Субклеточный состав сыворотки крови и мочи при бронхиальной астме: моделирование на животных и клинические аспекты

Размещено на http://www.allbest.ru

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОФИЗИОЛОГИИ» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Тема работы: «Субклеточный состав сыворотки крови и мочи при бронхиальной астме: моделирование на животных и клинические аспекты»

Авторы:

Медведева Юлия Сергеевна,

Архипова Елена Николаевна.

Научный руководитель:

Карганов Михаил Юрьевич

Введение

В настоящее время аллергическая бронхиальная астма (далее БА) успешно моделируется у мышей, крыс, морских свинок, овец, кроликов, собак, кошек и приматов. У каждого из перечисленных млекопитающих удается воспроизводить специфический спектр признаков астмы. По причине высокой стоимости, продолжительности и сложности экспериментальных работ использование крупных млекопитающих является затруднительным. Поэтому в настоящее время наиболее сбалансированной и применяемой является модель БА на лабораторных мышах [3].

Моделирование БА на лабораторных мышах имеет ряд значительных преимуществ. Уникальность «мышиной астмы» заключается в сочетании следующих факторов. Прежде всего, удается обеспечить высокую степень соответствия ключевых гистологических, иммунных и функциональных признаков экспериментальной патологии и астмы человека. В настоящее время хорошо отработана технология получения чистых линий трансгенных и нокаутных мышей. Мыши являются удобным экспериментальным объектом по причине невысоких материальных и трудовых затрат на их содержание, питание, а также короткого репродуктивного цикла.

Известно, что выяснение влияния наследственности человека на патологические проявления, ассоциированные с БА, представляет значительные трудности, поскольку невозможно включить в исследование генетически однородные группы испытуемых. По сути, чистые линии животных позволяют проводить эксперименты, оценивающие влияние только внешних факторов на едином «генетическом» фоне.

Недостаточность современных знаний о причинах развития астмы вынуждает воспроизводить отдельные признаки морфологических и функциональных изменений, характерных для данной патологии, а не для заболевания в целом. бронхиальный астма метаболический гомеостаз

В данной работе мы воспроизвели модель БА на мышах [4], оценили метаболические сдвиги сывороточного гомеостаза при развитии заболевания и сравнили данные показатели с метаболическими изменениями у пациентов с БА.

Материалы и методы

Экспериментальная работа по моделированию бронхиальной астмы проводилась на мышах линии C57BL (30 самцов, 21 самка), массой 18-20 г. В течение эксперимента животные содержались в стандартных условиях вивария.

Использовали краткосрочную безадъювантную модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у лабораторных мышей с использованием аллергена пыльцы тимофеевки [3]. Животных опытной группы (самцы n=10, самки n=9) иммунизировали внутрибрюшинно 20 мкг/мышь экстракта пыльцы тимофеевки полевой («Микроген», Ставрополь) по схеме 7 раз через день. Через 3 недели после окончания интраперитонеальных инъекций проводили 8-кратное ежедневное интраназальное введение аллергена по 500 мкг/мышь. Контрольная группа была разделена на две части. Они получали ложные иммунизацию и провокацию: внутрибрюшинные и интраназальные введения физиологического раствора по схеме - в первой группе (самцы n=10, самки n=7), разводящей жидкости для экстракта пыльцы тимофеевки - во второй группе (самцы n=10, самки n=7). В конце эксперимента (через 5 недель) все животные были подвергнуты эвтаназии путем декапитации.

Производили подсчет лейкоцитарной формулы. Сыворотку крови использовали для дальнейших исследований на лазерном корреляционном спектроскопе. Для патогистологического исследования от каждого животного брали легкие и фиксировали их в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина. Кусочки органов заливали в парафин и готовили гистосрезы толщиной 5-7 мкм на микротоме МНС-2 по общепринятым методикам с последующим их окрашиванием гематоксилином Майера и эозином.

