено, что при железодефицитной анемии беременных клинически важные морфологические проявления синдрома плацентарной недостаточности локализуются не только в хориальном дереве, но также в спиральных артериях и других структурах маточно-плацентарной области. Для улучшения диагностики нарушений дозревания хориального дерева на основании методов теории информации усовершенствована классификация хориальных ворсин с выделением следующих типов: а) мезенхимальные; б) эмбриональные; в) стволовые "ранние"; г) стволовые "поздние"; д) промежуточные незрелые; е) промежуточные зрелые; ж) терминальные; з) терминальные "специализированные хориальные ворсины". Суть усовершенствования классификации состоит в выделении среди стволовых хориальных ворсин их “ранних” и “поздних” вариантов. На примере железодефицитной анемии беременных раскрыты механизмы нарушения дозревания хориального дерева (через переключение клеточных и молекулярных механизмов регуляции численности и дифференцирования клеток хориальных ворсин, а также через установление новых возможных путей трансформаций хориальных ворсин, в частности, показана возможность прямой трансформации промежуточных незрелых в промежуточные зрелые хориальные ворсины). Впервые выявлена возможность негативного влияния поврежденной плаценты на состояние материнских эритроцитов при железодефицитной анемии беременных, что позволило сформулировать понятие о своеобразном порочном круге при этой болезни: повреждение плаценты (вследствие системной патологии материнской крови) > углубление патологии материнской крови > углубление повреждения плаценты и т.д. Установлено, что усиленное образование интервиллезного фибриноида при железодефицитной анемии беременных происходит по следующему механизму: сначала в синцитиотрофобласте возрастают процессы апоптоза и экспрессия интегрина бХв2; последний благодаря своим адгезивным свойствам не дает возможности фрагментам синцитиотрофобласта немедленно оставить поверхность хориальных ворсин, и, кроме того, присоединяет один из своих лигандов - фибриноген крови матери; локализованный таким образом на поверхности хориальных ворсин фибриноген вследствие высвобождения тканевых и эритроцитарных тромбопластинов из разрушенных фрагментов трофобласта и гемолизированных в интервиллезных пространствах материнских эритроцитов со временем полимеризуется в фибрин; последний осуществляет завершающее формирование конгломерата из остатков синцитиотрофобласта и элементов материнской крови. Выдвинута гипотеза об универсальном приспособительном характере органных перестроек плаценты при синдроме плацентарной недостаточности, осуществлено обоснование гипотезы исходя из теоретических позиций, а также через конкретные результаты собственных исследований. Показано, что морфологическая сущность органной перестройки заключается в торможении роста плаценты в толщину, но параллельном усилении роста плаценты по площади маточно-плацентарной области. Указанная перестройка является морфологической основой попыток плаценты относительно оптимизации кровообращения в интервиллёзных пространствах при сохранении общего массива плацентарных структур. Отсутствие приспособительно-компенсаторной органной перестройки плаценты при анемии ІІІ ст. может быть одним из внутренних факторов прогресса патологических изменений в хориальном дереве.

На основании полученных результатов впервые решена актуальная научно-практическая проблема гестационной патоморфологической диагностики синдрома плацентарной недостаточности при железодефицитной анемии беременных с выделением критериев его диагностики для определённых отрезков гестации: 13-16, 17-20, 21-24, 25-27, 28-32, 33-36, 37-40 недель, а также для пролонгированной беременности. Обосновано новое научное направление: "Гестационные механизмы формирования синдрома плацентарной недостаточности при экстрагенитальной патологии матери".

Ключевые слова: железодефицитная анемия беременных, синдром плацентарной недостаточности, плацента, хориальные ворсины, маточно-плацентарная область.

ANNOTATION

Davydenko I.S. Pathomorphological aspects of forming of syndrome of placental insufficiency at iron-deficiency anaemia of pregnant. - Manuscript.

Dissertation on competition of scientific degree of doctor of medical sciences in specialty 14.03.02 - pathological anatomy. - National Medical University named after O.O.Bogomolets, Ministry of Health of Ukraine, Kiyv, 2006.

The work is devoted to questions of forming of placental insufficiency (PI) at iron-deficiency anaemia of pregnant (IDAP).

At IDAP morphological signs of PI localize in chorial tree and utero-placental region (UPR). Were expose cellular and molecular machineries of violation of ripening of chorial tree. Was exposed possibility of development of vicious circle at IDAP: damage of placenta > deepening of pathology of maternal blood > increasing damage of placenta etc. The hypothesis pulled out about adaptive character of alterations of placenta at PI. It is shown, that their essence consists in braking of growth of placenta in thickness, but strengthening of growth on area UPR. The indicated alteration is morphological basis of attempts of placenta in relation to optimization of circulation of blood in intervillous spaces at saving of general array of placenta structures. Absence of alteration of placenta at anaemia of ІІІ degree can be one of internal factors of progress of pathological changes in chorial tree. On basis of results decided actual scientific and practical problem of gestational pathomorphological diagnostics of PI at IDAP over. Was founded new line of investigation: "Gestational machineries of forming of PI at extragenital pathology".

Keywords: iron-deficiency anaemia of pregnant, syndrome of placental insufficiency, placenta, chorial villi, utero-placental region.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Буковинському державному медичному університеті МОЗ України (м. Чернівці)

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор, Задорожна Тамара Данилівна, Інститут педіатрії, акушерства і гінекології АМН України, завідуюча лабораторії патоморфологічних досліджень

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Колєсова Надія Арнольдівна, завідуюча лабораторії метаболічного та структурного аналізу НДЛЦ Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (м.Київ)

доктор медичних наук, професор Ступіна Олександра Семенівна, провідний науковий співробітник лабораторії морфології і цитології Інституту геронтології АМН України (м.Київ)

доктор медичних наук, професор Даниленко Анатолій Іванович, завідувач кафедри патологічної анатомії Одеського державного медичного університету МОЗ України

Провідна установа: Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л.Шупика МОЗ України (м.Київ)

Захист відбудеться 01.06.2006 р. о 14-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 при Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця (03757, м. Київ-057, пр. Перемоги, 34).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (03757, м. Київ-057, вул. Зоологічна, 1).

