Експериментальна фармакокінетика циназепаму та його метаболітів

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ`Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ФАРМАКОКІНЕТИКА ЦИНАЗЕПАМУ ТА ЙОГО МЕТАБОЛІТІВ

14.03.05 - фармакологія

ОВЧАРЕНКО НАТАЛІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

Одеса - 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України.

Науковий керівник - академік АМН України, доктор біологічних наук, професор ГОЛОВЕНКО Микола Якович, завідувач відділу фізико-хімічної фармакології Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор КАРАСЬОВА Тамара Леонідівна, Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, м. Одеса, провідний науковий співробітник відділу медичної хімії

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник ГАЛКІН Борис Миколайович, Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова МОН України, м. Одеса, завідувач Проблемної науково-дослідної лабораторії синтезу лікарських препаратів

Провідна установа - Інститут фармакології та токсикології АМН України, відділ фармакокінетики, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “07” червня 2006р. о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65082, Одеса, Валіхівський пров., 2).

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Одеського державного медичного університету МОЗ України (65082, Одеса, Валіхівський пров., 3)

Автореферат розісланий “05” травня 2006р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради к.мед.н., доцент Годован В.В.

АНОТАЦІЯ

Овчаренко Н.В. Експериментальна фармакокінетика циназепаму та його метаболітів.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія - Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2006.

Дисертація присвячена вивченню процесів всмоктування, розподілу, метаболізму та виведення нового снодійного препарату, похідного 1,4-бенздіазепіну - циназепаму, а також його головного фармакологічно активного метаболіту - норциназепаму.

У дослідах in vitro спостерігаеться інтенсивний метаболізм циназепаму з утворенням головного метаболіту - норциназепаму та подальшим перетворенням до двох груп гідрофільних метаболітів - глюкуронових кон'югатів та негідролізуємих водорозчинних домішок. На підставі величини константи Міхаеліса K_m, розрахованої для різних органів та тканин, можливо заключити, що ферменти, які здійснюють гідроліз циназепаму, є різними для органів та є найбільш активними у печінці.

В умовах in vivo загальні напрямки метаболізму циназепаму (миші) співпадають із шляхами біотрансформації в умовах in vitro. При внутрішньовенному введенні з організму циназепам виводиться у кількості лише 4 % введеної дози, а при пероральному - близько 10 %. Залишок складають гідрофільні метаболіти - глюкуронові та негідролізуємі кон'югати.

При встановленій залежності „доза-концентрація-фармакологічний ефект” циназепаму було знайдено, що загальний фармакологічний ефект при його використанні зумовлений наявністю його метаболіту - норциназепаму.

Вивчення фармакокінетики норциназепаму продемонструвало його здатність легко всмоктуватись при пероральному та трансдермальному шляхах введення, та відносно менший ступінь метаболізму (при внутрішньовенному введенні виводиться 17 % незмінної речовини, а при трансдермальному - 30 % від введеної дози) у порівнянні із циназепамом.

Ключові слова: циназепам, норциназепам, фармакокінетика.

АННОТАЦИЯ

Овчаренко Н.В. Экспериментальная фармакокинетика циназепама и его метаболитов.-Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.05 - фармакология. Одесский государственный медицинский университет МЗ Украины, Одесса, 2006.

Диссертация посвящена изучению процессов всасывания, распределения, метаболизма и выведения нового снотворного препарата, производного 1,4-бенздиазепина - циназепама, а также его основного фармакологически активного метаболита - норциназепама.

Предварительное изучение кинетики рН зависимой экстракции циназепама и его метаболитов из биологического материала позволило предложить количественное выделение радиоактивного материала из проб, а также предварительное разделение исходного вещества и его метаболитов на этапе пробоподготовки, что достигалось селективной экстракцией норциназепама (составляющего основную часть липофильных метаболитов циназепама) при рН 8-9 (при добавлении карбонатного буфера), и циназепама при рН 3-4 (после экстракции норциназепама при щелочном рН и последующего подкисления среды).

В опытах in vitro было продемонстрировано, что циназепам подвергается интенсивному гидролизу с образованием основного метаболита - норциназепама. В дальнейшем происходит образование двух основных групп гидрофильных метаболитов - глюкуроновых конъюгатов и негидролизуемых водорастворимых метаболитов. Установлено, что в разных органах и тканях (плазма крови, головной мозг, печень) гидролиз протекает с разной скоростью, что обуславливает как образование норциназепама, так и его дальнейший метаболизм до водорастворимых коньюгатов. На основании величины константы Михаэлиса K_m, рассчитанной для изученных органов и тканей, можно сделать вывод, что ферменты, катализирующие гидролиз циназепама, являются различными для органов и наиболее активны в печени (K_m=5,17 0,48 моль/см³). В плазме крови и головном мозге процесс метаболизма обусловлено наличием разного количества одинаковых изоформ ферментов.

Пути биотрансформации циназепама в условиях in vivo совпадают с направлением его биотрансформации в условиях in vitro. При внутривенном введении из организма циназепам выводится в количестве ~ 4 % от введенной дозы, а при пероральном - ~ 10 %. Остальное количество составляют гидрофильные метаболиты - глюкуроновые коньюгаты и негидролизуемые -глюкуронидазой водорастворимые метаболиты. При пероральном введении незначительно увеличивается количество выводимых гидрофильных метаболитов, происходящее, в основном, за счет увеличения количества глюкуроновых конъюгатов. Как при внутривенном, так и при пероральном введениях меньшее содержание глюкуроновых коньюгатов в кале обусловлено их частичным гидролизом в желудочно-кишечном тракте ферментами эндогенного происхождения или микрофлоры.

