Хіміко-токсикологічне дослідження зопіклону

Размещено на http://allbest.ru

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВІТИ ІМЕНІ П.Л. ШУПИКА

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

ХІМІКО-ТОКСИКОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ЗОПІКЛОНУ

Виконала Клименко Ліна Юріївна

КИЇВ - 2007



АНОТАЦІЯ

Клименко Л.Ю. Хіміко-токсикологічне дослідження зопіклону. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. - Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України, Київ, 2007.

Дисертацію присвячено хіміко-токсикологічному дослідженню зопіклону.

Розроблено методики ідентифікації зопіклону за допомогою кольорових реакцій, методів УФ-спектроскопії, якісне визначення естерів та специфічного визначення зопіклону, методики кількісного визначення зопіклону та його “маркера” - 2-аміно-5-хлорпіридину.

Порівняно ефективність загальних методів ізолювання органічних отрут основного характеру щодо зопіклону та розроблено окремий метод ізолювання зопіклону із біоматеріалу.

Обґрунтовано схему хіміко-токсикологічного аналізу біоматеріалу на зопіклон та доповнення до загальних схем ТШХ-скринінгу органічних отрут, що дозволяють не втратити зопіклон при проведенні неспрямованого дослідження.

зопіклон естерний токсилогічний отрута



1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Перелік імпортних та вітчизняних препаратів, що пропонуються на фармацевтичному ринку України, постійно розширюється, тому розробка методів хіміко-токсикологічного та фармацевтичного аналізу сильнодіючих лікарських засобів є актуальною задачею токсикологічної та фармацевтичної хімії.

Великий інтерес в хіміко-токсикологічному відношенні мають препарати з групи снодійних засобів. До цих препаратів належить зопіклон, що за даними наукової літератури за останні 10 років також викликає інтерес в хіміко-токсикологічному відношенні. Описано численні випадки гострих, летальних та суїцидальних отруєнь зопіклоном, а також немедичного застосування препарату в суміші з іншими лікарськими засобами та алкоголем. Клінічна картина отруєнь зопіклоном та морфологічні зміни в організмі при цьому не завжди характерні і мають багато спільного з препаратами групи бензодіазепінів. Діагностика отруєнь цим препаратом ускладнюється ще тим, що разом з ним можуть застосовувати інші препарати. Саме тому в діагностиці таких отруєнь велике значення мають результати хіміко-токсикологічних досліджень.

Зважаючи на те, що в доступній нам вітчизняній та зарубіжній літературі вичерпних відомостей про повний хіміко-токсикологічний аналіз зопіклону нами не знайдено, таке дослідження є актуальним.

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи є розробка схеми хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на зопіклон, що включає ефективні та експресні методики ізолювання зопіклону із біологічного матеріалу, методики його ідентифікації та кількісного визначення, придатні для цілей хіміко-токсикологічного аналізу.

Для досягнення мети було поставлено такі задачі:

- запропонувати чутливі кольорові реакції для ідентифікації зопіклону, виділеного з біологічного матеріалу;

- вивчити умови проведення лужного гідролізу, а також кислотний гідроліз зопіклону в умовах, визначених для аналізу біологічного матеріалу на препарати групи бензодіазепінів; дослідити продукти, що утворюються при цьому, з метою їх використання для ідентифікації препарату та встановлення його відмінності від похідних 1,4-бензодіазепіну;

- розробити чутливі методики ідентифікації зопіклону за допомогою методу хроматографії в тонких шарах сорбенту (ТШХ) з використанням схем аналізу, що застосовують в загальноприйнятому ТШХ-скринінгу органічних отрут, а також методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) з використанням системи “ВЕРХ-аналізатора”, що є широкозастосовуваною в країнах СНД;

- розробити методики кількісного визначення зопіклону, придатні для цілей хіміко-токсикологічного аналізу, з використанням оптичних та хроматографічних методів аналізу;

- вивчити вплив природи органічних розчинників та рН середовища на екстракцію зопіклону з водних розчинів;

- порівняти ефективність загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних отрут основного характеру - О. О. Васильєвої, В. П. Крамаренка, Стаса-Отто, О. В. Удалова (модифікація методу Стаса-Отто) щодо зопіклону та розробити ефективну та експресну окрему методику ізолювання зопіклону із біологічного матеріалу, а також запропонувати методики виділення зопіклону із біологічних рідин організму (крові і сечі);

- запропонувати умови очищення зопіклону від співекстрактивних речовин у витягах із біологічного матеріалу за допомогою методів екстракції та хроматографії в тонкому шарі сорбенту;

- вивчити розподіл зопіклону в органах, отруєних препаратом; дослідити зберігання зопіклону в трупному матеріалі при його гнильному розкладенні.

Об'єкт дослідження. Снодійний препарат - зопіклон ((5RS)-6-(5-хлоропіридин-2-іл)-7-оксо-6,7-дигідро-5H-піроло[3,4-b]піразин-5-іл-4-метилпіперазин-1-карбоксилат).

Предмет дослідження. Хіміко-токсикологічний аналіз зопіклону.