Автореферат розісланий 30.04. 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, професор Грабовий О.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Стан репродуктивного здоров'я в Україні надалі ускладнюється, що нещодавно всебічно проаналізовано в Концепції державної програми "Репродуктивне здоров'я нації на 2006-2015 рр.". У названій Концепції серед основних проблемних питань репродуктивного здоров'я зазначені: високий рівень абортів, невиношування вагітності, ускладнень вагітності та пологів. Плацентарна недостатність (ПН) в своїх конкретних проявах, без сумніву, є одним із провідних об'єктів уваги для наукової та практичної розробки вказаних питань. Слід зазначити, що в руки сучасного патологоанатома для діагностики синдрому ПН потрапляє матеріал самих різних термінів гестації з діапазоном 5-42 тижні вагітності (А.П.Милованов, 1999, Б.И.Глуховец, Н.Г.Глуховец, 2002, K.Benirschke, P.Kaufmann, 2000, F.T.Kraus, 2003). В зв'язку з цим вкрай необхідними для сьогодення стають розробки саме гестаційної діагностики синдрому ПН - виявлення критеріїв вказаної патології диференційовано для конкретних відрізків вагітності.

Актуальність теми. Залізодефіцитна анемія вагітних (ЗДАВ), маючи велике значення в розвитку низки гестаційних ускладнень (С.М.Ясніковська, 2001), за останні роки характеризується високою частотою, яка становить по регіонам Україні від 28,4% до 83,1% (А.Я.Сенчук, Т.Д.Задорожная, К.К.Константинов, 1999, О.В.Кравченко, С.Д., Приходько, 2000, С.М.Ясніковська, 2001, Т.Т.Овчар, А.П.Петулько, И.В.Овчар, 2005). Патоморфологічна діагностика синдрому ПН при ЗДАВ для періоду строкових пологів розроблена в достатній мірі (А.Я.Сенчук, Т.Д.Задорожная, К.К.Константинов, 1999, K.Benirschke, P.Kaufmann, 2000). Тимчасом, діагностичні критерії синдрому ПН при ЗДАВ у терміни раніше за 37 тижнів не розроблені. Необхідно визнати, що для встановлення гестаційних критеріїв діагностики недостатньо простого описання гестаційних патоморфологічних змін у тканині плаценти. Безсумнівно, що для кожного варіанту морфологічних відхилень слід вияснити механізм його формування, довести його зв'язок із ЗДАВ. Останнє становить непросте завдання, адже не тільки гіпоксія є несприятливим чинником впливу ЗДАВ на провізорні органи. У крові вагітної при ЗДАВ розвивається системна патологія, яка торкається не тільки самого залізодефіциту, характерної патології материнських еритроцитів та анемічного варіанту гемічної гіпоксії, але й глибоких змін у вільнорадикальних процесах, біохімічному складі крові, системі гемостазу тощо (С.А.Гусева, В.П.Вознюк, М.Д.Бальшин, 2001, С.М.Ясніковська, 2001, Г.И.Козинец та ін., 2002). Потрібно розглядати вплив ЗДАВ на формування синдрому ПН як результат комплексної тривалої дії багатьох чинників, тому з цієї позиції важливо застосовувати адекватні наукові підходи з використанням, зокрема, відповідних цьому завданню статистичних методів дослідження.

З точки зору системного аналізу для з'ясування механізмів синдрому ПН необхідно досліджувати не тільки плацентарну тканину, а також безпосередньо анатомічно зв'язані із нею пуповину, плодові оболонки та матково-плацентарну ділянку (МПД), враховувати стан плода і матері (А.П.Милованов, 1999, K.Benirschke, P.Kaufmann, 2000, F.T.Kraus, 2003). Слід вказати на те, що морфологічні зміни в МПД при ЗДАВ залишаються поки що не вивченими, хоч такі дослідження потенційно є перспективними.

Досягнення сучасної науки дають нові можливості щодо встановлення клітинних та молекулярних механізмів формування різних видів патології у людини і тварин. Найбільш перспективним і розроблювальним на даний час напрямком є вивчення механізмів локальної регуляції кількості клітин. Останню потрібно розглядати з точки зору двох аспектів: процесів проліферації та процесів виживання диференційованих клітин. При ЗДАВ названі процеси в плаценті та МПД є маловивченими, причому в найбільшій мірі це стосується гестаційного аспекту синдрому ПН.

Зв'язок дисертаційної роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом планової науково-дослідної роботи Буковинського державного медичного університету “Репродуктивне здоров'я. Профілактика структурно-функціональних уражень фетоплацентарного комплексу при порушеному періоді гестації, прогнозування і корекція перинатальних наслідків адаптації новонароджених” (термін виконання: 2001-2005 рр.). Шифр теми: 20.00.0001.01, № держреєстрації 01.01.U005242. Дисертантом виконано та написано 10 розділів НДР: "Сучасні уявлення про взаємовідношення залізодефіцитної анемії вагітних та недостатності плаценти" (огляд літератури), "Органометричні, гістологічні, гістометричні, гістохімічні методи дослідження плаценти", "Постановка експерименту на лабораторних тваринах", "Клінічна характеристика хворих для морфологічних досліджень плаценти", "Органометричні параметри плаценти при поєднанні залізодефіцитної анемії вагітних та хронічної плацентарної недостатності", "Оцінка сили впливу залізодефіцитної анемії вагітних на структурні елементи ворсин плаценти за методом Снедекора (однофакторний дисперсійний аналіз)", "Мікроскопічна характеристика хоріального дерева залежно від періоду гестації та ступеня тяжкості анемії у вагітних", "Морфометричні параметри мікроциркуляції в термінальних ворсинах при гістологічних ознаках незрілості плаценти у 37-40 тижнів вагітності", "Морфологія еритроцитів венозної крові вагітної та інтервільозних просторів плаценти при залізодефіцитній анемії вагітних, що поєднана з хронічною плацентарною недостатністю", "Комп'ютерно-денситометричні та спектральні параметри білкового компонента трофобласта, децидуоцитів, материнських і плодових еритроцитів плаценти при експериментальній залізодефіцитній анемії вагітних".