При изучении зависимости “доза-концентрация-фармакологический эффект” циназепама показало, что при введении в возрастающих дозах циназепама его концентрация в головном мозге оставалась практически на постоянном уровне, тогда как регистрируемый фармакологический эффект (противосудорожное действие по антагонизму с бикукуллином) коррелировал с изменением концентрации в биофазе действия метаболита циназепама - норциназепама на фоне низкого содержания исходного соединения. На основании анализа полученных данных по изменению фармакологического действия и содержания в биофазе действия исходного соединении и его метаболитов циназепам был отнесен к классу пролекарств.

Изучение фармакокинетики норциназепама показало как его способность легко всасываться при пероральном и трансдермальном путях введения (при этом бидоступность составляла от 0,7 до 0,9), так и более высокую эффективность выведения (при внутривенном введении в неизменном виде из организма мышей выводится 17 % циназепама, а при трансдермальном - 30 %). Также следует отметить значительное (до 20 %) количество выводимых с мочой и калом глюкуроновых коньюгатов, что, по-видимому, является наиболее эффективным процессом его метаболизма.

Ключевые слова: циназепам, норциназепам, фармакокинетика.

ANNOTATION

Ovcharenko N.V. Experimental pharmacokinetics of cinazepam and its metabolites. - Manuscript.

Thesis for the degree of candidate of biological sciences by speciality 14.03.05 -pharmacology.-Odessa State Medical University of Ministry of Health of Ukraine, Odessa, 2006.

The work is dedicated to studying of absorption, distribution, metabolism and excretion processes for new somniferous drug, 1.4-benzdiazepine derivative - cinazepam as well as its main pharmacologically active metabolite - norcinazepam. In in vitro experiments there was shown the intensive metabolism for cinacepam, during which its main metabolite - norcinazepam and than two groups of hydrophilic metabolites are formed - glucuronic conjugates and nonhydrolized water-soluble metabolites. On the base of Michaelis constant K_m value, calculated for various organs ant tissues, one can concern, that enzymes catalyzing hydrolysis process belong to various groups and are the most active in liver.

In vivo the main metabolism ways are similar to biotransformation directions in vitro. After intravenous administration non-metabolized cinazepam is excreted from organism at 4 % from the dose administered, though after oral administration - at 10 %. The rest is for hydrophilic metabolites - glucuronic and non-hydrolized conjugates. The “dose-concentration-pharmacological action” dependence demonstrates, that cinazepam`s pharmacological action is determined with its metabolite- norcinazepam presence.

The norcinazepan pharmacokinetics shows that it easy absorbs after oral and transdermal administrations and relatively low biotransformation level (after intravenous administration 17 % and after transdermal - 30 % of the dose administered is excreted as unchanged substance).

Key words: cinazepam, norcinazepam, pharmacokinetics.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сучасні стандарти вважають порушення сну однією з найбільш значних проблем, що мають не лише медичне значення, але й надто несприятливі соціально-еономічні наслідки. Основним способом усунення безсоння є застосування лікарських засобів, яким притаманні достатньо виражені седативний та анксіолітичний ефекти (Карлов В.А. 1995, Mant A et al., 1998).

Снодійні лікарські засоби, що широко використовуються в медичній практиці, відрізняються фармакологічними властивостями та механізмами дії (Воронина Т.А. Неробкова Л.Н., 1988). Виходячи з особливості снодійного ефекту та механізму дії, а також враховуючи час їх появи в лікувальній практиці можна виділити препарати першого покоління (барбітурати), другого покоління (бенздіазепіни) і третього (тріазолобенздіазепіни, імідазопіридини) (Ковров Г.В. и соавт. 2001).

Снодійні засоби, похідні 1,4-бенздіазепіну, відносяться до препаратів цього типу дії, що найбільш використовуються (Александровський Ю.А. та спів., 1998). В порівнянні з бірбітуратами вони більш безпечні, володіють значно меншою побічною дією, застосовуються в малих дозах, а також, як і бірбітурати, викликають сон протягом 6-8 год (Воронина Т.А. и соавт., 1989, Вейн А.М., Хет К., 1998).

По прояву переважного фармакологічного ефекту препарати можна розділити на три групи: 1 - препарати з перевагою в спектрі снодійного, седативного компонентів, але менш вираженим анксіолітичною та протисудомною дією (флунітразепам, флуразепам); 2 - препарати, що поєднують снодійні ефекти з поступовою анксіолітичною дією (феназепам, лоразепам); 3 - препарати з перевагою в спектрі снодійності та седативності при мінімальній анксіолітичній дії (мідазолам, тріазолам, естазолам) (Горьков В.А. и соавт., 2001).

Основним недоліком більшості перерахованих препаратів є їх слабкий та неспецифічний снодійні ефекти. Так, нітразепам та флунітразепам спроможні порушувати фізіологічну структуру сну, володіючи при цьому незначною анксіолітичною дією, та мають значну кількість побічних ефектів (денна сонливість, відчуття млявості, порушення координації руху) (Lader M. 1996).

Не зважаючи на відомості про перевагу одного препарату над іншим в зв'язку з його селективною дією на відповідні фази сну, пошук нових більш ефективних снодійних препаратів - похідних 1,4-бенздіазепіну продовжується.

