Дослідження механізмів кардіопротекторного впливу омега-3 поліненасичених жирних кислот рослинного походження при пошкодженні міокарда різного ґенезу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук україни

інститут фізіології ім. о.о. богомольця

удк 616.127+577.115.3:6616-005.4+616-009

Дослідження механізмів кардіопротекторного впливу омега-3 поліненасичених жирних кислот рослинного походження при пошкодженні міокарда різного генезу

14.03.04 - патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Шиш анжела михайлівна

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі експериментальної кардіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, академік НАН України, Мойбенко Олексій Олексійович, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу експериментальної кардіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, Янчій Роман Іванович, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, провідний науковий співробітник відділу імунології і цитотоксичних сироваток

доктор медичних наук, Ткаченко Михайло Миколайович завідувач кафедри радіології з курсом радіаційної медицини Національного медичного університету імені О.О. Богомольця

Провідна установа: Національний науковий центр “Інститут кардіології ім. М.Д. Стражеска” АМН України

Захист відбудеться “_16_” січня_ 2007 р. о _14.00_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богогмольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “_15_” грудня_ 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

Анотації

Шиш А.М. Дослідження механізмів кардіопротекторного впливу омега-3 поліненасичених жирних кислот рослинного походження при пошкодженні міокарда різного генезу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.04 - патологічна фізіологія. - Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2007.

В експериментах на ізольованих перфузованих за Лангендорфом серцях щурів, ізольованих препаратах аорти було досліджено вплив модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран за допомогою -3 ПНЖК на серцево-судинну систему за умов ішемії-реперфузії та гострого іммобілізаційного стресу. Показано, що застосування -3 ПНЖК як тваринного, так і як вперше показано нами субстанції рослинного походження вітчизняного виробництва протягом 4 тижнів призводить до зміни жирнокислотного складу клітинних мембран підвищуючи рівень -3 ПНЖК та знижуючи рівень АК в мембранах тканини міокарда. Виявлено, що рослинна субстанція більш ефективно знижує рівень АК. Зменшення вмісту АК під впливом -3 ПНЖК супроводжується суттєвим зниженням утворення її активних метаболітів LTC₄ та ТxВ₂ у нормі та особливо при ішемії-реперфузії. Встановлено, що попередня модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран призводить до покращення відновлення ішемізованого серця під час реперфузії та супроводжується, як вперше показано нами, вірогідним зменшенням інтенсивності порушень структури та функцій серця при стресі та ішемії-реперфузії міокарда. Показано, що попереднє застосування -3 ПНЖК запобігає розвитку окисидативного стресу та зберігає активність ферментів антиоксидантного захисту при гострих стресорних та ішемічних впливах. Вперше встановлено, що при попередній модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран за допомогою нової субстанції -3 ПНЖК рослинного проходження підвищується активність сNOS та пригнічується активність iNOS як за умов ішемії-реперфузії, так і при гострому іммобілізаційному стресі порівняно з контрольними дослідами. Наслідком модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран є зменшення реактивності серця при дії адренергічних подразників та зменшення констрикторних реакцій коронарних судин, що може бути важливим механізмом кардіопротекції. Основними факторами підвищення резистентності серця до патологічних впливів у результаті модифікації клітинних мембран за допомогою -3 ПНЖК слід вважати: гальмування прооксидантних та посилення антиоксидантних процесів, зменшення адренергічної реактивності серця та судин, гальмування вивільнення арахідонової кислоти та її потенційно патогенних метаболітів лейкотриєнів та тромбоксанів, а також позитивні зміни в системі оксиду азоту. жирнокислотний поліненасичений мембрана стрес

Ключові слова: модифікація клітинних мембран; -3 ПНЖК; ішемія-реперфузія міокарда, стрес, вільнорадикальні процеси, система оксиду азоту, адренергічні реакції серця та судин.

Шиш А.М. Исследование механизмов кардиопротекторного влияния омега-3 полиненасыщенных жирных кислот растительного происхождения при повреждении миокарда разного генеза. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.04 - патологическая физиология. - Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2007.

В экспериментах на изолированных сердцах крыс, перфузированных по методу Лангендорфа, изолированных препаратах аорты было исследовано влияние модификации жирнокислотного состава клеточных мембран при помощи -3 ПНЖК на сердечно-сосудистую систему в условиях ишемии-реперфузии и острого иммобилизационного стресса. Показано, что прибавление -3 ПНЖК к рациону животных в течение 4 недель приводит к изменению жирнокислотного состава клеточных мембран, достоверно повышая уровень -3 ПНЖК и снижая уровень -6 ПНЖК, в частности АК, а также установлено, что растительная субстанция снижает уровень АК значительно больше, особенно при ишемии-реперфузии. Уменьшение содержания в мембранах АК под влиянием -3 ПНЖК сопровождалось существенным снижением образования ее активных метаболитов LTC₄ и ТxВ₂ в норме и особенно при ишемии-реперфузии. Выявлено кардиопротекторное влияние -3 ПНЖК, проявляющееся в антиаритмическом эффекте и улучшении функциональных показателей работы изолированного сердца (более быстрое восстановление полноценных сердечных сокращений и восстановление давления в левом желудочке, снижение конечно-диастолического давления и сопротивления коронарных сосудов) в условиях ишемии-реперфузии. Наряду с этим, предварительная модификация жирнокислотного состава клеточных мембран как в условиях стресса, так и при ишемии-реперфузии изолированного сердца сопровождается ингибированием свободнорадикальных процессов: уменьшением содержания в ткани миокарда диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, а также снижением параметров хемилюминeсценции. Кроме того показано, что предварительное применение -3 ПНЖК усиливает активность ферментов антиоксидантной защиты как в условиях стресса, так и при ишемии-реперфузии, что свидетельствует об уменьшении окислительных процессов. Нами впервые показано, что модификация жирнокислотного состава мембран кардиомиоцитов в значительной степени предупреждала возникновение деструктивных изменений в кардиомиоцитах в условиях острого иммобилизационного стресса, а также при ишемии-реперфузии. Впервые показано, что вследствие модификации жирнокислотного состава мембран клеток сердца с помощью новой субстанции -3 ПНЖК растительного происхождения в условиях ишемии-реперфузии миокарда и острого иммобилизационного стресса угнетается активность іNOS, повышается активность сNOS и увеличивается продукция NO. Впервые показано, что применение -3 ПНЖК уменьшает реактивность изолированного сердца при адренергической стимуляции. В опытах на изолированных препаратах аорты и изолированном сердце выявлено дозозависимое уменьшение реакций сердца и сосудов на действие НА в группах животных, которые получали -3 ПНЖК. Основными факторами повышения резистентности сердца к патологическим влияниям в результате модификации жирнокислотного состава клеточных мембран с помощью -3 ПНЖК следует считать: торможение прооксидантных и усиление антиоксидантных процессов, уменьшение адренергической реактивности сердца и сосудов, торможение высвобождения арахидоновой кислоты и ее потенциально патогенных метаболитов лейкотриенов и тромбоксанов, а также позитивные изменения в системе оксида азота.

