Валидационная оценка методов анализа новокаина в растворе для инъекций

Размещено на http://www.allbest.ru

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ

ПЯТИГОРСКИЙ ФИЛИАЛ

Валидационная оценка методов анализа новокаина в растворе для инъекций

Суровцева Елена

студент V курса 2 группы

Пятигорск 2014



Содержание

Введение

Глава 1. Общая характеристика новокаина гидрохлорида

1.1 Общая характеристика производных п-аминобензойной кислоты. Получение и физические свойства новокаина гидрохлорида

1.2 Способы идентификации новокаина гидрохлорида

1.3 Способы количественного определения новокаина гидрохлорида

1.4 Фармакологическое действие, применение в медицине и хранение лекарственных препаратов новокаина гидрохлорида

Обсуждение обзора литературы

Глава 2. Валидация методик анализа новокаина гидрохлорида в растворе для инъекций

2.1 Валидационная оценка методик качественного и количественного анализа лекарственного средства по показателю «Специфичность»

2.1.1 Установление специфичности в тестах «Испытание на подлинность»

2.1.2 Установление специфичности в тестах «Количественное определение»

2.2 Валидационная оценка методик количественного определении новокаина гидрохлорида по показателю «Прецизионность»

2.2.1 Определение прецизионности методики титриметрического анализа

2.2.2 Определение прецизионности методики спектрофотометрического

анализа

2.3 Валидационная оценка методик количественного определении новокаина гидрохлорида по показателю «Линейность»

2.3.1 Определение линейности методики титриметрического анализа

2.3.2 Определение линейности методики спектрофотометрическог анализа

2.4 Валидационная оценка методик количественного определения новокаина гидрохлорида по показателю «Правильность»

2.4.1 Определение правильности методики титриметрического анализа

2.4.2 Определение правильности методики спектрофотометрического анализа

Выводы по главе 2

Общие выводы

Список литературы

валидация новокаин гидрохлорид



Введение

Длительное время новокаина гидрохлорид (прокаина гидрохлорид) являлся местным анестетиком, применявшимся в хирургической практике. По сравнению с современными местными анестетиками (лидокаином, бупивакаином и др.), прокаин обладает менее сильной анестезирующей активностью. Однако в связи с относительно малой токсичностью, большой терапевтической широтой и дополнительными ценными фармакологическими свойствами, позволяющими использовать его в различных областях медицины, он до сих пор имеет широкое применение.

В медицине прокаина гидрохлорид широко используется для местной анестезии, кроме того, назначают его для лечения блокад. Иногда препарат используют для внутрикостной анестезии, для анестезии слизистых оболочек в оториноларингологии.

Современной фармацевтической промышленностью выпускаются растворы для инъекций, мази и суппозитории, содержащие прокаина гидрохлорид. Однако для применения лекарственных форм в медицинской практике необходимо предложить методики качественного и количественного анализа фармакологически активных компонентов, позволяющие достоверно оценивать его качество.

Количественный анализ пробы вещества или ингредиента лекарственного средства - это экспериментальное определение содержания одного или ряда компонентов физическими или химическими методами. Количественный химический анализ проводят согласно методикам анализа, утвержденным в установленном порядке, посредством прямых или косвенных измерений с использованием объемных методов анализа или физико-химических приборов. Любая аналитическая методика должна быть утверждена в установленном порядке, что подтверждает ее метрологическая аттестация. Для этой цели в фармацевтической практике используют метод валидации, то есть экспериментальное доказательство, что методика пригодна для выполнения поставленных задач.

Цели и задачи исследования. В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования является изучение методов анализа лекарственных средств, содержащих новокаина (прокаина) гидрохлорид; валидационная оценка методик качественного и количественного анализа парентерального лекарственного средства, содержащего прокаина гидрохлорид.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- изучить литературные данные и современное состояние в области анализа прокаина гидрохлорида;

- исследовать возможность использования химических и физико-химических методов для идентификации и количественного определения прокаина гидрохлорида в лекарственном средстве;

- обосновать выбор методик анализа раствора для инъекций, содержащего прокаина гидрохлорид;

- использовать валидационные характеристики для оценки используемых методов анализа;

- доказать валидность методик идентификации и количественного определения прокаина гидрохлорида в лекарственном средстве.

Научная новизна и практическая значимость: в результате проведенных исследований предложены методики анализа раствора для инъекций с прокаина гидрохлоридом. Методики характеризуются простотой выполнения, экспрессностью, высокой чувствительностью и позволяют достоверно оценивать качество исследуемого препарата.



Глава 1. Общая характеристика новокаина гидрохлорида

1.1 Общая характеристика производных п-аминобензойной кислоты. Получение и физические свойства новокаина гидрохлорида

Сложные эфиры п-аминобензойной кислоты применяют в качестве местноанестезирующих средств. Предпосылкой создания этой группы синтетических лекарственных веществ явилась попытка найти аналоги алкалоида кокаина, обладающего местно-анестезирующим эффектом, но вызывающего пристрастие (кокаинизм). В результате исследования химической структуры производных кокаина и их фармакологического действия было установлено, что местно-анестезирующий эффект обусловлен не всей молекулой кокаина, а отдельными ее структурными фрагментами, названными анестезиофорной группой:

На основе полученных данных было синтезировано и исследовано несколько тысяч соединений, содержащих анестезиофорную группу. Из них наиболее высокую активность проявили производные п-аминобензойной кислоты с общей формулой:



К ним относятся бензокаин, новокаина гидрохлорид и тетракаина гидрохлорид.