Мета роботи: встановити патоморфологічні критерії гестаційної діагностики синдрому плацентарної недостатності при залізодефіцитній анемії вагітних на підставі попереднього з'ясування клітинних та молекулярних механізмів формування структурної основи синдрому.

Задачі дослідження. гестаційний плацентарний анемія вагітна

1. Визначити органолокалізаційні аспекти синдрому плацентарної недостатності при залізодефіцитній анемії вагітних.

2. Встановити провідні патоморфологічні прояви синдрому плацентарної недостатності при залізодефіцитній анемії вагітних у хоріальних ворсинах.

3. Удосконалити класифікацію хоріальних ворсин плаценти для найбільш адекватного виявлення порушень дозрівання хоріального дерева.

4. Виявити особливості порушення трансформацій хоріальних ворсин при залізодефіцитній анемії вагітних.

5. Встановити клітинні та молекулярні механізми порушень трансформацій хоріальних ворсин.

6. Вивчити молекулярні особливості ушкоджень трофобласта хоріальних ворсин при залізодефіцитній анемії вагітних.

7. Провести експериментальне моделювання залізодефіцитної анемії на лабораторних тваринах для з'ясування закономірностей ушкодження трофобласта.

8. Дослідити молекулярні причини змінених ангіогенезу та формування позасудинного компонента строми хоріальних ворсин при залізодефіцитній анемії вагітних

9. Оцінити можливість впливу плаценти на материнські еритроцити безпосередньо в інтервільозних просторах плаценти.

10. Виявити клітинно-молекулярні механізми підсиленого утворення інтервільозного фібриноїду при залізодефіцитній анемії вагітних.

11. Дослідити можливість впливу залізодефіцитної анемії вагітних на структури матково-плацентарної ділянки.

12. Обґрунтувати гіпотезу про пристосувальний та компенсаторний характер органної перебудови плаценти при залізодефіцитній анемії вагітних.

13. На підставі з'ясування механізмів формування синдрому плацентарної недостатності при залізодефіцитній анемії вагітних розробити гестаційні критерії його діагностики.

Об'єкт дослідження. Структурна складова синдрому плацентарної недостатності при залізодефіцитній анемії вагітних.

Предмет дослідження. Механізми гестаційного формування морфологічної основи синдрому плацентарної недостатності при залізодефіцитній анемії вагітних.

Методи дослідження. У роботі використовувались органометричні, загальногістологічні, гістохімічні, гістоферментні, імуногістохімічні, лектиноімуногістохімічні, люмінесцентні, морфометричні (цифрова комп'ютерна гістометрія, гістостереометрія, цитометрія, мікроденситометрія, мікроспектрометрія), гематологічні методи дослідження. За матеріалами медичної документації здійснювався клінічний аналіз перебігу вагітності.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше встановлено, що при залізодефіцитній анемії вагітних клінічно важливі морфологічні прояви синдрому плацентарної недостатності, починаючись з 13-го тижня гестації, локалізуються не тільки в хоріальному дереві, але також у спіральних артеріях матково-плацентарної ділянки.

Для покращення діагностики порушень дозрівання хоріального дерева на основі аналізу з використанням математичного апарату теорії інформації удосконалена класифікація хоріальних ворсин на: а) мезенхімальні; б) ембріональні; в) стовбурові "ранні"; г) стовбурові "пізні"; д) проміжні незрілі; е) проміжні зрілі; є) термінальні; ж) термінальні "спеціалізовані" хоріальні ворсини. Принципово новим у класифікації є виділення серед стовбурових хоріальних ворсин двох їх варіантів: стовбурових "ранніх" та стовбурових "пізніх" ворсин.

На прикладі залізодефіцитної анемії вагітних розкриті механізми порушення дозрівання хоріального дерева (через залучення клітинних та молекулярних механізмів регуляції чисельності клітин хоріальних ворсин, а також через встановлення шляхів порушень трансформацій хоріальних ворсин).

Вперше виявлена можливість негативного впливу ушкодженої плаценти на стан материнських еритроцитів при залізодефіцитній анемії вагітних, що дозволило сформулювати поняття про своєрідне вадне коло при цій хворобі: ушкодження плаценти (внаслідок патології материнської крові) > поглиблення патології материнської крові > поглиблення ушкодження плаценти і т.д.

Висунута гіпотеза про універсальний пристосувальний характер органних перебудов плаценти при синдромі плацентарної недостатності, здійснено обґрунтування гіпотези з теоретичних позицій та через результати власних досліджень. Показано, що морфологічна сутність органної перебудови полягає в гальмуванні росту плаценти в товщину, але паралельному підсиленні росту плаценти по площі матково-плацентарної ділянки. Вказана перебудова є морфологічною основою спроб плаценти щодо оптимізації кровообігу в інтервільозних просторах при збереженні загального масиву плацентарних структур. Відсутність пристосувально-компенсаторної органної перебудови плаценти при анемії ІІІ ст. може бути одним із внутрішніх чинників прогресування патологічних змін у хоріальному дереві.

