Участь протеїназ та системи полі-АДФ-рибозилювання у радіаційно-індукованому апоптозі клітин тимуса та селезінки щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 577.+612.438.014.481+612.438.014.46

УЧАСТЬ ПРОТЕЇНАЗ ТА СИСТЕМИ ПОЛІ-АДФ-РИБОЗИЛЮВАННЯ У РАДІАЦІЙНО-ІНДУКОВАНОМУ АПОПТОЗІ КЛІТИН ТИМУСА ТА СЕЛЕЗІНКИ ЩУРІВ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ДРАГАН ЛЮДМИЛА ПЕТРІВНА

КИЇВ-2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у лабораторії фізико-хімічної біології кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник:доктор біологічних наук, професор Цудзевич Борис Олександрович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, старший науковий співробітник лабораторії фізико-хімічної біології біологічного факультету

Офіційні опо0ненти: доктор біологічних наук, професор Великий Микола Миколайович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, провідний науковий співробітник відділу біохімії коферментів;

доктор біологічних наук, професор Серкіз Ярослав Іванович, Інститут ядерних досліджень НАН України, провідний науковий співробітник відділу структури ядра.

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться 26.03.2007 року о 13-30_годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 22 лютого 2007 року.

Вчений секретар радіаційний рибозилювання селезінка щур

спеціалізованої вченої ради Андрійчук Т.Р.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження біохімічних механізмів розвитку апоптозу є актуальною проблемою сучасної біохімії. Така форма загибелі може індукуватися не лише за фізіологічних умов, а й під впливом чинників різної природи, включаючи іонізуюче випромінення. Індукція апоптозу залежить від багатьох факторів, таких як метаболічна активність клітин, стадія диференціювання, рівень і тривалість дії апоптогенного (ендо- чи екзогенного) чинника. Певною мірою все це обумовлює велику варіабельність залучення внутрішньоклітинних регуляторів біохімічних процесів.

Згідно з сучасними уявленнями апоптоз лімфоїдних клітин при променевому ураженні пов'язаний насамперед з порушенням структурної цілісності хроматину (Кучеренко М.Є., Цудзевич Б.О., 2006, Kerr J.F. et al., 1994). Пошкодження ДНК призводить до порушення активації шляхів трансдукції сигналу, які залучені до стресорної відповіді - затримки клітинного циклу, репараційних процесів та апоптозу.

На сьогодні постулюється, що сенсором пошкоджень ДНК є полі-(АДФ-рибозо)-полімераза, яка стимулює клітинну відповідь в цілому на дію генотоксичних агентів. Остання включає в себе запуск каскаду протеолітичних реакцій, у результаті яких відбувається розщеплення різноманітних клітинних білків, що врешті - решт призводить до порушення нормального функціонування клітини, її дезінтеграції та загибелі. При радіаційно-індукованих процесах вирішальна роль належить численній родині каспаз, активація яких призводить до протеолізу життєвоважливих білків клітини.

Особливо актуальними у сучасній радіаційній біохімії залишаються дослідження механізмів дії апоптичних чинників та пошук шляхів нормалізації біохімічних змін в організмі опромінених тварин. В цьому сенсі заслуговує на увагу рибонуклеозид гіпоксантину - інозин (рибоксин), як ефектор перебігу енергетичних та синтетичних реакцій у клітинах, зокрема, біосинтезу нуклеотидів та коферментів за променевого ураження організму (Lewandowski E.D. et al., 1991, Легеза В.И. и др., 1993, Jurkowitz M.S. et al., 1998).

Дослідження типових змін і особливостей структурних, метаболічних та функціональних порушень у високорадіочутливих клітинах тимуса і селезінки за дії іонізуючої радіації надасть можливість більш коректного тлумачення природи багатьох захворювань та відкрити нові перспективні підходи для ефективного регулювання імунодефіцитних станів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та виконана у рамках теми № 01 БФ 036-04 “Розробка наукових основ пошуку біологічно-активних сполук радіозахисної дії” (№ д / р 0101U002291).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідити участь протеїназ та системи полі-АДФ-рибозилювання у радіаційно-індукованому апоптозі лімфоїдних клітин тимуса і селезінки щурів, а також можливість корекції радіогенних змін за допомогою препарату рибоксину. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

Дослідити структурний стан ДНК за дії іонізуючої радіації та на фоні введення рибоксину.

Визначити активність ендогенних протеїназ за дії іонізуючої радіації.

Визначити активність катепсину В за дії іонізуючої радіації та на фоні ведення рибоксину.

Дослідити активність каспази-3 за дії іонізуючої радіації.

Визначити полі-(АДФ-рибозо)-полімеразну активність у лімфоцитах тимуса і селезінки щурів за дії іонізуючої радіації та на фоні введення рибоксину.