Методи дослідження. Для ідентифікації зопіклону у водних розчинах та витягах із біологічного матеріалу використовували методи ТШХ, ВЕРХ та УФ-спектроскопії, кольорові реакції, лужний та кислотний гідроліз естерів та амідів; для підтвердження структури продуктів, що утворюються при гідролізі зопіклону, використовували методи УФ- та ЯМР ¹Н-спектроскопії, ТШХ, ВЕРХ та визначення температури плавлення речовин; для кількісного визначення зопіклону та 2-аміно-5-хлорпіридину - УФ-спектрофотометричний, екстракційно-фотометричний та ВЕРХ-методи. Для ізолювання зопіклону із біологічного матеріалу використовували загальноприйняті методи О.О. Васильєвої, В.П. Крамаренка, Стаса-Отто, модифікацію останнього за О.В. Удаловим, а також окрему методику ізолювання хлороформом.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виконано систематичне дослідження зопіклону в хіміко-токсикологічному відношенні.

Вперше запропоновано високочутливі кольорові реакції на зопіклон, що базуються на використанні реакцій гідролізу та пергідролізу зопіклону в лужному середовищі з наступною ідентифікацією продуктів, що утворилися. Вперше встановлено структуру продуктів лужного гідролізу зопіклону та запропоновано умови використання їх як “маркерів” при виявленні зопіклону.

Запропоновано та запатентовано тест-системи для ідентифікації естерів та специфічного виявлення зопіклону, що ґрунтуються на реакції пергідролізу.

Хроматографічними (ТШХ та ВЕРХ) та спектроскопічними (УФ- та ЯМР ¹Н-) методами, а також за температурами плавлення встановлено структуру та індивідуальність продуктів, що утворюються при кислотному гідролізі зопіклону в умовах, що застосовують в аналізі препаратів групи бензодіазепінів, та запропоновано використовувати їх як “маркери” при виявленні зопіклону та для того, щоб відрізнити його від препаратів групи бензодіазепінів.

Вперше встановлено хроматографічну поведінку зопіклону та продуктів його лужного та кислотного гідролізу в умовах загальної схеми ТШХ-скринінгу органічних отрут та запропоновано доповнення до цієї схеми з метою виявлення зопіклону. Встановлено основні хроматографічні параметри зопіклону та продуктів його лужного та кислотного гідролізу при дослідженні методом ВЕРХ в системі “ВЕРХ-аналізатора”, що застосовують в хіміко-токсикологічному та криміналістичному аналізі в країнах СНД.

Розроблено нові УФ-спектрофотометрична, екстракційно-фотометрична та ВЕРХ-методики кількісного визначення зопіклону та продукту його лужного гідролізу - 2-аміно-5-хлорпіридину, придатні для цілей хіміко-токсикологічного та криміналістичного аналізу.

Встановлено оптимальні умови екстракції зопіклону та продуктів його лужного та кислотного гідролізу з водних розчинів органічними розчинниками. Вперше порівняно ефективність загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних отрут основного характеру щодо зопіклону. Розроблено ефективну та експресну окрему методику ізолювання зопіклону з біологічного матеріалу за допомогою хлороформу та запропоновано методики виділення зопіклону з біологічних рідин організму (крові, сечі).

Встановлено розподіл зопіклону в органах отруєних тварин та рекомендовано оптимальні об'єкти для проведення хіміко-токсикологічного аналізу. Встановлено термін зберігання зопіклону в біологічному матеріалі при його гнильному розкладенні.

На підставі виконаних досліджень вперше запропоновано схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на зопіклон.

Новизну роботи підтверджено двома патентами України.

Практичне значення одержаних результатів. На підставі комплексу проведених досліджень розроблено схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на зопіклон, що знайшла своє відображення в підготовлених методичних рекомендаціях “Хіміко-токсикологічний аналіз біологічного матеріалу на зопіклон”, які рекомендовано застосовувати в практичній роботі відділень судово-медичної токсикології для вирішення питань щодо отруєння зопіклоном, в клінічних лабораторіях з метою визначення зопіклону в біологічних рідинах, а також у криміналістичному аналізі.

Запропоновані тест-системи для ідентифікації естерів та специфічного виявлення зопіклону рекомендовано для використання в фармацевтичному та хіміко-токсикологічному аналізі з метою виявлення зазначених сполук.

Розроблені методики хіміко-токсикологічного дослідження зопіклону впроваджено в навчальний процес кафедри клінічної біохімії й судово-медичної токсикології Харківської медичної академії післядипломної освіти, кафедри токсикологічної хімії Національного фармацевтичного університету, кафедри фармації Івано-Франківського державного медичного університету, кафедри фармацевтичної хімії та фармакогнозії Луганського державного медичного університету, в практичну роботу відділень судово-медичної токсикології Одеського та Харківського обласного бюро судово-медичної експертизи.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Зопіклон (ксімован, імован, зімован, амобан, лімован, сопіван) належить до снодійних лікарських засобів групи циклопіролонів; за хімічною структурою являє собою (5RS)-6-(5-хлоропіридин-2-іл)-7-оксо-6,7-дигідро-5H-піроло[3,4-b]піразин-5-іл-4-метилпіперазин-1-карбоксилат.



За даними наукової літератури, зопіклон (1) може піддаватися розкладу в лужному середовищі з утворенням 2-аміно-5-хлорпіридину (2), тому розробку методик ідентифікації, кількісного визначення та ізолювання зопіклону із об'єктів біологічного походження проводили як відносно нативної речовини, так і за продуктом його лужного гідролізу.

