Властивості і функціональна роль систем Na+-залежного і Na+-незалежного виходу Са2+ з мітохондрій печінки і міокарда

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

АВТОРЕФЕРАТ

ВЛАСТИВОСТІ І ФУНКЦІОНАЛЬНА РОЛЬ СИСТЕМ NA⁺-ЗАЛЕЖНОГО І NA⁺-НЕЗАЛЕЖНОГО ВИХОДУ СА²⁺ З МІТОХОНДРІЙ ПЕЧІНКИ І МІОКАРДА

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, доцент Дубицький Леонід Олександрович Львівський національний університет імені Івана Франка, доцент кафедри фізіології людини і тварин

Офіційні опоненти:

член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор Костерін Сергій Олексійович, заступник директора з наукової роботи, завідувач відділу біохімії м'язів, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Доктор біологічних наук Янчій Роман Іванович, провідний науковий співробітник відділу імунології та цитотоксичних сироваток, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005 Львів, вул. Драгоманова, 17.

Автореферат розісланий “11” cерпня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук В.В. Манько

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. У кальцієвій регуляції функціональної активності різних видів клітин важливе місце посідають мітохондрії, які характеризуються великою кальцієвою ємністю та швидкістю накопичення іонів цього металу (Костерин С. А., 1990; Дубицький Л. О., Вовканич Л. С., 2000). Акумуляція Са²⁺ мітохондріями забезпечується, в основному, Са²⁺-уніпортером, який локалізований у внутрішній мембрані цих органел (Lehninger A. L., 1971). В останнє десятиріччя отримано ряд доказів існування в мітохондріях міокарда, м'язів, печінки і інших тканин поряд з Са²⁺-уніпортером систем Na⁺-залежного і Na⁺-незалежного (H⁺-стимульованого) виходу Са²⁺ з цих органел (Gunter Т. Е. et al., 1994; Bernardi Р., 1999; Rizzuto R. et al., 2000; Дубицький Л. О., Вовканич Л. С., 2001). Функціонування таких систем у мітохондріальній мембрані має важливе значення у забезпеченні Са²⁺-акумулювальної функції мітохондрій, попереджуючи перевантаження цих органел іонами кальцію та перехід їх у стан високої неспецифічної проникності. Наявність таких систем у мембрані мітохондрій передбачає також можливість Na⁺- і H⁺-залежної регуляції кальцієвого гомеостазу клітини та енергетики цих органел (Gunter T. E., 1994; McCormak J. G., Denton R. M., 1984; 1990; Babsky A. et al., 2002). Разом з тим неконтрольовані зміни внутрішньоклітинної концентрації Na⁺, а також стани ацидозу і алкалозу (Kjeldsen K. et al., 1987; Lagadis-Grossmann D., 1991; Babsky A., 1998) можуть призводити до суттєвих порушень кальцієвого гомеостазу і енергетики клітини та до її загибелі, як це, наприклад, показано у випадку клітин міокарда у тварин з експериментальною формою цукрового діабету (Doliba N. et al., 2000; Savchenko A. et al., 2001). Подібні стани можуть виникати також під впливом негативних чинників навколишнього середовища, зокрема за умов інтоксикацій катіонами металів (Kapoor S. C., Van Rossum G. D. V., 1984; Fullmer C. S., 1992; Goyer R. A., 1995; Дубицький Л. О., Вовканич Л. С., 2001). Тим не менше функціональне значення, властивості і механізми функціонування цих іон-транспортувальних систем мітохондрій залишаються мало вивченими. Недостатньо висвітлені питання, які стосуються властивостей систем Na⁺-залежного і Na⁺-незалежного, або Н⁺-стимульованого, виходу Са²⁺ з мітохондрій різних тканин. Практично відсутні роботи, присвячені системним дослідженням специфічності цих Са²⁺-транспортувальних систем до катіонів одно- та двовалентних металів. Разом з тим аналіз властивостей систем Na⁺-залежного і Н⁺-стимульованого виходу Са²⁺ з мітохондрій є важливим етапом у з'ясуванні молекулярних механізмів Са²⁺-акумулювальної функції мітохондрій, функціонування цих іон-транспортувальних систем та внутрішньоклітинних механізмів токсичної дії катіонів металів.