Дослідити вміст НАД і АТФ у тимусі та селезінці щурів за дії променевого чинника та на фоні введення рибоксину.

Оцінити рівень одно- та дволанцюгових розривів ДНК і визначити Са²⁺, Mg^{2+ _} залежну ендонуклеазну активність у лімфоїдних клітинах тимуса та селезінки щурів за дії іонізуючої радіації.

Об'єкт дослідження -біохімічні механізми радіаційно-індукованого апоптозу лімфоїдних клітин тимуса та селезінки щурів.

Предмет дослідження - структурний стан ДНК, ферментативна активність ендогенних протеїназ, катепсину В, каспази-3, полі-(АДФ-рибозо)-полімерази, вміст НАД і АТФ за дії іонізуючої радіації та на фоні введення рибоксину.

Методи дослідження - люмінесцентна мікроскопія (оцінка структурного стану ядерних нуклеїнових кислот), спектрофотометричні (визначення активності катепсину В, каспази-3, вмісту НАД), флуориметричні (визначення активності ендогенних протеїназ, Са²⁺, Mg²⁺-залежної ендонуклеазної активності, рівня одно- та дволанцюгових розривів ДНК), хемілюмінесцентний (визначення вмісту АТФ), радіоізотопний (визначення активності полі-(АДФ-рибозо)-полімерази) та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше проведено комплексне дослідження каскаду взаємопов'язаних біохімічних реакцій за радіаційно-індукованого апоптозу лімфоїдних клітин тимуса та селезінки щурів. Встановлено, що на початкових етапах за дії опромінення підвищується активність ендогенних протеїназ, лізосомальних катепсинів, а також цистеїнових протеїназ родини каспаз, зокрема каспази - 3, у лімфоцитах тимуса та селезінки щурів. За дії іонізуючої радіації відбуваються зміни активності полі-(АДФ-рибозо)-полімерази (ПАРП).

Так, на ранніх етапах після дії рентгенівського випромінення в дозах 1,0 Гр та 7,78 Гр, як правило, підвищується активність цистеїнових протеїназ, а активність полі-(АДФ-рибозо)-полімерази пригнічується. Паралельно з цим встановлено зниження вмісту НАД та АТФ у клітинах досліджуваних органів. Більш помітні зміни цих показників відбуваються після опромінення у летальній дозі. Одночасно підвищується активність Са²⁺, Мg²⁺- залежної ендонуклеази, зростає кількість одно- та дволанцюгових розривів ДНК, що є характерною ознакою пізньої стадії апоптозу і призводить до клітинної загибелі. Введення препарату рибоксину до опромінення тварин сприяє нормалізації досліджуваних показників.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати доповнюють і поглиблюють існуючі уявлення щодо біохімічних механізмів післярадіаційного розвитку процесів апоптозу у лімфоїдних клітинах тимуса і селезінки щурів, а також протирадіаційних ефектів препарату рибоксину. Викладені у роботі основні положення можуть бути рекомендовані до включення у навчальні програми вузів, де викладаються курси “Радіобіологія”, “Радіаційна медицина”, “Радіаційна біохімія” тощо.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто здійснено інформаційний пошук, аналіз та оцінку наукової літератури за темою дисертаційної роботи, виконані експериментальні дослідження. Планування досліджень та вибір методичних підходів для виконання комплексу лабораторних досліджень, аналіз і обгрунтування отриманих результатів було проведено спільно із науковим керівником та співробітниками лабораторії фізико-хімічної біології кафедри біохімії.

Апробація результатів роботи. Основні результати дисертаційної роботи були представлені на: ІІІ з'їзді з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія) (Київ, 2003), Міжнародній конференції ”Радіобіологічні ефекти : ризики, мінімізація, прогноз” (Київ, 2005), 6-ой международной междисциплинарной научно-практической конференции “Современные проблемы науки и образования” (Харьков, 2005), V съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2006), The 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society (Kyiv, 2006), ІХ Українському біохімічному з'їзді ( Харків, 2006).

