Теоретичні та практичні аспекти виготовлення гіперімунних сироваток (на моделі вірусів хвороби Ауєскі, геморагічної хвороби кролів і чуми м’ясоїдних)

Размещено на http://www.allbest.ru/

КАБІНЕТ МІНІСТРІВ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора ветеринарних наук

ТЕОРЕТИЧНІ ТА ПРАКТИЧНІ АСПЕКТИВИГОТОВЛЕННЯ ГІПЕРІМУННИХ СИРОВАТОК (на моделі вірусів хвороби Ауєскі, геморагічної хвороби кролів і чуми м'ясоїдних)

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

КОРНІЄНКО ЛЕОНІД ЄВГЕНОВИЧ

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Білоцерківському державному аграрному університеті

Науковий консультант - доктор ветеринарних наук, член-кореспондент

УААН СТЕГНІЙ Борис Тимофійович,

Інститут експериментальної і клінічної

ветеринарної медицини УААН, директор,

завідувач лабораторії біотехнології та клінічної біохімії

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор,

СКИБІЦЬКИЙ Володимир Гурійович,

Національний аграрний університет,

завідувач кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології

доктор ветеринарних наук, професор,

АПАТЕНКО Володимир Максимович,

Харківська Державна зооветеринарна академія,

завідувач кафедри мікробіології та біотехнології

доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник

ЧЕЧОТКІНА Наталя Павлівна,

Національний науковий центр “Інститут експериментальної та клінічної ветеринарної медицини”

УААН, завідувач лабораторії інфекційної патології відтворення сільськогосподарських тварин

Провідна установа - Сумський національний аграрний університет

Міністерства аграрної політики України, м. Суми.

Захист дисертації відбудеться “18” жовтня 2006 р. о “10” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26. 004. 03 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ - 41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд. 65

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

вірус сироватка геморагічний чума

Актуальність теми. Існує проблема виробництва препаратів імуноглобулінів як у ветеринарній, так і у гуманній медицині. Важливе значення серед таких препаратів мають специфічні імуноглобуліни і гіперімунні сироватки, які можуть використовуватись для негайного запобігання епідемічному, епізоотичному або вогнищевому поширенню (серопрофілактика, пасивна імунізація) і лікування (серотерапія) інфекційних захворювань (Анджапаридзе О.Г., 1968; Дяченко С.С. и соавт., 1980; Пилявская Е.А., 1983; Морогова В. и соавт., 1983; Рахимова Ф.И. и соавт., 1985; Хисматуллина Н.А. и соавт., 1985; Белоусов В.И. и соавт., 1996; Полищук С.В., 2000; Дяченко Н.С. и соавт., 2002; Панин А.Н. и соавт., 2002).

Сучасні дослідження із застосування гіперімунних сироваток у системі заходів профілактики й боротьби з інфекційними хворобами підтверджують тезу про необґрунтованість передчасного ігнорування серопрофілактики й серотерапії (Головко А.Н. и соавт., 1993; Вербицький П.І., 1999, 2000; Белявцева Е.А. 2000; Ипатенко Н.Г., 2000; Голуб Ю.С., Стеценко В.І., 2000; Малахов Ю.А., 2001; Кириллов Л.В., 2001; Дудников А.И. и соавт., 2000, 2004). Імуноглобуліни є надійними засобами профілактики і лікування так званих емерджентних неконтрольованих захворювань (Cunningnam-Rundles C. et al., 1982; Кострова О.М., Алешкин В.А., 1995; Анастасиев В.В., Короткова Т.В., 1999). Серотерапія не має альтернативи й у випадку захворювань, що спричинені, зокрема, герпесвірусами, аденовірусами, параміксовірусами, арбовірусами тощо (Краснянский В.П. и соавт., 1997).

Існуючі схеми й методи імунізації донорів різняться між собою кількістю ін'єкцій, кратністю й якістю антигену, що вводиться, та ад'ювантами (Дудников А.И., 1990; Мищенко В.А., 1990; Zaghawa et al., 1990; Yamanaka M. et al., 1993; Борисов В.В. и соавт., 2000). Здебільшого схеми отримання гіперімунних сироваток добираються до якогось певного діагностичного методу (Сюрин В.Н. и соавт., 1991, 1998). Універсалізація цього процесу із застосуванням концентрування антигенів та сучасних ад'ювантів на основі удосконалених схем і методів уведення є першочерговим завданням вірусологів і біотехнологів. Однак потреба у виробництві специфічних високоактивних сироваток не обмежується лише застосуванням їх у діагностичній практиці. Актуальність отримання імунних сироваток та імуноглобулінів зумовлюється також можливістю застосування останніх як засобів серопрофілактики й терапії у практиці ветеринарної та гуманної медицини. Переваги гетерологічних препаратів полягають у тому, що інтенсивна імунізація тварин дозволяє досягти високої концентрації антитіл, крім того, не існує обмежень у підборі продуцентів тощо (Дяченко Н.С. и соавт., 2002; Борисов Л.Б., 2002).

В Україні реєструються захворювання собак і хутрових звірів на чуму (Косенко М.В., 1999), геморагічну хворобу кролів (Малинівський В.М. із співавт., 2000), значна частина свинарських господарств залишаються неблагополучними з хвороби Ауєскі (Конаржевский К.Е., 1992), тому потрібна розробка схем отримання гіперімунних сироваток до збудників цих хвороб, а на підставі цього - удосконалення діагностичних методів і серотерапії окремих із них.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження з вірусом хвороби Ауєскі (штами “УНДІЕВ-18ВС”, “К”) виконані в рамках НДР ІЕКВМ УААН згідно із завданням - “Розробити фундаментальні основи біотехнології одержування та принципи застосування нового покоління специфічних засобів профілактики хвороби Ауєскі” (1991-1995 рр., номер державної реєстрації UA 01009822Р) відповідно до проекту “Ветеринарне забезпечення” УААН.

Робота з вірусом чуми м'ясоїдних (вакцинним (“ЕПМ”) і вірулентним) була ініціативною; з вірусом геморагічної хвороби кролів (вірулентними штамами: “Воронезький-87” та “НК/99”) здійснювалась на основі творчих угод з асоціацією Агробіологічних підприємств України.