Останнім засобом з більш потужним снодійним ефектом є циназепам (7-бром-5-(о-хлорфеніл)-1,2-дігідро-3-гемісукцинат-3Н-1,4-бенздіазепін-2-он), що був синтезований та вивчений у відділі медичної хімії (зав. відділом - академік. НАН України С.А. Андронаті) Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України. На різних моделях були вивчені фармакологічні властивості циназепаму, що свідчить про його високу снодійну дію, яка не супроводжується порушенням сну (Карасьова Т.Л. та спів., 2003). Окрім того сполука володіє високою анксіолітичною та седативною дією (Андронаті С.А. та спів., 1992).

Враховуючи той факт, що циназепам знаходиться на стадії доклінічного вивчення, необхідним є вивчення його важливих фармакокінетичних характеристик (метаболізм, розподіл та елімінація). Утворення активних метаболітів 1,4-бенздіазепінів ускладнюють дослідження їх фармакокінетики, оскільки тривалість періоду полуелімінації вихідної сполуки не співпадає з тривалістю фармакологічної дії. Це визначило напрямок подальшого вивченя фармакокінетики циназепаму та його основних метаболітів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота е фрагментом планових науково-дослідних робіт відділу фізико-хімічної фармакології Фізико-хімічного інституту ім О.В. Богатського НАН України та була виконана в рамках тем: “Прогнозування безпечності та ефективності лікарських засобів в реакціях метаболічної трансформації (№ держреєстрації 0103U007258), “Експериментальне вивчення біотрансформації лікарських засобів” (№ держреєстрації 0104U006265). Дисертант є співвиконавцем даних тем.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було з`ясування особливостей фармакокінетичного профілю циназепаму та його основного метаболіту норциназепаму при різних шляхах введення експериментальним тваринам.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

Розробити методи вилучення з біологічних рідин та радіохроматографічного розділення вихідної сполуки та її метаболітів.

Встановити кількісний та якісний склад метаболітів циназепаму.

Вивчити кінетику всмоктування, розподілу та елімінації ¹⁴С-циназепаму при різних шляхах введення експериментальним тваринам. Обґрунтувати та побудувати кінетичну схему масопереносу препарату в організмі мишей.

Виявити особливості фармакокінетики метаболіту циназепаму - норциназепаму (3-гідроксифеназепаму) при його різних способах введення експериментальним тваринам.

Визначити вміст циназепаму та норциназепаму у „біофазі дії” та вивчити взаємозв'язок параметрів фармакодинаміки та фармакокінетики на підставі аналізу мінімальних ефективних доз бікукуліну. Розробити математичний апарат, що дозволяє оцінити таку залежність.

Об'єкт дослідження. Розробка нових лікарських засобів з снодійним типом дії.

Предмет дослідження. Фармакокінетика циназепаму та його основного метаболіту.

Методи дослідження. Фармакологічні, радіометричні (радіоізотопні), фізико-хімічні, математичні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів роботи полягає у тому, що в ній вперше досліджено фармакокінетику (всмоктування, розподіл, метаболізм та елімінацію) циназепаму, що володіє снодійною, протисудомною та анксіолітичною дією.

Розроблена система методів, що забезпечують кількісну оцінку процесів метаболізму, розподілу в організмі введеної різними шляхами відповідної дози циназепаму та елімінації сполуки та її метаболітів.

Вперше сполученням методів радіохроматографічного та ферментативного аналізів доведена будова метаболітів, що утворюються в організмі експериментальних тварин біохімічним (гідролітичним) способом. Визначено внесок ферментів органів (мозок, печінка) та плазми крові в загальний об'єм перетворення циназепаму до норциназепаму.

Розраховано методом Мангельсдорфа константи швидкості утворення норциназепаму в гомогенатах органів й тканин мишей. Проведено порівняння їх з кінетичними параметрами процесів всмоктування, метаболізму (біотрансформації) та елімінації циназепаму.

Вивчено взаємозв'язок вмісту циназепаму та норциназепаму у головному мозку з динамікою швидкооборотних фармакологічних ефектів (протисудомних) після їх введення мишам. Вперше показано, що норциназепам вносить визначальний внесок в протисудомну дію циназепаму.

В роботі вперше визначено прогностичні показники фармакокінетики норциназепаму „концентрація-час”, „доза-концентрація”, „концентрація в головному мозку/плазмі крові” тощо, для характеристики пролікарських властивостей циназепаму.

Модифіковано математичний апарат (метод Мангельсдорфа) статистично коректного порівняння показників в дослідах iv vivo та in vitro, що забезпечує адекватний опис проведення дослідів.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень за темою дисертації є експериментально-теоретичним обґрунтуванням розробки нового снодійного препарату - циназепаму. На їх підставі підготовлено комплект нормативно-технічної документації по доклінічному вивченню субстанції циназепаму для продовження експертизи у ДФЦ МОЗ України з метою отримання дозволу на клінічні випробування.

Отримані результати дисертації є основною частиною подальших досліджень з доклінічного вивчення циназепаму, та можуть бути використані не тільки для запропонування та впровадження оптимальних схем фармакотерапії, але й для індивідуальної корекції лікування завдяки визначенню профілю фармакокінетики циназепаму та його активного метаболіту в організмі пацієнтів.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є особистою науковою працею автора. Внесок дисертанта у її виконання полягає в визначенні мети та завдань роботи, проведенні експериментальних досліджень, наукового аналізу та інтерпретації отриманих результатів, формулюванні основних положень висновків дисертації. Автором особисто проведено патентно-інформаційний пошук, експериментальні дослідження, статистичну обробку даних, підготовку наукових праць до публікації, написання і оформлення дисертації та автореферату.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи були представлені на 59^th Іnternatіonal Congress of FІР (Barcelona, 1999), 6^th European Congress of Pharmaceutіcal Scіences, EUFEPS 2000 (Budapest, 2000), 8^th ECNP Regional Meeting (Moscow, 2005), VI Національному з`їзді фармацевтів України “Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України” (Харків, 2005), VIII Конференції молодих вчених та студентів-хіміків Південного регіону України (Одеса, 2005), Конференції молодих вчених „Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005).