Ключевые слова: модификация клеточных мембран; -3 ПНЖК; ишемия-реперфузия миокарда, стресс, свободнорадикальные процессы, система оксида азота, адренергические реакции сердца и сосудов.

Shysh A.M. Investigation of cardioprotective mechanisms of plant-derived omega-3 polyunsaturated fatty acids on myocardium damage of different genesis. - Manuscript.

Thesis for a candidate biology degree by the speciality 14.03.04 - pathological physiology. - Bogomoletz Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

In experiments on the rat isolated hearts perfused under Langendorff preparation and isolated aorta rings we investiated the influence of phospholipids membrane modification by щ-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) on the cardiovascular system under ischemia-reperfusion and immobilization stress. It was shown that addition щ-3 PUFA both of marine origin and plant-derived to the animal diet within 4 weeks resulted in change of cell membrane fatty acid composition namely raising the level of щ-3 PUFA and reducing the level of щ-6 PUFA in membrane of myocardium. It was established that the plant-derived substance reduced arachidonic acid (AA) level in greater extent especially at ischemia-reperfusion. Reduction of the AA content in membranes under influence of щ-3 PUFA was accompanied by significant decrease in formation its active metabolites LTC₄ and ТxВ₂, particularly at ischemia - reperfusion. It was revealed that membrane phospholipids modification improved the functional parameters of the isolated heart in ischemia-reperfusion and as was shown for the first time minimized occurrence of destructive changes in myocardium both in conditions of stress and at ischemia - reperfusion. Besides that it was shown that pre-treatment with щ-3 PUFA attenuated lipid peroxidation, strengthens activity of antioxidant enzymes during reperfusion and stress. It was established that membrane phospholipids modification with plant-derived щ-3 PUFA raised сNOS activity, reduces іNOS activity, both in conditions of stress and ischemia - reperfusion compare to control. All indicated changes resulted in attenuation of heart reactivity to the adrenergic influences and minimize coronary vessels vasomotor reactions that can be the important mechanism of cardioprotection. The main factors of higher resistance of the heart to pathological influence after membrane composition modification by -3 PUFA are following: 1) inhibition of oxidative and activation of antioxidative processes; 2) minimization of heart and vessels reactivity to adrenergic stimulation; 3) the release inhibition of AA and its metabolites leukotriens and tromboxanes; 4) positive changes in NO-system.

Key words: cell membrane modification; щ-3 PUFAs, myocardial ischemia-reperfusion, stress, lipid peroxidation, NO-system, adrenergic reaction of myocardium and vessels.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Серцево-судинні захворювання займають перше місце в структурі смертності в Україні. За даними ВООЗ захворювання серцево-судинної системи, зокрема ішемічна хвороба серця, гострий інфаркт міокарда, захворювання периферичних та вінцевих артерій, займають провідне місце серед причин смертності у більшості розвинутих країн. В Україні серцево-судинна патологія складає 62,8 % серед усіх причин смерті. Це один із самих високих показників в світі і, безумовно, необхідно прагнути до його зниження [Коваленко В.М., 2004]. З розвитком нового напрямку в медицині по вивченню ролі -3 поліненасичених жирних кислот (ПНЖК) відкриваються нові можливості в корекції функціонального стану серцево-судинної системи шляхом впливу на природні механізми його регуляції.

Численні дослідження, проведені у різних країнах світу, достатньо переконливо показали, що у народів, які споживають велику кількість морських продуктів, збагачених на -3 ПНЖК, дуже низький рівень серцево-судинних захворювань (Dyerberg J. et al., 1975; Kromhout D. еt al., 1985; Wijendran V. еt al., 2004; Breslow J.L. еt al., 2006). Наявність конкурентних взаємовідношень між -3 ПНЖК та -6 ПНЖК, зокрема арахідоновою кислотою (АК), дозволяє впливати на вміст ейкозаноїдів - похідних АК та таким чином на процес агрегації тромбоцитів, тонус судин, запалення (Yin K. еt al., 1991; Abeywardena M.Y. et al., 2001; Holub B.J. et al, 2002). Модифікація жирнокислотного складу фосфоліпідів клітинних мембран з метою гальмування виділення АК за несприятливих умов може мати позитивні наслідки, дозволяючи попереджувати утворення патогенних речовин. Також встановлено, що щ-3 ПНЖК наряду з гіполіпідемічним ефектом мають гіпокоагуляційну, гіпотензивну, антиагрегантну, протизапальну та імуномоделюючу дію (Фещенко Ю.І. та ін., 1999; Амосова К.М. та ін., 2000; Simopoulos A.P. et al., 2002; Rupp H. et al., 2004). Не дивлячись на широке застосування щ-3 ПНЖК, механізми їх дії ще до кінця не вивчені.

Недостатньо вивчені або суперечливі дані про участь у механізмах кардіопротекторної дії -3 ПНЖК вільних радикалів кисню, системи оксиду азоту, зокрема різних NO-синтаз (сNOS та іNOS), зміни реактивності серця та судин до біологічно активних речовин - регуляторів діяльності серцево-судиної системи. Невідомий вплив щ-3 ПНЖК на серце та систему оксиду азоту за умов гострого стресорного пошкодження. Тому вивчення механізмів, за рахунок яких реалізується захисний ефект -3 ПНЖК, має важливе значення.