Метою досліджень є теоретичне і клініко-експериментальне обґрунтування методів отримання антигенів і гіперімунних сироваток для діагностики і лікування хвороби Ауєскі, чуми м'ясоїдних і вірусної геморагічної хвороби кролів.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:

- розробити нові та удосконалити існуючі методики інактивації і концентрування вірусів чуми м'ясоїдних і вірусу геморагічної хвороби кролів;

- розробити методи виготовлення очищених, концентрованих інактивованих вірусних антигенів, які можуть застосовуватись для імунізації тварин і як компоненти імунохімічних реакцій;

- розробити раціональні способи гіперімунізації, більш технологічні і досконалі методи отримання гіперімунних сироваток від морських свинок, кролів і великої рогатої худоби;

- визначити вплив формальдегіду, тепла, азиридинів на антигенні характеристики збудників хвороби Ауєскі, чуми м'ясоїдних і геморагічної хвороби кролів при отриманні гіперімунних сироваток, провести порівняльні дослідження таких сироваток з тими, що отримані на неінактивовані вірусні антигени;

- приготувати різні типи емульсії та визначити їх вплив на якість гіперімунних сироваток;

- розробити раціональні способи консервування й очищення гіперімунних сироваток;

- охарактеризувати профілактичні та лікувальні властивості гіперімунних сироваток проти чуми м'ясоїдних та геморагічної хвороби кролів;

- розробити метод оцінки активності вірусовмісної суспензії печінки, отриманої від загиблих кролів, з метою подальшого впровадження контролю активності антигену при виготовленні вакцинних препаратів;

- вивчити динаміку накопичення та елімінації різних груп антитіл при гіперімунізації кролів і великої рогатої худоби антигенами вірусів хвороби Ауєскі, чуми м'ясоїдних, геморагічної хвороби кролів;

- з'ясувати особливості використання феномену “вторинної імунної відповіді” при отриманні гіперімунних сироваток;

- вивчити у порівняльному аспекті з антигенами вірусів хвороби Ауєскі, чуми м'ясоїдних і геморагічної хвороби кролів ад'ювантну активність неорганічних сорбентів, масляних ад'ювантів вітчизняного і зарубіжного виробництва при отриманні гіперімунних сироваток;

- впровадити у практику ветеринарної медицини гіперімунні сироватки проти чуми м'ясоїдних і вірусної геморагічної хвороби кролів.

Об'єкт дослідження - профілактичні, лікувальні та діагностичні препарати, виготовлені з сироватки крові гіперімунізованих тварин при інфекційних вірусних хворобах.

Предмет дослідження - вірусні антигени (культуральні та виготовлені з паренхіматозних органів тварин); індикація, очищення і концентрування вірусів; способи та схеми гіперімунізації тварин при виготовленні імунізуючих та діагностичних препаратів проти хвороби Ауєскі, чуми м'ясоїдних та геморагічної хвороби кролів.

Методи дослідження - вірусологічні (культури тканин, титрування вірусів, біопроби на тваринах), морфологічні (патолого-анатомічний), біохімічні (загальний білок), імунологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Теоретично та експериментально обґрунтовані технологічні аспекти виготовлення діагностичних і лікувально-профілактичних препаратів із використанням антигенів вірусів хвороби Ауєскі, чуми м'ясоїдних, геморагічної хвороби кролів. Визначено та відпрацьовано технологічні етапи і схеми очищення та концентрування антигенів, які придатні для умов біофабричного виробництва діагностичних і лікувально-профілактичних препаратів на основі специфічних сироваток. З урахуванням доступності та рентабельності визначені методи і засоби очищення та концентрування вірусів різних родин, які відрізняються між собою структурно-морфологічними і біологічними особливостями (герпесвіруси, параміксовіруси, каліцивіруси). Встановлено, що препарати ПЕГ, аеросил, їх комбінація дозволяють здійснювати очищення вірусів на 80-99% від баластних білків, не порушуючи їх антигенної структури. Експериментально обґрунтована ефективність повної інактивації вірусів без порушення їх антигенної структури при використанні препаратів азиридинового ряду (аміноетилетиленімін), а також можливість пролонгування імуностимулювальної дії шляхом емульсування антигенів. Експериметально підтверджено більш високі показники імуностимулювальних властивостей масляних ад'ювантів (НАФ, ПАФ, “SEPPIC”) порівняно з сорбентами, що опосередковано підтверджує тезу про те, що при застосуванні останніх утворюється ліпопротеїнова структура за принципом ліпосом, чим зумовлюється зниження інтенсивності перетравлювання імунізуючого антигену, в результаті чого розвивається більш виражена імунна відповідь. Проведено оцінку різних типів емульсій. Показано, що антиген, корпускульований у маслі, в свою чергу пролонгує антигенне подразнення імунокомпетентної системи і підвищує імунну відповідь організму тварин-донорів. Оптимізовано кратність застосування антигенів з використанням можливості локальної реакції лімфатичних вузлів та врахуванням факторів “вторинної імунної відповіді” на уведення антигену. Обґрунтована і експериментально підтверджена можливість застосування дезмолу і формальдегіду для очищення і консервування (формальдегід) специфічних сироваток, що скорочує термін випуску препаратів і забезпечує їх стерильність. Вперше розроблені принципово нові схеми отримання гіперімунних сироваток крові морських свинок, кролів, великої рогатої худоби (патенти РФ № 2036660 та № 2044548, патент України № 35684 А).

Практичне значення одержаних результатів. На підставі проведених досліджень поліпшені існуючі та створені нові схеми й методи одержання гіперімунних сироваток на всіх технологічних етапах їх виготовлення. В результаті досліджень запропонований метод отримання універсального антигену, придатного як для імунізації тварин-донорів, так і для постановки імунохімічних реакцій.

Результати досліджень можуть бути використані науково-дослідними лабораторіями, виробничими цехами і біологічними фабриками України при виробництві діагностичних і лікувальних препаратів.

Державним Департаментом ветеринарної медицини затверджені: “Настанова по застосуванню гіперімунної сироватки проти чуми м'ясоїдних (хвороба Карре) із культурального вірусу” (реєстраційний № 15-14/34, 30.05.1995) та ТУ У на цей препарат (30.05.1995); “Тимчасова настанова по застосуванню полівалентної сироватки проти чуми, парвовірусних інфекцій та вірусного гепатиту собак та хутрових звірів” (реєстраційний № 15-14/87, 31.07.1996); “Настанова по застосуванню інактивованої тканинної концентрованої формол-вакцини проти вірусної геморагічної хвороби кролів із штаму НК/99” (реєстраційний № 15-14/177, 11.10.1999) і ТУ У 46.15.418-99 на цей препарат; “Настанова по застосуванню сироватки проти вірусної геморагічної хвороби кролів” (реєстраційний № 15-14/178, 11.10.1999) і ТУ У 46.15.417-99 на цей препарат.

Матеріали дисертації використовуються у навчальному процесі при викладанні курсу “Загальна та спеціальна епізоотологія”, вони використані також при написанні “Практикуму із загальної епізоотології” (1999) та підручника “Загальна епізоотологія” (2002), затверджених Міністерством аграрної політики України відповідно як посібник і підручник для викладачів і студентів факультетів ветеринарної медицини вищих навчальних аграрних закладів ІІІ і IV рівнів акредитації, та підручника “Епізоотологія з мікробіологією” (2006) для студентів факультетів ветеринарної медицини І і ІІ рівнів акредитації.