Практичне значення одержаних результатів. У результаті проведених досліджень, аналізу та узагальнення отриманих даних вирішена актуальна для практичної охорони здоров'я проблема патоморфологічної гестаційної діагностики синдрому плацентарної недостатності при залізодефіцитній анемії вагітних, а саме: встановлені його гестаційні патоморфологічні діагностичні критерії диференційовано для різних відрізків гестації: 13-16, 17-20, 21-24, 25-27, 28-32, 33-36, 37-40 тижнів та пролонгованої вагітності. Розроблено і впроваджено новий спосіб виготовлення препаратів-відбитків плаценти, який можна використовувати як додатковий засіб діагностики ЗДАВ при патоморфологічному дослідженні плаценти (Деклараційний патент України на винахід). Розроблено і впроваджено новий спосіб діагностики в одному гістологічному зрізі плаценти фібрину, колагенових волокон та кальцифікатів. (Деклараційний патент України на винахід). Розроблено 7 одноосібних раціоналізаторських пропозицій з удосконаленням гістохімічних та імуногістохімічних методів діагностики структурної патології плаценти.

Результати досліджень впроваджено в практичну роботу Чернівецького обласного дитячого патологоанатомічного бюро (2001-2003 рр.), Чернівецького обласного патологоанатомічного бюро (2001-2005 рр.), державного підприємства "Науково-дослідний інститут медико-екологічних проблем" МОЗ України (2003 р.), лабораторії патоморфології Інституту педіатрії, акушерства і гінекології АМН України (2005 р.), Державного патологоанатомічного Центру України (2005 р.), патологоанатомічного відділення Луганської обласної клінічної лікарні (2005 р.), пологового будинку м. Кам'янець-Подільський Хмельницької області (2005 р.) та пологового відділення 9-ї міської лікарні м. Дніпродзержинська, Дніпропетровської області (2005 р.). Матеріали дисертації використовуються при викладанні патологічної анатомії студентам на кафедрах патологічної анатомії Одеського державного медичного університету, Івано-Франківського державного медичного університету та Буковинського державного медичного університету. Всього здійснено 34 впровадження.

Особистий внесок здобувача. Ідею, мету дисертаційної роботи висунуто та сформульовано самостійно. Розробку завдань дослідження здійснено за участі наукового консультанта доктора медичних наук, професора Т.Д.Задорожної. Набір матеріалу для морфологічних досліджень проведено разом з лікарем акушер-гінекологом вищої категорії С.О. Давиденко. Виконання органометричних, загальногістологічних, поляризаційних, гістохімічних, гістоферментних, лектиноімуногістохімічних, люмінесцентних, морфометричних (цифрова комп'ютерна гістометрія, гістостереометрія, цитометрія, мікроденситометрія, мікроспектрометрія), більшості імуногістохімічних досліджень здійснено самостійно. Імуногістохімічні дослідження антигену PCNA та плацентарного лактогену виконано за участі наукового консультанта доктора медичних наук, професора Т.Д. Задорожної. Імуногістохімічні дослідження CD-рецепторів у плацентарній тканині та матково-плацентарній ділянці виконано сумісно з кандидатом медичних наук, доцентом І.Ф. Курченком. Аналіз результатів гематологічних та біохімічних досліджень здійснено самостійно за матеріалами медичної документації. Статистична обробка цифрового матеріалу виконана одноосібно. Узагальнення отриманих результатів, обґрунтування висновків та практичних рекомендацій, написання всіх розділів дисертації, підготовка і подача до друку наукових публікацій, підготовка до виступів і виступи на всіх наукових та науково-практичних конференціях здійснені автором дисертаційного дослідження самостійно.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались та обговорювались на: Всеукраїнській науковій конференції з міжнародною участю "Мікроциркуляція та її вікові зміни" (Київ, 1999), 2-му з'їзді Міжнародної спілки асоціацій патологоанатомів (Москва, 1999), Всеукраїнській науково-практичній конференції "Актуальні питання перинатології" (Чернівці, 2001), Всеукраїнській науковій конференції "Актуальні питання мікроциркуляції та гомеостазу при патології внутрішніх органів" (Чернівці 2002), Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю "Сучасні методи наукових досліджень в морфології та патології" (Полтава, 2003), Міжнародному Конгресі "Розвиток в морфологічних, експериментальних та клінічних дослідженнях положень вчення В.М. Шевкуненка про індивідуальну мінливість тіла людини" (Полтава, 2003), 7-му Конгресі патологів України "Екологічна та інфекційна патологія: сучасні патологоанатомічні аспекти" (Івано-Франківськ, 2003), 4-му Національному Конгресі патофізіологів України з міжнародною участю "Фундаментальні аспекти сучасної медицини" (Чернівці, 2004), Всеукраїнській науково-практичній конференції "Актуальні проблеми морфологічної діагностики хвороб плода і дитини" (Чернівці, 2004), ІХ-му Міжнародному Конгресі з клінічної патології (Бангкок, 2004), Всеукраїнській науковій конференції "Актуальні питання клінічної анатомії та оперативної хірургії" (Чернівці, 2004), ІІІ-й міжнародній конференції "Динаміка наукових досліджень 2004", (Дніпропетровськ, 2004), 7-й Міжнародній конференції "Кореляційна оптика 2005" (Чернівці, 2005), підсумкових наукових конференціях викладачів Буковинського державного медичного університету (Чернівці, 1997-2005).