Новокаина гидрохлорид по химической структуре представляет собой в-диэтиламиноэтилового эфира п-аминобензойной кислоты гидрохлорид[1,2]:

Получение новокаина гидрохлорида

Исходным продуктом для синтеза новокаина гидрохлорида служит п-нитробензойная кислота (или ее хлорангидрид). п-Нитробензойную кислоту получают окислением п-нитротолуола хромовой смесью:



Далее путем ацилирования этанола с помощью п-нитробензойной кислоты и последующим восстановлением полученного эфира п-нитробензойной кислоты получают бензокаин:

Путем последующей переэтерификации бензокаина в-диэтиламиноэтанолом в присутствии алкоголята натрия получают новокаин:

Новокаин можно также получить подобно бензокаину при взаимодействии хлорангидрида п-нитробензойной кислоты и в-диэтиламиноэтанола с последующим гидрированием нитрогруппы [1,3].

Физические свойства новокаина гидрохлорида

Новокаина гидрохлорид по физическим свойствам представляет белый кристаллический порошок, без запаха, горького вкуса, на языке вызывает чувство онемения. Температура плавления 1540 - 1580С. Новокаина гидрохлорид очень легко растворим в воде, легко растворим в спирте, мало растворим в хлороформе, практически нерастворим в эфире [1].

1.2 Способы идентификации новокаина гидрохлорида

В основе испытаний на подлинность новокаина гидрохлорида лежит наличие у него первичной ароматической аминогруппы, третичной алифатической, способность к гидролизу [1,4,5].

Объективными константами, подтверждающими подлинность новокаина, являются максимум поглощения 0,001% раствора при 290 нм, температура плавления при 154-1580С. Подлинность прокаина гидрохлорида устанавливают по идентичности ИК-спектров, снятых после прессования в таблетках калия бромида в области 4000 - 400 см-1 и прилагаемых к ФС рисунков спектров стандартных образцов [1,4].

К общим химическим методам идентификации прокаина относятся: реакции диазотирования с последующим азосочетанием; образование шиффовых оснований, цвиттер-ионов; образование изонитрила, что обусловлено наличием первичной ароматической аминогруппы; реакция образования гидроксамовых кислот, т.к. прокаин является сложным эфиром; реакции с общеалкалоидными реактивами (пикриновой, фосфорновольфрамовой, фосфорномолибденовой кислотами, реактивами Драгендорфа, Майера и др.); реакции галогенирования [1,6,7].

Взаимодействуя с нитритом натрия в кислой среде, прокаин образует соль диазония:

При добавлении полученной соли диазония к щелочному раствору в-нафтола образуется оранжевый осадок (азокраситель) [1,4]:

Вступая во взаимодействие с альдегидами, например п-диметиламинобензальдегидом в присутствии концентрированной серной кислоты, появляется оранжевое окрашивание [1,2]:

Прокаин вступает в реакцию конденсации с 2,4-динитрохлорбензолом в присутствии гидроксида натрия при нагревании, образуя цвиттер-ион хиноидной структуры. Наблюдается появление желто-оранжевого окрашивания. Окрашенное соединение извлекается хлороформом после подкисления уксусной кислотой [1,2]:

Под действием хлороформа и спиртового раствора гидроксида натрия прокаин образует изонитрил, имеющий тошнотворный запах[1,2]:

Продукт конденсации прокаина с гексаметилентетрамином в присутствии концентрированной серной кислоты обладает слабо-фиолетовой флуоресценцией.

Лекарственное вещество может быть идентифицировано с помощью общеалкалоидных реактивов (выпадают окрашенные осадки):



и с помощью реакции галогенирования:

Являясь сложным эфиром, прокаина гидрохлорид при взаимодействии с гидроксиламином в щелочной среде образует гидроксамовую кислоту:

Полученный раствор подкисляют хлороводородной кислотой, прибавляют раствор хлорида железа (III), образуется гидроксамат железа, имеющий вишневое окрашивание[1,6,7]:



Частной реакцией на прокаина гидрохлорид является взаимодействие с пергидролем и концентрированной серной кислотой (появляется сиреневое окрашивание), а со смесью концентрированных серной и азотной кислот прокаин при нагревании образует оранжево-красное окрашивание.

При добавлении к водному раствору прокаина кислоты хлористоводородной и 0,1М раствора калия перманганата фиолетовая окраска тотчас исчезает. Данная реакция является фармакопейной на прокаина гидрохлорид.

Как соль хлористоводородной кислоты, прокаина гидрохлорид вступает в реакцию с раствором серебра нитрата, образуя белый творожистый осадок, растворимый в растворе аммиака [1,7].

1.3 Способы количественного определения новокаина гидрохлорида

Согласно НД для количественного определения прокаина гидрохлорида используют метод нитритометрического титрования:



Точку эквивалентности можно установить потенциометрически или с помощью внутренних индикаторов (нейтральный красный, тропеолин 00 или смесь тропеолина 00 и метиленового синего) [1,8,9].

Прокаин может быть определен по связанной хлороводородной кислоте методом алкалиметрии (индикатор - фенолфталеин):

Возможно также аргентометрическое определение по хлорид-иону:

+ AgNO3 >

+ AgClv + HNO3

При этом в качестве индикатора могут быть использованы хромат калия (метод Мора):

2AgNO3 + K2CrO4 > Ag2CrO4v + 2KNO3

оранжево-красный

или железоаммониевые квасцы (обратная аргентометрия - метод Фольгарда). Избыток нитрата серебра определяют тиоцианатометрическим методом:

AgNO3 + NH4NCS > AgNCSv + NH4NO3

3NH4NCS + Fe NH4(SO4)2 > Fe(NCS)3 + 2(NH4)2SO4

Известны методики бромид-броматометрического и иодхлорметрического определения прокаина, основанные на образовании дибром- и дииодпроизводных:



Для количественного определения прокаина гидрохлорида также используют неводное титрование в среде безводной уксусной кислоты в присутствии ацетата ртути (II) или в среде муравьиной кислоты и уксусного ангидрида. Титрантом служит 0,1М раствор хлорной кислоты, точку эквивалентности устанавливают визуально (в качестве индикатора используют кристаллический фиолетовый) или потенциометрически [1,2]:

Для количественного определения прокаина в лекарственных формах используют спектрофотометрический метод. Определение проводят в максимумах светопоглощения при 298 нм (растворитель - вода очищенная) или при 290 нм (растворитель - 0,001М раствор хлороводородной кислоты). Разработаны также методики фотоколориметрического определения, основанные на реакции образования азокрасителя или гидроксамовой пробы [1,2].