Якщо на теперішній час відносно протекторної дії щ-3 ПНЖК, які входять до складу риб'ячого жиру, накопичено досить великий експериментальний та клінічний матеріал, то -3 ПНЖК рослинного походження в цьому відношенні мало досліджені, тому доцільно було дослідити кардіопротекторну ефективність нової субстанції щ-3 ПНЖК (63%) з доступної рослинної сировини (насіння льону), яку синтезовано в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України. Тому детальне порівняльне дослідження кардіопротекторної дії -3 ПНЖК, як нової вітчизняної субстанції -3 ПНЖК рослинного походження, так і існуючого препарату епадолу, який синтезовано з жирів глибоководних риб (Фещенко Ю.І. та ін., 1999), за різних патологічних умов серцево-судинної системи нам здається актуальним.

Метою дослідження було дослідження механізмів кардіопротекторної дії -3 ПНЖК рослинного та тваринного походження при патології міокарда різного генезу (ішемія-реперфузія, гострий іммобілізаційний стрес). Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

Провести порівняльне дослідження змін жирнокислотного складу клітинних мембран міокарда при використанні -3 ПНЖК тваринного та рослинного походження.

Дослідити зміни ультраструктури та функціонального стану міокарда за умов гострого іммобілізаційного стресу та ішемічно-реперфузійного пошкодження на фоні модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран.

Дослідити зміни метаболізму арахідонової кислоти, стан перекисних процесів та системи оксиду азоту за умов модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран при розвитку патологічних процесів (ішемія-реперфузія, стрес) в серцево-судинній системі.

Визначити вплив модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран на адренергічну реактивність серця та судин за фізіологічних умов та при розвитку іммобілізаційного стресу.

Об`єкт дослідження: ізольовані серця щурів, ізольовані препарати аорти щурів.

Предмет дослідження: механізми кардіопротекції при модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран за допомогою субстанцій -3 ПНЖК рослинного та тваринного походження, кардіодинаміка, скоротливі реакції судинних гладеньких м`язів, метаболічні зміни при ішемії-реперфузії та стресорних ураженнях міокарда.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках плану наукових досліджень відділу експериментальної кардіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця за темою "Дослідження механізмів розвитку та попередження порушень діяльності серцево-судинної системи при ішемічно-реперфузійному синдромі, розробка методів їх корекції" (№ державної реєстрації 0102U000827) та в рамках наукового проекту "Дослідження механізмів кардіопротекторної дії омега-3 поліненасичених жирних кислот" комплексної програми НАН України “Новітні медико-біологічні проблеми та оточуюче середовище людини” (№ державної реєстрації 0104U008944).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні отримано спільно з Інститутом біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України та досліджено нову субстанцію до складу якої входять -3 ПНЖК рослинного походження. Вміст -3 ПНЖК у субстанції рослинного походження складає до 63% - б-ліноленової кислоти.

У роботі встановлено, що застосування нової рослинної субстанції -3 ПНЖК обумовлює підвищення рівню -3 ПНЖК в мембранах тканини та зменшення вмісту щ-6 ПНЖК, зокрема, рівню АК та її активних метаболітів: ТхВ₂ (індуктора агрегації тромбоцитів), та ЛТС₄, які поряд з судиннозвужуючим ефектом, мають прозапальну дію. Показано, що застосування нової субстанції -3 ПНЖК рослинного походження за своїм впливом на жирнокислотний склад клітинних мембран не поступається тваринному препарату “епадол”, що містить -3 ПНЖК тваринного походження і вже застосовується в клініці як лікувальний та профілактичний засіб.

З`ясовано, що модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран суттєво впливає на реактивність ізольованого серця до дії адренергічних подразників як за фізіологічних, так і патологічних умов.

Вперше показано, що модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран міокарда в значній мірі попереджує ураження серця при гострому іммобілізаційному стресі.

З`ясовано, що захисними механізмами дії щ-3 ПНЖК можуть бути: гальмування прооксидантних процесів, підвищення активності сNOS та збільшення продукції оксиду азоту (NO), зменшення можливості адренергічних уражень серця.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Отримані результати надають нову достовірну інформацію про вплив зміни жирнокислотного складу клітинних мембран за допомогою субстанції рослинного походження вітчизняного виробництва на перебіг патологічних процесів у серцево-судинній системі. Вивчення кардіопротекторної дії -3 ПНЖК у є перспективним напрямком наукових досліджень у медицині. У роботі показана можливість попереджувати негативний вплив ішемії-реперфузії та гострого іммобілізаційного стресу, обмежувати активність перекисних процесів, зменшувати реакції серця та судин при дії адренергічних подразників, впливати на продукцію NO за рахунок модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран в бік збільшення в них -3 ПНЖК. Це є основою для розробки перспективних шляхів, направлених на зменшення ризику розвитку ішемічної хвороби серця та дає змогу рекомендувати застосування як тваринної, так і нової рослинної субстанції -3 ПНЖК для профілактики та лікування ішемічних та стресорних станів.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно здійснено науковий пошук та обґрунтування напрямку досліджень, проведено аналіз наукової літератури, проведена систематизація даних наукової літератури. Самостійно проведені експериментальні дослідження, статистична обробка одержаних результатів, аналіз результатів, сформульовані основні висновки роботи, підготовлено до публікації матеріали стосовно основних положень експериментальних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення й окремі фрагменти дисертації доповідалися та обговорювалися на конгресах та конференціях: 5^th International Congress on Coronary Artery Disease - From Prevention to Intervention - ICCAD. (Florence, Italy, 2003); 24th ISHR-European Section Meeting (Dresden, Germany, 2004); III Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, Россия, 2004); Workshop in cardiovascular physiology (Warsaw, Poland, 2004); ІІ Міжнародній науковій конференції “Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія і клініка” (Одеса, 2005); Всероссийской конференции молодых исследователей “Физиология и медицина” (Санкт-Петербург, Россия, 2005); 9-ой международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, Россия, 2005); European Physiological Meeting (Munich, 2006).

Публікації. Матеріали дисертації викладено в 7 статтях у наукових фахових виданнях та 8 тезах доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 158 сторінках друкованого тексту та ілюстрована 25 рисунками та 5 таблицями. Робота складається зі вступу, огляду літератури, розділу опису матеріалів і методів дослідження, розділу результатів дослідження та їх обговорення, розділу аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаної літератури, що нараховує 275 найменувань.