Публікації за темою дисертації. За результатами дослідження, викладеного в дисертаційній роботі, опубліковано 32 наукових праці, в тому числі: 20 статей у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України (з них 14 журнальних статей є одноосібними), два опублікованих патенти України на винахід (один патент одноосібний), три статті в збірниках наукових праць (дві статті в збірниках - одноосібні), сім публікацій містяться в матеріалах або тезах доповідей Всеукраїнських і міжнародних наукових та науково-практичних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Матеріали дисертації викладено українською мовою на 351 сторінках принтерного тексту (обсяг тексту основної частини - 278 сторінок). Робота складається із вступу, огляду літератури, розділів “Матеріал і методи”, шести розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаної літератури, який містить 658 джерел вітчизняних та зарубіжних авторів. Робота ілюстрована 61 таблицею, 79 рисунками (з 131 фотографією, 15 графіками, 3 схемами).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Залізодефіцитна анемія вагітних за своїм змістом є хронічною патологією, тому для валідності висновків в цьому дослідженні взяті до уваги тільки ті випадки, коли дана хвороба мала свій повний клінічний розвиток і тривала не менше чотирьох тижнів з діапазоном тривалості повних 4-34 тижні. В усіх випадках залізодефіцит був зареєстрований за вмістом сироваткового заліза ще за два-чотири тижні до розвитку характерних гематологічних змін в крові вагітної.

Хоч ЗДАВ найбільш типово розвивається з другої половини гестації, в невеликій частині спостережень ця патологія реєструвалася вже з 9-19 тижня. Аналіз таких випадків вважали цінним з точки зору виявлення загальних закономірностей формування синдрому хронічної плацентарної недостатності. Особливостями матеріалу було те, що ЗДАВ ІІІ-го ст. тяжкості в період до 25 тижнів вагітності не зафіксовано.

Кількісний розподіл досліджених випадків залізодефіцитної анемії по термінам гестації представлений у таблиці.

Таблиця

Кількісний розподіл випадків залізодефіцитної анемії за терміном гестації

Визначення відрізків термінів гестації здійснено на підставі поєднання двох принципів: морфологічної стадійності розвитку хоріального дерева та клінічної належності матеріалу (ранні та пізні аборти, передчасні та строкові пологи, пролонгована вагітність). Кожен відрізок гестації представлений рівномірно з представництвом кожного тижня гестації без жодного розриву.

З метою порівняльного аналізу сформовані пропорційні групи гестаційного контролю для кожного досліджуваного відрізка вагітності.

Згідно до комплексу клінічних даних виставлявся або відхилявся діагноз "Синдром хронічної плацентарної недостатності". Цей діагноз уточнювався при патоморфологічному дослідженні посліду з градацією за тяжкістю (компенсованістю) на компенсовану, субкомпенсовану та декомпенсовану форму синдрому.

Для доказу деяких закономірностей, що були виявлені на клінічному матеріалі був поставлений експеримент із моделюванням залізодефіцитної анемії у вагітних щурів. В експерименті використано 28 самок білих безпородних статевозрілих щурів вагою 220-240 грамів на початку експерименту.

Морфологічні дослідження посліду та МПД виконувалися на різних рівнях організації живої матерії з дотриманням принципів якісної та кількісної репрезентативності при ієрархічному переході від рівня до рівня.

Вивчення органного рівня організації посліду передбачало визначення основних органометричних параметрів плаценти, пуповини та вільних плодових оболонок, оцінки варіанта прикріплення пуповини до плаценти, типу розгалуження судин хоріальної пластинки та оцінки їх діаметру, описової характеристики материнської поверхні народженої плаценти з оцінкою особливостей будови котиледонів, враховували також клінічні дані з історій пологів про кількість навколоплідних вод. Площу найбільшого перетину плаценти вимірювали в см² за допомогою прозорої сітки з рівновіддаленими крапками. Об'єм органу визначали у см³ за кількістю витісненої рідини з мірного циліндру. Вимірювали масу плаценти. Периметр найбільшого перетину заміряли у см за допомогою курвіметра. Для оцінки товщини плаценти користувались спеціальним консольним пристроєм, що дозволяє вимірювати з точністю до 0,01 см. Параметри товщини знімали у 14 позиціях (з рівномірним представництвом центральних, парацентральних та периферичних відділів органу). Вираховували середню арифметичну товщини плаценти. Визначали також коефіцієнт варіації товщини (в %) в межах кожного органу. Для оцінки форми найбільшого перетину плаценти обраховували коефіцієнт "фактор форми" плоскої фігури, який визначали за формулою , де S - площа найбільшого перетину плаценти, а Р - периметр плаценти, а також показник "ексцентриситет еліпса". Для оцінки форми плаценти як 3-х мірної структури застосували коефіцієнт "площинно-товщинний індекс" (ПТІ), який обраховували згідно до формули: , де S - площа найбільшого перетину плаценти, а - середня арифметична товщини. У пуповини вимірювали її довжину та середній діаметр, оцінювали видимі неозброєним оком пошкодження. У вільних плодових оболонок вимірювали середню товщину, оцінювали їх колір, прозорість, блискучість, видимі неозброєним оком пошкодження. При оцінці макроскопічних параметрів посліду враховували динамічне ультразвукове обстеження жінки протягом вагітності. Для деяких макроскопічних досліджень використовувалася лупа з триразовим збільшенням. На паралельних пластинчастих розрізах тканини плаценти стереометричним методом визначали питомий об'єм явно неробочих зон (інфарктів, кіст, великих кальцифікатів та відкладань фібриноїду).

Підготовку матеріалу до мікроскопічних досліджень здійснювали диференційовано - залежно від вимог конкретної методики. Частину матеріалу фіксували 48 годин у 10%-му розчині нейтрального забуференого формаліну, після чого проводили зневоднювання у висхідній батареї спиртів та парафінову заливку при температурі 64⁰С. На санному мікротомі робили серійні гістологічні зрізи товщиною 5 мкм. Після депарафінізації зрізів виконували забарвлення гематоксиліном-еозином (з оглядовою метою), хромотропом-водним блакитним за методикою Н.З. Слинченко (для ідентифікації фібрину та волокнистого компонента строми), хромотропом-світловим зеленим (для диференціювання колагенових волокон, фібрину та відкладань солей кальцію при інфрачервоній мікроскопії), пікрофуксином за Van Gieson (для забарвлення колагенових зрілих волокон) з дофарбовкою клітинних ядер гематоксиліном Вейгерта, азур-ІІ-еозином з диференціюванням в розчині оцтової кислоти (для візуалізації тканинних базофілів та великих гранулярних лімфоцитів), імпрегнацію сріблом за Гоморі (для виявлення аргірофільних волокон), гістохімічне визначення загального білка за Бонхегом, кислих та основних білків за Мікель-Кальво, вільних аміногруп білків за Ясума та Ітікава, фібрину за Шуєніновим, ставили PAS-реакцію з контролем амілазою (для верифікації PAS-позитивних структур), заліза за Перлсом.