Матеріали дисертації використані при написанні наукових монографій “Чума м'ясоїдних” (перше й друге видання) (2000, 2002), “Вірусна геморагічна хвороба кроликів” (2001), “Хвороба Ауєскі” (2002), “Інфекційні та інвазійні хвороби кролів” (2003).

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно виконано, проаналізовано та узагальнено увесь обсяг експериментальних досліджень.

Здобувач також розробив та обґрунтував технологію отримання гіперімунних сироваток із застосуванням концентрованих емульсованих антигенів, запропонував: нові методичні підходи щодо схем отримання специфічних гіперімунних сироваток із використанням локальної реакції лімфатичних вузлів; методи концентрування та інактивації вірусовмісних суспензій; очищення гіперімунних сироваток. Здійснював безпосереднє проведення досліджень, статистично обрахував та узагальнив одержані результати, сформував висновки та пропозиції виробництву.

Вірусологічні, імунологічні, біохімічні дослідження, лікування тварин проводив разом із співробітниками кафедр епізоотології (Ярчук Б.М., Корнієнко Л.М.) та терапії і клінічної діагностики Білоцерківського ДАУ (Головаха В.І., Розумнюк А.В), співробітниками лабораторії біотехнології клітинних культур ІЕіКВМ (Білокінь В.С.) та фахівцями агробіологічних підприємств України (Главацький В.П.) а також із лікарями ветеринарної медицини Білоцерківської міської лікарні ДВМ (Власенко В.В).

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися та обговорювалися на Міжнародній науковій конференції “Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы” (Харків, 1995), ІІІ-, IV- і VI-й Міжнародних науково-практичних конференціях “Проблеми ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин” (Київ, 1998, 1999, 2000), Міжнародній конференції молодих вчених “Стан та перспективи розвитку ветеринарної науки” (Харків, 1999), Міжнародній науково-практичній конференції “Ветеринарна наука на порозі ХХІ віку” (Харків, 2000), Міжнародній науково-практичній конференції "Наукові та практичні аспекти ветеринарної медицини в Україні" (Біла Церква, 2006), конференції молодих учених і спеціалістів України “Проблеми ветеринарної медицини по обслуговуванню тваринництва колективних та фермерських господарств” (Харків, 1992), Українській конференції молодих учених “Сучасні проблеми ветеринарної медицини” (Київ, 1994), науково-практичній конференції “Вчені Білоцерківського державного сільськогосподарського інституту - виробництву” (Біла Церква, 1994), науково-практичній конференції “Наукове забезпечення агропромислового комплексу України в сучасних умовах” (Біла Церква, 1995), першій Всеукраїнській науково-виробничій конференції ветеринарних патологів “Актуальні питання ветеринарної патології” (Київ, 1996), науково-практичній конференції “Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми” (Харків, 1997), науково-практичній конференції з питань ветеринарного забезпечення хутрового звірівництва (Черкаси, 2005), науково-практичній конференції, присвяченій 75-річчю Новогалещинської біофабрики (Полтава, 2006), на засіданнях товариства ім. І.І. Мечнікова (Біла Церква, 1998), на наукових конференціях науково-педагогічних працівників факультету ветеринарної медицини (Біла Церква, 1994-2005).

Публікації. Результати експериментальних досліджень представлені у 53 наукових працях: у підручниках для викладачів і студентів факультетів ветеринарної медицини вищих навчальних закладів (3); у наукових монографіях (5); 26 (11 одноосібних) наукових статтях у профільних журналах і фахових збірниках наукових праць; у патентах на винахід (3); матеріалах тез міжнародних та державних конференцій з ветеринарної медицини (16).

Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 255 сторінках комп'ютерного тексту, ілюстрована 86 таблицями, 10 рисунками, включає вступ, огляд літератури, власні дослідження (7 розділів), їх аналіз і узагальнення, висновки та рекомендації виробництву, список використаної літератури (містить 515 джерел, у тому числі 191 із далекого зарубіжжя), та додатки.

ВИБІР НАПРЯМІВ ДОСЛІДЖЕНЬ, МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ

Робота виконувалась на базі лабораторії біотехнології клітинних культур Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини (1992 рік), науково-дослідної лабораторії кафедри епізоотології Білоцерківського державного аграрного університету, та віварію, в навчальному господарстві Білоцерківського державного аграрного університету, індивідуальних господарствах кролівників-любителів Володарського й Білоцерківського районів Київської області, на базі Білоцерківського міського підприємства державної ветеринарної медицини та Остерської дільничної лікарні ветеринарної медицини Чернігівської області (1993-2004 роки). Сироватки моновалентні (проти чуми) і полівалентні (проти чуми, парвовірозу та інфекційного гепатиту) реалізувались через державне підприємство “Укрзооветпромпостач” (м. Бровари) і випробовувались в усіх областях України.

У дослідах були використані штами вірусу хвороби Ауєскі, “УНДІЕВ-18ВС”, “К”; вірулентний штам вірусу чуми м'ясоїдних, виділений нами у 1992 р. і типований із специфічними моновалентними сироватками “Rhone Meriux”, також вакцинний штам “ЕПМ”; вірулентний штам “Воронезький-87” вірусу геморагічної хвороби кролів та виділений нами вірулентний штам “НК/99” (типований і паспортизований).

Культивування вірусу хвороби Ауєскі проводили на культурі клітин гонад кози (GН-91), первинній культурі клітин курячих фібробластів; - вірусу чуми м'ясоїдних на перещеплюваних культурах клітин ВНК-21 (нирка новонародженого сірійського хом'яка), ПТП (тестикули поросяти), культурі курячих фібробластів. Первинну культуру клітин курячих фібробластів (КФ) готували за раніше описаною методикою (Сюрин В.Н. и соавт., 1986). При проведенні досліджень з культурами клітин (зараження вірусом, визначення повноти інактивації вірусів, визначення титрів інфекційної активності після концентрування різними речовинами) обов'язково запроваджували контролі культур, які були використані (контроль спонтанної дегенерації).

У дослідах із культивування клітин використовували сироватку крові великої рогатої худоби виробництва Київського та Херсонського м'ясокомбінатів, живильні середовища Інституту поліомієліту та вірусних енцефаломієлітів (м. Москва) та Інституту ветеринарної медицини (м. Київ).