Напівхронічні експерименти були проведені на білих щурах-самцях лінії Вістар вагою 280-300 г з дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами (міжнародна конвенція, Страсбург, 1986) в два етапи. На першому етапі проводили модифікацію клітинних мембран шляхом додавання до стандартного раціону віварію субстанцій щ-3 ПНЖК в хронічних дослідах. На другому етапі в гострому експерименті на ізольованому перфузованому серці та тваринах з іммобілізаційним стресом досліджували кардіопротекторні ефекти щ-3 ПНЖК.

Модифікація клітинних мембран: тварини отримували препарат “епадол”, що містить 45% щ-3 ПНЖК тваринного походження, виробництва Київського вітамінного заводу, або субстанцію щ-3 ПНЖК рослинного походження, яка містить -ЛК (63%). Ця субстанція була розроблена спільно з співробітниками лабораторії хімічної ензимології Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (при допомозі к.м.н. Харченко О.В.). Тварини отримували -3 ПНЖК у дозі 0,1 мг/100 г маси тіла протягом 4 тижнів, як додаток до стандартного раціону віварію Інституту фізіології ім. О.О.Богогмольця.

Зміни жирнокислотного складу фосфоліпідів мембран визначали в ліпідному екстракті гомогенатів тканини міокарда та печінки, оцінюючи вміст щ-6 ПНЖК (АК та ЛК) та щ-3 ПНЖК (ЕПК, ДГК та б-ЛК), за методом високоефективної рідинної зворотньої хроматографії з використанням рефрактометричного детектора (Кейтс М. 1975). Вміст омега-3 та омега-6 ПНЖК виражали у відсотковому співвідношенні до загального вмісту жирних кислот. Матеріал для дослідження забирали в контролі, після 4 тижнів застосування щ-3 ПНЖК, після відтворення ішемії-реперфузії ізольованого серця щура, після 4 тижнів застосування щ-3 ПНЖК та відтворення ішемії-реперфузії ізольованого серця щура.

Дослідження функцій ізольованого серця за методом Лангендорфа. Тварин анестезували уретаном (1,9 г/кг маси тіла) та вводили гепарин (250 од/кг) за 10 хв до вилучення серця. Серце перфузували ретроградно за класичним методом Лангендорфа модифікованим розчином Кребса-Хензеляйта (Doring H.J., 1990). Розчин насичували газовою сумішшю 95% О₂ і 5% CO₂, підтримували температуру в системі на рівні 37°С та подавали в аорту перистальтичним насосом. Швидкість перфузуючого потоку встановлювали так, щоб перфузійний тиск в коронарних судинах досягав у середньому 70-75 мм рт.ст. Реєстрували такі показники: перфузійний тиск у коронарних судинах (КПТ); тиск у лівому шлуночку (ТЛШ), першу похідну цього тиску - dР/dt, про який судили за змінами тиску у латексному балончику, який вводили у лівий шлуночок; частоту серцевих скорочень (ЧСС). Додатково обраховували кількість екстрасистол на ділянках, де протягом 1 хв їх кількість була максимальною, а також час до зупинки серця під час ішемії та час до відновлення повноцінних серцевих скорочень після початку реперфузії.

В експериментах моделювали ішемію шляхом зупинки перфузії серця протягом 20 хв та наступну реперфузію протягом 40 хв. Гострий іммобілізаційний стрес моделювали шляхом фіксації тварин на спині у стані нерухомості протягом 6 годин.

Для електронномікроскопічних досліджень використовували рутинний метод заливки тканини в епоксидні смоли в модифікації Шарова В.Г. (1985).

Дослідження вазомоторних реакцій ізольованих препаратів судин. Ізольовані кільцеві препарати аорти щурів (діаметр 2 мм, ширина 1,5 мм) перфузували при 37 ⁰С розчином Кребса. Усі тестування судинних препаратів здійснювали в ізометричному режимі (при початково заданій напруженості). Перед вимірюванням судинні препарати витримували протягом 60 хв у нормальному розчині Кребса. НА подавали у розчин протягом 3 хв, його концентрація у розчині становила 1 нмоль - 1 мкмоль. Напруженість судинної смужки розраховували у Ньютонах на 1 м^2.. Цілісність судинного ендотеліального шару клітин визначали за наявністю ендотелій-залежних реакцій на ацетилхолін (1 мкмоль/л).

Зміни реактивності ізольованого серця щура вивчали за величиною адренергічної реакції при додаванні норадреналіну (НА) у перфузуючий розчин Кребса-Хензелейта. Концентрація останнього у перфузуючому розчині була від 1 нмоль до 1 мкмоль.

Біохімічні методи: Активність NOS-синтаз у гомогенатах тканин міокарда визначали спектрофотометрично за зміною вмісту нітрит-аніона (Yan L., 1994). Вміст нітританіону (NO₂-- ) визначали в безбілкових розчинах гомогенатів тканини серця в колориметричній реакції за допомогою реактиву Гріса методом Гріна в модифікації, захищеною патентом України (Коцюруба А.В. та ін., 2000). Визначали вміст малонового диальдегіду (МДА) (Стальная И.Д. и др., 1977), вміст дієнових кон`югатів (спектрофотометричним методом за УФ-поглинанням гептанових екстрактів проб). Активність супероксиддисмутази (СОД) вивчали за методом Чевари С. и др. (1985). Активність каталази вивчали за методом Королюк М.А. зі співав. (1988). Для визначення сумарної оцінки інтенсивності вільнорадикального окиснення при модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран використовували метод Н₂О₂-індукованої хемілюмінесценції (Владимиров Ю.Л. и др., 1989). Вміст ТхВ₂ та LTC₄ у тканині міокарда визначали радіоімунним методом згідно методичних рекомендацій, що додаються до стандартного набору реактивів ([³H] ТхВ₂ RIA kit, “Amersham” та [³H] LTC₄ RIA kit, “Du Pont”). Статистичну обробку даних у всіх дослідженнях проводили з використанням t-критерію Стьюдента для оцінки достовірності відмінностей. Статистично вірогідними вважалися значення Р<0,05.