1.4 Фармакологическое действие, применение в медицине и хранение лекарственных препаратов новокаина гидрохлорида

Новокаина гидрохлорид - местноанестезирующий лекарственный препарат. Местноанестезирующее действие прокаина связано с его влиянием на процесс генерации возбуждения и способностью блокировать проведение импульса по нервным волокнам. Являясь слабым основанием, блокирует Na+- каналы, препятствует генерации импульсов в окончаниях чувствительных нервов и проведению импульсов по нервным волокнам. Изменяет потенциал действия в мембранах нервных клеток без выраженного влияния на потенциал покоя. Подавляет проведение не только болевых, но и импульсов другой модальности [10,11,12].

При всасывании и непосредственном сосудистом введении в ток крови снижает возбудимость периферических холинергических систем, уменьшает образование и высвобождение ацетилхолина из преганглионарных окончаний (обладает некоторым ганглиоблокирующим действием), устраняет спазм гладкой мускулатуры, уменьшает возбудимость миокарда и моторных зон коры головного мозга.

При внутривенном введении оказывает анальгезирующее, противошоковое, гипотензивное и антиаритмическое действие (увеличивает эффективный рефрактерный период, снижает возбудимость, автоматизм и проводимость), в больших дозах может нарушать нервно-мышечную проводимость. Устраняет нисходящие тормозные влияния ретикулярной формации ствола мозга. Угнетает полисинаптические рефлексы. В больших дозах может вызывать судороги. Обладает короткой анестезирующей активностью (продолжительность инфильтрационной анестезии составляет 0,5-1 ч).

При внутримышечном введении эффективен у пожилых пациентов на ранних стадиях заболеваний, связанных с функциональными нарушениями центральной нервной системы (артериальная гипертензия, спазмы коронарных сосудов и сосудов мозга и др.). Помимо этого, при всасывании и непосредственном введении в ток крови прокаин оказывает общее влияние на организм [14,15].

В организме прокаин подвергается полной системной абсорбции. Степень абсорбции зависит от места и пути введения (особенно от васкуляризации и скорости кровотока в области введения) и итоговой дозы (количества и концентрации). Быстро гидролизуется эстеразами плазмы и печени с образованием 2-х основных фармакологически активных метаболитов: диэтиламиноэтанола (обладает умеренным сосудорасширяющим действием) и ПАБК (является конкурентным антагонистом сульфаниламидных химиотерапевтических лекарственных средств и может ослабить их противомикробное действие). T1/2 -- 30-50 с, в неонатальном периоде -- 54-114 с. Выводится преимущественно почками в виде метаболитов, в неизмененном виде выводится не более 2 %.

Длительное время прокаин являлся местным анестетиком, применявшимся в хирургической практике. По сравнению с современными местными анестетиками (лидокаином, бупивакаином и др.) обладает менее сильной анестезирующей активностью. Однако в связи с относительно малой токсичностью, большой терапевтической широтой и дополнительными ценными фармакологическими свойствами, позволяющими использовать его в различных областях медицины, он до сих пор имеет широкое применение [11,12].

Прокаин широко используется для местной анестезии. Кроме того, назначают его для лечения блокад. Иногда препарат используется также для внутрикостной анестезии. При местной анестезии концентрация растворов прокаина гидрохлорида и их количество зависят от характера оперативного вмешательства, способа применения, состояния и возраста больного. Прокаин иногда используют для анестезии слизистых оболочек в оториноларингологии.

Препарат рекомендуется также для лечения различных заболеваний. Внутрикожные инъекции 0,25-0,5% раствора рекомендуются для циркуляторной и паравертебральной блокады при экземах, нейродерматите, радикулите и др. Внутривенно и внутрь прокаин принимают при токсикозах беременных с гипертоническим синдромом, спазмах кровеносных сосудов, фантомных болях, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, неспецифическом язвенном колите, зуде, нейродерматите, экземе, тошноте и т.д. В связи со способностью препарата уменьшить возбудимость сердечной мышцы его применяют при мерцательной аритмии [11,12].

Суппозитории с прокаином назначают как местноанестезирующее и спазмолитическое средство при спазмах гладкой мускулатуры кишечника, при геморрое. Препарат в виде 5-10% растворов применяют, используя метод электрофореза. Прокаин входит в состав комплексного препарата «Меновазин», а также в состав препарата «Сульфокамфокаин».

Режим дозирования

Для инфильтрационной анестезии по 350--600 мг 0,25-0,5 % растворы; для анестезии по методу Вишневского (тугая ползучая инфильтрация) -- 0,125-0,25 % растворы; для проводниковой анестезии -- 1-2 % растворы (до 25 мл); для эпидуральной -- 2 % раствор (20-25 мл); для спинальной -- 5 % раствор (2-3 мл); для терминальной анестезии (в оториноларингологии) -- 10-20 % раствор. Для уменьшения всасывания и удлинения действия при местной анестезии, дополнительно вводят 0,1 % раствор эпинефрина гидрохлорида -- по 1 капле на 2-5-10 мл раствора прокаина.

При паранефральной блокаде (по А. В. Вишневскому) в околопочечную клетчатку вводят 50-80 мл 0,5 % раствора или 100--150 мл 0,25 % раствора, а при вагосимпатической блокаде -- 30-100 мл 0,25 % раствора. 10 % раствор применяют также для электрофоретического введения.

Высшие дозы для инфильтрационной анестезии для взрослых: первая разовая доза в начале операции -- не выше 1 г 0,25 % раствора (500 мл) и 0,75 г 0,5 % раствора (150 мл). Максимальная доза для применения у детей до 15 мг/кг.

Ректально. Предварительно освободив свечу от контурной упаковки при помощи ножниц (разрезав упаковку по контуру свечи), вводят её глубоко в задний проход (после очистительной клизмы или самопроизвольного освобождения кишечника) 1-2 раза в день.