Дополнительно проводили окраску альциановым синим на выявление слизи. После чего ядра клеток окрашивались в красный, слизь в сине-зеленый цвет. Окраску на тучные клетки проводили толуидиновым синим. В результате наблюдали окружающие ткани - синего цвета, тучные клетки - фиолетового, пурпурно-красного цвета. При окраске на соединения железа (III) по Перлсу ядра клеток окрашивались в красный цвет, соединения железа (III) окрашивались в темно-синий цвет.

Субфракционный состав сыворотки крови мышей изучали методом лазерной корреляционной спектроскопии. Данный метод позволяет определить соотношение частиц разного размера в различных биологических жидкостях (сыворотке крови, моче и т.д.). Для многокомпонентных образцов результатом обработки является кривая с несколькими выраженными пиками. Сравнение площадей под кривой позволяет определить изменение процентного вклада в светорассеяние частиц разного размера. Для характеристики смещения размеров частиц было принято целесообразным разделить всю область размеров на несколько интервалов. Для гистограмм сыворотки крови мышей можно выделить три основных интервала: 1 - от 0 до 20,58 нм, 2 - от 20,58 до 91,26 нм, 3 -свыше 91,26 нм. Для анализа использовались два критерия: сдвиг - характеристика интервала (небольшие, но устойчивые изменения размеров частиц), и различие в % - количественное изменение частиц [2].

Результаты и обсуждение

Морфологический анализ ткани легких у животных контрольной группы, получавших физиологический раствор, показал отсутствие патологических изменений. При окраске альциановым синим слизь обнаруживалась на поверхности слизистой оболочки бронхов лишь в виде тонкого слоя. Тучные клетки в единичном экземпляре встречались крайне редко.

У контрольной группы, получавшей разводящую жидкость, паренхима органа отличалась разнообразной картиной на разных участках среза. Форма и размер альвеол варьировал, большая часть из них сохраняла обычный план строения: альвеолярная стенка хорошо развита, представлена среднего размера альвеолоцитами, полость альвеол равномерно округлая, не увеличена. Отдельные группы альвеол, располагающиеся ближе к бронхам, отличались несколько утолщённой стенкой за счёт слабого отёка межальвеолярных перегородок. На периферийных участках гистологического среза лёгких отмечались небольшого размера маргинальные ателектазы в виде расширения альвеол, истончения их стенок с разрывом межальвеолярных перегородок и слиянием альвеолярных полостей. В срезах были представлены крупного, среднего и мелкого размера бронхи без признаков склероза стенок. Эпителий крупных бронхов был нормальный. В отдельных мелкого и среднего размера бронхах наблюдается умеренно выраженная десквамация эпителия. При окраске срезов альциановым синим, на поверхности слизистой оболочки таких бронхов обнаружилось небольшое количество слизи. При окраске срезов толуидиновым синим найдены единичные тучные клетки, располагающиеся преимущественно в перибронхиальной соединительной ткани среднего и мелкого размера бронхов.

В тканях легких мышей опытной группы были обнаружены выраженные патологические изменения. Слизистая оболочка крупных бронхов была утолщенной, имела складки, что свидетельствует об их спазме. Наблюдали высокий, вытянутой пальцевидной формы эпителий бронхов. Апикальная часть реснитчатых эпителиоцитов была в состоянии деструкции, часто отпадала в просвет бронха, ворсинчатая каёмка на апикальной части клеток была выражена плохо. Поверхность слизистой оболочки бронха обнаружили покрытой обильным количеством зернистой белковой массы, которая давала положительную реакцию при окраске на слизь альциановым синим (Рис. 1А). В эпителиальном слое слизистой оболочки встречались многочисленные бокаловидные клетки. Базальная мембрана эпителия бронхов была утолщена. Вокруг бронхов встречалась умеренно выраженная лейкоцитарная инфильтрация. При окраске гистологических срезов толуидиновым синим в очагах перибронхиальной лейкоцитарной инфильтрации выявлялись многочисленные лаброциты (тучные клетки).

В мелких бронхах был менее выражен спазм и деструкция эпителия слизистой оболочки, однако из-за небольшого диаметра бронхов обильное слизеобразование и десквамация эпителия привела к закупорке их просвета (слизистая пробка). Однако такая картина наблюдается нечасто. Скопление зернистой массы в центре бронха - это результат слизистой дистрофии эпителия бронхов и его десквамации в просвет бронха с образованием слизистой пробки (Рис. 1Б).