Зв'язок роботи з науково-дослідною тематикою кафедри. Робота виконана в рамках науково-дослідних тем “Механізми Са²⁺- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних клітин”, 2002-2005 рр. (№ держреєстрації 0103U001872), “Взаємодія катіонів металів з Na⁺/Ca²⁺- і Ca²⁺/H⁺-обмінниками мітохондрій печінки”, 2004-2006 рр. (№ держреєстрації 0104U010109).

Мета і завдання дослідження. Дослідити функціональне значення і властивості систем Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда та з'ясувати механізми взаємодії цих систем з катіонами одно- та двовалентних металів.

Для досягнення мети роботи було поставлено такі завдання:

з'ясувати функціональне значення і кінетичні властивості систем Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда щурів;

дослідити залежність швидкості Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки від температури;

дослідити вплив катіонів одновалентних металів (Tl⁺, Li⁺, Rb⁺, K⁺ і Cs⁺) на системи Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда;

дослідити вплив катіонів двовалентних металів (Ba²⁺, Sr²⁺, Mg²⁺ і Mn²⁺) на системи Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда;

з'ясувати залежність ефективності інгібування систем Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій катіонами одно- та двовалентних металів від їхніх фізико-хімічних параметрів.

Об'єкт дослідження: Са²⁺-акумулювальна функція мітохондрій.

Предмет дослідження: властивості і функціональне значення систем Na⁺-залежного і Na⁺-незалежного виходу Са²⁺ з мітохондрій.

Методи досліджень: фізіологічні, електрометричні, полярографічні, спектрофотометричні, методи біохімічної кінетики, дисперсійний, кореляційний і регресійний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. Показано, що Na⁺- і Н⁺-залежний вихід Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда опосередковується іонними обмінниками внутрішньомітохондріальної мембрани із стехіометрією транспортування не менше - 1Са²⁺ : 2Na⁺ або 1Ca²⁺: 2H⁺. Встановлено, що Na⁺/Ca²⁺- і Ca²⁺/H⁺-обмінники мітохондрій за фізіологічних рівнів концентрації Na⁺ і Н⁺ функціонують у режимі виходу Са²⁺ з цих органел. Вперше проведено порівняльний аналіз кінетичних властивостей Na⁺-залежного і Na⁺-незалежного (Н⁺-стимульованого) виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда. За даними аналізу температурної залежності Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій розраховано енергії активації цих іон-транспортувальних процесів та встановлено залежність їхньої активності від в'язкості фосфоліпідного бішару внутрішньої мембрани цих органел. З'ясовано, що ефективність інгібування Na⁺/Са²⁺- і Са²⁺/Н⁺-обмінників мітохондрій іонами одно- і двовалентних металів (I₅₀) позитивно корелює із спорідненістю їх до кисневмісних груп лігандів (ЕDТА, глутамат), а також з величинами потенціалу іонізації та електронегативності атомів цих металів. Встановлено також позитивний кореляційний зв'язок ефективності інгібування (I₅₀) мітохондріальних обмінників катіонами металів з ентальпією їхньої гідратації та негативний кореляційний зв'язок ефективності цього інгібування з величинами кристалографічного радіуса іонів цих металів. Показано, що одним із механізмів інгібування мітохондріальних обмінників катіонами одновалентних металів є модифікація ними кооперативних взаємодій іонів металів з іон-зв'язувальними центрами цих іон-транспортувальних систем. Отримані результати засвідчують, що транслокація Ca²⁺, H⁺ і Na⁺ мітохондріальними обмінниками та інгібування її катіонами одно- та двовалентних металів пов'язані із взаємодією їх з кисневмісними групами іон-транспортувальних центрів обмінників і супроводжуються процесами дегідратації іонів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати по-глиблюють знання про функціональне значення мітохондрій у підтриманні кальцієвого гомеостазу клітини та механізми цієї функції. Результати досліджень можуть бути використані для обґрунтування субклітинних механізмів патологічних станів, пов'язаних із гіпо- і гіпернатрієміями, ацидозами і алкалозами, інтоксикаціями солями металів, а також для оцінки токсичності катіонів металів та обгрунтування санітарно-гігієнічних та екологічних нормативів забруднення середовища катіонами металів. Результати досліджень впроваджені у навчальний процес у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького і використовуються при викладанні загального курсу “Фізіологія” (розділи “Загальна фізіологія”, “Фізіологія вісцеральних систем”), а також впроваджені у навчальний процес у Львівському національному уні-верситеті імені Івана Франка і використовуються при викладанні загального курсу “Фізіологія людини і тварин”, та спецкурсів “Біоенергетичні основи фізіологічних процесів”, “Мембранний транспорт іонів”. Вони можуть бути використані для підготовки спеціалістів медико-біологічного профілю в інших навчальних закладах України.