Публікації за темою дисертації. Опубліковано 12 робіт, що включають 6 статей у фахових журналах, з яких 3 у наукових фахових журналах, затверджених ВАК України, 6 тез доповідей в збірниках наукових робіт.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 164 сторінках машинопису і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, обговорення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел. Робота проілюстрована 44 рисунками та 37 таблицями. Бібліографія включає 118 джерел (100 вітчизняних та російськомовних та 18 іноземних).

фармакологічний снодійний циназепам метаболіт

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Всі дослідження були виконані з використанням похідних 1,4-бенздіазепіну: циназепам, норциназепам (3-гідроксіфеназепам), а також їх мічені радіоактивними елементами ¹⁴С - циназепам та ¹⁴С-норциназепам радіохроматографічною чистотою 91-95 % та питомою активністю 0,27 та 0,28 Ки/моль відповідно, які були синтезовані в Фізико-хімічному інституті ім. О.В.Богатського НАН України (Одеса).

Досліди були проведені на 1240 безпородних мишах масою 18-22 г та 10 білих щурах (лінія “Vistar”) масою 180-220 г, розведення віварію Одеського державного медичного університету. Дослідження проводили у відділі Фізико-хімічної фармакології Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України відповідно до вимог Комітету з біоетики Державного фармакологічного центру МОЗ України (Посвідчення № 20 від 20 вересня 2005 р.).

Похідні 1,4-бенздіазепіну вводилися внутрішньовенно, перорально та внутрішньоочеревинно у дозах 0,085-28 мг/кг. Вибір доз цих препаратів обумовлений раніше проведеними дослідженнями їх протисудомної активності як при внутрішньосудинний інфузії зворотних агоністів ГАМК-медіаторної системи, так і на моделі осередкової епілепсії, викликаної аплікацією бікукуліну, коразолу, пікротоксину, пеніциліну (Зіньковський В.Г. та спів., 1988 р.), що дає можливість провести порівняльний аналіз дії проліків і ліків при різних умовах, що моделюють гальмівні медіаторні системи. Контрольним тваринам уводилися відповідні об'єми фізіологічного розчину або твінової суспензії. Трансдермальне введення норциназепаму здійснювали, аплікуючи тваринам гідрогелеву матрицю (що складається з пропіленгліколю та полівінілового спирту) на попередньо виголену ділянку між лопатками та поміщаючи їх в умови, що виключають грумінг (Кравченко І.А. і спів., 1999).

Для оптимізації процесів екстракції загального радіоактивного матеріалу та окремих метаболітів препаратів з біологічного матеріалу в дослідах за умов in vivo та in vitro була вивчена кінетика рН-залежної рідин-рідинної екстракції хлороформом (Жук. О.В. та спів., 1983).

Модельні експерименти з вивчення кінетики двохфазної (водна-органічна фази) екстракції радіоактивних продуктів були проведені з використанням біологічного матеріалу - гомогенатів печінки, головного мозку та плазми крові. Метрологічні характеристики модельних експериментів демонструють достатньо високий ступень екстракції радіоактивних продуктів (циназепаму та норциназепаму) хлороформом з гомогенатів органів мишей у залежності від рН середовища (для циназепаму рН 3-4, та для норциназепаму при рН 8-9). Це дозволило зробити селективну екстракцію незмінного циназепаму та його основного метаболіту - норциназепаму, з заданим ступенем точності і наступну зонну препаративну радіохроматографію метаболітів.

Для вивчення процесів екскреції циназепаму та його метаболітів через певний проміжок часу (12 або 24 год) після введення радіоактивного препарату збирали проби сечі і калу тварин та екстрагували хлороформом у кислому середовищі (рН 3-4) з подальшим хроматографічним розділенням метаболітів методом препаративної тонкошарової хроматографії та визначенням вмісту індивідуальних радіоактивних сполук.

При вивченні кінетики розподілу циназепаму та норциназепаму в організмі тварин їх декапітували через певний проміжок часу після введення препарату та брали зразки органів та тканин для визначення вмісту загального радіоактивного матеріалу.

Вміст ¹⁴С-циназепаму та його метаболітів в досліджуваних біосубстратах визначався методом сцинтиляційної рідинної фотометрії на приладі ”Canberra Packard TRI-CARB 2700 TR” (США).

Протисудомний ефект визначали по антагонізму з бікукуліном (введення 0,01 % розчину бікукуліну у хвостову вену тварин через визначені проміжки часу) з реєстрацією мінімальних ефективних доз судомного агента (бікукулін), який викликає клоніко-тонічні судоми (ДКТС) та тонічну екстензію (ДТЕ) у тварин у порівнянні з контролем (Зіньковський В.Г. і спів., 1988).

Отримані результати були оброблені статистично з використаням програми Excel 6.0. Розрахунки лінійної регресії проводили з допомогою модифікації методу найменших квадратів зважених середніх групових величин (Гланц С., 1999). Для оцінки фармакокінетичних параметрів циназепаму та норциназепаму при різних способах їх введення був використаний математичний аналіз на підставі модельного підходу.

