Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ,

ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім.Р. Є. КАВЕЦЬКОГО

Характеристика функціонального стану монооксигеназної системи печінки при гепатоканцерогенезі, викликаному дією N-нітрозодиетиламіну

14.01.07 - онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Момот Валентина Яківна

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Науковий керівник	доктор медичних наук, професор Сидорик Євгеній Петрович, завідувач відділу біофізики канцерогенезу Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.
Офіційні опоненти:	доктор біологічних наук, професор Орел Валерій Еммануїлович, керівник відділу медичної фізики та біоінженерії Інституту онкології АМН України, м. Київ; доктор медичних наук Чешук Валерій Євгенович, доцент кафедри онкології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця, м. Київ.
Провідна установа	Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра онкології, м. Київ.

Захист відбудеться 12 квітня 2006 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України за адресою: 03022, Київ-22,вул. Васильківська, 45.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий 11 березня 2006 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук Бородай Н.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Біотрансформація нітрозосполук привертає увагу дослідників внаслідок накопичення достатньої кількості доказів їх канцерогенності практично для всіх видів експериментальних тварин і високої вірогідності утворювати пухлини у людей (Худолей В.В., 1999, Заридзе Д.Г., 2000).

N-нітрозодиетиламін (НДЕА) для прояви своїх канцерогенних властивостей потребує метаболічної активації в монооксигеназній системі за участю цитохрому

Р-450 (CYP) та інших складових монооксигеназного комплексу: NADPH-цитохром 450-редуктази (ФП₁), цитохрому b_5, NADH - цитохром b₅-редуктази, які локалізовані в мембранах ендоплазматичного ретикулуму клітин-мішеней (Yoo J. H., 1990, Sheweita S. D., 2000, Snyder R. 2004). Незважаючи на те, що на сьогоднішній день накопичені багаточисельні дані щодо механізмів канцерогенної дії НДЕА, залишаються недостатньо вивченими питання, які пов'язані з його впливом на експресію окремих ізоформ CYP за умов канцерогенезу. Перспективність таких досліджень обумовлена декількома причинами. По-перше, при хімічному канцерогенезі активний метаболіт утворюється в результаті окислення субстрату лише специфічними ізоформами CYP, тобто впливу кінцевого канцерогену та ризику малігнізації в першу чергу будуть піддаватись клітини з більшим вмістом цих ізоформ. Згідно гіпотези про моноклональне походження пухлин (Кобляков В.А., 1995) можна очікувати, що трансформовані та пухлинні клітини зберігають фенотип, подібний за складом ізоформам вихідної клітини. Тому вивчення складу ізоформ CYP може дати інформацію про здатність певних клітин до малігнізації (Гуляева Л.Ф., 2000). По-друге, багато протипухлинних препаратів активуються або дезактивуються специфічними ізоформами CYP (Guengerich F.P., 1999) і цілком вірогідно, що їх протипухлинну дію може визначати рівень експресії цих ізоформ CYP в пухлинах. В зв'язку з цим дані про експресуємі в пухлинах ізоформи CYP, та інформація, що стосується можливості модуляції ізоформного складу CYP, можуть бути використані для вибору специфічних цитостатиків та шляхів підвищення селективності їх дії. По-третє, враховуючи що ізоформи можуть розглядатись в якості маркерів диференційованої клітини, інформація про регуляцію їх експресії в пухлинах може бути важливою для розуміння процесів, пов'язаних з регуляцією функціонування генів в пухлині (Sheweita S. A., 2000).

При вивченні гепатоканцерогенезу, викликаного дією НДЕА, основний інтерес дослідників був зосереджений на CYP, як термінальній оксидазі і майже не приділялось уваги іншим складовим монооксигеназного комплексу, які обумовлюють алостеричну регуляцію активності окремих ізоформ CYP і відіграють критичну роль в метаболізмі як ендо-, так і ксенобіотиків в монооксигеназному циклі (Hlavica Р., 2001).

Незважаючи на масштабне вивчення антимутагенних і антиканцерогенних властивостей аскорбінової кислоти та ретинол ацетату, в літературі представлені досить суперечливі результати відносно їх впливу на ферменти метаболізму ксенобіотиків (Balansky R.M., 1994; Howel S.R., 1998). З огляду на вищесказане дослідження функціонального стану монооксигеназної системи печінки при гепатоканцерогенезі, вивчення впливу НДЕА на експресію окремих ізоформ CYP та можливості їх модуляції в пухлинах є актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію виконано згідно планів науково-дослідних робіт Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р. Є. Кавецького НАН України за темами: "Вивчити молекулярні переносники електронів в енергетичній та детоксикуючій системах мембран ендоплазматичного ретикулуму при хімічному канцерогенезі та в умовах регуляторного впливу" (номер державної реєстрації UA01001502P); "Вивчити різні форми цитохрому Р-450 і радикальні форми кисню в мембранах ендоплазматичного ретикулуму при гепатоканцерогенезі, індукованому НДЕА” (номер державної реєстрації 0194U017023).

Мета роботи - комплексне вивчення функціонального стану монооксигеназної системи печінки щурів на різних стадіях гепатоканцерогенезу і в умовах його модуляції ретинол ацетатом (РА) та аскорбіновою кислотою (АК).

Основні завдання роботи:

1) дослідити на всіх стадіях гепатоканцерогенезу динаміку змін окисленого та загального цитохрому Р-450, цитохрому b₅, активностей флавопротеїдів NADPH - і NADH - залежного ланцюга монооксигеназного циклу та ізоферментів CYP, що активують НДЕА в мікросомах печінки;

2) визначити вплив НДЕА на ізоформний склад CYP підродин ІА, ІІВ, ІІС і ІІЕ, використовуючи аналіз активності маркерних ферментів;

3) дослідити модулюючу дію РА та АК аскорбінової кислоти на ізоформний склад CYP на фоні введення НДЕА.

Об'єкт дослідження: функціональний стан монооксигеназнивного комплексу при гепатоканцерогенезі та в умовах його модифікації РА та АК.

Предмет дослідження: мембрани ендоплазматичного ретикулуму печінки і гепатом при гепатоканцерогенезі.

Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи проведено моделювання гепатоканцерогенезу у щурів-самців, виділені мікросоми із тканини печінки і пухлин методом диференційного центрифугування та проведена оцінка ступеня чистоти досліджуваних препаратів. Для виконання задач дослідження використані ЕПР-спектроскопія, спектрофотометрія, спектрофлуориметрія, денситометрія, рідинна хроматографія високого тиску, градієнтний електрофорез у поліакріламідному гелі, біохімічні методики визначення активності ферментів у модельних системах, індукторний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. Автором вперше було проведено комплексне вивчення білкових компонентів монооксигеназної системи за умов тривалого надходження НДЕА в організм тварин та показано, що фазовий характер змін активностей маркерних ферментів CYP, вмісту загального та окисленого CYP, цитохрому b_5, обумовлений стадіями канцерогенезу. Висока активність ФП₁ на всіх стадіях гепатоканцерогенезу призводить до роз'єднання монооксигеназного циклу, наслідком чого може бути зміна метаболізму ендогенних субстратів і утворення продуктів з промоторною активністю. Встановлено порушення експресії конститутивних ізоформ цитохрому Р-450 на стадіях ініціації-промоції та прогресії пухлинного росту. Показано, що застосування масивних доз РА та АК при пригніченому функціональному стані печінки внаслідок дії гепатоканцерогену не спричиняє захисної дії, а прискорює утворення пухлин в печінці.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати експериментального дослідження функціонального стану монооксигеназного комплексу мембран ендоплазматичного ретикулуму при гепатоканцерогенезі і в умовах його модифікації дозволяють істотно розширити існуючі уявлення про механізми канцерогенезу. Виявлена експресія ізоформи CYP IA1 на стадіях ініціації-промоції дозволяє використовувати її як маркер гепатоканцерогенезу, обумовленого дією НДЕА. Результати експериментальних досліджень можуть бути використані для розробки рекомендацій по спрямованій регуляції активності монооксигеназ в печінці та інших органах з метою підвищення ефективності протипухлинних цитостатиків і зниження їх токсичної дії.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто проаналізована сучасна наукова література за темою дослідження, відпрацьовані методи вирішення поставлених завдань та проведені експериментальні дослідження по визначенню динаміки вмісту загального CYP, цитохрому b₅, активностей ФП₁, ФП₂, маркерних ферментів ізоформ CYP підродин ІА, ІІВ, ІІС і ІІЕ. Визначено вміст ізоформ основних підродин CYP в мікросомах печінки щурів на стадіях ініціації-промоції, прогресії пухлинного росту, при модифікації гепатоканцерогенезу РА та АК. Планування напрямків досліджень, інтерпретація отриманих результатів, моделювання гепатоканцерогенезу, виділення мікросом, визначення вмісту окисленої форми CYP здійснено спільно зі с. н. с., к. б. н. Мельниковим О.Р., введення РА здійснено сумісно зі с. н. с., к. б. н. П'ятчаніною Т. В.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на: Всесоюзному симпозіумі "Биохимия опухолевой клетки" (Мінськ 1990); 7-th International Conference. Cytochrome P-450: Biochemistry and Biophysics (Москва, 1991); ІХ з'їзді онкологів України (Вінниця, 1995); VII Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1997); II з'їзді онкологів країн СНД (Київ, 2000); VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002); Міжнародному симпозіумі "Проблеми біофізичної медицини" (Київ, 2004).

Публікації. Основні положення роботи викладені в 10 друкованих працях, з яких 4 статті у фахових наукових журналах та 6 тез у збірках вітчизняних та міжнародних симпозіумів та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури по проблемі, 5 розділів, що відображають результати власних досліджень, заключення, висновків, списку використаних джерел, що включає 156 найменувань. Повний обсяг дисертації 126 сторінок. Вона містить 6 таблиць, 14 ілюстрацій. Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених задач було проведено три серії досліджень, в яких щурам-самцям вводили 0,01% розчин НДЕА (Sigma), в дозі 10 мг на кг маси тварин з питною водою до появи в печінці макроскопічно виявляємих пухлин. В третій серії досліджень через місяць від початку введення тваринам НДЕА вони додатково отримували перорально АК (40 мг/кг) і РА (53 МО/кг) на протязі 15 діб. Дослідження проведені на 890 безпородних щурах-самцях, що утримувались за стандартним раціоном у віварії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р. Є. Кавецького НАН України. Маніпуляції з тваринами проводили згідно до Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних наукових цілей.

Мікросоми із печінки дослідних і контрольних тварин після їх декапітації під гексеналовим наркозом виділяли методом диференційного центрифугування як відображено в роботі (Eriksson L. C., 1983) на 0,5 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 42, 56, 70, 84, 112, 146, 250 добу гепатоканцерогенезу.

Вміст окисленої форми CYP в тканині печінки та гепатом, в мікросомах із печінки і гепатом визначали методом ЕПР-спектроскопії на радіоспектрометрі "Varian" (США) при температурі 77К. Реєстрацію спектрів досліджуваного зразка проводили при робочій частоті 9200 - 9300 МГц, з діапазоном сканування магнітної індукції 0 - 4 Тл, частотою модуляції 100 кГц, амплітудою модуляції 0.8 мТл, потужністю ЗВЧ - 5 мВт. Вміст окисленого CYP визначали по амплітуді лінії поглинання з g-фактором 2.25 відносно стандарту (монокристал рубіну).

Вміст цитохрому b₅, загального CYP, неактивної форми цитохрому Р-420 в мікросомах визначали за методом (Omura T. and Sato R., 1964). Спектри поглинання гемопротеїдів записували на двопроменевому спектрофотометрі Hitachi - 557. Вміст цитохромів виражали в нмоль на мг білка, використовуючи коефіцієнти молярної екстинкції 165 мМ^-1см - ¹, 91 мМ - ¹ см^-1 і 124 мМ^-1 см^-1, відповідно.

Активність ФП₁ визначали в термостатованій кюветі при 30С на спектрофотометрі Unicam - 8000 при довжині хвилі 550 нм за методом (Shephard E. A., 1983) і розраховували в мкмолях загального цитохрому с на мг білка, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції 21 мМ^-1см - ¹.

Активність ФП₂ визначали на спектрофотометрі Unicam - 8000 при довжині хвилі 420 нм з субстратом K₃ [Fe (CN) ₆] за методом (Vilalba I. M., 1997) і розраховували в мкмолях субстрату на мг білка, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції 1.02 мМ^-1см^-1.

канцерогенність нітросполука гепатоканцерогенез монооксигеназна

Електрофорез білків мікросом в градієнті концентрацій поліакриламіду 5-15% здійснювали за методом (Laemmly U. K., 1970) адаптованому для електрофорезу на пластинах гелю. Проби калібрували за вмістом CYP.

Денситометрію гелів проводили на спектрофотометрі "Guiford" при довжині хвилі 560 нм. Молекулярні маси ізоформ CYP визначали за методом (Weber K., 1964) з використанням стандартів молекулярних мас фірми "Sigma". Ідентифікацію ізоформ CYP проводили за допомогою класичних індукторів: 3-метилхолантрену, (15 мг/кг, для ізоформ підродини ІА) фенобарбіталу (80 мг/кг, для ізоформ підродини ІІВ), етанолу (1.2 г/кг, для ізоформ підродини ІІЕ), які вводили 1 раз на добу на протязі трьох діб перед відповідними термінами на стадіях ініціації-промоції та прогресії пухлинного росту, а також з використанням специфічних субстратів до ізоформ підродин ІА, ІІВ, ІІС, ІІЕ та ІІІА.