Публікація матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті у фахових журналах та 7 тез доповідей у матеріалах вітчизняних і міжнародних з'їздів та конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів та їх обговорення, заключення, висновків, списку використаних джерел, що включає 216 посилань. Робота викладена на 133 сторінках друкованого тексту, ілюстрована 22 рисунками та 3 таблицями.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Досліди проводили на білих нелінійних щурах-самцях масою 150_170 г. Опромінення здійснювали на рентгенівській установці РУМ_17 в дозах 1,0 Гр та 7,78 Гр за умов: фільтри 0,5 мм Си та 1 мм Аl, шкірно-фокусна відстань 50 см, напруга 200 кВ, сила струму 5 мА для 1,0 Гр і 10 мА для 7,78 Гр, потужність експозиційної дози складала 7,3110^-5А/кг та 14,62 10^-5А/кг відповідно. Препарат рибоксин у вигляді 2%-ного розчину вводили за 15 хв до опромінення внутрішньочеревинно з розрахунку 150 мг препарату на 1 кг маси тварини. Тварин декапітували через 30 хвилин та 3 години після дії іонізуючої радіації. Лімфоцити тимуса виділяли за методом (Хант С, 1990). Лімфоцити селезінки отримували шляхом центрифугування клітинної суспензії на градієнті щільності Ficoll-Paque (густина 1,077 г/см³) згідно з (Boyum А., 1968). Життєздатність клітин оцінювали з використанням вітального барвника трипанового синього (Клаус Дж., 1990). Оцінку структурного стану ядерних нуклеїнових кислот проводили з використанням барвника акридинового оранжевого згідно з методом Бріта І.С. (Бріт І.С.,2003). Одержані зразки аналізували під люмінесцентним мікроскопом з подальшою двохвильовою послідовною фотометрією кольорових зображень. Дослідження ферментативної активності полі-(АДФ-рибозо)-полімерази проводили в пермеабілізованих 0,008% дигітоніном клітинах відповідно до методу (Чорна В.І., 2001). Активність ферменту визначали за включенням 8-¹⁴С-НАД в ядерні білкові субстрати. Кислотонерозчинні осади наносили на нітроцелюлозні фільтри та проводили вимірювання радіоактивності проб за допомогою рідинно-сцинтиляційного лічильника “Бета”. Вміст НАД у хлоратних екстрактах тимуса та селезінки визначали спектрофотометрично за відновленням останнього у присутності ферменту алкогольдегідрогенази. Дослідження вмісту АТФ проводили з використанням “1243-102 АТР Monitoring Kit” (“Sigma” США). Активність ендогенних протеїназ досліджували з використанням субстрату казеїн-флуоресцеїнізотіоціанату (Walker P.R., 1997). Активність цистеїнової протеїнази - каспази-3, визначали за допомогою “Caspase Colorimetric Protease Assay Sampler Kit” (BioSourse, США) та виражали в нмолях п-нітроаніліну, відщепленого від DEVD-p-NA. Визначення ферментативної активності катепсину В проводили згідно з рекомендаціями (Wang G.H., 1997) за накопиченням п_нітроаніліну, відщепленого від синтетичного субстрату б-бензоїл-L,D-аргінін-п-нітроаніліну (БАПНА). Рівень розривів ДНК оцінювали флуорометричним методом з використанням 3',5'_діамінобензойної кислоти (ДАБК)- дволанцюгові розриви реєстрували за умов лізису при рН 8,3, одноланцюгові розриви - при рН 12,4 (Дмитренко Н.П., 1997). Оцінку ступеня ендонуклеолізу хроматину здійснювали згідно з методом (Рябченко Н.И. и др., 1987) в умовах, оптимальних для прояву Са²⁺,Мg²⁺-залежної ендонуклеазної активності. Одержані експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Плохинский М.П., 1981; Кучеренко М.Є., 2001).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Аналіз структурного стану нуклеопротеїнового комплексу за дії іонізуючого випромінення та на фоні введення рибоксину, який проводили методом люмінесцентної мікроскопії, показав типові морфологічні ознаки радіаційно_індукованої інтерфазної загибелі лімфоїдних клітин тимуса та селезінки з утворенням гранул висококонденсованого хроматину та їх розміщенням поблизу ядерної мембрани.

За допомогою двохвильової фотометрії локальних ділянок люмінесцентних зображень лімфоїдних клітин тимуса та селезінки щурів та нової комп'ютерної програми обробки даних було встановлено зміни інтегрального показника ступеня упорядкованості ДНК (параметр =₆₄₀/І₅₃₀) за дії іонізуючого випромінення, що свідчить про структурні ушкодження хроматину.

На основі досліджень (Stoka V., 2001, Salvesen G.S., 2001) було запропоновано концепцію лізосомально-опосередкованої ланки апоптичної загибелі лімфоїдних клітин, згідно з якою порушення цілісності лізосом та вихід у цитозоль протеолітичних ферментів є раннім етапом деградаційного каскаду і передує активації таких маркерів апоптозу, як каспази та підвищенню проникності мембран мітохондрій.

На основі цієї концепції нами були запропоновані методичні підходи, які дали можливість експериментально підтвердити послідовність подій, що пов'язані з частковим виходом катепсинів з лізосом, особливо катепсину В, оскільки він є найбільш стійким з усіх протеїназ лізосом при

переході з кислого внутрішньолізосомального середовища у нейтральне середовище цитоплазми і відіграє провідну роль за апоптозу, індукованого чинниками різної природи.