Результати дослідження та їх обговорення. Циназепам (7-бром-5-(о-хлорфеніл)-1,2-дігідро-3-гемісукцинат-3Н-1,4-бенздіазепін-2-он) та його метаболіт норциназепам (7-бром-5-(о-хлорфеніл)-1,2-дігідро-3-гідрокси-3Н-1,4-бенздіазепін-2-он) є похідними 1,4-бенздіазепіну:



У роботі обґрунтовані методичні підходи та розроблено засновану на об'єднанні рН залежних екстракцій і радіохроматографії систему очищення та ідентифікації циназепаму та його метаболітів.

Радіохроматографічний та ферментативний аналіз метаболітів циназепаму. Вивчення біотрансформації циназепаму (I) в умовах in vitro при використанні гомогенатів органів (мозок, печінка, плазма крові) показало, що основним шляхом його метаболізму є реакція гідролізу, що каталізується неспецифічними тканинними естеразами до основного метаболіту - норциназепаму (II).

У подальшому норциназепам метаболізує з утворенням водорозчинних метаболітів (III) з різною швидкістю, яка залежить від присутності в органах основних ферментів, що каталізують реакції кон`югації, та є максимальною у гомогенаті печінки (орган, що виконує основну біотрансформаційну функцію).

Визначення констант k₁ и k₂ методом послідовного логарифмування на підставі даних концентрації норциназепаму, що утворюється в інкубаційному середовищі протягом часу, можливе за допомогою інтегрального рівняння, отриманого з наведеної спрощеної схеми метаболізму циназепаму в умовах in vitro:



,

де C_цин.t та C_{норцин.t} - концентрація циназепаму та норциназепаму в гомогенаті у час t, B - комплексна константа, k₁ та k₂ -інтегральні константи відповідних метаболічних процесів

Найбільша швидкість утворення норциназепаму (завдяки гідролізу циназепаму) відмічена у гомогенату печінки, тоді як у контролі, тобто у відсутності ферментів (хімічний гідроліз), вона є найнижчою (табл. 1).

Таблиця 1. Константи швидкості процесів метаболізму циназепаму в гомогенатах органів та тканин, (M m)

Гомогенат органу	k1, ч-1	k2,ч-1
Контроль	0,0156 0,0004	-
Плазма	0,314 0,007	0,157 0,003
Мозок	0,07 0,001	0,005 0,001
Печінка	0,371 0,005	0,026 0,002

Примітка: * - р 0,001 (у порівнянні з контролем)

Той факт, що швидкість гідролізу циназепаму відрізняється в гомогенатах різних органів, може бути пояснений як присутністю різної кількості гідролітичних ферментів, що каталізують розщеплення циназепаму, так й наявністю різних форм цих ферментів (присутність ізоформ ензимів, що мають різну активність). Визначення того, чи відбувається процес гідролізу циназепаму за допомогою різної кількості ферментів, чи за наявності різних ізоформ ферментів, може бути здійснено при визначенні константи Міхаеліса К_m (що характеризує фермент-субстратну пару, та, у разі єдиного субстрату - циназепаму, відрізняє різні ферменти чи їх ізоформи) та величини максимальної швидкості реакції гідролізу V_m (що є мірою активності ферментів у певному гомогенаті).

Використовуючи дані зміни вмісту в гомогенатах органів циназепаму на протязі інкубації, величину константи Міхаеліса та максимальної швидкості гідролізу (табл. 2) було розраховано методом лінеаризації даних в подвійних зворотних координатах (метод Лайнуівера-Берка або Іді-Хофтсі).

Таблиця 2. Визначення параметрів ферментативного гідролізу циназепаму в гомогенатах органів та тканин мишей, (M m)

Параметр ферментативного процесу	Печінка	Мозок	Плазма
Km, 10-3, моль/см3	5,17 0,48	296 71	644 50
Vmax, 10-3, моль/(дм3год)	1,36 0,13	12,4 2,9	34,4 2,6

Вивчення кількісного складу метаболітів циназепаму, що виводяться із організму мишей при його внутрішньовенному введенні, показало, що циназепам в умовах in vivo швидко метаболізує, утворюючи як вільні, так й водорозчинні метаболіти, при цьому лише 4 % від введеної дози виводиться у незмінному вигляді (табл. 3). Константа екскреції як циназепаму, так і його метаболітів із сечею та калом є приблизно однаковою, що свідчить про однакову ефективність елімінації як вихідної сполуки, так і його метаболітів з організму мишей при внутрішньовенному введенні. Кількість вільного норциназепаму також не перевищує 5 % від загальної кількості радіоактивних продуктів, що зв`язане з його подальшим метаболізмом до водорозчинних метаболітів - глюкуронових кон`югатів та негідролізуємих водорозчинних метаболітів. Слід відзначити нерівномірне співвідношення між глюкуроновими та негідролізуємими метаболітами, з переважним виведенням останніх як у сечі (в 10 разів), так й у калі (у 3 рази) внаслідок, можливо, більшої ефективності їх утворення. Взагалі при внутрішньовенному способі введення циназепаму близько 85 % дози виводиться через 96 год при приблизно однаковій ефективності елімінації радіоактивних продуктів із сечею та калом (див. табл. 3).