Розробка методів виявлення зопіклону

Ідентифікацію зопіклону та 2-аміно-5-хлорпіридину проводили хімічними (кольорові реакції) та фізико-хімічними методами (ТШХ, ВЕРХ, УФ-спектроскопія).

При пошуку якісних реакцій на зопіклон та 2-аміно-5-хлорпіридин було вивчено їх взаємодію з деякими реагентами, які широко застосовуються в аналізі алкалоїдів та інших органічних речовин, що містять в своїй структурі третинний атом азоту, а також з реактивами для виявлення первинної ароматичної аміногрупи та піридинового циклу. Реакції проводили на хроматографічних пластинах “Sorbfil” ПТСХ-ІІВ розміром 2 2 см. Такий спосіб виконання якісних реакцій дозволяє підвищити їх чутливість в кілька разів.

Встановлено, що для ідентифікації зопіклону можна застосовувати реактиви Вагнера, Бушарда, Драгендорфа та реактив Драгендорфа, модифікований за Муньє. Ідентифікацію 2-аміно-5-хлорпіридину запропоновано проводити за реакцією утворення основи Шиффа з 5% хлороформним розчином п-диметиламінобензальдегіду після обробки плям парами кислоти хлористоводневої концентрованої.

З метою пошуку специфічних якісних реакцій для ідентифікації зопіклону проводили його виявлення за продуктами лужного гідролізу. Попередньо нами було встановлено, що гідроліз зопіклону можна проводити безпосередньо на хроматографічних пластинах шляхом обприскування плям 10% розчином натрію гідроксиду.

Оскільки відомостей щодо інших продуктів лужного гідролізу зопіклону в літературі ми не знайшли, нами було зроблено припущення, що при цьому крім 2-аміно-5-хлорпіридину утворюються солі кислот (3 та 4):

Для підтвердження утворення сполуки 3 з альдегідною групою, нами на хроматографічних пластинах було виконано ряд реакцій (табл. 1). Реакції виконували після виведення із реакційної зони утвореного 2-аміно-5-хлорпіридину за допомогою методу ТШХ в системі розчинників хлороформ - ацетон (8:2).

Для підтвердження утворення в процесі гідролізу 2-аміно-5-хлорпіридину виконували реакцію з 5% хлороформним розчином п-диметиламінобензальдегіду після обробки парами кислоти хлористоводневої концентрованої (отримували плями яскраво-жовтого кольору) паралельно з дослідженням гідролізату методом ТШХ в присутності “свідка” - 2-аміно-5-хлорпіридину.



Таблиця 1. Результати кольорових реакцій на наявність альдегідної групи в продуктах лужного гідролізу зопіклону на хроматографічних пластинах

№ п/п	Реактив або спосіб обробки пластин	Забарвлення / чутливість, мкг
1	Несслера	жовтогаряче > сіре / 0,1
2	0,4% розчин 2,4-динітрофенілгідразину в 2 М розчині кислоти хлористоводневої	жовте / 5,0
3	послідовна обробка плям 0,5% розчином бензидину в суміші етанолу та 20% розчину NaOH (1:1) та 80% розчином кислоти ацетатної	яскраво-жовте > жовтогаряча флуоресценція в УФ-світлі при нагріванні / 0,1
4	2% розчин о-фенілендиаміну в суміші кислоти ацетатної безводної та води (1:3)	зелене > фіолетове / 0,5
5	послідовна обробка плям 5% розчином гідроксиламіну гідрохлориду в етанолі та 2% розчином феруму (III) хлориду	чорне / 0,1
6	розчин 0,6% о-толуїдину гідрохлориду в кислоті ацетатній безводній при нагріванні	синє / 0,1

Таким чином, підтверджено утворення при лужному гідролізі зопіклону 2-аміно-5-хлорпіридину та сполуки з альдегідною групою. За утворенням зазначених сполук можна проводити ідентифікацію зопіклону та його метаболітів, оскільки згідно з даними літератури їх лужний гідроліз перебігає за подібними схемами. Наявність в молекулі зопіклону естерного та амідного зв'язків дозволяє припустити можливість перебігу реакції пергідролізу препарату в лужному середовищі за схемою:

Таким чином, одна молекула препарату може бути постачальником до трьох пероксокарбоксильних груп (сполуки 5 та 6), утворення яких можна підтвердити, використовуючи їх як окисники деяких ароматичних амінів та індолу. Ці речовини не окиснюються гідроген пероксидом в лужному середовищі, але під дією перкислот здатні утворювати забарвлені продукти окиснення (табл. 2).

Для всіх реакцій взаємодії зопіклону з реактивами, наведеними в табл. 1 та 2, запропоновано можливий хімізм процесу.