Побочные действия

Препарат обычно хорошо переносится, однако он может вызывать побочные явления [11,12]:

Со стороны центральной и периферической нервной системы: головная боль, головокружение, сонливость, слабость, двигательное беспокойство, потеря сознания, судороги, тризм, тремор, зрительные и слуховые нарушения, нистагм, синдром конского хвоста (паралич ног, парестезии), паралич дыхательных мышц, блок моторный и чувствительный, респираторный паралич чаще развивается при субарахноидальной анестезии.

Со стороны сердечно-сосудистой системы: повышение или снижение артериального давления, периферическая вазодилатация, коллапс, брадикардия, аритмии, боль в грудной клетке.

Со стороны мочевыделительной системы: непроизвольное мочеиспускание.

Со стороны пищеварительной системы: тошнота, рвота, непроизвольная дефекация.

Со стороны крови: метгемоглобинемия.

Аллергические реакции: зуд кожи, кожная сыпь, анафилактические реакции (в том числе анафилактический шок), крапивница (на коже и слизистых оболочках).

Прочие: возвращение боли, стойкая анестезия, гипотермия, импотенция; при анестезии в стоматологии: нечувствительность и парестезии губ и языка, удлинение анестезии.

Передозировка

Передозировка лекарственными средствами, содержащими прокаин сопровождается следующими симптомами: бледность кожных покровов и слизистых оболочек, головокружение, тошнота, рвота, «холодный» пот, учащение дыхания, тахикардия, снижение артериального давления, вплоть до коллапса, апноэ, метгемоглобинемия. Действие на центральную нервную систему проявляется чувством страха, галлюцинациями, судорогами, двигательным возбуждением [10,11,12].

Особые указания

Пациентам требуется контроль функций сердечно-сосудистой системы, дыхательной системы и центральной нервной системы. Необходимо отменить ингибиторы МАО за 10 дней до введения местного анестетика. В период лечения необходимо соблюдать осторожность при вождении автотранспорта и занятии др. потенциально опасными видами деятельности, требующими повышенной концентрации внимания и быстроты психомоторных реакций.

Взаимодействие

Местные анестетики усиливают угнетающее действие на центральную нервную систему др.

Антикоагулянты (ардепарин, далтепарин, данапароид, эноксапарин, гепарин, варфарин) повышают риск развития кровотечений.

При обработке места инъекции местного анестетика дезинфицирующими растворами, содержащими тяжелые металлы, повышается риск развития местной реакции в виде болезненности и отека.

При использовании местноанестезирующих лекарственных средств для спинальной и эпидуральной анестезии с гуанадрелем, гуанетидином, мекамиламином, триметафаном повышается риск развития резкого снижения артериального давления и брадикардии.

Использование с ингибиторами МАО (прокарбазин, селегилин) повышает риск развития гипотензии. Усиливают и удлиняют действие миорелаксирующих лекарственных средств.

При назначении прокаина совместно с наркотическими анальгетиками отмечается аддитивный эффект, что используется при проведении спинальной и эпидуральной анестезии, при этом усиливается угнетение дыхания.

Вазоконстрикторы (эпинефрин, метоксамин, фенилэфрин) удлиняют местноанестезирующее действие.

Прокаин снижает антимиастеническое действие лекарственных средств, особенно при использовании его в высоких дозах, что требует дополнительной коррекции лечения миастении.

Ингибиторы холинэстеразы (антимиастенические лекарственные средства, циклофосфамид, демекарин, экотиофат) снижают метаболизм местноанестезирующих лекарственных средств.

Метаболит прокаина (ПАБК) является антагонистом сульфаниламидов [14,15].

Формы выпуска

Прокаина гидрохлорид выпускается в виде следующих лекарственных форм [11,12]:

0,25% и 0,5% растворы для инъекций в ампулах по 1, 2, 5, 10 и 20 мл и во флаконах по 200 и 400 мл;

1% и 2% растворы для инъекций в ампулах по 1, 2, 5 и 10 мл;

5% и 10% мази;

суппозитории ректальные по 0,1 г;

комбинированные препараты: «Сульфокамфокаин», «Меновазин».

Хранение

Прокаин и содержащие его лекарственные средства хранят с предосторожностью (список Б) в хорошо укупоренной таре, предохраняющей от действия света [1].

Обсуждение обзора литературы

В медицинской практике прокаина гидрохлорид широко применяется в качестве местноанестезирующего лекарственного средства. Прокаина гидрохлорид используют для инфильтрационной, проводниковой, эпидуральной и спинномозговой анестезии; вагосимпатической и паранефральной блокаде; болевом синдроме при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, геморрое, тошноте.

Современной фармацевтической промышленностью выпускаются растворы для инъекций, мази и суппозитории, содержащие прокаина гидрохлорид. Однако для применения данных лекарственных средств в медицинской практике необходимо предложить методики качественного и количественного анализа фармакологически активных компонентов, позволяющие достоверно оценивать его качество.

Изучение литературных данных свидетельствует о разнообразии методов анализа прокаина гидрохлорида. Для идентификации и количественного анализа прокаина в лекарственных средствах широко применяются как химические, так и физико-химические методы анализа. С целью обоснования методик качественного и количественного анализа прокаина гидрохлорида в растворе для инъекций актуальными являются исследования по определению валидационных характеристик методов анализа.

Глава 2. Валидация методик анализа новокаина гидрохлорида в растворе для инъекций

Состав лекарственного средства:

Новокаина гидрохлорида 5,0

Раствора кислоты хлористоводородной 0,1 моль/л до рН 3,8-4,5

Воды для инъекций до 1000 мл

По внешнему виду анализируемая лекарственная форма представляет собой бесцветную прозрачную жидкость без запаха.

Для идентификации и количественного определения прокаина гидрохлорида и глюкозы в лекарственном средстве изучена возможность использования химических и физико-химических методов, описанных в литературе. Выбор описанных ниже методик обусловлен простотой выполнения, экспрессностью и доступностью реактивов.