Іншу частину матеріалу для збереження цілісності певних антигенів та реактивних груп фіксували протягом 22 годин у 10%-му розчині нейтрального забуференого формаліну, після чого проводили прискорене зневоднювання у висхідній батареї спиртів та парафінову заливку при температурі 56⁰С. Такі парафінові зрізи фарбували на сульфгідрильні групи білків за Ліллі, для оцінки проліферативної активності клітин проводили сріблення на ядерцевий організатор (AgNOR), ставили низку імуногістохімічних реакцій з моноклональними антитілами виробників DakoCytomation (Denmark-USA) та R&D Systems, Inc. (USA): на проапоптотичні протеїни (Bax, Bcl-XS, р53); протиапоптотичні протеїни (Bcl-2, Mcl-1, Bcl-XL); проліферативний ядерний нуклеарний антиген (PCNA); васкулярний ендотеліальний фактор росту (VEGF); гормони плаценти - плацентарний лактоген, хоріонічний гонадотропін; цитокератин - для ідентифікації епітеліальних клітин; плацентарну лужну фосфатазу; виконували імуногістохімічну методику на визначення міжнуклеосомальних розривів ДНК - TUNEL із застосуванням тест-системи TACS XL™ (R&D Systems, Inc., USA). В зазначених імуногістохімічних реакціях використовувалася стрептавідинбіотинова система візуалізації антитіл LSAB2 (пероксидазна мітка + діамінобензидин) виробника DakoCytomation (Denmark-USA). Окрім зазначених методик на таких парафінових зрізах для ідентифікації клітин Гофбауера (за олігосахаридами, які містять б1,2-L-фукозу, що в інших стромальних клітинах ХВ не виявляються) проводили визначення рецепторів до лектинів насіння стрімчака (Ulex europaeus) з імуногістохімічною верифікацією вказаних лектинів первинними антитілами до них (DakoCytomation, Denmark-USA).

Кріостатні зрізи нефіксованої тканини за допомогою відповідних моноклональних антитіл та авідинбіотинової системи візуалізації АВС (DakoCytomation, Denmark-USA) використовували для імуногістохімічного вивчення експресії проапоптотичного антигену CD95, антигенів-маркерів різних типів лімфоцитів CD1а, CD3, CD4, CD8б, CD22, HLA-Dr, інтегрину бХв2 (за рецептором CD11c), фермента 11в-гідроксистероїд дегідрогенази, для гістоферментного визначення методом азосполучення активності лужної фосфатази, термостабільної лужної фосфатази, кислої фосфатази, не специфічної естерази, визначення сукцинатдегідрогенази тетразолієвим методом за Z. Lojda, визначення лактатдегідрогенази тетразолієвим методом за Z. Lojda, виявлення нейтральних ліпідів суданом-ІІІ, фосфоліпідів із залізним гематоксиліном за Бекером, хемілюмінесцентне визначення нітропероксидів з люмінолом за допомогою люмінесцентного мікроскопа ЛЮМАМ-Р8 (ЛОМО, Россия).

З метою об'єктивізації кількісних досліджень проводили комп'ютерну морфометрію об'єктів у гістологічних, гістохімічних та імуногістохімічних препаратах. Для цього спочатку отримували цифрові копії оптичного зображення ділянок мікроскопічних препаратів при використанні різних об'єктивів мікроскопа залежно від цілей аналізу. Потім цифрові копії зображення аналізували за допомогою ліцензійної копії комп'ютерної програми "ВидеоТест - Размер 5.0" (ООО Видеотест, Россия). Зокрема, підраховували кількість певних об'єктів, отримували їх основні геометричні характеристики (лінійні розміри, питому площу та об'єм, периметр, фактор форми), денситометричні параметри (оптична щільність, середня яскравість, відхилення яскравості, насиченість), спектральні характеристики (розкладення кольору об'єкта на три складові - червону, зелену, синю, з кількісною оцінкою кожної ділянки спектра). Конкретне застосування вказаних показників описано у відповідних розділах дисертації.

Проведені гематологічні дослідження крові жінок. Було досліджено мазки венозної крові, взятої за 2-5 годин до пологів, та препарати-відбитки плаценти не пізніше 20 хвилин після отримання посліду, які виконані способом, що дозволяє виділити виключно материнські формені елементи крові. Мазки крові та препарати-відбитки плаценти після висушування без фіксації фарбували водним еозином, який приготовлено на ізотонічному розчині та гематоксиліном Грота. Інші мазки крові та препарати-відбитки плаценти фарбували бромфеноловим синім за Мікель-Кальво для оцінки співвідношення між карбонільними та аміногрупами білків в еритроцитах.