Особистий внесок здобувача. Здобувач виконав весь обсяг експериментальної частини дисертації, статистичне опрацювання результатів, відбір і опрацювання літератури. Аналіз та інтерпретацію отриманих результатів здійснено спільно з науковим керівником, а також за участю співавторів публікацій.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень за темою дисертації були представлені на установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004 р.), міжнародній конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи” (Львів, 2004 р.), 1-ій Міжнародній конференції студентів та аспірантів ”Молодь і поступ у біології” (Львів, 2005 р.), 1-му з'їзді фізіологів СНД (Сочі, 2005 р.), 17-му з'їзді Українського фізіологічного товариства (Чернівці, 2006 р.), 2-ій Міжнародній конференції студентів та аспірантів ”Молодь і поступ у біології” (Львів, 2006 р.), IX з'їзді Українського біохімічного товариства (Харків, 2006 р.), IV з'їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006 р.), Міжнародній науковій конференції “Механізми функціонування фізіологічних систем“, приуроченій до 60-ліття новоствореної кафедри фізіології людини та тварин Львівського університету (Львів, 2006 р.), щорічних наукових конференціях Львівського національного університету імені Івана Франка (Львів, 2004-2006 рр.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових праць, у тому числі 6 статей у фахових наукових виданнях, затверджених ВАК України, 9 робіт - у матеріалах і тезах з'їздів, симпозіумів, конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини (матеріалів і методів досліджень, результатів та їхнього обговорення), висновків та списку використаної літератури (327 найменувань). Робота викладена на 174 сторінках машинописного тексту та проілюстрована 48 рисунками та 34 таблицями.

Основний зміст

Матеріали і методи досліджень

Дослідження кінетичних властивостей систем Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Ca²⁺

з мітохондрій печінки і міокарда і взаємодії катіонів одно- та двовалентних металів із Na⁺/Са²⁺- та Са²⁺/Н⁺-обмінниками цих органел проводили в умовах in vitro. Мітохондрії ізолювали з печінки і міокарда білих щурів методом диференціального центрифугування (Shneider W., Hogeboom G.H., 1959; Кондрашова Н.М., Григоренко Е.В., 1985; Дубицький Л.О., Вовканич Л.С., 1996). Дослідження на тваринах проводили з дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами (міжнародна конвенція, Страсбург, 1986). Середовище гомогенізації мітохондрій печінки містило (ммоль/л): сахароза - 300, триоксиметиламінометан (тріс) - 10, етиленглікольдиамінотетраацетат (ЕGТА) - 1 (рН 7,4). Виділення мітохондрій з міокарда проводили з окремими модифікаціями. Зокрема, середовище гомогенізації мітохондрій міокарда містило (ммоль/л): манітол - 210, сахароза - 70, тріс - 10, етилендиамінотетраацетат (ЕDТА) - 3, альбумін сироватки бика (БСА) - 0,1% (рН 7,4). Всі операції, пов'язані з отриманням мітохондрій печінки і міокарда, проводили за температури 0 - +2 С. Життєздатність ізольованих мітохондрій оцінювали за інтенсивністю дихання та окисного фосфорилювання, яке реєстрували полярографічним методом (Chance В., Williams G. 1955, 1956, Lardy H., 1955) з використанням закритого електрода Кларка та кисеньвимірювального блоку ГФ-012 виробництва експериментальної лабораторії при НДІ біологічних досліджень РАН (Пущино, Росія). Середовище інкубації мітохондрій містило (ммоль/л): сахароза - 150, KCl - 50, КН₂РО₄ - 1, тріс - 5 (рН 7,4, t 26 єC).