Так, активність катепсину В у тимоцитах та спленоцитах щурів після рентгенівського випромінювання в дозах 1,0 Гр та 7,78 Гр значно підвищувалась порівняно з контролем (рис. 1).

За дії іонізуючої радіації на щурів, яким попередньо було введено рибоксин, активність катепсину В у лімфоцитах достовірно знижувалась порівняно з активністю ферменту в опромінених тваринах (виключення складає тільки рівень активності катепсину В у спленоцитах через 30 хвилин після опромінення щурів в дозі 7,78 Гр, він був статистично вищим за такий рівень ферментативної активності в опромінених тварин).

Модулюючий ефект рибоксину пов'язаний, на нашу думку, із здатністю рибоксину інгібувати процеси пероксидного окиснення ліпідів - один із механізмів, що обумовлює порушення цілісності мембран лізосом та здійснювати активуючий вплив на функціонування ендогенної антиоксидантної системи організму (Hara K., 1988, Bratton S.B., 2001).

Поряд з лізосомальними протеїназами, які залучені у реалізацію програмованої клітинної загибелі як на ініціюючій, так і ефекторній стадіях, значну роль відіграють цистеїнові протеїнази родини каспаз, які вважаються центральною ланкою апоптозу, індукованого різноманітними чинниками.

Важливість каспази -3 у протеолізі клітинних білків підкреслює той факт, що після її активації клітина необоротно втрачає здатність до виживання. Подібна значущість каспази -3 у регуляції апоптозу та інших клітинних функцій дали нам вагомі підстави до визначення її активності в умовах наших модельних досліджень.

Експериментальним шляхом було встановлено, що тотальне одноразове опромінення тварин в дозах 1,0 Гр та 7,78 Гр сприяє підвищенню активності каспази-3 у тимоцитах щурів, причому ця активація різна за величиною і залежить як від часу, так і від дози опромінення (рис. 2А).

На відміну від загальної картини підвищення активності каспази -3 у тимоцитах в умовах опромінення тварин у спленоцитах спостерігається дещо інша тенденція (рис. 2Б). В той час як через 30 хвилин за обох доз опромінення встановлено статистично вірогідне підвищення активності ферменту, через 3 години має місце значне зниження активності ефекторної каспази -3. Вважаємо, що різні за спрямованістю зміни активності каспази -3 в тимоцитах та спленоцитах опромінених за обох доз тварин вказують на певні відмінності у метаболічній відповіді цих лімфоїдних органів на дію променевого чинника. Отже, виявлені закономірності зміни активності ефекторної каспази-3 свідчать про важливість цього ферменту як медіатора апоптичної загибелі у клітинах імунної системи.

Оскільки одним з функціонально значущих субстратів каспази-3 є фермент полі-(АДФ-рибозо)-полімераза, який займає вагоме місце у процесі радіаційно-індукованої загибелі імунокомпетентних клітин і, зважуючи на те, що саме каспазо-опосередкована деградація ПАРП є маркером апоптичної загибелі, нами було досліджено активність даного ферменту за дії іонізуючої радіації.

Згідно з одержаними результатами, за дії іонізуючої радіації відбуваються значні зміни активності полі-(АДФ-рибозо)-полімерази, причому характер показників у лімфоїдних клітинах тимуса та селезінки різний (рис.3 ). Так, встановлено пригнічення ферментативної активності ПАРП у тимоцитах щурів через 30 хв і через 3 години після опромінення щурів у дозах 1,0 Гр та 7,78 Гр порівняно з контрольними значеннями (рис.3.І)

При співставленні результатів, отриманих при визначенні активності ПАРП в спленоцитах щурів через 30 хвилин та 3 години (рис. 3.ІІ), виявляється аналогічність змін при опроміненні тварин в дозі 7,78 Гр - пригнічення ПАРП у згаданих інтервалах часу, а за дози 1,0 Гр через 30 хвилин після дії променевого чинника спостерігається активація ферменту.

Що стосується впливу рибоксину на активність ПАРП в тимоцитах і спленоцитах щурів, то насамперед треба відмітити, що активність цього ферменту у спленоцитах опромінених тварин на фоні введеного препарату зазнає закономірних корегуючих змін.

Аналізуючи дані в цілому по вивченню активності ПАРП в лімфоїдних клітинах опромінених щурів, можна констатувати, що найбільш вірогідними причинами варіабельності поведінки ферменту в спленоцитах, з одного боку, і тимоцитах - з іншого, є специфічна внутрішньоклітинна реакція на дію променевого чинника за рахунок залучення різних механізмів трансдукції апоптичного сигналу. При цьому можливо, що на ранніх етапах (30 хвилин після дії променевого чинника) має місце фрагментація ПАРП за рахунок активації різних представників родини ефекторних каспаз (Virag L. et аl., 2001).