Активність N-диметилази амідопірину (підродина CYP ІІІА), N-диметилази бензфетаміну (підродина ІІВ) визначали по кількості утвореного формальдегіду при довжині хвилі 412 нм, як представлено в роботі (Герасимов К.Е., 1988) і розраховували, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції 80 мМ^-1см^-1.

Активність пара-гідроксилази аніліну (ізоформа CYP ІІЕ1) визначали за кількістю утвореного пара-нітрофенолу при довжині хвилі 546 нм, як представлено в роботі (Reinke L. A., 1985) і розраховували, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції 10.28 мМ^-1см^-1.

Активність пентоксирезоруфін О-диетилази (ізоформа CYP ІІВ1), етоксирезоруфін О-диетилази (ізоформа CYP ІА1) і метоксирезоруфін О-диетилази (ізоформа CYP ІА2) визначали на спектрофлуориметрі MPF-12 (Hitachi), як представлено в роботі (Lubert R. A., 1985). Швидкість утворення резоруфіну розраховували при порівнянні відносної флуоресценції до флуоресценції каліброваної кількості резоруфіну (довжина хвилі збудження 562 нм і флуоресценції - 586 нм).

Активність бенз (а) пірен-гідроксилази (ізоформа CYP ІА2) визначали за швидкістю накопичення 3-окси-бенз (а) пірену на спектрофлуориметрі MPF-12 (Hitachi), як представлено в роботі (Осташевский В.А., 1987) при довжині хвилі збудження 456 нм і флуоресценції - 552 нм.

Активність тестостерон-гідроксилази (підродина CYP ІІС) визначали згідно методу (Van DerHoeven T. H., 1984). Метаболіти тестостерону екстрагували дихлорметаном, висушували в потоці азоту, розчиняли в метанолі та аналізували на рідинному хроматографі високого тиску Waters Model 600E на аналітичній колонці С₁₈ Nova PAK (60мкм, 3.9х150мм). Рухома фаза складала 7.5% розчин тетрагідрофурану в воді і градієнт концентрації метанолу в воді (7.5 - 60%) при швидкості потоку 1 мл за хвилину. На колонку наносили 20 мкл досліджуваного зразку, концентрацію метаболітів реєстрували при 254 нм і визначали як відношення між відповідною площиною піку метаболіту до площини піка стандарту. В якості стандарту використовували розчин тестостерону в метанолі фірми "Sigma”.

Вміст білку визначали за методом, який представлений в роботі (Дарбре А., 1989). Препарати мікросом, які містили компоненти захисного буферу (гліцерин і дітіотреітол), додатково осаджували ацетоном. Осад розчиняли в аліквоті 0.1М NaOH з 0.1% розчином дезоксихолату натрію.

Статистичну обробку результатів було проведено за допомогою пакета програм "Excel та Statistika V.6" з використанням t-критерію Ст'юдента (Лапач С.Н., 2001). Достовірно різними вважались результати при р 0.05.

Результати досліджень та їх обговорення

Зміна вмісту окисленого та загального CYP, цитохрому b₅, активностей ФП₁, ФП₂, пара-анілін гідроксилази, бензфетамін диметилази в мікросомах печінки при гепатоканцерогенезі, викликаному дією НДЕА. Проведено порівняльний аналіз динаміки вмісту та активності компонентів монооксигеназного комплексу на всіх стадіях канцерогенезу. Співвідношення між вмістом окисленого і загального CYP вивчено із застосуванням ЕПР - та оптичної спектроскопії. Такий методичний підхід пов'язаний з фізико-хімічними властивостями НДЕА, який відноситься до субстратів змішаного типу, тобто може безпосередньо взаємодіяти з гемом CYP і утворювати нітрозильний комплекс (відновлена форма) і таким чином знижувати кількість каталітично активної (окисленої) форми CYP. НДЕА також індукує експресію ізоформи CYP ІІЕ1, яка каталізує його N-диетилювання та денітрозування. В перші три доби дії НДЕА, він реалізує себе як суїцидний субстрат, тобто взаємодіє з гемом CYP і виключає фермент з каталітичного циклу, що підтверджується зниженням вмісту окисленого CYP на 25% (р<0.05). На третю добу дії НДЕА відмічені максимальні значення ферментативних активностей пара-анілін гідроксилази (ізоформа ІІЕ1) та бензфетамін-диметилази (ізоформа ІІВ1) на 38% і 28% відповідно (р<0.05). Ці ізоформи активують НДЕА до високореакційних діазосполук, які взаємодіють з макромолекулами і обумовлюють його мутагенні та канцерогенні властивості (Appel Y., 1991). На 28 - 30 добу гепатоканцерогенезу вміст загального та окисленого CYP, цитохрому b₅, активність ФП₂ вірогідно знижувались, активність ферментів, які метаболізують НДЕА знаходились на рівні їх значень в контролі, а активність ФП₁ залишалась підвищеною (Рис.1). Останнє вказує на те, що в цей період гепатоканцерогенезу монооксигеназний цикл не функціонує як замкнута система, що може призводити до утворення в ньому високо реакційних похідних як кисню, так і субстратів, тобто продуктів з мутагенними та промоторними властивостями.

В період активної проліферації клітин печінки (30 - 70 доба канцерогенезу) зареєстровано поступове підвищення вмісту окисленого і загального CYP до рівня, близького значенням в контролі. Нормалізація вмісту окисленого CYP повинна призводити до збільшення швидкості метаболізму екзогенних та ендогенних субстратів за рахунок підвищення швидкості утворення фермент-субстратного комплексу на першій стадії окислення в монооксигеназному циклі. Однак, цей факт не підтверджувався результатами аналізу ферментативних активностей, пара-анілін гідроксилази та бензфетамін диметилази, які опосередковані ізоформами, що метаболізують НДЕА. Їх активність в терміни максимального підвищення вмісту CYP вірогідно знижена на 25 і 28%, відповідно.

Рис. 1. Вміст окисленого CYP (1); загального CYP (2); активності пара-анілін гідроксилази (3), бензфетамін диметилази (4); NADPH - цитохром Р-450 редуктази (5), вмісту цитохрому b₅ (6) та активності NADH-цитохром b₅ - редуктази (7) в мікросомах печінки в терміни екстремальних змін при гепатоканцерогенезі

З чого виходить, що на цей період сформувався такий метаболічний фенотип клітин печінки, який обумовлює їх резистентність до токсичної дії канцерогену. В період активної проліферації нами виявлено зсув співвідношення між окисленою і відновленою формами CYP, в бік збільшення кількості відновленої форми.