Таблиця 2. Результати кольорових реакцій зопіклону, що базуються на реакції пергідролізу

№ п/п	Реактив	Забарвлення / чутливість, мкг
1	суміш 10% розчину NaOH, 10% розчину Н2О2 та 0,1 М розчину 3,3',5,5'-тетраметилбензидину в етанолі (1:1:1)	жовто-коричневе / 0,5
2	суміш 10% розчину NaOH, 10% розчину Н2О2 та 0,5% розчину бензидину в етанолі (1:1:1)	блідо-жовте / 1,0
3	суміш 10% розчину NaOH, 10% розчину Н2О2 та 2% розчину о-фенілендиаміну в етанолі (1:1:1)	червоно-коричневе / 0,1
4	суміш 10% розчину NaOH, 10% розчину Н2О2 та 2% розчину індолу в етанолі (1:1:1)	червоно-коричневе / 0,1

Кожний із запропонованих реактивів (див. табл. 1 та 2) не є специфічним для виявлення зопіклону, проте будь-яке комплексне використання цих реактивів (що включає застосування одного реактиву з табл. 1, одного реактиву з табл. 2 та, додатково, 5% хлороформного розчину п-диметиламінобензальдегіду після лужного гідролізу 10% розчином натрію гідроксиду та нейтралізації 20% розчином кислоти хлористоводневої для виявлення 2-аміно-5-хлорпіридину, що утворюється при цьому) робить ідентифікацію зопіклону специфічною та дозволяє ефективно відрізнити його від інших лікарських препаратів.

Реакцію пергідролізу в лужному середовищі з використанням як субстрату для окиснення о-фенілендиаміну ми вивчали додатково з різними органічними сполуками, що містять в своїй структурі естерну групу. За результатами проведених досліджень запропоновано та запатентовано склад хімічного реактиву для якісного визначення речовин, що містять у своїй структурі естерну групу.

Нами також встановлено умови, за яких ця реакція стає специфічною для виявлення саме зопіклону (зменшення в складі реактиву кількості натрію гідроксиду в 30 разів). На підставі наведених даних отримано деклараційний патент України на корисну модель.

Методом тонкошарової хроматографії з використанням п'яти типів тонких шарів вивчено хроматографічну поведінку зопіклону та 2-аміно-5-хлорпіридину в присутності снодійних засобів групи бензодіазепінів, донормілу та димедролу.

Дослідження проводили в 16 системах розчинників, серед яких 10 систем визнано стандартними Міжнародним комітетом з систематичного токсикологічного аналізу Міжнародної асоціації судових токсикологів, 4 системи, що застосовують в загальному ТШХ-скринінгу органічних отрут, та 2 системи, що є окремими для дослідження препаратів, похідних 1,4-бензодіазепіну.

Вивчено відношення зопіклону та 2-аміно-5-хлорпіридину до проявників, що застосовують в загальному ТШХ-скринінгу отрут основного характеру, та запропоновано нові проявники для специфічного виявлення зазначених сполук на основі розроблених нами якісних реакцій (реактиви 1, 3 - 5 із табл. 1, реактив 3 із табл. 2 для виявлення зопіклону та 5% хлороформний розчин п-диметиламінобензальдегіду після обробки парами кислоти хлористоводневої концентрованої - для виявлення 2-аміно-5-хлорпіридину).

Запропоновано методику дослідження зопіклону методом двомірної тонкошарової хроматографії в системі розчинників хлороформ - метанол (9:1): після елюювання в першому напрямку проводять пошук зопіклону за флуоресценцією в УФ-світлі, після чого пляму піддають лужному гідролізу, елюють пластину в другому напрямку та виявляють 2-аміно-5-хлорпіридин за значенням R_f, флуоресценцією в УФ-світлі після обробки парами кислоти хлористоводневої концентрованої та результатом якісної реакції з 5% хлороформним розчином п-диметиламінобензальдегіду після обробки парами кислоти хлористоводневої концентрованої.

Симптоматика отруєнь зопіклоном є близькою до картини передозувань препаратів групи бензодіазепінів. Тому в випадку отруєння зопіклоном не можна виключати можливості проведення експертом спрямованого аналізу на похідні 1,4-бензодіазепіну. Спрямований хіміко-токсикологічний аналіз зазначеної групи препаратів починають з кислотного гідролізу біологічного матеріалу 6 М розчином кислоти хлористоводневої при температурі 110С протягом 1 години. Отриманий гідролізат нейтралізують, екстрагують хлороформом, а потім хлороформний витяг досліджують методом ТШХ, використовуючи як елюент бензен. Плями відповідних бензофенонів ідентифікують за наявністю жовтого забарвлення або флуоресценції в УФ-світлі. Нами виконано кислотний гідроліз зопіклону в зазначених умовах, проведено дослідження продуктів, що утворюються при цьому, за допомогою хроматографічних та спектроскопічних методів встановлено їх структуру.

Схему кислотного гідролізу зопіклону можна подати таким чином:

Виходячи із структури можливих продуктів кислотного гідролізу зопіклону, можна припустити, що після нейтралізації реакційної суміші екстрагуватися хлороформом будуть сполуки 7 та 2, що не містять в своїй структурі карбоксильної групи та не утворюють солей.

Проведення ТШХ-дослідження з використанням як елюенту бензену дозволяє чітко відрізнити продукти гідролізу зопіклону від продуктів гідролізу препаратів групи бензодіазепінів (продукти гідролізу зопіклону на відміну від продуктів гідролізу препаратів групи бензодіазепінів залишаються на старті), проте не дозволяє розділити між собою продукти кислотного гідролізу зопіклону та препарат, що, можливо, не піддався гідролізу. Тому проводили додаткове дослідження хлороформного витягу методом ТШХ в системі розчинників хлороформ - ацетон (8:2), що, як встановлено попередньо, дозволяє задовільно розділити зопіклон (1) та 2-аміно-5-хлорпіридин (2). На хроматографічних пластинах отримано дві плями продуктів кислотного гідролізу зопіклону, одна із яких відповідає 2-аміно-5-хлорпіридину (за значенням R_f та результатами проявлення), а другій плямі, що має зелену флуоресценцію в УФ-світлі, нами приписано структуру речовини 7.