Таблиця 3. Параметри виведення циназепаму та його метаболітів із сечею та калом при різних способах введення циназепаму, розраховані методом Мангельсдорфа, (M m)

Метаболіт	Максимально виведена кількість (% дози)	Константа екскреції, год-1
	Внутрішньовенне	Пероральне	Внутрішньовенне	Пероральне
Загальні радіоактивні продукти	89,0 ± 21,4	98,5 15,4	0,028 ± 0,003	0,035 0,017
Гідрофільні	54,3 ± 2,3	65,4 7,8	0,031 ± 0,001	0,033 0,011
Глюкуронові кон'югати	8,8 ± 2,2	14,9 2,1	0,031 ± 0,003	0,022 0,011
Негідролізуємі	45,5 ± 15,1	51,2 6,3	0,027 ± 0,003	0,037 0,011
Циназепам	4,3 ± 1,1	9,5 1,4	0,031 ± 0,001	0,064 0,017
Норциназепам	4,8 ± 1,2	8,7 1,1	0,029 ± 0,001	0,054 0,019

Примітка: * - р 0,05 (у порівнянні з внутрішньовенним введенням)

При пероральному введенні циназепаму процес виведення загальних радіоактивних продуктів перебігає з меншою швидкістю. В першу добу кількість радіоактивного матеріалу, що виводиться, підтримується на приблизно однаковому рівні, але у подальшому спостерігається повільніша фаза процесу, яка продовжується з 24 до 96 год після введення препарату. Кількість незмінної речовини, що виводиться із сечею, лише у перші 12 год перевищує рівень його метаболіту - норциназепаму, тоді як у подальшому його кількість, що виводиться, стає практично рівною до кількості норциназепаму. Зазначений факт можливо розцінювати як підтвердження лінійності кінетики екскреції циназепаму із сечею, внаслідок чого його кількість у екскретах лінійно залежить від його концентрації у крові. Це також підтверджується відносно (у порівнянні із норциназепамом) його більш високою гідрофільністю та ефективністю виведення із сечею.

Таким чином, як при внутрішньовенному так й при пероральному введеннях циназепам піддається значному метаболізму, внаслідок якого від 5 % (при внутрішньовенному введенні) до 10 % (при пероральному введенні) виводиться у вигляді незмінної речовини (див. табл. 3). Більшість метаболітів циназепаму складають водорозчинні метаболіти (глюкуронові кон'югати та негідролізуємі метаболіти), кількісний склад яких значно відрізняється не тільки від шляху введення, але й від переважного шляху виведення (із сечею чи з калом), що є наслідком вторинного часткового гідролізу водорозчинних метаболітів після їх включення до гепатоінтестінальної циркуляції. Константи екскреції гідрофільних метаболітів як при внутрішньовенному, так й пероральному шляхах введення є майже рівними (недостовірно відрізняються), що, при пероральному введенні препарату, свідчить про значну швидкість процесу всмоктування циназепаму та про те, що виведення гідрофільних метаболітів є лімітуючою фазою у загальному процесі їх екскреції.

Залежність “доза-концентрація-фармакологічний ефект” циназепаму. Вивчення зміни вмісту як циназепаму, так і його метаболітів в організмі мишей демонструє низький вміст незмінної сполуки, що обумовлено високим ступенем його метаболізму. Основним метаболітом, присутнім в органах мишей після внутрішньоочеревинного введення циназепаму, є норциназепам, кількість якого перевищує вміст циназепаму у 4-6 разів. Найбільший вміст норциназепаму відмічений у мозку тварин, тоді як у печінці його кількість декілька менша.

Враховуючи той факт, що в головному мозку концентрація норциназепаму значно перевищує вміст циназепаму, а також на підставі досягнення максимальної протисудомної дії при введенні різних доз циназепаму на фоні його практично незмінної концентрації в головному мозку можливо зробити висновок, що фармакологічна активність циназепаму зумовлюється присутністю його метаболіту - норциназепаму (табл. 4), який утворюється в організмі завдяки метаболічному перетворенню циназепаму, а сам циназепам віднести до проліків.

Таблиця 4. Експериментально отримані та теоретично розраховані показники протисудомної дії ¹⁴С-циназепаму при його введенні у дозах, які зростають, від вмісту у головному мозку вільних метаболітів, (M m)

Вільні метаболіти, імп/хв/г	Експериментальні показники	Розраховані показники
	ДКТС, мг/кг	ДТЕ, мг/кг	ДКТС, мг/кг	ДТЕ, мг/кг
1410 40	0,645 0,011	0,968 0,024	0,851 0,037	1,470 0,063
1665 92	0,763 0,041	1,125 0,043	0,882 0,053	1,511 0,092
2619 99	1,170 0,050	1,740 0,050	0,951 0,040	1,603 0,067
4497 98	0,870 0,060	1,140 0,070	1,008 0,024	1,678 0,041
3266 131	1,097 0,036	1,455 0,027	0,977 0,041	1,638 0,070
5089 150	1,182 0,036	1,765 0,025	1,018 0,031	1,691 0,052
5998 184	1,262 0,051	1,775 0,055	1,030 0,033	1,705 0,054
5568 1314	1,225 0,086	1,564 0,029	1,025 0,241	1,699 0,401

Примітка: * - р 0,001 (у порівнянні з експериментальними показниками)

Усе вищезазначене дозволяє зробити висновок про основний вклад норциназепаму у фармакологічний спектр циназепаму та розглядати його (а не циназепам) як основну діючу речовину.

Фармакокінетика норциназепаму. Приймаючи до уваги необхідність як швидкого розвитку фармакологічного ефекту для купірування гострих приступів (яке забезпечується за допомогою внутрішньовенного введення) або тривале надходження норциназепаму до організму й підтримку його концентрації на постійному рівні (що може здійснюватись при трансдермальному введенні) було проведено порівняльний аналіз фармакокінетики норциназепаму при внутрішньовенному, пероральному та трансдермальному шляхах введення.

Вивчення фармакокінетики норциназепаму, як основного активного метаболіту циназепаму, при внутрішньовенному введенні показало, що розподіл його в органах та тканинах має біекспоненційний характер. Розрахована на підставі фармакокінетичних параметрів (при внутрішньовенному введенні) біодоступність норциназепаму при його пероральному та трансдермальному введеннях близька до 1,0 (табл. 5).