Оскільки при АДФ-рибозилюванні білків донором АДФ-рибози є НАД, то слід було очікувати, що в наших умовах, коли активність ПАРП пригнічена, вміст НАД в клітинах повинен зростати. Але, як показали наші дослідження (таблиця 1), вміст НАД в тимоцитах та спленоцитах опромінених тварин, порівняно з контрольними значеннями, знижений. На нашу думку, цей факт частково можна пояснити активацією синтезу циклічної-АДФ-рибози, ацетил-АДФ-рибози, які є потенційними проапоптичними агентами.

Таблиця 1 Вміст НАД у лімфоїдних органах щурів за дії іонізуючої радіації (Мm, n=5)

*- достовірно у відношенні до контролю, **- достовірно у відношенні до контролю на фоні введення рибоксину, # - достовірно у відношенні до відповідних опромінених груп, Р 0,05

Механізм дії рибоксину можна пояснити із урахуванням тісного зв'язку обміну пуринів, до яких належить і інозин, з метаболізмом НАД. Причому, незалежно від дози опромінення та часу після дії іонізуючої радіації, рибоксин сприяє підвищенню рівня НАД в клітинах порівняно з таким, що має місце при опроміненні тварин, або створює умови для стабілізації рівня НАД.

Для кращого розуміння біохімічних механізмів радіаційно _ індукованого порушення функціонування лімфоцитів важливо дослідити вміст АТФ у лімфоїдних органах щурів. Внутрішньоклітинний вміст АТФ у радіочутливих органах тварин на ранніх етапах розвитку променевого ефекту може зменшуватись за рахунок посилення реакцій деградації пуринових нуклеотидів. Також післяпроменеве зниження пулу макроергу пов'язують з радіаційним порушенням біосинтезу пуринів (Chen C.F., 2001). Оскільки рівень АТФ може контролювати проходження апоптозу як за рахунок активного транспорту до ядра мітохондріальних проапоптичних чинників, так і за активації ініціаторної каспази-9, що розщеплює прокаспазу-3, метою наступного етапу роботи було вивчити вплив іонізуючої радіації на вміст аденозинтрифосфату у тимусі та селезінці опромінених тварин.

При визначенні внутрішньоклітинного рівня АТФ в лімфоїдних клітинах щурів за дії іонізуючої радіації було встановлено дозозалежне його зниження, що є логічним в умовах радіаційного ураження (рис. 4).

Слід зазначити, що реалізація протипроменевого ефекту рибоксину спрямована на нормалізацію рівня АТФ в тимоцитах та спленоцитах щурів, що пояснюється активним включенням цього природного пуринового метаболіту до анаболічної ланки обмінних процесів.

Отже, в умовах нашого досліду виявлено, що після дії променевого чинника вміст АТФ зберігається на рівні, достатньому як для запуску, так і для здійснення ефекторної стадії радіаційно-індукованого апоптозу, чому, можливо, сприяє саме каспазо-опосередкована деградація ПАРП.

Оскільки на сьогодні вважається, що ПАРП є одним з перших факторів, який розпізнає пошкодження у молекулі ДНК і бере безпосередню участь у функціонуванні системи ексцизійної репарації, було доцільно дослідити рівень одно- та дволанцюгових розривів ДНК за дії променевого чинника та на фоні введення рибоксину.

В наших дослідженнях показано, що іонізуюча радіація в дозах 1,0 Гр та 7,78 Гр викликає виникнення певного, вищого за контрольні значення рівня одно- та дволанцюгових розривів ДНК у лімфоїдних клітинах тимуса і селезінки тварин (таблиця 2).

Таблиця 2 Рівень одно- та дволанцюгових розривів ДНК у лімфоїдних клітинах тимуса і селезінки щурів за дії іонізуючої (Мm; n=5)

*- достовірно у відношенні до контролю **- достовірно у відношенні до контролю на фоні введення рибок сину # - достовірно у відношенні до відповідних опромінених груп Р 0,05

Таким чином, одержані експериментальні результати: радіаційно-індуковане підвищення рівня одно- і дволанцюгових розривів ДНК та зниження активності ферменту полі-(АДФ-рибозо)-полімерази на фоні активації протеолітичного каскаду цистеїнових протеїназ свідчить, на нашу думку, про можливість зниження ефективності роботи системи ексцизійної репарації ДНК в лімфоїдних клітинах. Така система подій та наслідків в умовах радіаційного ураження обумовлена, можливо, необоротним приєднанням апоптичного фрагменту (р24) ДНК-зв'язуючого домену полі-(АДФ-рибозо)-полімерази до молекули ДНК (Wang G.H. et al., 1997) .