Гідролізати було досліджено методом двомірної тонкошарової хроматографії за описаною вище методикою в системі розчинників хлороформ - ацетон (8:2) та доведено, що 2-аміно-5-хлорпіридин є структурним фрагментом молекули другого продукту кислотного гідролізу зопіклону. Для підтвердження структури та індивідуальності цієї речовини нами проведено препаративний гідроліз зопіклону, екстракційним методом отримано речовини 7 (з кислого середовища) і 2 (з лужного середовища), перекристалізовано їх з етанолу, після чого визначено їх температури плавлення, які становлять 242С і 138С відповідно. Для речовини 7 також отримано ЯМР-¹Н-спектр.

Дані щодо температури плавлення і спектральні характеристики сполуки 7 дозволяють стверджувати, що це (7RS)-6-(5-хлоропіридин-2-іл)-7-гідрокси-6,7-дигідро-5Н-піроло[3,4-b]піразин-5-он.

Наявність речовини 9, що містить в своїй структурі альдегідну групу, в кислому гідролізаті (до проведення нейтралізації та екстракції) було підтверджено якісною реакцією на хроматографічних пластинах з розчином о-фенілендиаміну в кислоті ацетатній безводній.

Таким чином, проведені дослідження підтверджують запропоновану нами схему кислотного гідролізу зопіклону і дозволяють рекомендувати сполуки 7 і 2 як “маркери” наявності зопіклону, а також для того, щоб відрізнити його від препаратів групи бензодіазепінів.

Ідентифікацію зопіклону, 2-аміно-5-хлорпіридину та продукту кислотного гідролізу 7 проведено методом ВЕРХ з використанням ВЕРХ-аналізатора “Міліхром А-02” (ЗАТ “ЕкоНова”, Новосибірськ, РФ). Елюювання градієнтне, виконується змішуванням двох елюентів: елюент А - [4 M LiClO₄ - 0,1 M HClO₄] - H₂O (5:95); елюент Б - ацетонітрил “для ВЕРХ”; швидкість потоку - 100 мкл/хв.; об'єм проби - 2 мкл. Детектування УФ-спектрофотометричне, проводиться одночасно при 8 довжинах хвиль - 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 та 300 нм.

Встановлено основні хроматографічні параметри зопіклону, сполуки 7 та 2-аміно-5-хлорпіридину в зазначених умовах - час та об'єм утримування, спектральні відношення, а також мінімальну концентрацію речовин в розчині, що можна визначити за допомогою наведеної методики.

Для ідентифікації зопіклону отримано УФ-спектри зопіклону, речовини 7 та 2-аміно-5-хлорпіридину в 0,1 М розчині кислоти хлористоводневої. Встановлено, що максимум поглинання зопіклону в УФ-області спектру припадає на довжину хвилі 304 нм, а 2-аміно-5-хлорпіридину - 203, 234 та 316 нм; розраховано значення питомого та молярного показників поглинання зопіклону при довжині хвилі 304 нм та 2-аміно-5-хлорпіридину - при довжині хвилі 316 нм.

Розробка методик кількісного визначення зопіклону та 2-аміно-5-хлорпіридину

Для кількісного визначення зопіклону та 2-аміно-5-хлорпіридину розроблено УФ-спектрофотометричні методики з використанням як розчинника 0,1 М розчину кислоти хлористоводневої, які можна застосовувати в інтервалі концентрацій від 2 до 20 мкг/мл та від 1 до 20 мкг/мл з відносною невизначеністю середнього результату ±1,54% та ±1,89% відповідно.

Розроблено екстракційно-фотометричну методику кількісного визначення зопіклону на основі реакції утворення іонних асоціатів з метиловим оранжевим, що екстрагуються хлороформом при рН 4,6. Методику можна використовувати при визначенні зопіклону в інтервалі концентрацій від 10 до 140 мкг в пробі. Відносна невизначеність середнього результату не перевищує ±1,26%.

Для зопіклону та 2-аміно-5-хлорпіридину розроблено методики кількісного визначення за допомогою методу ВЕРХ з використанням як розчинника суміші 0,01 М розчину кислоти хлористоводневої та води (1:1). Визначення проводили на хроматографі “Міліхром А-02” в умовах, що застосовували для ідентифікації речовин. Площа піків розчинів зопіклону та 2-аміно-5-хлорпіридину лінійно залежить від їх концентрації в діапазоні концентрацій від 1 мкг/мл до 200 мкг/мл з відносною невизначеністю середнього результату ±2,39% та 1,83% відповідно.

В усіх випадках для розрахунку вмісту речовин в модельних розчинах використовували градуювальні графіки або відповідні рівняння прямих.

Розроблену методику кількісного визначення 2-аміно-5-хлорпіридину методом ВЕРХ використовували для кількісного визначення зопіклону в модельних розчинах. Для цього користувалися відповідним градуювальним графіком та коефіцієнтом перерахунку 2-аміно-5-хлорпіридину на зопіклон, що дорівнює 3,024. Отримані дані свідчать про те, що лужний гідроліз зопіклону відбувається кількісно. Це дозволяє використовувати градуювальний графік для кількісного визначення 2-аміно-5-хлорпіридину для кількісного визначення зопіклону за продуктом його лужного гідролізу.