Определение подлинности.

Новокаина гидрохлорид. 1. К 2 мл препарата прибавляют 5-6 капель кислоты хлористоводородной разведенной, 2-3 капли 0,1М раствора натрия нитрита и 0,1-0,3 мл полученной смеси вливают в 1-2 мл щелочного раствора в-нафтола. Образуется оранжево-красный осадок или вишневое окрашивание.

2. К 2 мл препарата прибавляют 3 капли кислоты серной разведенной и 1 мл 0,02М раствора калия перманганата. Фиолетовая окраска тотчас исчезает.

Количественное определение.

Нитритометрия

К 25 мл препарата прибавляют 10 мл кислоты хлористоводородной разведенной, доводят объем раствора водой до 80 мл, прибавляют 0,5 г калия бромида, 2 капли раствора тропеолина 00, 1 каплю раствора метиленового синего, раствор охлаждают до 0-50С и титруют 0,05М раствором натрия нитрита, добавляя его в начале по 0,2-0,3 мл через 1 мин, а в конце титрования (за 0,1 - 0,2 мл до точки эквивалентности) по 1-2 капли через 1 мин до перехода красно-фиолетовой окраски в голубую.

1 мл 0,05М раствора натрия нитрита соответствует 13,64 мг прокаина гидрохлорида.

Спектрофотометрия

В мерную колбу вместимостью 250 мл переносят 0,5 мл препарата, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 288 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Параллельно измеряют оптическую плотность СО 0,001% раствора новокаина гидрохлорида.

Расчет содержания новокаина в г/мл проводят по формуле:

(1) ,

где: Ах - оптическая плотность исследуемого раствора;

Ао - оптическая плотность раствора СО новокаина;

0,00001 - содержание новокаина в г в 1 мл раствора СО.

Далее нами проведена валидационная оценка предложенных методов качественного и количественного анализа новокаина в лекарственном средстве по некоторым валидационным характеристикам.

2.1 Валидационная оценка методик качественного и количественного анализа ингредиентов лекарственного средства по показателю «Специфичность»

Под специфичностью методики следует понимать способность достоверно определять анализируемое соединение в присутствии других компонентов образца [13].

Специфичность - это способность аналитической методики давать правильный результат определения вещества в присутствии сопутствующих компонентов.

Доказательство специфичности валидируемой методики обычно основывается на рассмотрении полученных с ее использованием данных анализа модельных смесей известного состава.

Для установления специфичности согласно прописи были приготовлены

модельные смеси, содержащие:

новокаин и стабилизатор (0,1 моль/л раствор хлористоводородной кислоты) по прописи;

только новокаин;

только стабилизатор.

Далее была проведена валидационная оценка методик качественного анализа лекарственного средства по показателю специфичность.

2.1.1 Установление специфичности в тестах

«Испытание на подлинность»

Для установления специфичности следует убедиться в отсутствии положительного эффекта реакции на сопутствующие вещества.

В модельных смесях 1 и 2 с помощью качественных реакций доказана подлинность новокаина в лекарственном средстве.

В модельной смеси 3, содержащей только кислоту хлористоводородную с помощью качественных реакций на прокаина гидрохлорид доказано отсутствие аналитического эффекта у стабилизатора.

Таким образом, согласно проведенным исследованиям, доказана специфичность методик идентификации прокаина гидрохлорида в лекарственном средстве.

2.1.2 Установление специфичности в тестах

«Количественное определение»

Методики, используемые для количественного определения также должны подвергаться валидационной оценке по данному критерию. При этом для всех типов методик существуют свои особенности.

Титриметрические методы. Главным является то, что растворители и сопутствующие компоненты не должны вступать в реакцию с титрантом, а так же необходимо быть уверенным в специфичности индикатора. При анализе конкретных объектов следует приготовить модельную смесь и провести её титрование. Поскольку, в ряде случаев, затрачивается часть титранта на взаимодействие с растворителем, проводится контрольный опыт. На основании полученных данных и принимается решение о специфичности методики [13].

Спектрофотометрический метод. При выполнении анализа спектрофотометрическим методом нужно подтвердить, что сопутствующие компоненты не мешают определению.

Для определения специфичности методик титриметрического и спектрофотометрического количественного определения новокаина использовали модельную смесь 3, содержащую только стабилизатор.

Согласно методикам провели спектрофотометрический и нитритометрический анализ модельной смеси 3. Результаты исследования показали, что стабилизатор не определяется в данных условиях. Таким образом, методики специфичны для прокаина гидрохлорида.

2.2 Валидационная оценка методик количественного определения новокаина гидрохлорида по показателю «Прецизионность»

Прецизионность (воспроизводимость) - это характеристика случайного рассеяния. По существу это мера суммы случайных ошибок. При установлении прецизионности следует иметь в виду, что данная характеристика бывает трех уровней:

- повторяемость (сходимость);

- промежуточная прецизионность (внутрилабораторная воспроизводимость);

- межлабораторная воспроизводимость.

Однако для целей фармацевтического анализа бывает достаточно только первого уровня.

При установлении прецизионности существует два способа её оценки.

1. Не менее девяти определений, охватывающих диапазон применения методики (например, три концентрации / три определения для каждой);

2. Не менее шести определений для образцов с содержанием анализируемого вещества, близким к номинальному количеству.

Затем вычисляют величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD). Следует отметить, что ни один нормативный документ не устанавливает нижнюю границу прецизионности и она определяется используемым методом анализа:

В фармацевтическом анализе для нормирования значений прецизионности наиболее оптимальными можно считать рекомендации американской ассоциацией аналитической химии (АОАС), в которой приводятся данные оценки сходимости как функции аналитических концентраций (табл. 2) [13].