Статистичну обробку цифрових даних здійснювали залежно від конкретного завдання фрагмента дослідження. Планування необхідної кількості спостережень у кожній групі дослідження визначали на підставі обрахунків достатньої кількості для конкретного застосованого статистичного метода при рівні чутливості - 0,80 та рівня значущості р=0,05. Для параметричних даних застосовували попередню перевірку на нормальність розподілу за допомогою критерію Вілкі-Хана-Шапіро. Якщо згідно даного критерію гіпотеза про нормальність розподілу не відхилялася (при р=0,05), то використовували параметричні методи статистичного аналізу: непарний та парний двосторонні критерії Стьюдента (для рівних та нерівних дисперсій - перевіряли згідно критеріїв Левена та Фішера), параметричний однофакторний дисперсійний аналіз, для множинних порівнянь - критерій Ньюмена-Кейлса, для аналізу зв'язків застосовували бінарний лінійний кореляційний аналіз за Пірсоном, бінарний лінійний регресійний аналіз, множинний лінійний кореляційний аналіз, парціальний лінійний кореляційний аналіз, канонічний кореляційний аналіз, за необхідності проводили інтервальні оцінки. Непараметричні методи статистики використовували в разі відхилення гіпотези про нормальність у вибірках (як основний засіб), а також при малочисельних вибірках (як паралельний засіб): критерій Манні-Вітні, парний критерій Вілкоксона, непараметричний дисперсійний аналіз за Краскелом-Уоллісом. При наявності доказів про нелінійний зв'язок виконували нелінійний бінарний та множинний кореляційний аналіз. Для встановлення розбіжностей між відсотковим відображенням частоти певної ознаки серед двох статистичних вибірок використовували спеціальний статистичний метод - кутове фі-перетворення Фішера. Більшість статистичних розрахунків здійснювали за допомогою ліцензійної копії комп'ютерної програми Primer of Biostatistics, Version 4.03 (by S.A.Glanz, 1998). Ті статистичні процедури, які не передбачені у вказаній комп'ютерній програмі, були проведені у середовищі ліцензійної копії комп'ютерної програми Excel (версія XP, Microsoft® Corp.) шляхом програмування відповідних алгоритмів розрахунків.

Результати власних досліджень та їх обговорення. Проведені морфологічні дослідження плаценти на різних рівнях її структурної організації дозволити підтвердити характерні для ЗДАВ зміни в структурних елементах цього органу, які незалежно описані авторами наукових публікацій. Зокрема, показано, що при ЗДАВ має місце порушення дозрівання ХВ, перебудова судинного русла ХВ з гіперплазією судин та змінами їх інтравільозної транслокації, склеротичні зміни в стромі ХВ, посилене відкладання інтервільозного фібриноїду, пригнічення білоксинтезуючої та гормональної функції плаценти. Всі вказані зміни є варіантами морфологічних проявів синдрому плацентарної недостатності.

Слід, однак, вказати на те, що дані літератури щодо ЗДАВ не в повній мірі є зіставлюваними як між собою так і з результатами даного дослідження з огляду на низку обставин. Не у всіх публікаціях чітко вказуються клінічні та соціальні особливості формування груп дослідження, або не враховується аспект різних анатомічних форм плаценти (а це є принципово важливим як для самої валідності висновків по суті так і для реалізації чутливості статистичних методів виявлення закономірностей). Не у всіх опублікованих роботах вказана тривалість ЗДАВ або її ступінь тяжкості. Навіть якщо й враховувалися ступені тяжкості хвороби, то в таких дослідженнях не застосовувалися адекватні для цієї ситуації статистичні методи обробки даних (дисперсійний аналіз та процедуру множинних порівнянь), адже виділення ступенів тяжкості хвороби передбачає аналіз кількох груп дослідження, які зв'язані одними умовами. Головною відмінністю даного дослідження від попередніх є не тільки оцінка результату впливу ЗДАВ на плаценту, яка народжена при строкових пологах, але й здійснення спроб виявлення шляхів формування структурних змін у плаценті. Одним із ключових засобів у таких спробах був гестаційний аналіз: дослідження змін у плаценті в різні терміни вагітності з узагальненням отриманої інформації по кожному відрізку гестації та екстраполяцією результатів аналізу на загальну динаміку змін.

Завдяки гестаційному аналізу та низці раніше не застосованих підходів щодо ЗДАВ (формування груп дослідження з комплексним урахуванням різноманітних аспектів - анатомічних особливостей плацент, багатьох клінічних та соціальних посилань, використання оригінальних органометричних показників стану плаценти, залучення нових підходів щодо класифікації типів ХВ та шляхів їх дозрівання, дослідження особливостей будови МПД при ЗДАВ, реалізації сучасних можливостей медичної молекулярної морфології, а також адекватному застосуванню статистичних методів множинного аналізу) були уточнені деякі варіанти патологічних змін у плаценті та виявлені нові раніше не відомі факти.

Гестаційний аналіз слід розглядати не тільки як засіб виявлення механізмів формування синдрому плацентарної недостатності, що поки що є недостатньо розробленим напрямком досліджень, але й як інструмент вирішення актуальної науково-практичної проблеми діагностики вказаної патології на матеріалі, який все частіше потрапляє до рук сучасного патолога: спостережень штучного або мимовільного переривання вагітності.

Як це вище зазначалося, ЗДАВ найбільш типово розпочинається з третього триместру вагітності, але частина спостережень відноситься до другого і навіть першого триместрів гестації. Аналіз саме цих випадків є найбільш цінним для вияснення аспектів формування синдрому плацентарної недостатності при акушерській чи екстрагенітальній патології матері.

Оскільки дане дослідження присвячене не просто залізодефіцитній анемії, а ЗДАВ, яка за своїм змістом є хронічною гестаційною патологією, то вивчені спостереження тривалістю не менше чотирьох тижнів. Таким чином, найбільш раннім гестаційним матеріалом з точки зору ЗДАВ були пізні аборти за медичними показаннями, починаючи з відрізка гестації 13-16 тижнів. Матеріал ранніх абортів у 5-12 тижнів гестації (спостереження залізодефіцитної анемії, яка розвинулася до вагітності) використовувався лише для перевірки деяких припущень, які були висунуті в процесі аналізу основного матеріалу, що був отриманий у 13-40 тижнів гестації.

Найпершими морфологічними змінами, які реєструвалися вже з 13-16 тижнів вагітності, були: дефіцит трофобластичних та вільозних відростків ХВ та зменшення товщини плацентарного бар'єра.