На основі отриманих результатів можна припустити, що в цей період гепатоканцерогенезу в клітинах печінки формується ферментативний фенотип, складовою частиною якого являється CYP, що за своїми кількісними та якісними характеристиками відрізняється від гемопротеїду нормальних гепатоцитів. В результаті цього монооксигеназна ферментна система такого клону клітин формує нові функціональні властивості, які забезпечують умови його злоякісної трансформації. Таке припущення підтверджується утворенням на 85 - 90 добу макроскопічних пухлинних вузлів в печінці експериментальних тварин.

Подальший ріст пухлин призводить до пропорційного зниження вмісту окисленого та загального CYP, компонентів NADH-залежного ланцюга, активностей ферментів, що опосередковані ізоформами CYP підродини ІІЕ і ІІВ.

Ці зміни на 250 добу канцерогенезу є характерними для функціонального стану монооксигеназної системи в гепатомах (Рис.1).

На зміну співвідношення між окисленою та відновленою формами CYP може впливати вміст редокс-еквівалентів, які в монооксигеназний цикл поставляє ФП₁. При дії НДЕА активність флавопротеїду підвищувалась і досягала максимальних значень (до 200%) на 70 добу канцерогенезу. Отримані нами дані співпадають з результатами досліджень, в яких показано збільшення до 230% активності флавопротеїду в регенеруючій печінці (Dmitriev L. F., 2001), тобто при активації проліферативних процесів. В гепатомах (на 250 добу) активність ферменту залишалась підвищеною (150%) відносно її значень в контролі. Високий рівень активності ФП₁ спостерігали в гепатомах мишей, генетично схильних до гепатоканцерогенезу (Кобляков В.А., 1993). Такий рівень активності ферменту на фоні зниження вмісту загального та окисленого CYP може спричиняти розімкнення монооксигеназного циклу і надходження в міжмембранний простір радикальних форм кисню (супероксидний та гідроксильний радикали) які, взаємодіючи з гемом CYP, призводять до його інактивації. Підтвердженням такого припущення являється реєстрація в гепатомах неактивної форми CYP - цитохрому Р-420.

Отримані нами результати про фазовий характер змін вмісту окисленого та загального CYP, цитохрому b₅, активності флавопротеїдів, бензфетамін-диметилази і пара-анілін гідроксилази, що обумовлені стадіями канцерогенезу, вказують на узагальненість фенотипових змін ферментів І-ої фази детоксикації при гепатоканцерогенезі. Внаслідок зменшення вмісту гемопротеїдів в гідроксилюючій системі печінки щурів знижувалась здатність генерувати реакційно активні похідні із проканцерогену. Наслідком високої активності ФП₁ може бути розімкнення монооксигеназного циклу, яке призводить до генерування реакційних форм кисню, радикальних форм субстратів, інших похідних неповної каталітичної реакції та слугувати патогенетичною ланкою промоції росту пухлин. Враховуючи, що рівень конститутивних ізоформ CYP в печінці інтактних тварин складає дві третини від їх загального вмісту (Swelieva S. A., 2002), можна припустити, що зниження рівня окисленого CYP при дії НДЕА пов'язано з порушенням експресії саме конститутивних ізоформ. Для підтвердження цього припущення було вивчено ізоформний склад CYP на стадіях ініціації - промоції, прогресії пухлинного росту, викликаного дією НДЕА.

Ізоформний склад цитохрому Р-450 при гепатоканцерогенезі. Аналіз електрофореграм, а також притаманних окремим ізоформам активностей показав, що білковий профіль мікросом на всіх стадіях канцерогенезу якісно не відрізнявся від препаратів, отриманих від інтактних тварин. Кількісні відмінності вмісту окремих ізоформ CYP і пов'язаних з ними ферментативних активностей в терміни екстремальних змін на стадії ініціації - промоції (28 - 30 доба) представлені в Табл.1 і 2 відповідно. В цей період канцерогенезу, кількість загального CYP зменшувалась відносно контролю в 1.8 рази (р 0.05). Вміст ізоформ CYP

Таблиця 1

Вміст ізоформ CYP в мікросомах печінки на стадії ініціації - промоції канцерогенезу та за умов їх індукції фенобарбіталом, 3-метилхолантреном і етанолом.

Ізоформи	М. мкДа	Без індукції	ФБ	3-МХ	ЕТ
		%	нмоль/мг	%	нмоль/мг	%	нмоль/мг	%	нмоль/мг
ІІА1/ІІА2	48	2	0.01 0.004	3	0.027 0.001	4	0.030 0.001	3	0.02 0.001
ІІС13	50	4	0.02 0.002	4	0.037 0.007	3	0.022 0.001	9	0.02 0.001
ІІС7/ІІС11	51	20	0.10 0.05	23	0.120 0.005	26	0.192 0.008	30	0.201 0.009
ІІВ1/ІІВ2 ІІІА1/ІІІА2 ІА2	52	34	0.166 0.07	65	0.570 0.025	24	0.178 0.007	27	0.161 0.007
ІІЕ1 ІІС6	53	33	0.162 0.08	4	0.156 0.007	4	0.030 0.001	24	0.181 0.08
ІА1	56	7	0.036 0.02	4	0.09 0.001	44	0.326 0.015	2	0.013 0.001
Загальний CYP (нмоль/мг)		0.49 + 0.03	0.92 + 0,06	0.74 + 0,05	0,67 + 0,04

p 0.05, дані достовірні відносно контролю

підродини ІІА знижувався в два рази. При цьому окислення тестостерону по 7-положенню зменшувалось в 5 разів, а по 15 - в 1,2 рази (Табл.2). Такий перерозподіл активностей дає підставу припустити, що зменшення вмісту CYP підродини ІІА обумовлено за рахунок ізоформи ІІА1. Прямим доказом правомірності такого припущення є результати, що отримані при індукції ізоформи ІІА1 - 3-МХ і ізоформи ІІА2 - ФБ. Як видно з Табл.2 в мікросомах тварин, що отримували МХ, або ФБ, окислення тестостерону по 7-позиції збільшувалось в 3 та 1.5 рази відповідно. В обох випадках активність тестостерон-гідроксилази не змінювалась по положенню 15. Таким чином, зниження концентрації білка з м. м.48 кДа обумовлено за рахунок ізоформи ІІА1.

Згідно даних електрофорезу вміст ізоформи ІІС13 (м. м.50 кДа) на стадії ініціації - промоції знижувався в 2 рази, вміст ізоформи ІІЕ1 (м. м.53 кДа) достовірно не відрізнявся від контролю, а вміст ізоформи ІА1 (м. м.56 кДа) та активність 7-етоксирезоруфін диетилази (ЕРОД) збільшувалась в 7 разів.

Зниження вмісту білку з м. м.51 кДа в 2.4 рази і активності 16 - тестостерон гідроксилази в 4 рази, обумовлено зменшенням кількості ізоформ ІІС7 та ІІС11. Обидві ізоформи є конститувними, виявлялись тільки у самців і окислювали тестостерон по 16-позиції, але приблизно 90% андрогенів окислює ізоформа ІІС11.