Таблица 1 Данные оценки прецизионности как функции концентрации анализируемого компонента

Содержание анализируемого компонента в образце, %	Относительное стандартное отклонение (RSD)
100	1,3
10	2,8
1	2,7
0,1	3,7
0,01	5,3
0,001	7,3
0,0001	11,0
0,00001	15,0
0,000001	21,0
0,0000001	30,0

2.2.1 Определение прецизионности методики титриметрического анализа

Для определения прецизионности методики нитритометрического титрования приготовили модельную смесь.

Для этого точную навеску новокаина гидрохлорида (0,05 г) помещали в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, добавляли воды для инъекций 5 мл, раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 - 4,5 и доводили объем раствора до метки водой для инъекций. Далее проводили:

Определение №1.

3 параллельных титрования, отмеривая каждый раз по 5 мл ЛП.

Определение №2.

3 параллельных титрования, отмеривая каждый раз по 10 мл ЛП.

Определение №3.

3 параллельных титрования, отмеривая каждый раз по 15 мл ЛП.

Расчет содержания прокаина гидрохлорида (г/мл) проводили по формуле:

Результаты заносили в таблицу 2 и рассчитывали стандартное отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD).

Таблица 2 Результаты установления прецизионности методики титриметрического определения прокаина гидрохлорида

Навеска, взятая на анализ, г	Объем аликвоты, взятый на анализ, мл	Объем титранта, мл	Найдено, г/мл	Метрологические характеристики
0,0500	5	1,83	0,00499	_ Х=0,00499 SD=0,00001986 RSD=0,40%
0,0500	5	1,84	0,00502
0,0500	5	1,83	0,00499
0,0500	10	3,65	0,00498
0,0500	10	3,67	0,00501
0,0500	10	3,66	0,00499
0,0500	15	5,50	0,00500
0,0500	15	5,45	0,00495
0,0500	15	5,50	0,00500

Следует отметить, что ни один нормативный документ не устанавливает нижнюю границу прецизионности и она определяется используемым методом анализа. Из данных таблицы 2 следует, что величина относительного стандартного отклонения методики нитритометрического титрования прокаина составила 0,40%, что является удовлетворительным для данного метода.

2.2.2 Определение прецизионности методики спектрофотометрического анализа

Для определения прецизионности методики спектрофотометрического определения приготовили модельную смесь.

Для этого точную навеску новокаина гидрохлорида (0,05 г) помещали в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, добавляли воды для инъекций 5 мл, раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 - 4,5 и доводили объем раствора до метки водой для инъекций (раствор А). Далее в мерную колбу вместимостью 25 мл переносили 2,5 мл полученного раствора и доводили объем водой до метки (0,05% раствор) (раствор Б).

Затем готовили параллельно три раствора.

Растворы В1, В2, В3. В три мерные колбы вместимостью 50 мл помещали по 0,5 мл раствора Б, доводили объем водой до метки, перемешивали.

Растворы В4, В5, В6. В три мерные колбы вместимостью 50 мл помещали по 1,0 мл раствора Б, доводили объемводой до метки, перемешивали.

Растворы В7, В8, В9. В три мерные колбы вместимостью 50 мл помещают по 1,5 мл раствора Б, доводили объем водой до метки, перемешивали.

Измеряли оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 288 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО новокаина гидрохлорида. Расчет содержания новокаина гидрохлорида в г/мл проводят по формуле:

,

где: Ах - оптическая плотность исследуемого раствора; Ао - оптическая плотность раствора СО новокаина; 0,00001 - содержание новокаина гидрохлорида в г в 1 мл раствора СО. V - объем раствора Б2, взятый для приготовления растворов В (0,5; 1,0 или 1,5 мл). Результаты заносили в таблицу 3 и рассчитывали стандартное отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD).

Таблица 3 Результаты установления прецизионности методики спектрофотометрического определения прокаина гидрохлорида

Навеска, взятая на анализ, г	Объем аликвоты, взятый на анализ, мл	Оптическая плотность	Найдено, г/мл	Метрологические характеристики
0,0500	0,5	0,245	0,00496	_ Х=0,00501 SD=0,0000421 RSD=0,79%
0,0500	0,5	0,248	0,00506
0,0500	0,5	0,245	0,00496
0,0500	1,0	0,490	0,00500
0,0500	1,0	0,493	0,00503
0,0500	1,0	0,495	0,00505
0,0500	1,5	0,732	0,00498
0,0500	1,5	0,735	0,00500
0,0500	1,5	0,746	0,00507
А0 = 0,490

Из данных таблицы 3 следует, что величина относительного стандартного отклонения методики спектрофотометрического определения прокаина составила 0,79%, что является удовлетворительным для данного метода.

2.3 Валидационная оценка методик количественного определения новокаина гидрохлорида по показателю «Линейность»

Линейность методики - это наличие прямой пропорциональной зависимости оптической плотности от концентрации или количества определяемого вещества в анализируемой пробе. Линейность выражается уравнением у = ах +b. Это уравнение называют линейной регрессией. Параметр b градуировочной функции характеризует отрезок, отсекаемый на оси ординат и соответствующий значению холостого опыта, а коэффициент а характеризует наклон градуировочной кривой и является отражением чувствительности методики.

Расчет коэффициентов градуировочного графика проводят по формулам:

В химических методах анализа (титриметрия) аналитик не может повлиять на значения коэффициентов a и b. Однако, если при проведении контрольного опыта, титрант не расходуется, то градуировочный график принимает форму прямой, выходящей из начала координат, и имеющей тангенс угла наклона равный 1.

Значения параметров a и b вычисляются методом регрессионного анализа. В настоящее время пользуются соответствующими компьютерными программами (например, Excel).

Основной характеристикой линейности является коэффициент корреляции -- мера взаимосвязи измеренных явлений. Коэффициент корреляции (обозначается «r») рассчитывается по специальной формуле:

Для аналитических целей можно использовать только ту методику, для которой зависимость функции от аргумента коррелируется с коэффициентом r, который должен быть ?0,99.

2.3.1 Определение линейности методики титриметрического анализа

Для проверки линейности брали 5 экспериментальных точек. Для этого точную навеску новокаина (0,5 г) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в воде, доводили объем водой до метки и перемешивали (раствор А).