Встановлений нами корегуючий ефект рибоксину можна пояснити з позиції підвищення загальної резистентності організму внаслідок мобілізації захисних ресурсів. Враховуючи важливу участь аденозин-5`-трифосфату у внутрішньоклітинних репараційних процесах, можна припустити, що застосування рибоксину попереджує зменшення внутрішньоклітинної концентрації АТФ, що сприяє репараційному відновленню структурної організації молекули ДНК.

Звичайно, крім прямої дії іонізуючого випромінення та опосередкованого впливу продуктів вільнорадикальних реакцій на утворення одно- та дволанцюгових розривів ДНК, значну роль відіграє активація Са²⁺, Мg²⁺-залежної ендонуклеази (Иванник Б.П. и др., 1986). Останнє твердження узгоджується з даними, які ми отримали при дослідженні активності Са²⁺, Мg²⁺ - залежної ендонуклеази - показано значне радіаційно-індуковане дозозалежне підвищення рівня вмісту полідезоксирибонуклеотидів у лімфоїдних клітинах тимуса та селезінки щурів.

Аналіз даних наукової літератури і власних досліджень щодо участі протеїназ та системи полі-АДФ-рибозилювання в радіаційно-ідукованому апоптозі у лімфоцитах дає підстави стверджувати про певну залежність загибелі клітин від ступеня їх адекватної відповіді, яка здатна посилювати отриманий сигнал та передавати його специфічним ефекторам апоптозу. Дані системи є частиною динамічного процесу в клітині і ступінь прояву їх перебуває у тісному корелятивному зв'язку між собою. Ендогенні протеїнази та система полі-АДФ-рибозилювання є основою складної сітки каскадних ланцюгових реакцій, які відповідають за різноманітні сигнали і тим самим здатні координувати, синхронізувати і інтегрувати регуляцію численних біохімічних реакцій.

Результати, отримані при застосуванні рибоксину, як модифікуючого фактору, за умов радіаційно-індукованого апоптозу в лімфоцитах тимуса та селезінки щурів свідчать про його нормалізуючу дію.

ВИСНОВКИ

Досліджено участь цистеїнових протеїназ та системи полі-АДФ-рибозилювання за радіаційно-індукованого апоптозу (через 30 хв та 3 години після дії на організм тварин рентгенівського випромінення в дозах 1,0 Гр та 7,78 Гр) у лімфоїдних клітинах тимуса і селезінки щурів. Також показана можливість використання препарату рибоксину як корегуючого протипроменевого чинника.

Сукупність отриманих результатів свідчить про значну радіочутливість процесів, пов'язанних з активацією протеолізу в імунокомпетентних клітинах тимуса та селезінки за опромінення тварин. Встановлено підвищення активності ендогенних протеїназ, а також зростання активності лізосомального катепсину В на ранньому етапі радіаційно-індукованого апоптозу.

Встановлено залучення родини каспаз до процесів розвитку апоптозу в лімфоїдних клітинах у ранній післяпроменевий період. Залежно від дози радіації та часу після опромінення показано різноспрямованість змін активності каспази - 3 у тимусі та селезінці щурів.

Дія іонізуючого випромінення призводить до пригнічення активності полі-(АДФ-рибозо)-полімерази у тимоцитах щурів, а в спленоцитах виявлено її підвищення через 30 хв після опромінення за дози 1,0 Гр та пригнічення активності ферменту за дози 7,78 Гр, що супроводжується характерними змінами вмісту НАД і АТФ у клітинах цих органів.

Виявлено, що динаміка та характер пострадіаційних зрушень в організмі тварин призводить до збільшення ступеня фрагментації хроматину за рахунок Са²⁺, Мg²⁺-залежного ендонуклеолізу та підвищення кількості одно- та дволанцюгових розривів ДНК у лімфоїдних клітинах тимуса та селезінки щурів.

Введення тваринам препарату рибоксину активує біоенергетичні процеси і сприяє нормалізації у досліджуваних клітинах активності цистеїнових протеїназ, полі-(АДФ-рибозо)-полімерази та зниженню рівня одно- та дволанцюгових розривів ДНК.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Andriychuk T.R., Dragan L.P., Raksha N.G. Oxidant-dependent proteolysis in radiation-induced lymphoid cell death // Annales Universitatis Mariae Curie-Sclodowska, Lublin-Polonia. -2004.-Vol. XVII, №2.- Sectio DDD.- P.353-355. (Здобувачем проаналізовано літературу, визначено активність катепсину В у лімфоїдних клітинах тимуса та селезінки щурів за радіаційно-індукованого апоптозу).