Na⁺- і Н⁺-залежний вихід Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда реєстрували електрометричним методом з використанням установки, зібраної на основі Са²⁺-селективного електрода фірми Orion (модель 9320). Для мітохондрій печінки середовище інкубації містило (ммоль/л): сахароза - 150, KCl - 50, КН₂РО₄ - 0,1, тріс - 5 (рН 7,4, 26 °С). Для мітохондрій міокарда використовували середовище інкубації дещо зміненого складу (ммоль/л): сахароза - 180, KCl - 50, KH₂PO₄ - 0, 1, тріс - 10 (рН 7,4, 26°С). У середовище інкубації вносили Са²⁺ (10-50 мкмоль/л), мітохондрії (3-4 мг білка), сукцинат (0,35 ммоль/л). Реєстрацію виходу Са²⁺ з мітохондрій розпочинали після внесення у середовище інкубації блокатора Са²⁺-уніпортера цих органел - рутенію червоного (Vasington F.D., et al., 1972) у концентрації 5 мкмоль/л. Na⁺- і Н⁺-залежний вихід Са²⁺ з мітохондрій ініціювали шляхом внесення NaCl i HCl у середовище інкубації цих органел. Для вивчення впливу катіонів одно- та двовалентних металів на функціонування Na⁺/Ca²⁺- і Ca²⁺/H⁺-обмінників мітохондрій у середовище інкубації цих органел додатково вносили хлориди одновалентних металів (1 - 40 ммоль/л), за винятком іонів Tl, який був у формі нітрату (0,1 - 1,0 ммоль/л), а також хлориди двовалентних металів (5 - 50 мкмоль/л). Вихід Са²⁺ з мітохондрій у середовище інкубації розраховували за калібрувальною кривою із врахуванням зв'язування кальцію компонентами середовища інкубації шляхом його титрування СаCl₂. Вміст білка у суспензії мітохондрій визначали за методом Лоурі (Lowry O. H. et al., 1951).

Результати досліджень та їх обговорення

Кінетичний аналіз Na⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда. Встановлено, що у мітохондріях серця, мозку, скелетних м'язів вихід Са²⁺ активується Na⁺ (Gunter T. E., et al., 1994). У мітохондріях печінки, нирки, гладеньких м'язів ідентифіковано Na⁺-незалежний вихід Са²⁺, який активується Н⁺ (Gunter T. E., Pfeiffer D. R., 1990; Костерин С. А., 1990; Gunter T. E., et al., 1994; Шинлова О. П. и др., 1996; Дубицький Л. О., Вовканич Л. С. 2001; Дубицький Л., та ін., 2003). Виявлено також H⁺-стимульований вихід Са²⁺ у мітохондріях серця (Crompton M., et al., 1977) та Na⁺-залежний вихід Са²⁺ у мітохондріях печінки (Goldstone T. P., Crompton M., 1982). Проте ряд питань, що стосуються властивостей і механізмів Na⁺- і Н⁺-залежного транспортування Са²⁺ через внутрішньо-мітохондріальну мембрану залишаються дискусійними (Bernardi P., 1999; Gunter T. E., et al., 2000).