На титрование отмеривали последовательно 5 мл; 10мл; 15 мл; 20 мл; 25 мл раствора (А), что соответствовало 0,025 г; 0,05 г; 0,075 г; 0,100 г; 0,125 г прокаина.

Данные вносили в таблицу 4.

Таблица 4 Результаты титриметрического определения прокаина гидрохлорида

Навеска, мл	Навеска, г	Объем титранта, мл	Найдено, г
5	0,025	1,83	0,0249
10	0,050	3,60	0,0491
15	0,075	5,50	0,0750
20	0,100	7,30	0,0099
25	0,125	9,0	0,1228

По полученным данным строили градуировочный график зависимости содержания компонента от объема титранта.



Рисунок 1 Градуировочный график зависимости объема титранта от содержания новокаина гидрохлорида

Как следует из представленного графика, все экспериментальные точки находятся вблизи линии тренда (прямой линии). По полученным данным рассчитывали уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции:

r = 1,00

Для данной выборки значение коэффициента корреляции составило 1,00. Это позволяет утверждать о наличии достаточно жесткой линейной зависимости объема титранта от концентрации.

2.3.1 Определение линейности методики спектрофотометрического анализа

Для этого точную навеску новокаина (0,1 г) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора водой до метки, перемешивают (раствор А).

В мерные колбы вместимостью 100 мл последовательно вносили 0,5 мл; 0,75 мл; 1,0 мл; 1,25 мл; 1,5 мл раствора А и доводили объем растворов водой до метки (получали 0,00050%; 0, 00075%; 0,00100%; 0,00125% и 0,00150% растворы).

Измеряли оптическую плотность каждого раствора на спектрофотометре при длине волны 288 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения - вода очищенная. Параллельно измеряли оптическую плотность 0,001% раствора прокаина.

Результаты определения представлены в таблице 5.

Таблица 5 Результаты измерения оптической плотности

C, %	0,0005	0,00075	0,001	0,00125	0,0015
D	0,242	0,360	0,493	0,615	0,745

По полученным данным строили градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации.

Рисунок 2 Градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации новокаина гидрохлорида

Как следует из представленного графика, все экспериментальные точки находятся вблизи линии тренда (прямой линии).

По полученным данным рассчитывали уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции:

r = 1,00

Для данной выборки значение коэффициента корреляции составило 1,00. Это позволяет утверждать о наличии достаточно жесткой линейной зависимости оптической плотности от концентрации.

2.4 Валидационная оценка методик количественного определения новокаина гидрохлорида по показателю «Правильность»

Правильностью аналитической методики называется степень близости экспериментальных результатов к истинному значению во всей области измерений. Главным фактором, определяющим правильность, является значение систематической погрешности.

Для оценки правильности методик количественного определения активной субстанции применимы следующие подходы:

применение аналитической методики к образцу с известной степенью чистоты, например к стандартному образцу;

сравнение результатов анализа, полученных с использованием валидируемой методики и арбитражного метода, правильность и прецизионность которого известны;

заключение о правильности можно сделать после того, как установлены прецизионность, линейность и специфичность.

Для оценки правильности методик количественного определения готового лекарственного препарата:

применение методики к искусственным (модельным) смесям, к которым были добавлены известные количества анализируемого вещества;

если невозможно получить образцы всех компонентов лекарственного препарата, возможно применение метода добавок или арбитражной методики, правильность которой доказана

заключение о правильности можно сделать после того, как установлены прецизионность, линейность и специфичность.

Для тестирования методики на правильность готовятся три модельные смеси из разных навесок с точным содержанием каждого из компонентов, включая и вспомогательные вещества. Согласно рекомендациям ICH необходимо проанализировать не менее 9 образцов на 3 уровнях концентраций. Правильность методики устанавливается в указанном диапазоне ее применения. Для оценки полученных результатов наиболее простым и наглядным критерием служит открываемость (R), которая вычисляется по формуле:

При проведении анализа будут получены 9 значений открываемости.

Для более детальной оценки следует статистически обработать полученные значения R, рассчитав стандартное и относительное стандартное отклонение.

Для того чтобы сделать вывод о полученных результатах, следует иметь ввиду, что для анализа субстанций с содержанием действующего вещества не менее 98%, значения правильности должны быть в пределах 99-101%.

При анализе субстанций с нормой содержания действующего вещества менее 98%, в пределах 98-102%. Для лекарственных препаратов с различным содержанием определяемого компонента рекомендуются следующие интервалы правильности (таблица 6):

Таблица 6 Оценка правильности в зависимости от концентрации активного компонента в анализируемом образце

Содержание аналита в образце, %	Открываемость,%
100	98 - 102
?10	98 - 102
?1	97 - 103
?0,1	95 - 105
0,01	90 - 107
0,001	80 - 110
0,0001	80 - 110
0,00001	60 - 115
0,000001	40 - 120

2.4.1 Определение правильности методики титриметрического анализа

Для определения правильности приготовили 3 модельных раствора новокаина гидрохлорида (таблица 7):

Таблица 7 Приготовление модельных смесей раствора новокаина гидрохлорида

Модельная смесь	1	2	3
Навеска новокаина гидрохлорида (г)	0,25	0,50	0,75
Раствора кислоты хлороводородной 0,1 моль/л	До рН 3,8 - 4,5	До рН 3,8 - 4,5	До рН 3,8 - 4,5
Воды для инъекций	До 100 мл	До 100 мл	До 100 мл

Раствор А1. Точную навеску новокаина гидрохлорида (0,25 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют воды для инъекций 50 мл, раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 - 4,5 и доводят объем раствора до метки водой для инъекций.

Раствор А2. Точную навеску новокаина гидрохлорида (0,5 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют воды для инъекций 50 мл, раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 - 4,5 и доводят объем раствора до метки водой для инъекций.