Оскільки зопіклон та його метаболіти в лужному середовищі гідролізуються з утворенням 2-аміно-5-хлорпіридину, цю методику можна використовувати для визначення “загального зопіклону” в біологічних об'єктах.

Дослідження умов екстракції зопіклону та 2-аміно-5-хлорпіридину з водних розчинів органічними розчинниками

Для розробки оптимальних умов ізолювання зопіклону із біологічного матеріалу попередньо вивчено екстракцію речовин із водних розчинів деякими органічними розчинниками в залежності від рН середовища. Потрібне рН середовища створювали за допомогою універсальних буферних розчинів з рН від 2,0 до 12,0.

Гексан практично не екстрагує зопіклон із водних розчинів незалежно від рН середовища, тому його можна використовувати для очищення як “кислого”, так і “лужного” витягу із біологічного матеріалу. Хлороформ і діетиловий етер можна використовувати для екстракції зопіклону із “лужного” витягу з біологічного матеріалу.

Розробка методик ізолювання зопіклону із біологічного матеріалу

При дослідженні виділення зопіклону із біологічного матеріалу та біологічних рідин використовували модельні суміші препарату з печінкою, що не зазнала гнилісних змін, кров'ю та сечею. Кількість зопіклону (1000 мкг), що використовували для проведення модельних дослідів, було розраховано, виходячи з даних наукової літератури щодо кількості препарату в органах і тканинах людини при смертельних отруєннях.

Нами вивчено можливість ізолювання зопіклону із біологічного матеріалу за допомогою загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному аналізі методів: О.О. Васильєвої, Стаса-Отто, В.П. Крамаренка та проаналізовано їх переваги і вади. Крім того, виділення зопіклону з біологічного матеріалу проводили за допомогою методики, запропонованої О.В. Удаловим, що є модифікацією методу Стаса-Отто та відрізняється від нього тим, що екстракцію етанолом проводять в нейтральному середовищі, а осадження білків проводять за допомогою ацетону після підкислення спиртового витягу кислотою хлористоводневою.

Нами також запропоновано методику ізолювання зопіклону з біологічного матеріалу за допомогою хлороформу та модифікація цієї методики, що полягає в попередній екстракції біологічного матеріалу гексаном з метою видалення із біологічного матеріалу ліпофільних сполук.

Зважаючи на результати, отримані при ізолюванні зопіклону з печінки трупа за допомогою хлороформу, запропоновано використовувати цей розчинник для ізолювання препарату із крові та сечі.

Ідентифікацію зопіклону у витягах із об'єктів біологічного походження проводили методами ВЕРХ та ТШХ за допомогою методик, наведених вище.

Кількісні параметри різноманітних методів ізолювання зопіклону із біологічного матеріалу наведено в табл. 3. Слід підкреслити, що за методом Стаса-Отто та за методикою, запропонованою О.В. Удаловим, зопіклон із біологічного матеріалу не ізолюється.

Найбільш експресним та зручним у виконанні методом ізолювання зопіклону з біологічного матеріалу є, на наш погляд, модифікований метод ізолювання хлороформом з попередньою очисткою біологічного матеріалу гексаном. Метод дозволяє швидко виділити до 80% препарату. При цьому отриманий витяг звільнений від більшості ліпофільних сполук, завдяки чому він є зручнішим в роботі - при нанесенні на хроматографічну пластину не залишається жирних плям.

Методи О.О. Васильєвої та В.П. Крамаренка дозволяють виділити достатньо велику кількість зопіклону із біологічного матеріалу. Крім того, за цими методами ми отримували витяги, що є практично звільненими від співекстрактивних речовин, що могли б заважати виявленню зопіклону методом ТШХ. Кількісне визначення зопіклону в цих витягах можна проводити за УФ-спектрофотометричною та екстракційно-фотометричною методиками без додаткової ТШХ-очистки, оскільки поглинання в контрольних дослідах для зазначених випадків практично відсутнє (не перевищує 5% від поглинання у відповідних основних дослідах).



Таблиця 3. Результати ізолювання зопіклону із об'єктів біологічного походження (n = 3; Р = 0,95; УФ-спектрофотометричний метод кількісного визначення)

Метод ізолювання	Виділено зопіклону, %
за О.О. Васильєвою	57,24 ± 5,66
за В.П. Крамаренком	64,27 ± 4,12
методика ізолювання хлороформом із печінки	81,17 ± 2,40
методика ізолювання хлороформом із печінки (після екстракційної очистки)	64,58 ± 3,12
методика ізолювання хлороформом із печінки з очисткою гексаном	80,02 ± 2,15
методика І ізолювання хлороформом із крові	65,15 ± 2,48
методика ІІ ізолювання хлороформом із крові	59,74 ± 4,66
методика ізолювання хлороформом із сечі	68,64 ± 3,89

Запропоновано методику ТШХ-очистки витягів із об'єктів біологічного походження - спочатку проводять елюювання пластин в хлороформі з метою очистки від співекстрактивних речовин - один раз або, за необхідності, двічі. За цих умов зопіклон залишається на лінії старту, а співекстрактивні речовини мігрують до лінії фінішу. Після висушування пластини елююють в системі розчинників хлороформ - метанол (9:1). З пластин зопіклон 0,1 М або 0,01 М розчином кислоти хлористоводневої.