Проведеними нами дослідженнями встановлено, що залежність швидкості Na⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда від концентрації Na⁺ у середовищі інкубації має сигмоподібний характер. Це свідчить про кооперативні взаємодії Na⁺ з Na⁺-зв'язувальними центрами обмінника. Кінетичним аналізом у системі координат Хілла показано, що значення коефіцієнта Хілла (1,85 -1,94) близьке до двох. Це вказує на те, що транспортування одного Са²⁺ Na⁺/Са²⁺-обмінником здійснюється в обмін не менше ніж на два Na⁺. Величини констант напівнасичення цього транспортувального процесу для Na⁺ у мітохондріях печінки і міокарда є близькими (К_0,5(Na⁺) = 8,41 - 11,21 ммоль/л). Разом з тим V_max(Na⁺) Na⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій міокарда становить 16,51 нмоль Са²⁺/хв ·мг білка, а з мітохондрій печінки - 1,92 нмоль Са²⁺/хв · мг білка. Це свідчить про більш високу потенційну здатність мітохондрій міокарда до Na⁺-залежної регуляції виходу Са²⁺ з цих органел порівняно з мітохондріями печінки. В цілому це співпадає з уявленнями про важливу роль Са²⁺ у регуляції діяльності міокарда (Babcock, D. F., et al., 1997; Horikawa Y, et al., 1998; Trollinger D. R. et al., 2000; Gunter T. E., 2000). Субмаксимальні швидкості Na⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда спостерігаються в діапазоні концентрації Na⁺ (5,0 - 20,0 ммоль/л). Це

свідчить, що Na⁺/Са²⁺-обмінник мітохондрій ефективно функціонує в режимі виходу Са²⁺ з цих органел за фізіологічних рівнів концентрації Na⁺ у цитозолі клітини.

Швидкість Na⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда

збільшується із збільшенням вмісту кальцію в цих органелах за гіперболічною кінетикою. Кінетичні параметри Na⁺- залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда, розраховані за кальцієм, дещо відрізняються. Так, V_max(Са²⁺) цього транспортувального процесу у мітохондріях печінки і міокарда складає відповідно 1,96 і 35,58 нмоль Са²⁺/хв · мг білка, а величини К_0,5(Са²⁺) є близькими і становлять відповідно 22,03 і 20,46 нмоль/мг білка. Судячи із величин K_0,5 спорідненість Na⁺/Са²⁺-обмінника до Са²⁺ у мітохондріях міокарда і печінки, є близькою. Проте V_max цієї іон-транспортувальної системи у мітохондріях міокарда є значно вищою. Ці результати узгоджуються із даними кінетичного аналізу Na⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій цих тканин, які було розраховано для Na⁺.

Таким чином, мітохондрії міокарда характеризуються більш високою потенційною здатністю до Na⁺-залежної регуляції виходу Са²⁺ з цих органел порівняно з мітохондріями печінки. Вірогідно, це пов'язано з різним ступенем кальцієвої регуляції функціональної активності клітин цих тканин.

Кінетичний аналіз Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда. Швидкість виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда збільшується також після закислення середовища інкубації цих органел. Залежність швидкості Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда від позамітохондріальної концентрації Н⁺, як і у випадку з Na⁺ -залежним виходом Са²⁺ з мітохондрій цих тканин має сигмоподібний характер. Сигмоподібна залежність Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда від концентрації Н⁺ та коефіцієнт Хілла, близький до двох (1,6 - 1,65), вказують на те, що цей вихід опосередковується обмінником, що здійснює вихід із мітохондрій одного Са²⁺ в обмін не менше ніж на два Н⁺, як і у випадку з Na⁺/Са²⁺-обмінником. З'ясовано також основні кінетичні властивості цього транспортувального процесу. Зокрема встановлено, що V_max(Н⁺) Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з матриксу мітохондрій печінки і міокарда складає відповідно 1,67 і 13,52 нмоль Са²⁺/хв · мг білка. Величини K_0,5 цього виходу Ca²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда для Н⁺ становлять 13,29 - 14,24 нмоль/л. Субмаксимальне збільшення швидкості Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда спостерігається в діапазоні концентрацій Н⁺ 40 - 60 нмоль/л, що відповідає фізіологічним межам концентрацій цих іонів у клітині (рН 7,2 - 7,4). Це свідчить, що Ca²⁺/H⁺-обмінник мітохондрій ефективно функціонує в режимі виходу Са²⁺ з цих органел за фізіологічних рівнів концентрації Н⁺ у цитозолі клітини.