Раствор А3. Точную навеску новокаина гидрохлорида (0,75 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют воды для инъекций 50 мл, раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 - 4,5 и доводят объем раствора до метки водой для инъекций.

Далее проводили 3 параллельных титрования на трех уровнях концентраций (9 определений), по методике количественного определения, отмеривая по 10 мл каждого из модельных растворов (А1 , А2, А3).

Расчет содержания новокаина гидрохлорида в % (открываемость) проводят по формуле:

где: V- объем титранта, мл;

К- поправочный коэффициент;

Т- титр 0,05М раствора натрия нитрита по определяемому веществу, мг/мл;

а - навеска раствора А, взятая на анализ, мл;

С - содержание новокаина гидрохлорида в исходном растворе (0,25; 0,5; 0,75 г).

Результаты представлены в таблице 8.



Таблица 8 Результаты установления правильности методики титриметрического определения новокаина гидрохлорида

№ п/п	Уро- вень	Взято лек. вещества, г	Найдено лек. вещества, г	R%	Метрологические характеристики
1	1	0,025	0,0254	101,6
2	1	0,025	0,0252	100,8
3	1	0,025	0,0252	100,8
4	2	0,050	0,0503	100,6
5	2	0,050	0,0501	100,2
6	2	0,050	0,0500	100,0
7	3	0,075	0,0748	99,73
8	3	0,075	0,0751	100,1
9	3	0,075	0,0753	100,4

Коэффициент открываемости прокаина гидрохлорида при использовании титриметрической методики составил 100,47% (RSD=0,56%). Это свидетельствует об удовлетворительной правильности методики анализа.

2.4.2 Определение правильности методики спектрофотометрического анализа

Для определения правильности приготовили 3 модельных раствора новокаина гидрохлорида (таблица 9):

Таблица 9 Приготовление модельных смесей раствора новокаина гидрохлорида

Модельная смесь	1 (А1)	2 (А2)	3 (А3)
Навеска новокаина гидрохлорида (г)	0,025	0,05	0,075
Раствора кислоты хлороводородной 0,1 моль/л	До рН 3,8 - 4,5	До рН 3,8 - 4,5	До рН 3,8 - 4,5
Воды для инъекций	До 10,0 мл	До 10,0 мл	До 10,0 мл

Раствор А1. Точную навеску новокаина гидрохлорида (0,025 г) помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, добавляют воды для инъекций 5 мл, раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 - 4,5 и доводят объем раствора до метки водой для инъекций.

Раствор А2. Точную навеску новокаина гидрохлорида (0,05 г) помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, добавляют воды для инъекций 5 мл, раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 - 4,5 и доводят объем раствора до метки водой для инъекций.

Раствор А3. Точную навеску новокаина гидрохлорида (0,075 г) помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, добавляют воды для инъекций 5 мл, раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 - 4,5 и доводят объем раствора до метки водой для инъекций.

Раствор Б1. В мерную колбу вместимостью 10 мл переносят 1,0 мл раствора А1 и доводят водой до метки (0,025% раствор).

Раствор Б2. В мерную колбу вместимостью 10 мл переносят 1,0 мл раствора А2 и доводят водой до метки (0,05% раствор).

Раствор Б3. В мерную колбу вместимостью 10 мл переносят 1,0 мл раствора А3 и доводят водой до метки (0,075% раствор).

Растворы В1, В2, В3. В три мерные колбы вместимостью 50 мл переносят по 1,0 мл раствора А1 и доводят водой до метки.

Растворы В4, В5, В6. В три мерные колбы вместимостью 50 мл переносят по 1,0 мл раствора А2 и доводят водой до метки.

Растворы В7, В8, В9. В три мерные колбы вместимостью 50 мл переносят по 1,0 мл раствора А3 и доводят водой до метки.

Измеряют оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 288 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Параллельно измеряют оптическую плотность СО 0,001% раствора новокаина гидрохлорида.

Расчет содержания новокаина в процентах (открываемость) проводят по формуле:

,

где: Ах - оптическая плотность исследуемого раствора;

Ао - оптическая плотность раствора СО новокаина;

С - масса навески исследуемого образца новокаина (0,025; 0,05; 0,075 г);

0,00001 - содержание новокаина в г в 1 мл раствора СО.

Результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10 Результаты установления правильности методики спектрофотометрического определения новокаина гидрохлорида

№ п/п	Уро- вень	Взято лек. вещества, г	Найдено лек. вещества, г	R%	Метрологические характеристики
1	1	0,00025	0,000258	103,2
2	1	0,00025	0,000252	100,8
3	1	0,00025	0,000255	102,0
4	2	0,00050	0,000500	100,0
5	2	0,00050	0,000506	101,2
6	2	0,00050	0,000510	102,0
7	3	0,00075	0,000748	99,73
8	3	0,00075	0,000756	100,8
9	3	0,00075	0,000750	100,0

Коэффициент открываемости новокаина гидрохлорида при использовании спектрофотометрической методики составил 101,08% (RSD=1,13%). Это свидетельствует об удовлетворительной правильности методики анализа.

Таким образом, на основании результатов валидационной оценки методик идентификации и количественного определения новокаина гидрохлорида в растворе для инъекций можно сделать вывод, что предлагаемые методики удовлетворяют аналитическим задачам. Следовательно, данные методики можно использовать для качественного и количественного определения новокаина гидрохлорида в лекарственном средстве.

Выводы по главе II

Предложены методики анализа новокаина гидрохлорида в растворе для инъекций.

Для идентификации новокаина гидрохлорида предложены химические реакции.

Доказана валидность методик идентификации по показателю «Специфичность».

Количественное определение новокаина гидрохлорида в лекарственном средстве проводили методом нитритометрического титрования и УФ-спектрофотометрии.

Проведена валидационная оценка предлагаемых методик количественного анализа новокаина гидрохлорида по показателям «Специфичность», «Прецизионность», «Линейность», «Правильность».

Установлено, что предлагаемые методики валидны по данн...