Слід зазначити, що проведення кількісного визначення методом ВЕРХ після ТШХ-очистки взагалі дозволяє виключити вплив співекстрактивних речовин на результати аналізу.

За результатами проведених досліджень запропоновано схему спрямованого аналізу біологічного матеріалу на зопіклон.

Внесено доповнення до загальних схем ТШХ-скринінгу органічних отрут (пошук невідомої отрути та похідних 1,4-бензодіазепіну), що дозволяють не втратити зопіклон при проведенні неспрямованого дослідження.

Встановлено розподіл зопіклону в органах отруєних тварин та запропоновано при летальних отруєннях зопіклоном брати для хіміко-токсикологічного дослідження шлунок і кишечник із вмістом, нирки, селезінку, сечу, печінку, мозок, легені, кров.

Вивчено умови зберігання зопіклону в біологічному матеріалі при його гнитті та встановлено, що через 21 добу в біологічному матеріалі виявити зопіклон неможливо.



ВИСНОВКИ

1. Вперше на основі систематичних досліджень обгрунтовано схему спрямованого хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на зопіклон, що включає методики його ізолювання із біологічного матеріалу, ідентифікації за допомогою комплексу кольорових реакцій, методів УФ-спектроскопії, ТШХ та ВЕРХ, а також кількісного визначення. Внесено доповнення до загальних схем ТШХ-скринінгу органічних отрут (пошук невідомої отрути та похідних 1,4-бензодіазепіну), що дозволяють не втратити зопіклон при проведенні неспрямованого дослідження.

2. Визначено умови проведення лужного гідролізу та пергідролізу зопіклону, підтверджено утворення при цьому 2-аміно-5-хлорпіридину, а також сполук з альдегідною та пероксокарбоксильною групами, на основі чого вперше запропоновано високочутливий специфічний комплекс кольорових реакцій на зопіклон та дві тест-системи для якісного визначення речовин, що містять в своїй структурі естерну групу, та специфічного виявлення зопіклону.

3. Розроблено чутливі методики ідентифікації зопіклону за допомогою методів УФ-спектроскопії, ТШХ та ВЕРХ з використанням широко застосовуваного в країнах СНД “ВЕРХ-аналізатора” “Міліхром А-02”.

4. За допомогою методів ТШХ, ВЕРХ, УФ-, ЯМР ¹Н-спектроскопії та за температурами плавлення встановлено структуру продуктів, які утворюються при кислотному гідролізі зопіклону в умовах, що застосовуються в аналізі препаратів групи бензодіазепінів. Встановлено, що з кислого гідролізату хлороформом екстрагується (7RS)-6-(5-хлоропіридин-2-іл)-7-гідрокси-6,7-дигідро-5Н-піроло[3,4-b]піразин-5-он, а з нейтралізованого гідролізату - зазначена сполука та 2-аміно-5-хлорпіридин, що можуть бути “маркерами” при виявленні зопіклону в хіміко-токсикологічному аналізі. Запропоновано системи розчинників для розділення зазначених сполук і продуктів кислотного гідролізу препаратів групи бензодіазепінів.

5. Розроблено методики кількісного визначення зопіклону та його “маркера” - 2-аміно-5-хлорпіридину, придатні для цілей хіміко-токсикологічного аналізу (спектрофотометрична, екстракційно-фотометрична та ВЕРХ).

6. Встановлено оптимальні умови екстракції зопіклону та 2-аміно-5-хлорпіридину з водних розчинів. Найбільш високий ступінь екстракції зазначених речовин забезпечують хлороформ та діетиловий естер в лужному середовищі.

7. Вперше порівняно ефективність загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних отрут основного характеру щодо зопіклону. Розроблено ефективний та експресний індивідуальний метод ізолювання зопіклону із біологічного матеріалу за допомогою хлороформу та запропоновано методики виділення зопіклону з біологічних рідин організму (крові, сечі). Запропоновано методику очищення зопіклону від співекстрактивних речовин в витягах із біологічного матеріалу із застосуванням методу ТШХ.

8. Встановлено розподіл зопіклону в органах отруєних тварин та рекомендовано оптимальні об'єкти для проведення хіміко-токсикологічного аналізу. Встановлено термін зберігання зопіклону в біологічному матеріалі при його гнильному розкладенні.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Болотов В.В., Клименко Л.Ю. Спектрофотометричне та екстракційно-фотометричне визначення зопіклону та продукту його лужного гідролізу - 2-аміно-5-хлорпіридину // Вісник фармації. - 2004. - №4 (40). - С. 15 - 19. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка статті).

Болотов В.В., Клименко Л.Ю. Розробка кольорових реакцій на зопіклон // Журнал органічної та фармацевтичної хімії. - 2005. - Т. 3. - Вип. 1 (9). - С. 65 - 69. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка статті).

Болотов В.В., Клименко Л.Ю., Іванчук І.М. Застосування тонкошарової хроматографії в аналізі снодійних засобів зопіклону та донормілу // Вісник фармації. - 2005. - №2 (42). - С. 7 - 12. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка статті).

Болотов В.В., Клименко Л.Ю. Високоефективна рідинна хроматографія в аналізі зопіклону // Журнал органічної та фармацевтичної хімії. - 2005. - Т. 3. - Вип. 4 (12). - С. 77 - 81. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка статті).