Залежність швидкості Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда від вмісту кальцію у цих органелах має гіперболічний характер.

Максимальна швидкість (V_max) цього транспортувального процесу у мітохондріях печінки і міокарда для Са²⁺ становить відповідно 2,16 і 3,27 нмоль Са²⁺/хв · мг білка, а константа напівнасичення - 103,08 і 6,23 нмоль/мг білка. Це свідчить, що спорідненість Са²⁺/Н⁺-обмінника мітохондрій міокарда до Са²⁺ є вищою, порівняно з обмінником мітохондрій печінки.

Отримані результати свідчать, що в мітохондріях печінки і міокарда поряд з Na⁺/Ca²⁺-обмінником функціонує Ca²⁺/Н⁺-обмінник. Обидва мітохондріальні обмінники характеризуються подібними кінетичними властивостями і за фізіологічних умов функціонують у режимі Na⁺(Н⁺)-залежного виходу Са²⁺ з цих органел. Разом з тим виявлено, що потенційна здатність цих систем до Na⁺- і Н⁺- залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій міокарда є вищою ніж з мітохондрій печінки.

Аналіз температурної залежності Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки. Одним із важливих методичних підходів у дослідженні іон-транспортувальних систем клітини є аналіз залежності їхньої функціональної активності від температури. Такий підхід дозволяє оцінити енергетичні параметри транспортування іонів цими іон-транспортувальними системами, а також вплив мембран на стан цих мембрано-зв'язаних іон-транспортувальних білків (Болдырев А. А. 1981, Bernardi P., 1984).

Проведеними нами дослідженнями встановлено, що збільшення температури середовища інкубації мітохондрій печінки в діапазоні від 5 до 35 ⁰С супроводжується суттєвим збільшенням швидкості Na⁺ і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з матриксу цих органел. Так, за температури 5⁰С швидкість Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з матриксу мітохондрій становила 0,30 ± 0,015 нмоль Са²⁺/хв · мг білка, а за температури 35 ⁰С - 5,05 ± 0,025 нмоль Са²⁺/хв·мг білка. Швидкість Na⁺-залежного виходу Са²⁺ з матриксу мітохондрій становила за температури 5⁰С 0,55 ± 0,009 нмоль Са²⁺/ хв·мг білка, а за температури 35 ⁰С - 4,35 ± 0,012 нмоль Са²⁺/ хв·мг білка.

За даними аналізу температурної залежності Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з матриксу мітохондрій у системі координат Арреніуса розраховано енергію активації цих іон-транспортувальних процесів. Значення енергії активації Na⁺- і Н⁺- залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій становили за нашими даними відповідно 135,70 і 180,72 кДж/моль за температури нижче 20⁰С та 76,57 і 120,54 кДж/моль - за температури вище 20⁰С. Отже Na⁺- і Н⁺-залежний вихід Са²⁺ з матриксу мітохондрій печінки характеризується достатньо високими величинами енергії активації. Для порівняння енергія активації уніпорту Са²⁺ в мітохондрії печінки за даними окремих авторів складає біля 42 кДж/моль (Bragadin M., et al., 1979). При цьому Н⁺-залежний вихід Са²⁺ з матриксу мітохондрій печінки характеризується значно більшими величинами енергії активації порівняно з Na⁺-залежним виходом Са²⁺ з цих органел.