Клітинні культури та вірус культивували у флаконах із під антибіотиків і культуральних колбах об'ємом 1,2-1,5 л. Інкубування клітин і вірусу припиняли за наявності 65-85% уражених клітин, що становило у межах 24-72 год для вірусу хвороби Ауєскі, і в межах 3-15 діб для вірусу чуми м'ясоїдних. Вірусовмісні суспензії перевіряли на стерильність. Активність вихідних вірусних суспензій переважно визначали за титрами інфекційності на гомологічних культурах. Титри інфекційності вираховували за методом Кербера у модифікації И.П. Ашмарина, А.А. Воробьева (1962).

Очищення вірусовмісних суспензій від клітинного детриту здійснювали методом відстоювання та центрифугування із застосуванням аеросилу і поліетиленгліколю. Очищення сироваток від баластних речовин здійснювали методом відстоювання й центрифугування із застосуванням розчинів аеросилу, поліетиленгліколю, дезмолу, формаліну. Ступінь очищення вірусовмісних суспензій визначали за зниженням рівня білка в пробі спектрофотометричним методом при довжині хвилі 280 нм (Холин Ю.А. и соавт., 1981) і за методом O.H. Lowry et al. (1951).

Концентрування вірусу хвороби Ауєскі для проведення циклів гіперімунізації здійснювали за раніше відпрацьованими методиками (Корниенко Л.Е., 1992). Концентрування вірусовмісних суспензій (вірусів чуми м'ясоїдних, чуми великої рогатої худоби, геморагічної хвороби кролів) здійснювали поліетиленгліколем і поліетиленіміном. Ефективність концентрування суспензій вірусу геморагічної хвороби кролів визначали за активністю вірусу в РГА та РЗК. У вихідній вірусовмісній культуральній рідині, концентратах і надосадовій рідині визначали титр інфекційності вірусу чуми м'ясоїдних. Процент втрати вірусу розраховували за формулою (титри інфекційної активності вірусу визначали у абсолютних значеннях):

Втрати вірусу, % = титр інф. акт. надосадової рідини

титр інф. акт. у вихідній вірусовм.сусп.

Концентрування вірусовмісних суспензій із застосуванням аеросилу й гідроксиду алюмінію здійснювали 3% робочими розчинами. До вірусовмісних суспензій вносили сорбенти до кінцевих концентрацій 0,015-0,6% (за сухою речовиною). Надосадову рідину декантували, втрати вірусу розраховували за наведеною вище формулою.

При концентруванні вірусовмісних суспензій комбінованим способом (поліетиленгліколь+аеросил) в освітлену вірусовмісну суспензію вносили NaCl до кінцевої концентрації 0,5М і після перемішування додавали поліетиленгліколь до кінцевих концентрацій 8-12%, перемішували й додавали аеросил до кінцевих концентрацій 0,015-0,075% (за сухою речовиною). Після відстоювання при температурі 2-4^оС протягом 24-48 год надосадову рідину в кількості 90% від вихідного об'єму декантували, а решту вірусної суспензії з осадом центрифугували при 2000g. Осад ресуспендували до 1/50-1/100 вихідного об'єму вірусовмісної суспензії із застосуванням 0,1М аміачного буферного розчину, (рН 7,4-7,6) і розраховували втрати вірусу за вищезазначеною формулою.

У процесі підбору оптимальних схем імунізації, застосування різних антигенів і ад'ювантів використовували відгодівельних бичків віком 12-18 міс (117 гол), коней віком 3-5 років (12 гол), морських свинок масою 300-400 г (210 гол), підсвинків масою 40-50 кг (33 гол), кролів масою 1,8-2,5 кг (163 гол). В гострих дослідах із зараження тварин використано безпородних цуценят собак віком 2-4 міс (18 гол), кролів масою 1,8-2,5 кг (111 гол). В дослідах з випробування діагностичної цінності розроблених імунологічних методів досліджено 35 трупів собак з підозрою на чуму м'ясоїдних і 106 трупів кролів із підозрою на вірусну геморагічну хворобу.

РЗК та РТЗК ставили за методиками В.Н.Сюрина и соавт. (1986, 1991).

Реакцію нейтралізації здійснювали на гомологічних культурах клітин за загальноприйнятою методикою з дворазовим розведенням досліджуваних сироваток і постійними дозами вірусу 100-1000 ТЦД₅₀/см³ (ГОСТ-25763-83), а реакцію дифузної преципітації (РДП у гелі за Оухтерлоні, подвійна радіальна імунодифузія) за відповідною методикою (Сюрин В.Н. и соавт., 1986).

Реакцію радіальної імунодифузії ставили за схемою, запропонованою В.А. Мищенко (1976) для визначення антитіл до вірусу ящуру, а реакції гемаглютинації та її затримки ставили за загальноприйнятими методиками (Сюрин В.Н. и соавт., 1986, 1991).

При застосуванні емульсій (з масел вітчизняного виробництва) типу “вода в маслі”, “масло у воді”. “вода-масло-вода” використовували вазелінове масло, повний ад'ювант Фрейнда, ПЕС, ярославське й ангарське мінеральні масла, мінеральні масла ВНДІЗТ (м. Владимир, Росія), емульсії комбінованих антигенів, а також емульгатори: твін, ланолін, спан. Масла й емульгатори брали у різних співвідношеннях (Дудников Л.А., 1992; Жансеркенова О.О., 1992). Для контролю виготовлення емульсії типу “вода-масло-вода” використовували твін (метод Герберта)(Бурдов А.Н. и соавт., 1990).

Реактогенність ад'ювантів визначали за місцевою реакцією та розмірами ущільнення тканин, що розвивались на місці уведення антигену й часу їх розсмоктування. Для зручності оцінки реактогенності масел і ад'ювантів застосували 6-бальну шкалу за методикою А.А. Сидорчука (1991): 0 - відсутність місцевої реакції; 1 - реакція у вигляді невеликої олеоми (горошина) розміром 1х1 см; 2 - помірна олеома, розміром 2х2 (квасоля); 3 - значна олеома, розміром від 3х3 до 4х4 (голубине яйце); 4 - велика олеома, розміром з куряче яйце; 5 - розкриття олеоми з утворенням виразки або абсцесу.

У дослідах використали також мінеральні ад'юванти виробництва французької фірми “SEPPIC”: ISA50 (тип емульсії “вода в маслі”, співвідношення ад'ювант:антиген - 50:50), ISA206 (тип емульсії “вода-масло-вода”, співвідношення - 50:50), ISA25 (тип емульсії “масло у воді”, співвідношення - 25:75); немінеральний ад'ювант ISA27 (тип емульсії “масло у воді”, співвідношення - 25:75); немінеральний ад'ювант ISA35 (тип емульсії “масло у воді”, співвідношення - 25:75), суміш мінерального і немінерального масел - ад'ювант ISA28 (тип емульсії “масло у воді”, співвідношення - 25:75).