Рис. 1. Окраска бронха мыши опытной группы, А - окраска слизи в бронхе альциановым синим. Интенсивно синим цветом окрашена слизь, в центре бронха видна слизистая пробка, Б - Окраска гематоксилином и эозином структуры бронха. В центре бронха скопление зернистой массы (тёмно-красный цвет) - слизистая пробка. Увеличение 10Х10.

Мыши относятся к организмам с лимфоцитарным профилем крови (так же как крысы, кролики, человек). Проведенный нами анализ относительного лейкоцитарного состава крови показал значимый лимфоцитоз в опытной группе и снижение нейтрофилов до нижней границы нормы (Рис. 2).

Рис.2. Процент нейтрофилов и лимфоцитов у контрольных и опытных мышей с моделью БА. * - p < 0,05, критерий Манна-Уитни.

Нейтропения характеризуется тем, что клетки разрушаются быстрее, чем производятся, это наблюдается при некоторых бактериальных инфекциях, аллергических и аутоиммунных заболеваниях, а также при приеме ряда лекарств.

Изменения в клеточном составе крови и тканях приводят к изменениям в составе сыворотки крови. Метод ЛКС позволяет оценить вклад в светорассеяние частиц различного гидродинамического радиуса для биологических жидкостей, в том числе для сыворотки крови и мочи. При сравнении ЛК-гистограмм сыворотки крови мышей в опыте наблюдается значимое снижение вклада в светорассеяние частиц в точках 37 и 91 нм и тенденция к увеличению вклада частиц размером 122 - 165 нм по сравнению с контрольной группой (Рис. 3).

Рис. 3. ЛКС-гистограмма сыворотки крови мышей при моделировании БА.

У мышей опытной группы при моделировании БА отмечается большое количество смешанных сдвигов, которые характеризуются значительным вкладом в светорассеяние частиц малого размера (менее 10 нм) и крупных частиц (71-150 нм) (Рис. 4).

Увлечение вклада частиц зоны 71-150 нм характерно для аллергических процессов, в то время как увеличение зоны <10 нм является следствием возрастания в сыворотке мелких белков (альфа-1, альфа-2, бета- глобулинов) и является показателем острых воспалений.

Рис. 4. Частота встречаемости различных метаболических сдвигов у мышей при моделировании БА, %.

Так как исследованиям биологических жидкостей людей было отведено достаточно много экспериментов с использованием метода ЛКС, то шкалу абсцисс со временем и с накоплением данных стали делить на более крупные интервалы, так называемые информативные зоны частиц. По оси абсцисс стали откладывать гидродинамические радиусы частиц в информативных зонах (нм): для сыворотки крови - I - 0-10 нм; II - 11-30 нм; III - 31-70 нм; IV - 71-150 нм; V - 150 и выше соответственно, для мочи - I - менее 75 нм; II - 76-220 нм; III - 221-1500 нм; IV - более 1500 нм. По оси ординат - также вклад частиц в светорассеяние в %.

На основании данных, полученных при исследовании здоровых людей (без верифицированного диагноза), были построены усредненные гистограммы распределения светорассеивающих частиц по размерам для крови и мочи - так называемые «нормальные» спектры (Рис. 5). Анализ аналогичных гистограмм пациентов с аллергической бронхиальной астмой показал, что в образцах мочи больных преобладают, по сравнению с «нормальными» спектрами, крупные частицы размером 221-1500 (III зона). Такое изменение спектральных показателей, согласно семиотическому классификатору, определяется как «аллергоподобные сдвиги» [1]. Основная идея «семиотического классификатора» основана на том, что формирование патологических сдвигов в организме человека зависит не только от конкретной природы заболевания, но и от взаимодействия саногенетических механизмов организма. В ЛК-спектрах сыворотки крови увеличивается вклад в светорассеяние частиц малого размера, что свидетельствует об усилении процессов деградации молекул, характерных для состояний, сопровождающихся интоксикацией организма («интоксикационноподобные сдвиги»).