Зміни жирнокислотного складу фосфоліпідів клітинних мембран під впливом -3 ПНЖК рослинного та тваринного походження. Вплив нової субстанції щ-3 ПНЖК рослинного, а також тваринного походження на жирнокислотний склад клітинних мембран серця щурів досліджували у контролі та за умов ішемії-реперфузії ізольованого серця щурів. Встановлено, що щ-3 ПНЖК тваринного (І група) та рослинного (ІІ група) походження суттєво впливають на жирнокислотний склад мембран тканини серця, заміщуючи в них ПНЖК з сімейства щ-6 на ПНЖК з сімейства щ-3. Зокрема, у гомогенатах тканини міокарда вміст АК у обох групах знижувався, але субстанція рослинного походження була навіть більш ефективною. Ішемія та наступна реперфузія призводили до збільшення вмісту АК у контрольних серцях, тоді як у І та ІІ групах її рівень достовірно зменшувався. Застосування субстанції рослинного походження і в цьому відношенні було більш ефективним. Вміст -ЛК у ІІ групі збільшувався (в 1,5 рази, Р<0,05) більш значно як у контролі, так і при ішемії-реперфузії. Вміст ЕПК в обох групах був більшим як за умов контролю, так і при ішемії-реперфузії .

Таким чином, застосування -3 ПНЖК як рослинного, так і тваринного походження достовірно підвищує рівень -3 ПНЖК в клітинах тканини міокарда та знижує рівень щ-6 ПНЖК, зокрема АК, але субстанція рослинного походження знижує рівень АК значно більше, особливо при ішемії-реперфузії.

Функціональні та ультраструктурні зміни серця за умов ішемії-реперфузії та вплив модифікації жирнокислотного складу мембран клітин на перебіг цих процесів. Результати експериментів показують, що 20-хв ішемія та наступна 40-хв реперфузія призводить до підвищення перфузійного тиску у коронарних судинах на 32,3%, Р<0,05 (на 40-й хв реперфузії). Починаючи з 1-2 хв після початку реперфузії ішемізованого серця тиск у лівому шлуночку (ТЛШ) максимально знижується (у 2,2 рази) та по відношенню до вихідного рівня. Також неухильно знижується швидкість скорочення та розслаблення серцевого м`яза. Разом з цим, ішемія та наступна реперфузія призводять до суттєвого підвищення кінцево-діастолічного тиску (КДТ) у лівому шлуночку, що може свідчити про порушення процесу розслаблення та наявність контрактурних процесів у міокарді. Відразу після закінчення ішемії та відновленні перфузії серця спостерігались суттєві порушення серцевого ритму (до ішемії було 8 екстрасистол за хв., при реперфузії 24 екстрасистоли за хв.), тобто триразове збільшення кількості екстрасистол. Наведені результати вказують на те, що ішемія-реперфузія призводить до розвитку суттєвих порушень кардіодинаміки, скорочувальної активності міокарда та розвитку аритмій.

Модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран щ-3 ПНЖК тваринного та рослинного походження в деякій мірі попереджує вазоконстрикторний вплив ішемії-реперфузії на судини. Слід зазначити, що КДТ у І та ІІ групах зменшується вже на 5 хв, тоді як у контрольних умовах залишається підвищеним. Відсутність зменшення ТЛШ під час реперфузії в І групі може бути ще одним свідченням на користь кращого функціонального стану серця. У групі ІІ (щ-3 ПНЖК рослинного походження) ТЛШ збільшується вже на 15 хв. та на 40 хв. реперфузії є на 60% (Р<0,05) вищим, ніж у контролі. Слід зазначити, що при відновленні перфузії серця після ішемії кількість екстрасистол у групі І та ІІ була меншою у 5,4 та 3,7 рази (Р<0,05) порівняно з контролем. Внаслідок попереднього застосування щ-3 ПНЖК подовжувався час до повної зупинки серця під час ішемії та зменшувався час до відновлення повноцінних скорочень з початком реперфузії порівняно з контролем.

Таким чином, можна стверджувати, що щ-3 ПНЖК виявляють кардіопротекторну дію, яка проявляється у антиаритмічному ефекті, зменшенні ішемічно-реперфузійних порушень роботи ізольованого серця. Встановлено, що щ-3 ПНЖК рослинного походження практично не поступаються у цьому відношенні тваринним.

Зміни ультраструктури міокарда за умов ішемії-реперфузії ізольованого серця та гострого іммобілізаційного стресу при застосуванні омега-3 ПНЖК. Електронномікроскопічні дослідження міокарда показали, що ішемія та наступна реперфузія ізольованого серця щура призводить до незворотних ультраструктурних змін характерних для розвитку некрозу, основними з яких є порушення цілісності сарколеми, про що свідчить наявність колоїдного лантану (електронного трейсера) в клітині, контрактури та лізис міофіламентів, деструкція внутрішніх мітохондріальних мембран. Слід зазначити, що попередня модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран за умов ішемії-реперфузії призводила до зміни співвідношення кількості зворотно та незворотно пошкоджених кардіоміоцитів. Ультраструктурні дослідження показали зменшення, у порівнянні з групою контрольних експериментів (ішемія-реперфузія), кількості клітин з ознаками незворотного пошкодження, а саме з порушенням цілісності сарколеми та контрактурами. Основною відмінністю ультраструктури міокарда групи тварин з щ-3 ПНЖК було те, що більшість кардіоміоцитів містили мітохондрії з практично непошкодженим матриксом, які часто розміщувалися групами, локалізованими в різних частинах клітин, утворюючи велику кількість міжмітохондріальних контактів.

Нами також вперше вивчена можливість корекції негативних впливів іммобілізаційного стресу на серце за допомогою щ-3 ПНЖК. Як свідчать результати електронномікроскопічних досліджень гострий іммобілізаційний стрес призводить до вогнищевих ультраструктурних змін в серці щурів, в різній мірі виражених, в окремих ділянках міокарду. Відсутність або значне зменшення глікогену в кардіоміоцитах, набряк та деструкція мітохондрій, субсарколемальний та перинуклеарний набряк, в окремих клітинах наявність контрактур або втрата міофіламентами характерної посмугованості та накопичення лантану можуть свідчити про порушення мікроциркуляції та, як наслідок, розвитку в окремих ділянках міокарду ішемічного пошкодження.