Результати досліджень опрацьовували методами варіаційної статистики за Урбахом В.Ю. (1964), Сосовим Р.Ф. і співавт. (1974). При математичному опрацюванні результатів досліджень використовували ЕОМ і застосовували комп'ютерні програми статистичної обробки Microsoft Excel.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Оптимізація методик культивування (підтримання), інактивації, очищення і концентрування вірусів

Культивування й підтримання вірусів. Вірус чуми м'ясоїдних. Відповідно результатів наших досліджень, вірус чуми м'ясоїдних досить непогано адаптується до культур клітин ВНК-21 і первинної культури КФ. Негативні результати були отримані нами лише при адаптації цього вірусу до культури клітин ПТП. Уже в перших пасажах на культурі клітин ВНК-21 вірус чуми м'ясоїдних спричиняв ЦПД протягом 12-15 діб, а до 9-10 пасажу вона проявляється на 5-9 добу. Титри інфекційної активності вірусу поступово підвищуються. Якщо в перших пасажах вони становили 4,58-5,83 lg ТЦД₅₀/см³, з 5-6-го пасажу вони збільшились до 6,58-6,75 lg ТЦД₅₀/см³ (Р<0,01), а на 9-10 пасажі досягали 7,5 lg ТЦД₅₀/см³ (0,001). Відповідно знижувалась доза зараження порівняно з попередніми пасажами до 00,5-0,02 ЦПО (цитопатичних одиниць) на одну клітину. При адаптації цього вірусу до первинної культури клітин курячих фібробластів спостерігаються майже ті ж закономірності, однак термін адаптації та час прояву ЦПД дещо менші, порівняно з культурою ВНК-21. Так, у перших чотирьох пасажах в окремих культуральних колбах спостерігали ЦПД вже на 8-12-у добу, до 7-го пасажу ЦПД проявлялась на 7-12-у добу, а на 9-10 - на 5-8-у добу. Подальше пасажування не призводило до скорочення терміну прояву ЦПД і зменшення дози зараження. Однак, результати титрування вірусу (переважно на гомологічних культурах) показали, що вихід вірусу в культурі клітин ВНК-21 був вищим. У 9-10 пасажах титр інфекційної активності вірусу на культурі ВНК-21 становить 7,5 lg ТЦД₅₀/см³ (Р<0,05), тоді як на первинній культурі клітин КФ - 7,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Вірус геморагічної хвороби кролів. Нами у 1999 р. було виділено й ідентифіковано штам ВГХК. Проведено дослідження з підтримання виділеного вірусу на кролях. Результати з титрування вірусу показали, що в найбільш високих титрах збудник накопичується в печінці кролів, заражених цим вірусом (4,5 lg ЛД₅₀/см³). Досліди з пасажування вірусу ВГХК в організмі кролів показали, що обов'язковим є серологічне дослідження тварин перед зараженням, оскільки специфічні антитіла виявляють навіть у тварин, яким не проводили щеплення проти ВГХК. Звідси - неможливість відтворення хвороби або наявність досить тривалого інкубаційного періоду після зараження. Порівнюючи різні методи зараження ми з'ясували, що оптимальними є інтраназальний і внутрішньом'язовий. Кролі, в сироватці крові яких антитіла були відсутні, гинули через 18-24 год, а при наявності антитіл в титрах 1-2 log₂ (в РЗГА) - через 72-120 год. Отже, було встановлено, що між чутливістю кролів до зараження ВГХК і наявністю в їх крові гемаглютинабельних та інших антитіл існує певна корелятивна залежність, яку слід враховувати при підтриманні вірусу ВГХК. Досліди показали, що обробка серопозитивних тварин преднізолоном дещо знижує несприйнятливість організму до зараження, однак не давала абсолютної гарантії захворювання дослідних тварин.

Інактивація вірусів. Результати досліджень з інактивації вірусу чуми м'ясоїдних формальдегідом свідчать, що при концентраціях препарату 0,035-0,07% за температурного режиму 37^оС повна інактивація збудника наставала вже через 12 год від початку інактивації. При температурному режимі інактивації 26^оС процес втрати інфекційності дещо уповільнювався, однак все одно становив 8 год при тих же концентраціях діючої речовини. При концентрації формальдегіду 0,1% при обох температурних режимах інактивації повна втрата інфекційності вірусовмісних суспензій спостерігалась вже через 4 год. Інактивація вірусу чуми м'ясоїдних аміноетилетиленіміном при концентрації речовини 0,04-0,08% і температурному режимі 37^оС відбувалась за 8 год, при 0,12% - за 6 год, при 0,16% - за 4 год. Зниження температурного режиму до 26^оС дещо уповільнювало процес інактивації при 0,04-0,08% до 10 год, при 0,12% - 8 год, при 0,16% - 6 год.

Для інактивації вірусу геморагічної хвороби кролів застосували, як і з двома попередніми вірусами, формальдегід і аміноетилетиленімін. Концентрація формальдегіду в наших дослідах - 0,3%. Аміноетилетиленімін брали так само в високих концентраціях. Результати досліду показали, що при 4, 26 і 37^оС протягом доби зазначені препарати інактивують інфекційну активність вірусу. При зараженні інтактних до ВГХК кролів залишкова вірулентність була відсутня. Інактивація при 56^оС вірусовмісної суспензії ВГХК впродовж 1 години виявилась недостатньою. При перевірці на залишкову вірулентність один кріль з двох заражених захворів на ВГХК. Через 2 год від початку інактивації залишкової інфекційності вірусовмісної суспензії не спостерігали.

Очищення й концентрування вірусних антигенів для імунізації тварин-донорів. Імунізація тварин-донорів вірусовмісними суспензіями обов'язково передбачає їхнє попереднє очищення від клітинного детриту і забезпечення більш високої специфічності. Результати дослідів з очищення вірусовмісних суспензій із застосуванням центрифугування показало невисоку ефективність цього методу. Однак, центрифугування було більш ефективним ніж природна седиментація. Так, ступінь очищення вірусовмісної суспензії вірусу чуми м'ясоїдних при центрифугуванні становила 59,2%, при природній седиментації лише 46,3%; для вірусу геморагічної хвороби кролів - 68,75% і 54,2%, відповідно.