2. Андрійчук Т.Р., Драган Л.П., Ракша Н.Г., Бріт І.С. Оцінка структурного стану ядерних нуклеїнових кислот лімфоцитів щурів за дії іонізуючого випромінення // Вісник Київського ун-ту імені Тараса Шевченка. Серія: Біологія.-2004.-Вип.42.-С.23-24. (Здобувачем проаналізовано літературу, особисто виконано мікроскопію фіксованих клітин, цифрову зйомку та комп'ютерну двохвильову фотометрію кольорових зображень за програмою Photometry, обробку та аналіз результатів досліджень).

3. Андрійчук Т.Р., Драган Л.П., Ракша Н.Г. Радіаційно-індуковані порушення ДНК у тимоцитах щурів // Вісник Київського ун-ту імені Тараса Шевченка. Серія: Біологія.-2004.-Вип.43.-С.55-56. (Здобувачем проаналізовано літературу, досліджено рівень одно- та дволанцюгових розривів ДНК у тимоцитах щурів та підготовлено матеріали до друку).

4. Andriychuk T.R., Dragan L.P., Raksha N.G., Kucherenko M.E. Role of poly(ADP)ribosylation in radiation-induced apoptosis of immunocompetent cells // Укр. біохім. журн.-2005.-Т.77, №2.-С.93. (Здобувачем проаналізовано літературу, досліджено активність полі-(АДФ-рибозо)-полімерази за дії променевого чинника, здійснено статистичну обробку результатів досліджень).

5. Andriychuk T.R., Kudina N.G., Dragan L.P., Tszudzevich B.A. The influence of ionizing radiation upon the state of chromatin of the cells from immunocompetent rat's organs // Матеріали III з'їзду з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія) (21-25 травня 2003 р.).-Київ: Український фітосоціологічний центр, 2003._С.18.

6. Андрійчук Т.Р., Драган Л.П., Ракша Н.Г., Цудзевич Б.О. Участь цистеїнових протеїназ в апоптозі спленоцитів за променевого ураження // Радіобіологічні ефекти : ризики, мінімізація, прогноз : Матеріали Міжнародної конференції (22-24 березня 2005 р.).- Київ, 2005.- С.14.

7. Андрийчук Т.Р., Ракша Н.Г., Драган Л.П. Участие лизосомальных факторов реализации программированной клеточной гибели (апоптоза) // Современные проблемы науки и образования: Материалы 6-ой международной междисциплинарной научно-практической конференции (30 апреля - 9 мая 2005г.).- Харьков: Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, 2005.-С.70.

8. Андрийчук Т.Р., Ракша Н.Г., Драган Л.П., Цудзевич Б.А .Влияние ионизирующей радиации и инозина на состояние системы поли-АДФ-рибозилирования лимфоцитов тимуса // Материалы V съезда по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (10-14 апреля 2006 г.).- Москва, 2006. - С.19.

9. Andriychuk T.R., Raksha N.G., Polyakova V.V., Dragan L.P., Tszudzevich B.A. Radiation-induced apoptosis: relationship between main executioners // The 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society and The 4th Annual Meeting of the Ukrainian Society for Radiation Biology (22 nd to 25 th August 2006 Kyiv).- Kyiv, 2006.-P.65.

10. Полякова В.В., Драган Л.П., Андрійчук Т.Р., Ракша Н.Г. Радіаційно-індуковані порушення ДНК у спленоцитах щурів та їх модифікація рибоксином // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду (24-27 жовтня 2006 р.).- Харків, 2006.- Т. 2.- С. 218.

11. Andriychuk T.R., Raksha N.G., Dragan L.P., Tszudzevich B.A. Caspases-mediated regulation of poly(ADP-ribose)polymerase activity during radiation-induced apoptosis // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду (24-27 жовтня 2006 р.).- Харків, 2006.- Т.1.- С.95.

АНОТАЦІЯ

Драган Л.П. Участь протеїназ та системи полі-АДФ-рибозилювання у радіаційно-індукованому апоптозі клітин тимуса та селезінки щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04_біохімія.-Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2006.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню участі протеїназ та системи полі-АДФ-рибозилювання у радіаційно-індукованому апоптозі в лімфоїдних клітинах тимуса та селезінки щурів. Показано, що активація лізосомальних протеїназ, зокрема катепсину В, можливо, є найбільш ранньою подією в системі ініціації проходження апоптичних сигналів, де фермент бере участь у регуляції ланок мітохондріального та рецептор-опосередкованого шляху радіаційно-індукованої загибелі клітин. На початкових етапах за дії іонізуючої радіації в дозах 1,0 Гр та 7,78 Гр встановлено зростання активності ендогенних протеїназ родини каспаз, зокрема каспази-3. За цих умов виявлено порушення активності полі-(АДФ-рибозо)-полімерази у тимоцитах та спленоцитах щурів, що супроводжується змінами вмісту НАД і АТФ у клітинах лімфоїдних органів, і ступінь цих змін має дозозалежний характер. Показано радіаційно-індуковане зростання кількості одно- та дволанцюгових розривів ДНК у лімфоїдних клітинах, а також підвищення рівня Са²⁺ , Мg²⁺ - залежного накопичення полідезоксирибонуклеотидів. За дії на тварин рентгенівського випромінення на фоні попереднього введення рибоксину спостерігається модифікуючий вплив препарату на рівень досліджуваних показників порівняно з відповідними результатами при опроміненні в дозах 1,0 Гр та 7,78 Гр.