 _%

Рис. 5. Усредненные гистограммы ЛК-спектров мочи и сыворотки крови здоровых людей и пациентов с аллергическими заболеваниями бронхолегочной системы. По оси абсцисс - гидродинамические радиусы частиц в информативных зонах (нм): для мочи - I - менее 75 нм; II - 76-220 нм; III - 221-1500 нм; IV - более 1500 нм и сыворотки крови - I - 0-10 нм; II - 11-30 нм; III - 31-70 нм; IV - 71-150 нм; V - 150 и выше соответственно. По оси ординат - вклад частиц в светорассеяние (%). * - p < 0,05, критерий Манна-Уитни.

Чтобы выяснить, какой вклад в метаболический гомеостаз вносят сопутствующие бронхиальной астме заболевания, провели ЛК-исследование образцов мочи и сыворотки крови пациентов, у которых была выявлена только БА, и пациентов с сопутствующим круглогодичным аллергическим ринитом (КАР). Не выявив достоверно значимых различий в распределении светорассеивающих частиц (Рис. 6), объединили эти две группы в одну и работали далее с одной большой когортой пациентов с БА.

Рис. 6. Усредненные гистограммы ЛК-спектров мочи и сыворотки крови пациентов с БА и с БА с сопутствующим круглогодичным аллергическим ринитом (КАР). Обозначения осей как на Рис.5.

Всех пациентов разделили на три подгруппы. Первую подгруппу составили пациенты, которые вне зависимости от степени тяжести проявлений аллергосиндрома быстро отвечали на базовую терапию и при минимальном объеме детоксикационных и иммунологических мероприятий достигали медикаментозной ремиссии. Пациенты этой группы достигали самых лучших результатов в снижении дозировок базовых препаратов.

Во второй подгруппе при наличии яркой клинической картины лабораторные показатели отмечали кажущееся благополучие. Дальнейшее клиническое наблюдение за этой подгруппой пациентов позволило сделать вывод о том, что, по-видимому, имел место компенсаторный срыв детоксикационной функции мочевыделительной системы (при нормальном клиническом анализе мочи). Эта подгруппа является переходной. Требовался несколько больший объем детоксикационных мероприятий и иммунологического сопровождения для достижения ремиссии. Пациенты чаще при снижении дозировок базовых препаратов дестабилизировались и возвращались к более высоким дозам.

Третья подгруппа - на этой стадии эндотоксикоза происходит снижение общей активности комплемента, как проявление компенсаторного срыва уже в системе иммунитета. Пациенты при максимальном иммунологическом сопровождении базовой противовоспалительной терапии дольше всего стабилизировались. Снижение доз базовых препаратов в этой группе шло медленнее всего.

Для ЛК-спектров мочи характерно сходное распределение частиц по размерам во всех обследованных подгруппах: максимальный вклад в светорассеяние вносят частицы размером 220-1500 нм (Рис. 7). Появление в спектрах крупных частиц может указывать на развитие процессов аллергизации в организме.

Рис. 7. Распределение светорассеивающих частиц в образцах мочи пациентов с различной степенью нарушений в состоянии защитных систем организма. По оси абсцисс - гидродинамические радиусы частиц в информативных зонах (нм): I - менее 75 нм; II - 76-220 нм; III - 221-1500 нм; IV - более 1500 нм. По оси ординат - вклад частиц в светорассеяние (%).

Анализ ЛК-спектров сыворотки крови выявил значимые отличия в распределении светорассеивающих частиц в трех обследованных подгруппах. В Гр.1 максимальный вклад в светорассеяние вносят частицы IV зоны (71-100 нм). В Гр.2 и Гр.3 доля частиц IV зоны снижена, а II зоны (11-30 нм) увеличена по сравнению с Гр.1 (р<0,05; критерий Манна-Уитни). По характеру распределения светорассеивающих частиц можно предположить, что в Гр.1 преобладают «анаболические сдвиги» сывороточного гомеостаза. Как известно, при аллергических нарушениях происходит активация Th2-клеток и повышена продукция цитокинов: ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13 [5]. ИЛ-5 способствует созреванию эозинофилов и их активации. ИЛ-4/ИЛ-13 индуцируют В-клетки к синтезу IgE [6, 7]. Следовательно, с иммунологических позиций аллергический процесс на начальных этапах заболевания сопровождается появлением в крови крупных молекулярных комплексов.