Нами вперше показано, що модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран в значній мірі попереджувала виникнення деструктивних змін у кардіоміоцитах за умов гострого іммобілізаційного стресу. Так, в міокарді тварин, при попередньому застосуванні щ-3 ПНЖК в більшості кардіоміоцитів зберігалася внутрішньоклітинна архітектоніка, були відсутні контрактури міофіламентів, мітохондрії зберігали структуру та взаємну орієнтацію, не відмічалася втрата глікогену. Слід зазначити відсутність лантану в клітинах, що свідчило про збереження цілісності сарколеми.

Таким чином, морфологічні дослідження показали, що за умов ішемії-реперфузії ізольованого серця кардіопротекторна дія щ-3 ПНЖК проявляється в збереженні ультраструктури кардіоміоцитів, а саме - в попередженні порушень цілісності сарколеми, ймовірно в результаті зменшення руйнування її фосфоліпідного шару, та в збереженні структури мітохондрій, що відіграє значну позитивну роль на етапі реперфузії і дозволяє уникнути загибелі кардіоміоцитів у результаті реоксигенації ішемізованого міокарда. Доведено, що модифікація жирнокислотного складу мембран кардіоміоцитів також в значній мірі запобігає розвитку ультраструктурних змін міокарда при гострому іммобілізаційному стресі.

Дослідження можливих механізмів кардіопротекторної дії - 3 ПНЖК.

Метаболізм АК за умов ішемії-реперфузії та його зміни на фоні - 3 ПНЖК. Проведені нами дослідження показали, що зменшення вмісту АК супроводжується суттєвим зниженням утворення її активних метаболітів - LTC₄ та ТxВ₂ у тканині міокарда. Відомо, що метаболіти АК активують агрегацію тромбоцитів та мають вазоконстрикторну дію (Колчин Ю.Н. и др., 1990; Мойбенко А.А. и др., 1991; Lands W.E. et al., 2001). Отримані нами дані свідчать, що у гомогенатах тканини міокарда із застосуванням щ-3 ПНЖК вміст ТxВ₂ та LTC₄ зменшувався у порівнянні з контролем. При відтворенні ішемії - реперфузіі ізольованого серця щура вміст метаболітів АК зростає. Попереднє застосування щ-3 ПНЖК та відтворення ішемії-реперфузії призводило до зниження вмісту ТхВ₂ як у І, так і у ІІ групах порівняно до групи “ішемія-реперфузія”. Аналогічно, зафіксовано зменшення ЛТС₄ у І та ІІ групах у 8,5 та 3,0 рази - відповідно.

На підставі отриманих даних, можна стверджувати, що при модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран разом із зменшенням вмісту АК в мембранах реєструється значне зниження утворення її біоактивних похідних - ЛТС₄ та ТхВ₂ у нормі та особливо при ішемії-реперфузії, що може попереджувати коронароконстрикторні реакції та порушення скоротливості міокарда при реперфузії.

Стан перекисних процесів за умов гострого іммобілізаційного стресу та ішемічно-реперфузійного пошкодження при змінах жирнокислотного складу клітинних мембран. Активація вільнорадикальних процесів та ПОЛ є одним з основних механізмів ушкодження серця за умов ішемії-реперфузії (Halliwell B., 1993; Ланкин В.З., 2000). Отримані нами дані біохімічних досліджень підтвердили, що ішемія та наступна реперфузія призводять до активації вільнорадикальних процесів. Так, загальна світлосума ХЛ за 5 хв реєстрації збільшувалась в 3,9 рази (Р<0,05) порівняно з контролем .

В наших експериментах встановлено, що застосування -3 ПНЖК пригнічує розвиток вільнорадикальних процесів у ішемізованому міокарді. Нова субстанція рослинного походження достовірно знижує інтенсивність ХЛ на 83,6 % (Р<0,05) за умов ішемії-реперфузії та не поступається дії -3 ПНЖК тваринного походження. Також слід зазначити, що модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран сприяє зменшенню вмісту МДА у гомогенаті тканини міокарда за умов ішемії-реперфузії.

Якщо за умов ішемії-реперфузії спостерігається зниження активності СОД (на 48,29 %, (Р<0,05)), то у групах із застосуванням щ-3 ПНЖК активність цього ферменту зберігається. Отримані нами дані підтверджують припущення про зменшення утворення вільних радикалів та вмісту вторинних продуктів ПОЛ при модифікації жирнокислотного складу мембран клітин міокарда та про збереження активності ферментів антиоксидантного захисту.

Нами також вперше було показано, що попередня модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран значно зменшує активність вільнорадикальних процесів при стресі. За умов гострого іммобілізаційного стресу у гомогенатах тканини міокарда загальна світлосума ХЛ збільшувалася у 2,9 рази (Р0,05) порівняно з контролем. Так, загальна світлосума ХЛ у І групі була меншою на 25,1%, а у ІІ групі на 53,7% (Р0,05) відносно цього ж показника групи зі стресом. Слід зазначити, що субстанція рослинного походження діяла більш ефективно. Нами виявлено, що попереднє застосування -3 ПНЖК за умов гострого стресорного пошкодження сприяє збереженню активності СОД. Наведені результати свідчать, що як при ішемії-реперфузії, так за умов гострого

іммобілізаційного стресу -3 ПНЖК зменшують продукцію вільних радикалів та підвищують активність ферментів антиоксидантної системи, що свідчить про зменшення окиснювального стресу.

Таким чином, отримані результати свідчать, що зміна жирнокислотного складу клітинних мембран за допомогою щ-3 ПНЖК може позитивно впливати на стійкість мембран до перекисних процесів при ішемічно-реперфузійному пошкодженні та за умов гострого іммобілізаційного стресу за рахунок пригнічення вільнорадикальних процесів та посилення ферментної ланки антиоксидантного захисту.