Таблиця 2

Активності монооксигеназ в мікросомах печінки на стадії ініціації - промоції канцерогенезу та за умов їх індукції фенобарбіталом, 3-метилхолантреном і етанолом.

Ізоформа СYP	Моноокси-генази	Активність монооксигеназ (пмольсм-1хв-1)
		Без індукції	ФБ	3-МХ	ЕТ
Ендогенний субстрат
IIА1/А2	7-Тг	2.031.3	3.430.44	6.110.62	2.60.3
	15-Тг	6.870.5	7.24 1.13	7.50.12	5.75 0.8
IIС11, IIВ1/2	16-Тг	16815	1514	16125	25642
IIС11	2-Тг	35228	29330	25638	21221
IIС13, IIIА1, IА1/2	6-Тг 2-Тг	84690 108.32.0	457135 122.14.6	76787 72.72.0	103649 94.30.3
Екзогенний субстрат Активність монооксигеназ (нмольмг-1хв-1)
IIВ1	БФ-Д	16.050.3	9011	3.260.2	11.30.4
IIIА	АМД	35.40.1	36.241.3	9.00.1	11.61.0
IIЕ1	п-НФГ	0.280.03	0.150.02	0.110.02	0.850.05
IА1	ЕРОД	0.390.12	0.050.02	4.280.1	0.040.02
1А2	БП-Г	0.900.15	0.350.1	7.50.6	0.200.01

р - 0.05, дані достовірні відносно контролю

Індукція ФБ призводить до ще більш вираженого зменшення активності 16 - тестостерон гідроксилази. Такий результат вказує, що на стадії ініціації-промоції дія НДЕА призводить до зменшення кількості ізоформи ІІС11, наслідком чого може бути порушення метаболізму стероїдних гормонів, що також може бути молекулярною базою промоції гепатоканцерогенезу (Кобляков В.А., 1998).

Сумарна кількість ізоформ з м. м.52 кДа на стадії ініціації - промоції збільшувалась в порівнянні з нормою в 1.7 рази. Окислення тестостерону по 6 - положенню мікросомами тварин, що отримували ФБ, знижувалась в 2.3 рази, а активність амідопірин-диметилази (АМД), яка опосередкована ізоформами підродини ІІІА, збільшувалась в 3 рази. Враховуючи відомості, що ця ізоформа також індукується при введенні ФБ (Гулеева Л.Ф., 2000), можна припустити, що збільшення вмісту білку з м. м.52 кДа відбулось за рахунок ізоформ підродини ІІІА. Кількість ізоформ CYP ІІВ1, ІІВ2 та ІА2 згідно результатів активності їх маркерних ферментів не відрізнялась від контролю.

Вміст загального CYP в печінці дослідних тварин поступово збільшувався і досягав максимальних значень приблизно на 70 добу канцерогенезу, коли його рівень перевищував норму в 1.2 рази. При виявленні перших макроскопічних гіперпластичних вузлів (85 доба) і подальшому експансивному рості пухлин в печінці дослідних тварин (стадія прогресії) ізоформи підродини ІІА та ізоформа ІІС13 практично не реєструвались (Табл.3).

Таблиця 3

Вміст ізоформ CYP в мікросомах печінки на стадії прогресії пухлинного росту та за умов їх індукції фенобарбіталом, 3-метилхолантреном і етанолом.

Ізоформи	М. м. кДа	Без індукції	ФБ	3-МХ	ЕТ
		%	нмоль/ мг	%	нмоль/ мг	%	нмоль/ мг	%	нмоль/ мг
ІІА1/ІІА2	48	-	-	2	0.03 0.001	3	0.025 0.007	3	0.03 0.001
ІІС13	50	-	-	1.6	0.02 0.001	4	0.03 0.001	2.0	0.022 0.001
ІІС7/ІІС11	51	38	0.360 0.02	19	0.229 0.011	9	0.07 0.002	26	0.288 0.013
ІІВ1/ІІВ2 ІІІА1/ІІІА2 ІА2	52	32	0.330 0.016	66	0.830 0.037	22	0.160 0.007	31	0.273 0.011
ІІЕ1 ІІС6	53	25	0.260 0.014	8	0.10 0.06	4	0.033 0.002	27	0.238 0.04
ІА1	56	7	0.07 0.003	1	0.01 0.001	57	0.42 0.019	2	0.020 0.001
Загальний CYP (нмоль/мг)		1.04 + 0,06	1.22 + 0,06	0.74 + 0,03	0.87 + 0,03

р - 0.05, дані достовірні відносно контролю

Сумарна кількість інших ізоформ підродини ІІС в цей період канцерогенезу збільшувалась, але залишалась в 1,3 рази нижчою, від їх рівня в контролі. Результати по зміні кількісного вмісту ізоформ підродини ІІС співпадали зі зміною кількості метаболітів тестостерону по 6 - і 16 - положеннях (Табл.4). Цей факт можна вважати доказом того, що на стадії прогресії росту пухлин в печінці знижувався вміст ізоформ підродини ІІС, які експресуються конститутивно. Однак ізоформи цієї підродини неоднозначно реагують на введення індукторів.

Таблиця 4

Активності монооксигеназ в мікросомах печінки на стадії прогресії пухлинного росту за умов їх індукції фенобарбіталом, 3-метилхолантреном і етанолом.

Ізоформи CYP	Моноокси-генази	Активність монооксигеназ (пмольсм-1хв-1)
		Без індукціі	ФБ	3-МХ	ЕТ
Ендогенный субстрат
2А1/А2	7-Тг	0.22 0.01	0.28 0.02	0.32 0.02	0.30 0.1
	15-Тг	0.1 0.01	0.14 0.01	0.24 0.02	0.21 0.05
2С11, 2В1/2	16-Тг	295 10	184 15	180 16	188 12
2С6	2-Тг	475 15	952 18	452 21	490 16
2С13, 3А1,1А1/2	6-Тг 2-Тг	60 1.0 296 7	48 0.6 342 46	61 1.6 201 6.0	59 0.9 314 1.6
Екзогенний субстрат Активність монооксигеназ (нмольмг-1хв-1)
2В1	БФ-Д	17.4 0.3	35.2 2.4	16.4 0.4	18.3 0.7
3А	АМД	19.4 0.4	38.4 2.6	15.15 0.3	18.0 0.7
2Е1	п-НФГ	0.15 0.02	0.26 0.02	0.11 0.03	0.32 0.05
1А1	ЭРОД	0.22 0.03	0.09 0.01	3.29 0.04	0.08 0.03
1А2	БП-Г	0.1 0.05	0.35 0.1	9.5 0.1	0.12 0.03

р - 0.05, дані достовірні відносно контролю

В мікросомах тварин, що отримували ФБ в цей період гепатоканцерогенезу, активність 16-гідроксилази знижувалась, що підтверджує припущення про зменшення експресії ізоформ підродини ІІС за рахунок ізоформ ІІС7 та ІІС11.