Болотов В.В., Клименко Л.Ю. Кислотный гидролиз в анализе зопиклона // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики. Збірник наукових статей. - Випуск XV, Т. 1. - Запоріжжя: Вид-во ЗДМУ. - 2006. - С. 9 - 15. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка статті).

Болотов В.В., Клименко Л.Ю. Вивчення методів ізолювання зопіклону з об'єктів біологічного походження // Вісник фармації. - 2006. - № 3 (47). - С. 26 - 30. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка статті).

Деклараційний патент на корисну модель (Україна) №14478, МПК 2006 G01N31/20. Спосіб якісного визначення зопіклону / В.В. Болотов, Л.Ю. Клименко. № u 2005 11210. Заявлено 28. 11. 2005. Опубл. 15. 05. 2006. Бюл. №5. - 6 с. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка опису патенту, обгрунтування формули корисної моделі).

Патент на винахід (Україна) №77879, МПК 2006 G01N31/20, G07C69/00. Хімічний реактив і спосіб якісного визначення речовин, що містять у своїй структурі естерну групу / В.В. Болотов, Л.Ю. Клименко, М.Є. Блажеєвський. № а 2005 05766. Заявлено 13. 06. 2005. Опубл. 15. 01. 2007. Бюл. №1. - 6 с. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка опису патенту, обгрунтування формули винаходу).

Болотов В.В., Клименко Л.Ю. Спектрофотометричне та екстракційно-фотометричне визначення зопіклону та 2-аміно-5-хлорпіридину // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю “Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок”. - Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. - С. 258 - 260. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка тез).

Болотов В.В., Клименко Л.Ю. Применение тонкослойной хроматографии для обнаружения зопиклона и 2-амино-5-хлорпиридина // Матеріали всеукраїнського науково-практичного семінару “Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії”. 26 листопада 2004 р. - Харків: Вид-во НФаУ, 2004. - С. 291 - 295. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка тез).

Варик Ю.О., Клименко Л.Ю., Болотов В.В. Застосування реакції лужного пергідролізу складних ефірів для ідентифікації деяких лікарських препаратів // Тези доповідей міжвузівської студентської наукової конференції “Наукові основи створення лікарських засобів”. 14 - 15 квітня 2005 р. - Харків: Вид-во НФаУ, 2005. - С. 32. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка тез).

Болотов В.В., Клименко Л.Ю. Розробка специфічних якісних реакцій для виявлення зопіклону // Матеріали VI Національного з'їзду фармацевтів України “Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України”. 28 - 30 вересня 2005 р. - Харків: Вид-во НФаУ, 2005. - С. 141 - 142. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка тез).

Болотов В. В., Клименко Л.Ю. Вивчення екстракції зопіклону із водних розчинів органічними розчинниками // Матеріали VI Національного з'їзду фармацевтів України “Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України”. 28 - 30 вересня 2005 р. - Харків: Вид-во НФаУ, 2005. - С. 142 - 144. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка тез).

Вивчення зопіклону за допомогою методу високоефективної рідинної хроматографії / В.В. Болотов, Л.Ю. Клименко, В.Ф. Першин, С.М. Кузнєцова, Ф.Х. Циба // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю “Стан, перспективи судово-токсикологічної служби та наукових досліджень”. 9 - 10 листопада 2005 р. - Харків. - С. 25 - 26. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка тез).

Варик Ю.О., Клименко Л.Ю., Болотов В.В. Кислотний гідроліз в аналізі зопіклону // Тези доповідей міжвузівської студентської наукової конференції “Актуальні питання створення нових лікарських засобів”. 27 квітня 2006 р. - Харків: Вид-во НФаУ, 2006. - С. 38. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка тез).

Шимко О.В., Клименко Л.Ю., Болотов В.В. Розробка якісних реакцій для виявлення зопіклону // Тези доповідей міжвузівської студентської наукової конференції “Актуальні питання створення нових лікарських засобів”. 27 квітня 2006 р. - Харків: Вид-во НФаУ, 2006. - С. 61. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка тез).

Болотов В.В., Клименко Л.Ю. Порівняльний аналіз методів ізолювання зопіклону із тканин печінки // Матеріали другої міжнародної конференції “Створення, виробництво, стандартизація та фармакологічні дослідження нових лікарських засобів та біологічно активних добавок”. 12 - 13 жовтня 2006 р. - Харків: Вид-во НФаУ, 2006. - С. 80 - 82. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка тез).

Болотов В.В., Клименко Л.Ю. Розробка методик ізолювання зопіклону з крові // Матеріали другої міжнародної конференції “Створення, виробництво, стандартизація та фармакологічні дослідження нових лікарських засобів та біологічно активних добавок”. 12 - 13 жовтня 2006 р. - Харків: Вид-во НФаУ, 2006. - С. 82 - 83. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка тез).

Болотов В.В., Клименко Л.Ю. Хіміко-токсикологічний аналіз сечі на зопіклон // Матеріали другої міжнародної конференції “Створення, виробництво, стандартизація та фармакологічні дослідження нових лікарських засобів та біологічно активних добавок”. 12 - 13 жовтня 2006 р. Харків: Вид-во НФаУ, 2006. - С. 83 - 84. (Особистий внесок здобувача - проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовка тез).

Размещено на Allbest.ru

...