Система оксиду азоту за умов ішемії-реперфузії та гострого іммобілізаційного стресу при попередньому застосуванні омега -3 ПНЖК. Відомо, що зміни в системі NO можуть відігравати значну роль у розвитку патологічних процесів у серці, що залежить від кількості продукованого NO та умов реалізації його ефектів (Hunley T.E. et al., 1995; Jugdutt B.I. et al., 2002). Отримані нами дані біохімічних досліджень свідчать, що активність конститутивної NOS в гомогенатах сердець після ішемії-реперфузії знижувалась на 76,4 % (Р<0,05), тоді як на фоні -3 ПНЖК була вищою на 166,7 % (Р<0,05) порівняно з групою “ішемія-реперфузія”. Активність іNOS в гомогенатах тканини міокарда після ішемії-реперфузії збільшувалась на 132 % (Р<0,05) відносно даних отриманих у контролі. Попереднє застосування -3 ПНЖК при ішемії-реперфузії призводило до зниження активності іNOS на 37 % (Р<0,05) порівняно з групою “ішемія-реперфузія”. Нами також показано збільшення вмісту NO₃^- (стабільного метаболіту NO) на 43,8%, Р0,05 в тканинах серця з попередньою модифікацією мембран в порівнянні з групою “ішемія-реперфузія” Ролі стресорних факторів у патогенезі пошкодження серця та судин завжди приділяється велика увага, але як впливає модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран в умовах дії стресорних факторів на систему оксиду азоту досі не було відомо. Нами вперше показано, що в серцях тварин з попередньою модифікацією клітинних мембран після гострого іммобілізаційного стресу активність сNOS підвищується, а активність iNOS пригнічується на відміну від того, що відбувається у контролі.

Нами встановлено, що в умовах застосування субстанції рослинного походження активність iNOS пригнічується більш значно, ніж при використанні субстанції тваринного походження. З нашої точки зору, важливим фактором, що визначає кардіопротекторні властивості -3 ПНЖК є їх можливість підвищувати активність сNOS та вміст NO саме в примембранній зоні клітин серця. В той же час нами показано, що активність iNOS, яка збільшувалась при пошкодженні міокарда, зменшувалась при модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран серця.

Адренергічна реактивність серця та судин при змінах жирнокислотного складу клітинних мембран. Одним з важливих механізмів кардіопротекції слід вважати зменшення адренергічних впливів на серце при патологічних станах (Esler M. et al, 1998; Марков Х.М., 2004, Hasegawa T. et al., 2005). При дослідженні адренергічних реакцій на ізольованих кільцях аорти показано послаблення реактивності судин на дію вазоконстриктора (НА) в групі тварин, які отримували щ-3 ПНЖК, в порівнянні з контрольною групою, де реакція судин була більшою. Реакція судин з модифікованими мембранами при застосуванні НА у зростаючих концентраціях зменшувалась дозозалежно порівняно з контролем. Отримані нами дані свідчать про дозозалежне зниження реактивності судин на дію вазоконстриктора після модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран за допомогою щ-3 ПНЖК.

Нами вперше показано, що застосування -3 ПНЖК зменшує реактивність ізольованого серця при адренергічній стимуляції. Інтенсивність інотропних реакцій сердець з попередньою модифікацією мембран на НА у зростаючих концентраціях зменшувалась дозозалежно порівняно з контролем З`ясовано, що застосування -3 ПНЖК знижує адренергічну реактивність серця та судин як за фізіологічних умов, так і за умов гострого іммобілізаційного стресу. Наведені результати вказують на те, що -3 ПНЖК можуть впливати на регуляцію реакцій серця при адренергічній стимуляції, зменшуючи ці реакції, як на екзогенні, так і, ймовірно, на ендогенні катехоламіни, що може бути наслідком модифікації жирнокислотного складу мембран клітин серця.

Таким чином, можна констатувати, що попередня модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран шляхом включення до дієти щурів ненасичених жирних кислот типу омега-3 призводить до посилення стійкості серця до патологічних впливів (ішемія-реперфузія та стрес). Цей кардіопротекторний ефект проявляється як покращення функціональних показників діяльності серця при його ішемії та реперфузії (значно менші порушення скоротливості міокарда, коронарного кровообігу та ритму) так і зменшенням ультраструктурних змін міокарда. Вперше показано, що модифікація мембран за допомогою щ-3 ПНЖК захищає серце при гострому іммобілізаційному стресі. На відміну від ряду робіт закордонних та вітчизняних авторів (Амосова К.М. та ін., 2000; Marchioli R. еt al., 2005; Breslow J.L. еt al. 2006) доведено, що не тільки -3 ПНЖК тваринного походження, а й -3 ПНЖК рослинного походження спроможні модифікувати клітинні мембрани та таким чином захищати серце від пошкоджуючих впливів. Нами отримані чіткі дані щодо суперечливого питання (Song J.Y. еt al., 2000; Higgins S. еt al., 2001; Yuan Y.V. еt al., 2003) про вплив -3 ПНЖК на вільнорадикальні процеси в організмі, і в наших дослідах продукція вільних радикалів кисню у тварин з модифікованими клітинними мембранами при розвитку патологічних процесів постійно була зменшеною, а активність антиоксидантних ферментів постійно була збільшеною порівняно з результатами контрольних дослідів (без модифікації мембран). Це може являти собою один із важливих механізмів захисту серця в патологічних умовах. Іншими механізмами захисту серця слід вважати зменшення утворення та інтенсивності метаболізму АК та продукції її потенційно патогенних метаболітів: лейкотриєнів та тромбоксанів; зменшення адренергічних реакцій серця та посилення порівняно з контрольними дослідами активності системи сNOS і вірогідно продукції NO ендотеліального походження. Як вперше показано нами в системі оксиду азоту при розвитку патологічних процесів у тварин з модифікованими клітинними мембранами порівняно з контрольними тваринами відбуваються зміни, які можна трактувати як позитивні - різноспрямовані зміни активності сNOS (збільшення) та іNOS (зменшення). Збільшення активності сNOS (вірогідно еNOS) може бути наслідком стабілізації мембранних структур (а саме кавеол), та зменшення негативного впливу АК на активність кавеолярної еNOS (Jugdutt B.I. еt al., 2002; Ander B. P. еt al., 2003).

Висновки

1. Вперше досліджено вплив нової вітчизняної субстанції щ-3 ПНЖК рослинного походження на функції та реакції серця та судин в нормальних та патологічних умовах порівняно з впливом щ-3 ПНЖК тваринного походження, що дозволило виявити її кардіопротекторний вплив при ішемії-реперфузії міокарда та гострому іммобілізаційному стресі та обгрунтувати можливість їх використання в клініці.