Пациенты с «катаболическим» типом сдвигов составляют в Гр.1 20% , в Гр.2 - 50%, в Гр. 3 -62% (Рис. 8). Таким образом, доля больных с эндогенной интоксикацией значимо выше в Гр.2 и Гр.3 по сравнению с Гр.1 (р < 0,05; двусторонний критерий Фишера).

Рис. 8. Частота встречаемости различных типов ЛК-спектров в группах пациентов с различной степенью нарушений в состоянии защитных систем организма. Пояснения в тексте.

Эмпирические выводы, сделанные на основе клинических наблюдений, объясняющие распределение пациентов по трем группам нашли подтверждение при ЛКС тех же сред. Преобладание интоксикационноподобных сдвигов в ЛК-спектрах сыворотки пациентов 2 и 3 подгрупп позволило сделать вывод о наличии смешанного характера воспалительного процесса у этих пациентов. Таким образом, в этих группах речь идет уже не только об аллергическом воспалении: при компенсаторном срыве мочевыделительной, а затем и иммунной систем присоединяется инфекционное воспаление.

Моделирование БА на мышах с гистологическим подтверждением развившейся патологии позволило определить тип основных метаболических процессов происходящих в сыворотке крови и показало сходство ЛК-гистограмм у иммунизированных мышей и людей с БА. При моделировании БА на мышах наблюдали отчетливую тенденцию к увеличению вклада в светорассеяние частиц сыворотки крови в диапазоне 122-165 нм. При обследовании пациентов с разными уровнями тяжести этого заболевания нарастал сходный диапазон частиц 71-150 нм (Рис. 5) за счет сильного уменьшения вклада в светорассеяние частиц 30-70 нм. При этом максимально этот диапазон был увеличен в первой подгруппе пациентов (Рис. 8. зона IV), которые находились на ранней стадии развития заболевания (вне зависимости от тяжести проявлений).

При моделировании того или иного заболевания следует учитывать стадию развития болезни, которую получает исследователь и использует в последующих экспериментах.

Известно, что одни линии предрасположены к гиперпродукции IgE, другие - к развитию воспалительных изменений, а у третьих более выражены фиброзные процессы в легких. Кроме определения маркеров патологии, необходимо учитывать комплексные функциональные изменения организма животных.

Список литературы:

1. Бажора Ю.И., Носкин Л.А. Лазерная корреляционная спектроскопия в медицине. - Одесса: Друк.-2002.-397 с.

2. Karganov M., Alchinova I., Arkhipova E., Skalny A.V. - Laser Correlation Spectroscopy: Nutritional, Ecological and Toxic Aspects. In: “Biophysics”. A.N. Misra ed.- InTech, 2012. -ISBN 978-953-51-0376-9. P.1-16.

3. Kryuchkov NA, Bashkatova YuN, Khaitov MR. Murine models of atopic bronchial asthma: methodology and prospects of application [Article in Russian]. Vestn Ross Akad Med Nauk 2010;(7):22-28.

4. Kryuchkov NA, Babakhin AA, Bashkatova YuN et al. An acute mice model of IgE-mediated bronchial asthma induced by timothy pollen allergen: final results [Article in Russian]. Rus Allergol J 2008; (4):37-45.

5. Ngoc PL, Gold DR, Tzianabos AO, Weiss ST, Celedуn JC. Cytokines, allergy, and asthma. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2005 Apr;5(2):161-6.

6. Ozdemir C, Akdis M, Akdis CA. T-cell response to allergens. Chem Immunol Allergy. 2010; 95:22-44.

7. Schmidt-Weber CB. Anti-IL-4 as a New Strategy in Allergy. Chem Immunol Allergy. 2012; 96:120-125.

Размещено на Allbest.ru