Високоефективним виявися метод очищення вірусовмісних суспензій від клітинного детриту із застосуванням різних концентрацій поліетиленгліколю. Так, ступінь очищення для вірусу чуми м'ясоїдних при 10% концентрації становив 60,0%, при 15% - 71,1, при 20% - 80,0%; для вірусу геморагічної хвороби кролів відповідно - 53,5%, 64,4, 74,0%. Однак високий ступінь очищення вірусовмісних суспензій (від 74,0 до 85,2%) супроводжувався зниженням титру інфекційності вірусовмісних суспензій. Тобто вірус у значній кількості осідав у преципітат і надалі після ресуспендування міг бути використаний для імунізації донорів. Найбільшого ефекту осадження вірусів чуми м'ясоїдних досягали преципітацією поліетиленгліколем. Проведення одно-, дво- і триразового переосадження поліетиленгліколем вірусовмісної суспензії вірусу чуми м'ясоїдних підвищувало ступінь очищення з 60,0 до 77,8 і 93,4%. Враховуючи високу здатність поліетиленгліколю преципітувати модельні віруси, він був використаний у подальших дослідах з концентрування. Оптимальна преципітація вірусів відбувалась при 4-годинній експозиції з ПЕГ. Процент неадсорбованого вірусу для збудника чуми м'ясоїдних становив лише 3,8-3,16%.

Високий рівень активності було виявлено також у поліетиленіміну (80,0-91,8%), однак проблемним виявилось виділення вірусу з преципітату. З цих причин у наступних дослідах дана речовина більше не застосовувалась.

При порівнянні сорбівних властивостей аеросилу і гідроксиду алюмінію встановили переваги першого стосовно досліджених вірусів. У 0,015% концентрації аеросил сорбував 82,22% вірусу чуми м'ясоїдних, тоді як гідроксид алюмінію в тій же концентрації сорбував 24,14%. При застосуванні 0,015-0,075% концентрації сорбентів з вірусом геморагічної хвороби кролів ефективність сорбції аеросилом також була вище ніж у гідроксиду алюмінію. Активність вірусу, яка визначалась за титрами виявлення антитіл в РГА після сорбції гідроксидом алюмінію в концентрації 0,075%, становила 5,5±0,36 log₂ ГАО, аеросилом - 4,0±0,36 log₂ ГАО (Р0,01). При збільшенні концентрації аеросилу в вірусовмісних суспензіях з 0,09 до 0,6% кількість неадсорбованого вірусу чуми м'ясоїдних становила 0,83%. Активність вірусу геморагічної хвороби кролів в РГА зменшувалась з 10,25±0,27 до 1,2 log₂ ГАО (Р0,001). При концентраціях аеросилу 0,3-0,6% концентрування вірусовмісних суспензій вдавалося здійснити лише у 8-12 разів за об'ємом. При комбінованому методі концентрування вірусовмісних суспензій поліетиленгліколем у присутності аеросилу спостерігали максимальний концентрувальний ефект цих хімічних речовин. При концентруванні 10% поліетиленгліколем і 0,075% аеросилом залишається неадсорбованим всього 0,56% вірусу чуми м'ясоїдних. Гемаглютинабельна активність вірусовмісної суспензії геморагічної хвороби кролів в РЗГА після застосування таких концентрацій сорбенту знижувалась з 10,25±0,27 log₂ до 2,0 log₂ (Р0,001). При з'ясуванні терміну концентрування комбінованим способом встановили, що час, достатній для утворення концентрату для вірусів чуми м'ясоїдних і вірусу геморагічної хвороби кролів, становить лише 4 год. Збільшення терміну концентрування комбінованим методом до 24 год знижує кількість неадсорбованого вірусу чуми м'ясоїдних з 1,0 до 0,46%, для збудника вірусної геморагічної хвороби кролів, що з'ясувалось за РГА з 2,0 до 1,67 log₂ ГАО (Р0,05). Результати дослідів з концентрування вірусів чуми м'ясоїдних і геморагічної хвороби кролів аеросилом у присутності поліетиленгліколю вказують на високу ефективність методу.

Розробка методів контролю активності отриманих антигенів і гіперімунних сироваток. При відпрацюванні методик постановки серологічних рекцій з метою контролю вірусних антигенів і перевірки активності отриманих гіперімунних сироваток було стандартизовано методики постановки РЗК при хворобі Ауєскі, чумі м'ясоїдних і вірусній геморагічній хворобі кролів. РЗК дозволяє ідентифікувати віруси у напівфабрикатах, з яких готуються вакцини, діагностичні і контрольні антигени або препарати для імунізації донорів діагностичних сироваток крові, а також у патологічному матеріалі та продуктах забою тварин. Так, при постановці РЗК з вірусом хвороби Ауєскі було встановлено, що титрувати комплемент потрібно в гемсистемі, а 1 ОД дорівнює 0,3%. В реакцію зв'язування комплементу при хворобі Ауєскі необхідно брати комплементу з надлишком у 0,6% від максимального титру. При постановці РЗК і РТЗК з вірусом чуми м'ясоїдних використовували подвійні розведення сироватки і 1% комплементу від максимального титру. При постановці РЗК з метою індикації з досліджуваним вірусом використовували виключно сироватки морських свинок. Порівнюючи результати РЗК і РТЗК, звернули увагу на те, що остання була чутливішою від РЗК з випробуваними вірусами, а зокрема з вірусом хвороби Ауєскі і геморагічної хвороби кролів на 1-2 розведення (Р0,01).

РН використовували для визначення ступеня гомологічності між штамами вірусу чуми м'ясоїдних за загальноприйнятою методикою. Специфічну гіперімунну сироватку з більш високим титром в РН отримували на епізоотичний штам. Активність останньої з цим штамом становила 8,83±0,1 log₂, а з вакцинним - 9,08±0,1 log₂ (Р0,05).

При випробуванні РРІД і РДП з вірусами хвороби Ауєскі та чуми м'ясоїдних встановили більш високу на 2,0-4,2 log₂ чутливість РРІД (Р0,01-0,001).

Гемаглютинабельна активність штаму НК/99 вірусу геморагічної хвороби кролів не поступалась вірулентному штаму “Воронезький-87”. Була встановлена антигенна гомологія цих двох штамів вірусної геморагічної хвороби кролів.

Відпрацьовані реакції були використані при вивченні патогенетичних особливостей розвитку чуми м'ясоїдних і вірусної геморагічної хвороби при експериментальному зараженні сприйнятливих тварин. Було встановлено, що при чумі м'ясоїдних у перехворілих собак збудник може протягом декількох місяців зберігатись у центральній нервовій системі (персистування). До того ж, збільшення вірусонейтралізуючих антитіл у таких тварин підтверджує активну експресію вірусного антигену в центральній нервовій системі таких тварин. РН і РРІД виявились придатними для індикації антигену вірусу чуми при еспериментальному й спонтанному зараженні. За допомогою РРІД можна ефективно проводити індикацію збудника чуми в крові під час гарячкового стану.

РГА була використана нами при виявленні закономірностей розвитку інфекційного процесу при геморагічній хворобі кролів. Встановлено, що найвищі титри гемаглютинабельної активності вірусу виявляються в печінці уражених тварин (9-12 log₂ ГОА). Поява патологічних змін в інших органах на заключному етапі розвитку хвороби - результат різкого порушення функції печінки.