2. Застосування щ-3 ПНЖК тваринного походження та, як вперше показано, нової субстанції -3 ПНЖК рослинного походження протягом 4 тижнів призводить до зміни жирнокислотного складу клітинних мембран, що виявляється зменшенням у них вмісту ПНЖК з сімейства -6 та збільшення вмісту ПНЖК з сімейства -3. Вперше показано, що модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран за допомогою -3 ПНЖК рослинного походження вітчизняного виробництва більш ефективно зменшує вміст арахідонової кислоти в жирнокислотному складі клітинних мембран.

3. Модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран за допомогою -3 ПНЖК рослинного походження, зменшує ішемічні та реперфузійні порушення роботи ізольованого серця, попереджує розвиток коронароконстрикції в реперфузійний період та проявляє виражений антиаритмічний ефект.

4. Вперше показано, що модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран міокарда з заміщенням щ-6 ПНЖК на щ-3 ПНЖК в значній мірі попереджує порушення діяльності серця та ультраструктури міокарда при іммобілізаційному стресі.

5. Механізмами протекторних ефектів -3 ПНЖК рослинного та тваринного походження слід вважати: пригнічення вільнорадикальних реакцій та підвищення активності ферментів антиоксидантної системи; мембраностабілізуючу дію омега-3 ПНЖК - зниження утворення продукції арахідонової кислоти та її біоактивних, потенційно патогенних похідних - лейкотриєну С₄ та тромбоксану В₂ у вихідному стані та особливо при ішемії-реперфузії міокарда; збільшення активності сNOS та зменшення активності іNOS, а також збільшення вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту в серці при ішемії-реперфузії міокарда; зменшення реактивності серця та судин до адренергічних впливів.

6. Вперше показано різноспрямовані зміни активності сNOS та іNOS, а також обернену залежність між змінами вмісту арахідонової кислоти та активності сNOS при ішемії-реперфузії міокарда на фоні модифікації жирнокислотного складу мембран клітин серця за допомогою -3 ПНЖК.

7. Результати проведених нами досліджень свідчать про перспективність застосування метода модифікації жирнокислотного складу мембран за допомогою -3 ПНЖК як тваринного, так і, як показано нами, рослинного походження для профілактики та лікування ішемічних та стресорних ушкоджень міокарда.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кукоба Т.В., Кириленко О.Є., Шиш А.М., Мойбенко О.О., Коцюруба А.В., Харченко О.В., Петренко О.Є. Вплив модифікації жирнокислотного складу мембран фосфоліпідів на функціональний стан ізольованого серця при гострій ішемії - реперфузії міокарда // Фізіол. журн. - 2003. - Т. 49, № 5. - С. 63-71.

2. Шиш А.М., Кукоба Т. В., Харченко О. В. Модифікація жирнокислотного складу мембран фосфоліпідів клітин омега-3 поліненасиченими жирними кислотами // Доп. НАНУ - 2004. - № 11. - С. 184-188.

3. Шиш А.М., Пивовар С.М., Кукоба Т.В., Коцюруба А.В., Мойбенко О.О. Вплив модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран на адренергічну реактивність серця та судин // Фізіол. журн. - 2004. - Т. 50, № 6. - с. 19-26.

4. Шиш А.М., Кукоба Т.В., Тумановська Л.В., Мойбенко О.О. Вплив модифікації фосфоліпідного складу мембран на реактивність серця до дії стресорних факторів // Клін. та екперим. патологія. - 2004. - Т. 3, № 2, ч.1. - С. 53-55.

5. Шиш А.М., Кукоба Т.В., Тумановська Л.В., Мойбенко О.О. Модифікація жирнокислотного складу мембран як фактор захисту міокарда при стресорному пошкодженні серця // Фізіол. журн. - 2005. - Т. 51, № 2. - С. 17-23.

6. Кукоба Т.В., Шиш А.М., Мойбенко О.О., Коцюруба А.В., Харченко О.В. Вплив омега-3 поліненасичених жирних кислот на перекисне окиснення ліпідів // Фізіол. журн. - 2005. - Т. 51, № 1. - С. 26-32.

7. Кукоба Т.В., Шиш А.М., Мойбенко О.О., Коцюруба А.В., Харченко О.В. Вплив б-ліноленової кислоти на діяльність ізольованого серця щура при гострій ішемії-реперфузії міокарда // Фізіол. журн. - 2006. - Т.52, №5. - С.12 - 20.

8. Kyrylenko O., Kukoba T., Shysh A., Moybenko O. Effects of dietary polyunsaturated fatty acids on the isolated heart functioning // Journal Coronary Artery Disease. - 2003. - Vol. 5, №1. - Р. 117-118.

9. Шиш А.М. Влияние модификации фосфолипидного состава мембран на резистентность изолированного сердца к адренергическим воздействиям // Третья Всероссийская с международным участием школа-конференция по физиологии кровообращения. Москва (Россия). - 2004.- С. 18-79.

10. Shysh A.M., Kukoba T.V., Moуbenko O.O. Influence of membrane composition modification on isolated heart reactivity to adrenergic actions // Workshop in cardiovascular physiology “Signal transduction in cardio-vascular system”. Warsaw (Poland). - Р. 95.

11. Moybenko O., Kukoba T., Shysh A. & Kharchenko O. Cardioprotective effect of omega-3 polyunsaturated fatty acids // J. Mol. Cell. Cardiol. - 2004. - Vol.36, issue 5. - Р. 141.

12. Шиш А.М., Кукоба Т.В. Влияние модификации фосфолипидного состава мембран миокарда на регуляторные реакции сердца и синтез NO // Всероссийская конференция молодых исследователей “Физиология и медицина”. Сборник материалов. Санкт-Петербург (Россия). - 2005. - С. 140.

13. Шиш А.М., Кукоба Т. В., Мойбенко О.О. Дослідження механізмів протекторного впливу омега-3 поліненасичених жирних кислот на регуляторні та стресорні реакції серця // Тези доповідей конференції: “Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія і клініка”. Одеса. - 2005. - С. 217-220.

14. Шиш А.М., Кукоба Т.В. Исследование механизмов протекторного влияния щ-3 полиненасыщенных жирных кислот на регуляторные и стрессорные реакции сердца // 9-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сборник тезисов. Пущино (Россия). - 2005. - С. 177.

15. Shysh A.M., Kukoba T.V., Moybenko O.O. Influence of n-3 fatty acids on isolated heart reactivity to adrenergic actions // Acta Physiologica. - 2006. - Vol. 186, suppl. 1. - P. 229.