Ключові слова: лімфоцити тимуса та селезінки, рентгенівське випромінення, апоптоз, полі-(АДФ-рибозо)-полімераза, катепсин В, каспаза - 3, рибоксин.

АННОТАЦИЯ

Драган Л.П. Участие протеиназ и системы поли-АДФ-рибозилирования в радиационно-индуцированном апоптозе клеток тимуса и селезёнки крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04_биохимия. -Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2006.

Диссертационная работа посвящена исследованию участия протеиназ и системы поли-АДФ-рибозилирования в радиационно-индуцированном апоптозе лимфоцитов тимуса и селезёнки крыс.

Показано, что активация лизосомальных протеиназ, а именно катепсина В, является, возможно, наиболее ранним фактом в системе инициации прохождения апоптических сигналов, а сам фермент задействован в регуляции как митохондриального, так и рецептор-опосредованного пути радиационно-индуцированого апоптоза. Установлено увеличение активности эндогенных протеиназ семейства каспаз тимоцитов и спленоцитов животных, в частности каспазы -3, на ранних этапах при действии рентгеновского излучения в дозах 1,0 Гр и 7,78 Гр. При этом также выявлены изменения ферментативной активности поли-(АДФ-рибозо)-полимеразы (ПАРП) в лимфоидных клетках тимуса и селезёнки крыс, что в свою очередь, сопровождается изменением содержания НАД и АТФ в клетках этих органов и имеет дозозависимый характер. Показано, что снижение внутриклеточного уровня НАД и АТФ в лимфоидных органах крыс не превышает порогового значения, при котором механизм гибели клетки переходит от апоптоза к некрозу. Так, каспазо-опосредованная деградация ПАРП нарушает функционирование системы поли-АДФ-рибозилирования, особенно снижает эффективность работы репарационных механизмов. Выявлено, что после облучения увеличивается количество одно- и двуцепочных разрывов ДНК, а также активируются, в результате опосредованной каспазами инактивации ПАРП, Са²⁺ , Мg²⁺- зависимые эндонуклеазы, что приводит к характерной для апоптоза фрагментации хроматина и накоплению полидезоксирибонуклеотидов.

При облучении животных на фоне предварительного введения рибоксина установлен модифицирующий эффект на исследованные показатели по сравнению с соответствующими результатами при действии ионизирующего излучения в дозах 1,0 Гр и 7,78 Гр.

Ключевые слова: лимфоциты тимуса и селезёнки, рентгеновское облучение, апоптоз, поли-(АДФ-рибозо)-полимераза, катепсин В, каспаза-3, рибоксин.

ANNOTATION

Dragan L.P. The involvement of proteinases and the system of poly-ADP-ribosylation in radiation-induced apoptosis of the rat thymus and spleen cells. - Manuscript.

Dissertation for the of candidate of biological sciences degree in speciality 03.00.04 - Biochemistry. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2006.

The dissertation is devoted to the study of the involvement of proteinases and the system of poly-ADP-ribosylation in radiation-induced apoptosis of the rat thymus and spleen lymphoid cells. It has been shown that activation of the lysosomal proteinases, namely cathepsin B, is probably the earliest event in the system of apoptotic signal transduction and this enzyme participates in regulation of mitochondrial and receptor-mediated pathways of radiation-induced cell death. Increase in activity of endogenous proteinases of the caspase family, particularly caspase-3, on the early stages after X-ray exposure (1.0 Gy and 7.78 Gy ) has been established. Under these conditions disorders in functional activity of poly-(ADP-ribose)-polymerase in the rat thymocytes and splenocytes were observed, which was accompanied by changes in NAD⁺ and ATP contents; the degree of these changes seems to be dose-dependent. Radiation-induced increase in the level of DNA single- and double-strand breaks, as well as increase of the rate of Ca²⁺, Mg²⁺-dependent polydeoxyribonucleotide accumulation have been demonstrated. The injection of riboxine accompanied by further X-ray exposure of rats resulted in the modificating effect of preparation on the activity of investigated parameters in compare with respective results after irradiation in 1.0 Gy and 7.78 Gy.

Key words: thymus and spleen lymphocytes, X-radiation, apoptosis, poly-(ADP-ribose)-polymerase, cathepsin B, caspase-3, riboxine.

Размещено на Allbest.ru