Високе значення абсолютної біодоступності при пероральному введенні обумовлено тим, що норциназепам достатньо легко всмоктується з шлунково-кишкового тракту, а при трансдермальному - тривалим находженням норциназепаму до внутрішнього середовища тварин з аплікованої матриці та наявністю гастроінтестінальної циркуляції, внаслідок чого значно збільшується площа під фармакокінетичною кривою.

Таблиця 5. Фармакокінетичні параметри процесів всмоктування 2¹⁴С норциназепаму при різних способах введення (10 мг/кг, 0,28 Ки/моль), (Mm)

Фармакокінетичні параметри	Внутрішньовенне	Пероральне	Трансдермальне
Плазма крові
Площа під фармакокінетичною кривою “концентрація - час”, (AUC0-, (імп/хв) год/см3)	86462 ± 5968	139664 33852	133097 ± 1595
Площа під фармакокінетичною кривою “концентрація·час - час”, (AUMC0-, (імп/хв) год2/см3)	576615 ± 26596	2736348 72804	7100883 ± 30339
Середній час утримання (MRT, год)	6,0 ± 0,2	19,6 7,1	46,6 ± 8,4
Середній час абсорбції MAT, год	-	12,9 2,1	33,3 ± 6,4
Константа надходження, (kabs, год-1)	-	0,077 0,012	0,03 ± 0,008
Біодоступність, (f)	1,0	0,79 0,26	0,28 ± 0,15
Головний мозок
AUC0-, (імп/хв) · год/см3	80676 ± 6132	521096 137158	198542 ± 1036
AUMC0-, (імп/хв) · год2/см3	484459 ± 13918	10219996 4396629	13005031 ± 13838
MRT, год	6,7 ± 0,3	19,6 9,9	55,0 ± 3,2
MAT, год	-	13,6 3,9	37,2 ± 4,3
kabs, год-1	-	0,073 0,014	0,026 ± 0,003
f	1,0	0,82 0,24	0,26 ± 0,12

Примітка: * - р 0,05, ** - р 0,01, *** - р 0,001 (у порівнянні з внутрішньовенним введенням)

Вивчення кінетики екскреції норциназепаму показало, що при внутрішньовенному введенні переважним процесом метаболізму норциназепаму є глюкуронова кон'югація. Загальна кількість ліпофільних метаболітів, що виводяться із сечею та калом й представляють переважно норциназепам, що не піддавався метаболізму, складає ~ 17 %. Навпаки, при трансдермальному введенні норциназепаму процес утворення глюкуронових кон'югатів виражений у значно меншому ступені, у той час як кількість ліпофільних метаболітів складає ~ 31 % від загальної кількості радіоактивних продуктів, що виводяться із сечею та калом (табл. 6). Вклад ниркової екскреції у загальний процес елімінації метаболітів при внутрішньовенному веденні набагато вищий, ніж при трансдермальному. Застосування норциназепаму (як активного метаболіту циназепаму) у вигляді його попередника - циназепаму, призводить до значного метаболізму основної кількості норциназепаму, тоді як при використанні вільного норциназепаму значно збільшує його біодоступність.

Таблиця 6. Параметри виведення норциназепаму та його метаболітів із сечею та калом при різних способах введення, розраховані методом Мангельсдорфа, (M m)

Метаболіт	Максимально виведена кількість (% дози)	Константа екскреції, год-1
	Внутрішньовенне	Трансдермальне	Внутрішньовенне	Трансдер-мальне
Ліпофільні	17,5 1,4	30,5 4,5	0,075 0,014	0,0098 0,0012
Глюкуронові кон'югати	65,3 2,1	31,4 2,1	0,084 0,021	0,005 0,001
Негідролізуємі	17,3 2,1	38,1 1,3	0,061 0,012	0,008 0,003

Примітка: * - р 0,01, ** - р 0,001 (у порівнянні з внутрішньовенним введенням)

ВИСНОВКИ

В дисертації наведено теоретичне обґрунтування та експериментальне вивчення фармакокінетики інноваційного препарату - похідного 1,4-бенздіазепіну - циназепаму, що володіє снодійною, протисудомною та анксіолітичною дією.

Встановлено, що в умовах in vitro циназепам піддається гідролізу з утворенням норциназепаму та подальшим його метаболізмом до водорозчинних метаболітів. Найшвидший процес гідролізу обумовлений присутністю ізоформ ферментів з високою активністю, протікає у печінці (K_m = 5,17 0,48 · 10^-3 моль/см³), тоді як у мозку (K_m = 296 71 · 10^-3 моль/см³) та плазмі крові (K_m = 644 50 · 10^-3 моль/см³) гідроліз протікає завдяки наявності різної кількості однакових ізоформ гідролаз.

Процес виведення циназепаму та його метаболітів при його внутрішньовенному введенні із сечею є моноекспоненційним, з калом - біекспоненційним, а при пероральному - біекспоненційним у сечі та калі. В умовах in vivo з організму мишей при внутрішньовенному введенні (у % введеної дози) виводиться ~ 4,3 %, а при пероральному ~ 10 % циназепаму та приблизно така ж кількість вільного норциназепаму. Гідрофільні метаболіти складають ~ 2/3 від загальної кількості виведеної радіоактивності, з яких переважну частину складають негідролізуємі водорозчинні метаболіти.

При внутрішньоочеревинному введенні циназепаму спостерігається низький вміст вихідної сполуки внаслідок високого ступеня метаболізму, тоді як кількість норциназепаму перевищує вміст циназепаму у 4-6 разів. Найбільший вміст норциназепаму спостерігається у мозку.