Збільшення вмісту ізоформ CYP з м. м.52 кДа співпадало зі зміною характеру метаболізму специфічних субстратів: підвищувалась швидкість метаболізму тестостерону по 16-позиції, активність N-диметилази бензфетаміну і амідопірину в 1.6, 1.3 та 1,4 рази відповідно. Необхідно відмітити, що на цій стадії гепатоканцерогенезу зберігався високий рівень ізоформи ІА1, що підтверджено збільшенням вмісту білку з м. м 56 кДа і специфічною активністю ЕРОД (Табл.3,4).

Таким чином, при гепатоканцерогенезі, викликаному дією НДЕА, виявлені фенотипові зміни в експресії ізоформ CYP, які вказують на порушення функціонального стану монооксигеназного комплексу в цілому. Враховуючи факт, що при індукції гепатоканцерогенезу ми не застосовували екзогенних промоторів, можна припустити, що саме порушення метаболізму стероїдних гормонів може виступати патогенетичною ланкою фази промоції. Виявлена нами експресія ізоформи ІА1 може бути наслідком взаємодії продуктів неповного окислення стероїдних гормонів в монооксигеназному циклі з Ah-рецептором, який за своїми фізико-хімічними властивостями близький до рецептору стероїдних гормонів (Waxman D. J., 1999). Як на стадії ініціації-промоції, так і в період прогресії пухлинного росту кількісний вміст ізоформ CYP та притаманні їм активності маркерних ферментів збільшувались при введенні специфічних індукторів, що дало нам підставу використати цей факт для спрямованої модуляції ізоформного складу в печінці та визначення її впливу на гепатоканцерогенез.

Модуляція ізоферментів CYP аскорбіновою кислотою та ретинол ацетатом при гепатоканцерогенезі, викликаному дією НДЕА. Реакції деалкілювання та денітрозування НДЕА каталізуються ізоформами CYP підродин ІІЕ та ІІВ, на які впливають субстрати, що також метаболізуються цими ізоформами (низькомолекулярні спирти, лікарські препарати, вітаміни та ін.) Метаболізм РА здійснюється в монооксигеназному циклі печінки, а АК впливає на синтез та деградацію CYP та інших гемопротеїдів (Pelissier M. A., 1992; Matsushita N., 1993).

Динаміка вмісту загального CYP при дії НДЕА, НДЕА+РА, НДЕА+АК, має фазовий характер, обумовлений стадіями канцерогенезу. Зниження вмісту CYP в мікросомах печінки на 28 добу індукції пов'язано з токсичною дією НДЕА.

Активація проліферативних процесів в клітинах печінки супроводжувалась збільшенням вмісту CYP, максимальні значення якого реєструвались на 60 добу. Злоякісний ріст пухлин на стадії прогресії призводив до поступового зменшення вмісту загального CYP, рівень якого на 150 добу в цій серії досліджень складав приблизно 75% від контролю.

Введення РА після 4 тижня дії НДЕА, тобто на фоні порушення функціональної активності монооксигеназної системи, коли вміст CYP становив 0.59 нм/мг білку, що в 1.3 рази менше від значень в контролі, призвело до ще більш вираженого пригнічення системи гідроксилювання. В групі тварин, що отримувала НДЕА та РА, вміст ізоформ підродини ІІА, та ізоформ ІІС13, ІА1 достовірно не відрізнявся від їх вмісту в печінці тварин, що отримували тільки канцероген. Відмічено підвищення вмісту ізоформ підродини ІІЕ і ІІВ. В цій експериментальній групі ми виявили кумулятивну токсичну дію НДЕА і РА, що спочатку призвело до збільшення на 75% кількості загиблих тварин, а потім до скорочення латентного періоду виходу пухлин в печінці майже на місяць Ці результати свідчать, що РА підсилює токсичну дію НДЕА внаслідок збільшення вмісту ізоформ підродини ІІВ. Ізоформи цієї підродини метаболізують РА до більш полярних гепатотоксичних сполук - 13-цис-етилретиламіду та трансретиламіду, які, згідно даних (McCornick D. L., 1990), є промоторами канцерогенезу, що в нашому випадку спричинило скорочення латентного періоду і підсилення токсичної дії НДЕА.

В контрольній групі тварин, що отримувала тільки РА, кількість загального CYP знаходилась в межах його значень в контролі. В ізоформному складі CYP мала місце тенденція до підвищення вмісту ізоформ підродин ІІС, ІІВ і ІІІА, що може бути обумовлено їх участю в метаболізмі РА (Howell S. R., 1998).

При введенні тваринам АК на фоні надходження НДЕА вміст загального CYP в печінці на 60 добу канцерогенезу. становив 0.96 нмоль/мг білка, що вірогідно на 26% (р0.05) відрізнявся від його значень в контролі. Вміст ізоформ підродини ІІА, ІІС та ізоформи ІА1 вірогідно не відрізнявся від його значень для печінки тварин, які отримували лише НДЕА. Сума вмісту ізоформ підродини ІІВ, ІІІА та ізоформи ІІЕ1, які приймають участь в метаболізмі НДЕА збільшувалась в 1.4 та 1.3 рази відповідно. Таким чином, сумісна дія АК та НДЕА не призвела до зниження вмісту загального CYP та якісної зміни складу його ізоформ, не викликала загибелі тварин, в порівнянні з дією НДЕА, але скоротила латентний період появи пухлин в печінці на два тижні. Стимулююча дія АК може бути пов'язана з її відновлювальними властивостями, при цьому АК виявляє прооксидантну дію та спричиняє індукцію перекисного окислення ліпідів, білків та інших макромолекул. Прооксидантна дія високих доз АК призводила до зниження експресії 27 генів ферментів - антиоксидантів і ферментів метаболізму ксенобіотиків (Mori T., 1997; Brunet S., 2000).

Таким чином, дія РА і АК проявляє модифікуючий ефект на активність монооксигеназної системи за різними механізмами, що в обох випадках призводить до скорочення латентного періоду появи гематом.

На нашу думку, отримані факти необхідно враховувати в клінічній практиці при призначенні АК та РА на фоні зниженої функціональної активності монооксигеназної системи печінки.

Висновки

У дисертації наведені результати дослідження основних компонентів монооксигеназної системи за умов тривалого надходження в організм тварин гепатотропного канцерогену, що дозволяє доповнити існуючі уявлення щодо процесів метаболізму цього канцерогену та розширити науково-практичне підґрунтя про можливість модуляції функціонального стану монооксигеназної системи з метою зменшення токсичного навантаження на організм.