Нами також відпрацьований метод визначення активності суспензії печінки при вірусній геморагічній хворобі кролів. Метод було включено як один з технологічних етапів виготовлення вакцини проти даної хвороби. Серією дослідів було встановлено, що титри гемаглютинабельних антитіл в РЗГА - 4,0-5,0 log₂ є достатніми для попередження зараження таких кролів вірулентним вірусом. При активності вірусу 7,0-8,2 log₂ ГОА в РГА титри гемаглютинабельних антитіл в РЗГА становили 3,4-4,4 log₂, що було недостатнім для тривалого захисту від зараження таких тварин. Лише при активності вірусовмісної суспензії 9,0-10,2 log₂ ГОА (Р0,01) активність сироваток на 21-у добу після введення такого препарату становила 5,6-6,8 log₂ (Р0,01). Такі титри гемаглютинабельних антитіл виявились достатніми, щоб тварини протистояли експериментальному зараженню.

Розробка схем і методів імунізації донорів

Отримання гіперімунних сироваток від різних видів тварин. Після проведення досліджень з культивування, інактивації і концентрування вірусних антигенів нами було запропоновано кілька принципово нових схем отримання гіперімунних сироваток на морських свинках, кролях і великій рогатій худобі із застосуванням таких антигенів.

При випробовуванні ад'ювантів різного походження при імунізації морських свинок антигенами вірусу хвороби Ауєскі встановили, що більш високі імуностимулювальні властивості мали масляні ад'юванти (НАФ). Зокрема при застосуванні цих ад'ювантів вірусонейтралізуюча активність сироваток становила 4,6±0,3 log₂, а отримані при застосуванні ПАФ - 5,6±0,25 log₂ (Р0,01). Враховуючи цю ситуацію в дослідах з отримання гіперімунних сироваток, надалі використовували концентровані емульсовані антигени. Масляну емульсію з антигеном вірусу хвороби Ауєскі вводили морським свинкам у стегнову групу м'язів в об'ємі 1,0 см³. Через 20-22 доби цей же препарат вводили аналогічно в іншу кінцівку. Третя ін'єкція здійснювалась через 28-30 діб після першої. Донорів піддавали знекровлюванню на 39-40 добу після початку імунізації. Активність отриманих сироваток в РН і РЗК на інактивований формальдегідом вірусний антиген становила відповідно 6,25±0,3 і 5,66±0,34 log₂, а на інактивований аміноетилетиленіміном - 6,7±0,18 (Р0,05) і 6,1±0,08 log₂ (Р0,05). При порівняльному випробуванні методу отримання діагностичних сироваток на білих щурах, запропонованого Юсуповим Р.Х. (1984), встановили, що активність сироваток, отриманих за нашим методом, перевищувала відповідну на 0,9-1,35 log₂ в РН (Р0,01). Цей спосіб імунізації був з успіхом випробуваний нами на моделях вірусів чуми м'ясоїдних і геморагічної хвороби кролів. Активність сироваток в РЗК після трьох ін'єкцій антигену становила для вірусу чуми м'ясоїдних - 9,12±0,12, для вірусу геморагічної хвороби кролів - 10,8±0,2 log₂ (Р0,01).

Таким чином, нами був запропонований більш ефективний метод імунізації морських свинок. Використання морських свинок дає можливість отримувати гіперімунну сироватку на 39-40 добу і знизити її собівартість за рахунок зменшення витрат на утримання донорів.

Досліди з гіперімунізації кролів із застосуванням різних ад'ювантів, як і у випадку з морськими свинками, показали переваги масляних ад'ювантів НАФ і ПАФ. Вірусонейтралізуюча активність сироваток, отриманих від кролів після чотирьох ін'єкцій неконцентрованого антигену вірусу хвороби Ауєскі при застосуванні НАФ на 45 добу від початку імунізації, становила 6,15±0,16 log₂, при застосуванні ПАФ - 7,33±0,37 log₂ (Р0,01). Активність отриманих сироваток при застосуванні ад'ювантів НАФ і ПАФ порівняно з аеросилом і гідроксидом алюмію була вищою на 1,0-1,4 log₂ (Р0,01) і 2,18-2,58 log₂ (Р0,01-0,001), відповідно.

Надалі був відпрацьований спосіб гіперімунізації кролів емульсованим антигеном із використанням феномену локальної реакції лімфатичних вузлів. Прискорення процесу отримання гіперімунних сироваток досягалось за рахунок того, що одночасно з першою ін'єкцією антигену проводиться фенотипова корекція імунокомпетентної системи донора, що забезпечує більш інтенсивну імунохімічну відповідь. Вона забезпечується тим, що при введенні антигену вірусу хвороби Ауєскі з ад'ювантом в міжпальцеві простори задніх кінцівок відбувається коммітування клітин пам'яті і гіперплазія лімфатичних вузлів за рахунок інтенсивного збільшення популяції антитілоутворюючих клітин. Друга ін'єкція антигену в суміші з ад'ювантом здійснювалася в гіперплазовані підколінні лімфатичні вузли і на фоні попередньої їхньої сенсибілізації і подразнення ад'ювантом посилювала попередньо досягнутий імунологічний ефект. Цьому також сприяла і особлива форма застосування імунізуючого антигену, який після емульсування в масляному ад'юванті утворює складну ліпопротеїнову структуру, за фізико-хімічними властивостями ідентичну лізосомам.

Активність отриманих сироваток була вищою порівняно зі способом-прототипом (Kardl V. et al., 1990) на 0,33-1,0 log₂ (Р0,05-0,01) в РН, на 0,47-1,84log₂ (Р0,05-0,01) в РРІД, на 2,0 log₂ (Р0,01) в РДП. Недоліком сироваток, отриманих способом-прототипом, була відсутність комплементозв'язувальної активності цих препаратів. Комплементозв'язувальна активність сироваток, отриманих до антигену вірусу хвороби Ауєскі запропонованим нами способом, становила 5,33-6,14 log₂. Одержані на кролях гіперімунні діагностичні сироватки були придатними для постановки РН, РЗК, РРІД, РДП.

Використання способу, запропонованого для імунізації кролів антигенами вірусу хвороби Ауєскі, дозволяє значно прискорити процедуру отримання цільового продукту і отримати гіперімунну сироватку на 29-35 добу, а також знизити її собівартість за рахунок зменшення витрат на утримання донорів. Цей метод імунізації був з успіхом випробуваний і з антигенами інших вірусів (чуми м'ясоїдних, вірусу геморагічної хвороби кролів). Внаслідок зменшення інтервалу між ін'єкціями вдається отримувати гіперімунні сироватки, але їхня активність на 2-3 log₂ (Р0,01-0,001) нижча, ніж в запропонованому способі. Зниженню собівартості запропонованого способу сприяє також імунізація інактивованим антигеном. В цьому випадку відпадає необхідність у спеціалізованих віварних приміщеннях, придатних для роботи з тваринами, зараженими вірусом. Навіть після одноразового введення антигену без ад'ювантів активність їх сироваток в РН починає виявлятись впродовж першого тижня.