При ефекторному аналізі залежності „доза - концентрація - протисудомний ефект” циназепаму та норциназепаму встановлено, що основний протисудомний ефект циназепаму зумовлений присутністю в мозку норциназепаму.

Кінетика розподілу норциназепаму при внутрішньовенному введенні є біекспоненційною. При пероральному введенні спостерігаються швидке надходження норциназепаму до організму мишей (k_abs = 0,161 0,053 ч^-1), тоді як при трансдермальному - повільне (k_abs = 0,03 ± 0,008 ч^-1), що обумовлює ефект обертання констант. Біодоступність норциназепаму при пероральному шляху введення близька до 1,0 завдяки повній абсорбції норциназепаму.

При внутрішньовенному введенні норциназепаму у незмінному вигляді із сечею та калом виводиться близько 18 % введеної дози, тоді як при трансдермальному - 30 %. При трансдермальному введенні спостерігається зменшення (у 1,5 рази) вкладу ренальної екскреції у загальний процес елімінації норциназепаму та його метаболітів у порівнянні з внутрішньовенним введенням.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Овчаренко Н.В. Метаболізм циназепаму в організмі мишей // Одес. мед. журн.-2005.-№ 6 (92).- С.16-19.

2. Порівняльна кінетика розподілу 3-гідроксифеназепаму при різних способах введення / Головенко М.Я., Кравченко І.А., Ларіонов В.Б., Овчаренко Н.В., Александрова О.І // Досягнення біології та медицини.- 2004. - №1 (3). - С.46-48 (внесок дисертанта: постановка завдань дослідження, обговорення результатів, підготовка матеріалу до друку).

3. Синтез и фармакологические свойства 3-лауроилокси-7-бром-5(о-хлор)фенил-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-она при его внутривенном и трансдермальном введении / Кравченко И.А., Александрова А.И., Андронати С.А., Ларионов В.Б., Овчаренко Н.В., Павловский В.И., Тахтарова А.И. // Вісник Одеського національного університету.- 2003.- T.8, вып.8. - С.130-136 (внесок дисертанта: постановка завдань дослідження, обговорення результатів, участь в експерименті, формулювання висновків, оформлення статті).

4. Кравченко І.А., Александрова О.І., Овчаренко Н.В. Фізико-хімічні властивості та стабільність трансдермальних систем, що містять похідні 1,4-бенздіазепіну // Медична хімія. - 2003. - T.5, № 2. - С.101-103 (внесок дисертанта: постановка завдань дослідження, аналіз та обговорення результатів, написання статті).

5. Особенности сравнительной кинетики экскреции 3-гидроксифеназепама и его метаболитов при трансдермальном и внутривенном введениях / Ларионов В.Б., Головенко Н.Я., Кравченко И.А., Александрова А.И., Овчаренко Н.В // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2003. - T. 66, № 3. - С.53-55. (внесок дисертанта: постановка завдань дослідження, обговорення результатів).

6. Аліфатичні спирти, кислоти та солі алкілпіридинію як підсилювачі трансдермального проникнення 3-гідроксифеназепаму / Александрова О.І., Кравченко И.А., Ларіонов В.Б., Овчаренко Н.В. // Медична хімія. - 2003. -T. 5, № 1. - C.80-82 (внесок дисертанта: постановка завдань дослідження, обговорення результатів, участь в експерименті).

7. Biokinetics of different phenazepam drug forms / Zinkovskiy V.G., Kravchenko I.A., Ovcharenko N.V, Andronati S.A. // Abstracts of “World Congress of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences` 99. - Barcelona, 1999”. - P. 149. (внесок дисертанта: участь в проведенні експерименту, обговорення результатів, підготовка матеріалу до друку).

8. Determination of the pharmacokinetic parameters of the transdermal form of 3-oxyphenazepam / Larionov V.B., Zinkovsky V.G., Kravchenko I.A., Alexandrova A.I., Ovcharenko N.V. // Abstracts of 6^th European Congress of Pharmaceutical Sciences, EUFEPS 2000. - Budapest, 2000. - P. 193. (внесок дисертанта: проведення експерименту, обговорення результатів, підготовка матеріалу до друку).

9. Pharmacological activity of new 1.4-benzdiazepine derivatives - esters of 3-hydroxyphenazepam and high aliphatic acids / Kravchenko I.A., Sivko A.I., Ovcharenko N.V., Larionov V.B., Pavlovskiy V.I., Andronati S.A. // Abstracts of the 8^th ECNP Regional Meeting.- Moscow, 2005.- P. 158-159. (внесок дисертанта: проведення експерименту, обговорення результатів, підготовка матеріалу до друку).

10. Кравченко И.А., Сивко А.И., Овчаренко Н.В. Синтез новых пролекарств - потенциальных лекарственных препаратов на основе производных 1,4-бенздиазепина // Матеріали VI Национального з'їзду фармацевтів України “Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України”.- Харьков, 2005.- С.95-96. (внесок дисертанта: проведення експерименту, обговорення результатів, підготовка матеріалу до друку).

11. Овчаренко Н.В. Фармакокинетика циназепама и его метаболитов при внутрибрюшинном введении // Тези доповідей VIII Конференції молодих учених та студентів-хіміків Південного регіону України.-Одеса, 2005.- С.66.

12. Овчаренко Н.В. Метаболизм циназепама in vitro // Тези доповідей ІІ Науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології”.- Київ, 2005.- С. 42-43.

Размещено на Allbest.ru

...