Пояснення першого з названих фактів знайшли в зниженні проліферативної активності цитотрофобласта (ЦТ) ХВ. Зниження проліферативної активності ЦТ співпадає з інтенсифікацією при ЗДАВ деяких молекулярних подій у трофобласті. Зокрема, встановлено посилення процесів вільнорадикального окиснення, на що вказували зміни у показниках, що відображають вміст нітропероксидів, окиснювальну модифікацію білків і пов'язаний з ними підсилений протеоліз та окиснення сульфгідрильних груп білків у трофобласті. Одночасно з цим відбувалася активізація деяких молекулярних механізмів клітинної смерті. Так, мало місце підсилення експресії протеїну р53 в ядрах трофобласта, а також встановлені факти збільшення вмісту протеїну Вах та його підсиленої транслокації в органели цитоплазми трофобласта. Щоправда, характерних для апоптозу змін у ядрах трофобласта у 13-16 тижнів вагітності не виявлено, включно відсутність доказів міжнуклеосомальних розривів ДНК, що перевірялося за допомогою імуногістохімічної методики, заснованої на принципі TUNEL. Відсутність апоптотичних змін, напевно, пов'язана із відносною ефективністю протиоксидантних систем, до числа яких слід зарахувати цитоплазматичний протеїн з протиапототичною функцією Bcl-2, а також сульфгідрильні групи різних сполук у цитоплазмі трофобласта, які "взяли на себе перший окиснювальний удар".

Товщина плацентарного бар'єра при ЗДАВ у термін 13-16 тижнів була зниженою, не зважаючи на потовщення трофобластичного покриву ХВ, який є складовим компонентом плацентарного бар'єра. Таким чином, потоншення названого бар'єра при ЗДАВ викликано зміненим формуванням судинного русла в ХВ з більшим наближенням плодових судин ХВ до трофобласта. Механізми такої перебудови до кінця не зрозумілі, принаймні особливостей у експресії такого фактора як VEGF або гормонів (хоріонічний гонадотропін та плацентарний лактоген) у термін 13-16 тижнів гестації при ЗДАВ ще не помічено. Слід відзначити, що товщина плацентарного бар'єра залишалася при ЗДАВ більшою ніж у контролі впритул до 33 тижня гестації і з того часу зрівнялася з контрольними показниками.

У проміжок гестації 17-20 тижнів при збереженні всіх змін (включно ситуації щодо вільнорадикальних процесів), характерних для 13-16 тижнів, з'являються нові суттєві з точки зору синдрому ПН події. Зокрема, при ЗДАВ стає більшою ніж у контролі абсолютна площа поверхні капілярів та питомий об'єм капілярів ХВ. Знову, як і в термін 13-16 тижнів, молекулярних пояснень цього при використаних методах дослідження не виявлено. У проміжок гестації 17-20 тижнів вперше відмічено зростання числа TUNEL-позитивних ядер синцитіотрофобласта (СТ), а також докази більшої конденсації хроматину ядер СТ з тенденцією до маргінації в них хроматину. Слід думати, що описана гестаційна динаміка змін у ХВ у двомісячний проміжок з 13-го по 20-й тижні вагітності, вказує на два принципові висновки.

Перший висновок. На ХВ при ЗДАВ діють в першу чергу фактори зі сторони інтервільозних просторів (кров матері), адже в найбільшій мірі страждає саме трофобластичний покрив ХВ, який безпосередньо контактує з чинниками материнської крові. Зміни зі сторони кровоносного русла ХВ скоріше є проявом дії деяких м'яких регуляторних факторів.

Другий висновок. Цілий місяць (з 13 по 16 тиждень), не зважаючи на активізацію вільнорадикальних процесів та проапоптотичних молекулярних механізмів у трофобласті ХВ, не розвивалося морфологічних апоптозоподібних змін у ядрах цих клітин, вони з'явилися лише з 17-20 тижня вагітності. Можна припустити, що необхідно не менше кількох тижнів, щоби відбулася декомпенсація протирадикальних механізмів у трофобласті, перше ніж це призведе до реалізації каскадних апоптотичних процесів та відповідних морфологічних змін у ядрах епітелію ХВ.

Ще одним із морфологічних проявів впливу ЗДАВ на хоріальне дерево у термін гестації 17-20 тижнів було таке співвідношення між різними типами ХВ, яке дозволило припустити принципову можливість переходу (прямої трансформації на місці) проміжних незрілих у проміжні зрілі ХВ. Хоча така трансформація не вкладається в гіпотезу K. Benirschke та P. Kaufmann про диференціювання ХВ, згідно якої проміжні зрілі ХВ утворюються з мезенхімальних (ембріональних за А.П. Миловановим) ХВ, а не з проміжних незрілих ХВ, все ж у даному дослідженні були отримані певні докази протилежного характеру. Аналіз можливості прямої трансформації проміжних незрілих у проміжні зрілі ХВ, який проведений у розділах 5-6, дозволив отримати аргументи на користь вказаної трансформації - характерні співвідношення типів ХВ протягом різних періодів гестації, локалізаційні докази, ентропійний аналіз ХВ, існування перехідних морфологічних форм від проміжних незрілих у проміжні зрілі ХВ. Тимчасом аргументів, які б доводили протилежне, не встановлено. Таким чином, слід вважати, що в плаценті протягом гестації як одна із форм диференціювання ХВ (окрім тих форм, які існують згідно гіпотези K. Benirschke та P. Kaufmann) відбувається пряма трансформація проміжних незрілих у проміжні зрілі ХВ, причому при ЗДАВ така трансформація порушується в плані її гальмування. Це означає, що вже з періоду гестації 17-20 тижнів, за умови, якщо ЗДАВ триває не менше 4 тижнів, у плаценті розвиваються перші порушення дозрівання ХВ.