Досліди з гіперімунізації коней показали, що сироватки цих тварин характеризуються досить високою активністю різних груп антитіл. Так, при імунізації коней антигенами вірусу хвороби Ауєскі, емульсованими в НАФ і ПАФ, різниця титрів вірусонейтралізуючих антитіл на 45 добу становила 1,25 log₂ (Р0,01); з антигеном вірусу чуми м'ясоїдних - 0,67 log₂ (Р0,05). Однак, слід зазначити, що при застосуванні емульсованих антигенів на основі вітчизняних масел спостерігалась досить висока реактогенність таких препаратів (у коней проявляється ексудативний тип запалення). Коні легше переносили введення сорбованих антигенів, хоча активність таких сироваток була нижчою і для створення відповідних титрів вірусонейтралізуючих антитіл потрібні були додаткові витрати засобів і матеріалів.

При проведенні досліджень з гіперімунізації свиней також встановлені високі імуностимулювальні та пролонгуючі властивості масляних НАФ і ПАФ ад'ювантів. Титри вірусонейтралізуючих антитіл до вірусу хвороби Ауєскі на 45 добу від початку імунізації становили 4,67±0,42 і 5,67±0,42 log₂ (Р0,01), до вірусу чуми м'ясоїдних - 4,67±0,42 і 5,33±0,38 log₂ (Р0,05), відповідно.

При гіперімунізації великої рогатої худоби закономірно було встановлено переваги емульсованих антигенів порівняно з сорбентами. Титри вірусонейтралізуючих антитіл при застосуванні НАФ і ПАФ до вірусу хвороби Ауєскі становили відповідно 4,8±0,2 і 5,6±0,25 log₂ (Р0,05), до вірусу чуми м'ясоїдних відповідно 4,2±0,2 і 4,6±0,25 log₂ (Р0,05). Титри гемаглютинабельних антитіл до вірусу геморагічної хвороби кролів на 45-й день відповідно при застосуванні НАФ і ПАФ становили 10,4±0,3 і 12,0±0 log₂ (Р0,01). Порівняно з сорбованим антигенами активність сироваток перевищувала таку на 4-6 log₂. Досліди із застосування для гіперімунізації великої рогатої худоби концентрованих емульсованих антигенів показали переваги порівняно з ПАФ на 1,2-2,2 log₂ (Р0,01).

На основі попередніх дослідів із використанням локальної реакції лімфатичних вузлів на введення вірусних антигенів було запропоновано новий спосіб гіперімунізації великої рогатої худоби антигенами вірусу чуми м'ясоїдних. Спосіб грунтується на використанні для імунізації концентрованого емульсованого антигену, введенні його безпосередньо в лімфатичні вузли (передлопаткові і колінної складки, почергово) і внутрішньовенно. Таким чином кратність, введень доведено до 3-х, а масовий відбір крові проводили на 29-35 добу після першої імунізації. Порівняно із способом-прототипом (Старов С.К. и соавт., 1995) запропонований дозволяє скоротити термін отримання сироватки на 41-55 діб, з активністю специфічних сироваток, що вище відповідної в РДП на 5,1 (Р0,001), в РРІД - на 4,3 (Р0,001), в РЗК - на 1,35 (Р0,01), в РН - на 2,05 log₂ (Р0,01) (табл. 1).

Таблиця 1

Активність гіперімунних сироваток, отриманих із

використанням різних схем імунізації

Примітка. *** - Р<0,001, порівняно із запропонованим способом.

При випробуванні цього способу імунізації з концентрованими антигенами вірусу геморагічної хвороби кролів активність сироваток становила 13,3±0,4 log₂ в РТЗК і 16,7±0,62 log₂ в РЗГА.

При застосуванні неконцентрованого антигену вірусу хвороби Ауєскі на 35 добу від початку імунізації було отримано сироватки із вірусонейтралізуючою активністю 8,9±0,04 log₂. Отримані сироватки виявились придатними для виготовлення діагностикумів і лікувальних препаратів.

Отже, при проведенні імунізації слід враховувати, що гіперімунні сироватки різних видів тварин мають неоднакову активність в реакціях преципітації (РДП, РРІД) та зв'язування комплементу (РЗК, РТЗК). Так, кролі і свині відповідають утворенням преципітувальних антитіл на найбільшу кількість різних антигенів, морські свинки - більш високими титрами комплементозв'язувальних антитіл. Преципітувальні антитіла, як правило, з'являлись на 3-6 добі після першого введення антигену, комплементозв'язувальні - на 15-20, вірусонейтралізуючі на 7-18 добі. За швидкістю та інтенсивністю імунологічних реакцій на введення вірусних антигенів кролі мають переваги над іншими донорами. Титри противірусних антитіл у сироватці цих тварин на 1-2 log₂ вищі за титри в сироватках від морських свинок, великої рогатої худоби і свиней. Окремі сироватки від коней і свиней в РЗК, РТЗК мали антикомплементарну і прокомплементарну активність. Отже, добирати тварин-донорів, яких використовують для отримання гіперімунної сироватки, потрібно залежно від мети дослідження (сироватка для певного набору діагностикумів, лікувальна сироватка).

Вивчення реактогенних та антигенних властивостей концентрованих інактивованих антигенів із застосуванням ад'ювантів різного походження. Досліди з імунізації тварин різними антигенами наочно показали більшу ефективність концентрованих препаратів. Тому ми вирішили в наступних дослідах випробувати схему “концентрований препарат у ад'юванті” (сорбенті чи масляній емульсії) і таким чином оцінити імунну відповідь тварин-донорів. Вірусонейтралізуюча активність гіперімунних сироваток при концентруванні антигенів поліетиленгліколем і застосуванні гідроксиду алюмінію після трьох ін'єкцій антигену у кролів становила 6,0±0 log₂ з антигеном вірусу хвороби Ауєскі, 6,5±0,25 log₂ - антигеном вірусу чуми м'ясоїдних. Активність таких сироваток в РЗК при імунізації вірусом геморагічної хвороби кролів досягає 8,5±0,25 log₂. Досить високими, але дещо меншими за активністю (на 0,3-0,6 log₂), виявились гіперімунні сироватки, отримані з цими ж антигенами на великій рогатій худобі (Р<0,05).