1. Виявлено фазовий характер змін вмісту окисленого та загального CYP, цитохрому b₅, активності флавопротеїдів, бензфетамін-диметилази і пара-анілін гідроксилази в мікросомах печінки, обумовлений стадіями канцерогенезу і вказує на узагальненість фенотипових характеристик ферментів І-ої фази детоксикації при гепатоканцерогенезі, викликаному дією НДЕА.

2. Показано зрушення співвідношення між окисленою і відновленою формою цитохрому Р-450 в напрямку його відновленої форми на стадії прогресії пухлинного росту, що може створювати умови для стимуляції росту ініційованих клітин.

3. На основі порівняльного аналізу ефективності функціонування NADPH - і NADH - залежних ланцюгів монооксигеназної системи при гепатоканцерогенезі виявлено зміни вмісту цитохрому b₅ і високий рівень активності ФП₁, що може призводити до зміни профілю метаболізму ендогенних субстратів і сприяти промоції канцерогенезу.

4. Показано збільшення експресії ізоформи підродини ІА1 на стадіях ініціації-промоції і прогресії пухлинного росту, що може бути однією з умов формування фенотипу резистентності ініційованих клітин до дії НДЕА.

5. Встановлено, що зменшення вмісту загального цитохрому Р-450 на стадії прогресії пухлинного росту обумовлено порушенням експресії конститутивних ізоформ підродини ІІС, що може призводити до зміни профілю метаболізму ендогенних субстратів.

6. Показано, що застосування ретинол ацетату в дозі 53 МО/кг за умов введення НДЕА змінює експресію ізоформ CYP, що призводить до накопичення продуктів із промоторною активністю і сприяє скороченню періоду появи гіперпластичних вузлів у печінці.

7. Встановлено, що аскорбінова кислота в дозах 40мг/кг на фоні порушення функціонального стану печінки діє як прооксидант, приводить до скорочення латентного періоду гепатоканцерогенезу без зміни якісного і кількісного складу ізоформ CYP.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Мельников О.Р., Момот В.Я., Пятчанина Т.В., Сидорик Е.П. Изменение соотношения ферро - и феррицитохрома Р-450 в печени животных как условие трансформации гепатоцитов под действием N-нитрозодиэтиламина // Экспер. онкология. - 2000. - Т.22, №3. - С.139 - 141. (Автором виділені мембрани ендоплазматичного ретикулуму із печінки при гепатоканцерогенезі, вивчено вміст феррі - цитохрому Р-450, вміст ферро - цитохрому Р-450, цитохрому Р-420. Брала участь у написанні та оформленні статті).

2. Melnikov O. R., Momot V. Ya., Pyatchanina T. V., Sidorik E. P. State of cytochrome P-450 and its oxidized form under hepatocarcinogenesis induced by N-nitrosodiethylamine in animals liver // Доклады НАН Украины. - 2001. - №5. - С.172 - 175. (Автором виділені мембрани ендоплазматичного ретикулуму із печінки при гепатоканцерогенезі, вивчено вміст окисленої форми цитохрому Р-450, загального цитохрому Р-450 методом диференційної спектрофотометрії. Брала участь у написанні та оформленні статті).

3. Мельников О.Р., Момот В.Я., Пятчанина Т.В., Сидорик Е.П. Модификация системы цитохрома Р-450 аскорбиновой кислотой и ретинол ацетатом при химическом канцерогенезе печени // Доклады НАН Украины. - 2001. - №6. - С.173 - 178. (Автором виділені мембрани ендоплазматичного ретикулуму із печінки при гепатоканцерогенезі, проведено індукторний аналіз для ідентифікації ізоформного складу цитохрому Р-450, вивчено ізоформний склад цитохрому Р-450. Брала участь у написанні і оформленні статті).

4. Мельников О.Р., Момот В. Я, П'ятчаніна Т. В, Сидорик Є.П. Співвідношення низькоспінового і високоспінового цитохрому Р-450 у мікросомах гепатом, індукованих N-нітрозодиетиламіном // Фізіологічний журнал - 2005. - Т.51, № 5. - С.65 - 69. (Автором вивчено вміст високо - та низькоспінового цитохрому Р-450 в мікросомах гепатом. Оформлена публікація).

5. Момот В.Я., Корнева Е.Н., Мельников О.Р., Сидорик Е.П. Изоформный состав цитохрома Р-450 в гепатомах, индуцированных N-нитрозодиэтиламином - // Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Биохимия опухолевой клетки". Минск. - 1990. - С.72 - 73.

6. Momot V. Ya., Melnikov O. R., Sidorik E. P. Status of monooxygenase in nitrosamine-induced hepatomas - // Proceeding of the 7-th International Conference. Cytochrome P-450: Biochemistry and Biophysics. Ed. Archakov A.I., Bachmanova G.I., Moscow. - 1992. - P.577 - 579.

7. Мельников О.Р., Момот В.Я., Сидорик Є.П. Вплив ретиноїдів на ізоформний склад цитохрому Р-450 печінки при гепатоканцерогенезі, викликаному N-нітрозодиетиламіном - // Тези доповідей ІХ з'їзду онкологів України; Вінниця, 1995. - С.101 - 102.

8. Мельников О.Р., Момот В.Я., П'ятчаніна Т.В., Мельникова Н.М. Ізоформний склад цитохрому Р-450 мембран ендоплазматичного ретикулуму клітин печінки і гепатом,індукованих N-нітрозодиетиламіном - // Тези доповідей VII Українського біохімічного з'їзду ч. III; Київ. - 1997. - С.52 - 53.

9. Мельников О.Р., Момот В.Я., Пятчанина Т.В. Сидорик Е.П. Состояние гидроксилирующей системы печени при гепатоканцергенезе в условиях модификации ретинол ацетатом и аскорбиновой кислотой - // Тезисы II съезда онкологов стран СНГ; - Украина, Киев, 2000 г. Экспериментальная. онкология. - 2000. - Vol.22, Supl.

10. Мельников О.Р., Момот В.Я., Пятчанина Т.В., Сидорик Е.П. Модификация этанолом изоформного состава цитохрома Р-450 печени животных при гепатоканцерогенезе, индуцированном N-нитрозодиэтиламином - // Тези доповідей VIIІ Українського біохімічного з'їзду, Чернівці. - 2002. Укр. біохімічний журнал. - 2002. - Т.24, №4а, - С.61.

Анотація

Момот В.Я. Характеристика функціонального стану монооксигеназної системи печінки при гепатоканцерогенезі, викликаному дією N-нітрозо-диетиламіну. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 - Онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ - 2006.

У дисертації наведені результати дослідження функціонального стану монооксигеназного комплексу мембран ендоплазматичного ретикулуму печінки щурів за умов гепатоканцерогенезу, викликаного дією N-нітрозодиетиламіну. Встановлено, що зміни вмісту окисленого та загального CYP, цитохрому b₅, активності NADH-цитохром b₅ - редуктази, пара-анілін гідроксилази та бензфетамін-диметилази мають фазовий характер, який обумовлений стадіями канцерогенезу. Активність NADРH-цитохром Р-450 редуктази підвищена на всіх стадіях канцерогенезу.

На стадії ініціації - промоції та прогресії пухлинного росту виявлено вірогідне зниження вмісту конститутивних ізоформ CYP підродини ІІС та підвищення експресії ізоформи ІА1, яка не реєструється в печінці інтактних тварин.

Встановлено, що введення ретинол ацетату та аскорбінової кислоти за умов порушення функціонально стану печінки, викликаного дією N-нітрозодиетиламіну, не спричиняє захисної дії і скорочує латентний період виходу пухлин в печінці.

Ключові слова: гепатоканцерогенез, монооксигеназний комплекс, ізоформи цитохрому Р-450, ретинол ацетат, аскорбінова кислота.

Аннотация

Момот В.Я. Характеристика функционального состояния монооксигеназной системы печени при гепатоканцерогенезе, вызванном действием N-нитрозодиэтиламина. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 - Онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев - 2006.

Диссертация посвящена комплексному исследованию функционального состояния монооксигеназной системы печени животных при гепатоканцерогенезе, вызванном N-нитрозодиэтиламином, а также модифицирующего влияния витаминов-антиоксидантов на содержание, активность мембраносвязанных ферментов монооксигеназной системы детоксикации ксенобиотиков, изоформный состав цитохрома Р-450 на стадиях инициации-промоции, прогрессии опухолевого роста.

В динамике изучено содержание окисленного и общего цитохрома Р-450, цитохрома b₅, активностей NADPH-цитохром Р-450-редуктазы, NADH-цитохром b₅-редуктазы, пара-анилин гидроксилазы (изоформа IIE1), бензфетамин-диметилазы (изоформа IIВ). На стадиях инициации-промоции и прогрессии опухолевого роста исследовано влияние канцерогена на экспрессию изоформ подсемейств IA, IIB, IIC, IIE и IIIA на основании их содержания и изменения активностей маркерных ферментов, опосредованных изоформами этих подсемейств. Используя период токсического действия N-нитрозодиэтиламина, когда обнаружено снижение всех исследуемых параметров, как модель нарушения функционального состояния печени, изучен модифицирующий эффект ретинол ацетата и аскорбиновой кислоты, которые вводили в массивных дозах в течение двух недель. В этой модели изучено содержание цитохрома Р-450 и изменение его изоформного состава по отношению к действию канцерогена, витаминов совместно с канцерогеном, а также только витаминов.

При использовании ЭПР-спектроскопии, оптической спектрофотометрии, спектрофлуориметрии, денситометрии, жидкостной хроматографии высокого давления, градиентного электрофореза в полиакриламидном геле, биохимических методик определения активности ферментов в модельных системах, индукторного анализа в микросомах из ткани печени на всех стадиях канцерогенеза и в гепатомах выявлены общие фенотипические изменения ферментов I-ой фазы метаболизма ксенобиотиков, которые обусловлены стадиями канцерогенеза.

Сравнительный анализ функционирования NADPH - и NADH-зависимых цепей монооксигеназного цикла при гепатоканцерогенезе выявил снижение количества цитохрома b₅, активности NADH - цитохром b₅ - редуктазы и повышение активности NADPH-цитохром Р-450-редуктазы, что может приводить к изменению профиля метаболизма эндогенных субстратов и способствовать промоции канцерогенеза.

Показано, что снижение содержания общего цитохрома Р-450 на стадии инициации-промоции гепатоканцерогенеза обусловлено снижением уровня экспрессии конститутивных изоформ цитохрома Р-450 подсемейства ІІС и изоформы IIЕ1. Содержание общего цитохрома Р-450 возрастает на стадии прогрессии опухолевого роста и достоверно превышает значения контроля, на фоне практического исчезновения изоформ цитохрома

Р-450 подсемейства IIA и изоформы IIC13. Уменьшение количества метаболитов тестостерона по 16 - положению указывает на снижение количества изоформы IIC11, а выраженное повышение активности 7-этоксирезоруфин диэтилазы и белка с м. м.56 кД указывает на экспрессию изоформы IА1 в этот период канцерогенеза. Установлено, что в гепатомах на фоне снижения содержания общего цитохрома Р-450 сохраняется способность к индукции изоформ подсемейств IА, IIB, IIE.

Выявлено, что применение ретинол ацетата в дозе 53 МЕ/кг в течение двух недель на фоне введения НДЕА приводит к снижению уровня общего цитохрома Р-450 и увеличению экспрессии изоформ цитохрома Р-450 подсемейств IIE и IIB, усиливающих токсическое действие НДЭА, что приводит к сокращению латентного периода появления гиперпластических узлов в печени.

Введение аскорбиновой кислоты в дозе 40 мг/кг при нарушении функционального состояния монооксигеназной системы не изменяло количество общего цитохрома Р-450, качественный и количественный состав его изоформ, но также привело к экспрессии изоформ, метаболизирующих НДЕА, и следовательно, к сокращению латентного периода гепатоканцерогенеза.

Ключевые слова: гепатоканцерогенез, монооксигеназный комплекс, изоформы цитохрома Р-450, ретинол ацетат, аскорбиновая кислота.

Annotation

Momot V.Ja. Characteristic of the functional state of liver monooxygenase system under N-nitrosodiethylamine-induced hepatocarcinogenesis. -

A manuscript.

Dissertation for the candidate of biological sciences degree in speciality 14.01.07 - Oncology. - R. E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology of National Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv - 2006.

The dissertation presents the results of studying the functional activity of monooxygenase complex in liver endoplasmic reticulum membranes under N-nitrosodiethylamine - induced hepatocarcinogenesis in rats.

The changes in content of oxidized and reduced cytochrome P-450 and cytochrome b₅ as well as in activity of NADH-cytochrome b₅ - reductase, para-aniline hydroxylase and benzphetamine dimethylase were found to have a phase character and depend on carcinogenesis stage. NADPH-cytochrome P-450 - reductase level was shown to increase at all of stages.

Significant decrease in content of constitution isoforms of cytochrome P-450 IIC subfamily and expression of IA1 isoform that was absent in the liver of intact animals were observed at the initiation-promotion as well as progression stages of hepatocarcinogenesis.

It was shown that retinol acetate and ascorbic acid did not posses with defense action but shortened the latent period of tumor output under condition of N-nitrosodiethylamine-caused disturbance in liver functions.

Key words: hepatocarcinogenesis, monooxygenesis complex, isoforms of cytochrome P-450, retinol acetate, ascorbic acid.

Размещено на Allbest.ru

...