Шляхом лінеаризації температурної залежності швидкості Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з матриксу мітохондрій в координатах Арреніуса встановлено також, що отримані лінії характеризуються наявністю перегину в точках, що відповідають 19 - 21 ⁰С. Відомо, що наявність точок перегину на графіку Арреніуса біля 19 - 21 ⁰С характерна для температурної залежності плавлення фосфоліпідного бішару мембрани мітохондрій (Болдырев А. А., 1981). Це свідчить, що активність систем Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій залежить від в'язкості фосфоліпідного бішару мембрани мітохондрій тканин. Результати проведеного аналізу температурної залежності Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки перш за все є додатковим доказом того, що ці іон-транспортувальні процеси здійснюються за участю специфічних білків-переносників внутрішньо-мітохондріальної мембрани, які забезпечують повільний вихід Са²⁺ з цих органел.

Інгібіторний аналіз взаємодії іонів одновалентних металів з Na⁺/Са²⁺- і Са²⁺/Н⁺-обмінником мітохондрій. Одним із підходів у з'ясуванні фізико-хімічних механізмів транслокації іонів натрію, водню і кальцію Ca²⁺-транспортувальними системами мітохондрій та інгібування їх катіонами інших металів є співставлення ефектів катіонів цих металів на функціонування Са²⁺-транспортувальних систем з їхніми фізико-хімічними властивостями (спорідненість до кисневмісних лігандів, ентальпія гідратації, радіус іона тощо). Такий аналіз був успішно реалізований стосовно кальцієвих помп та Na⁺-Ca²⁺-обмінника плазматичної мембрани секреторних клітин шлункових залоз та Ca²⁺-уніпортера мітохондрій (Дубицький Л. О., Вовканич Л. С., 2000, 2001, 2003). Цей аналіз дозволяє виділити фізико-хімічні параметри катіонів металів, які лімітують транслокацію іонів Ca²⁺-транспортувальними системами та їх інгібування, що важливо для з'ясування молекулярних механізмів функціонування цих систем та механізмів токсичної дії катіонів різних груп металів.

Проведеними дослідженнями встановлено, що катіони одновалентних металів пригнічують функціонування Na⁺/Са²⁺- і Са²⁺/Н⁺-обмінників мітохондрій печінки і міокарда. Так, після внесення у суспензію мітохондрій печінки Cs⁺, Rb⁺ і Li⁺ у концентрації 40,0 ммоль/л швидкість Na⁺-залежного виходу Ca²⁺ з цих органел зменшувалась відповідно на 22,62, 27,50 і 72,25%. Внесення Cs⁺, Rb⁺ і Li⁺ у суспензію мітохондрій міокарда також супроводжувалось зменшенням швидкості Na⁺-залежного виходу Ca²⁺ з цих органел відповідно на 10,69, 20,57 і 51,67%. Встановлено, що Cs⁺, Rb⁺ і Li⁺ також суттєво пригнічують функціонування Са²⁺/Н⁺-обмінника мітохондрій печінки на 14,32, 12,99 і 31,01%. Внесення катіонів цих металів у суспензію мітохондрій міокарда також супроводжувалось зменшенням швидкості Н⁺-залежного виходу Ca²⁺ з цих органел відповідно на 11,56, 25,60, і 45,11%. Більш ефективним інгібітором Na⁺/Са²⁺- і Са²⁺/Н⁺-обмінників мітохондрій цих тканин виявився Tl⁺. Так, іони цього металу у концентрації 1 ммоль/л пригнічували активність систем Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки на 61,96 і 68,06%. Швидкість Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій міокарда під впливом Tl⁺ зменшувалась на 24,03 і 31,89%.

Методами кінетичного аналізу у системі координат Уебба (Келети Т., 1990) показано, що катіони одновалентних металів інгібують Nа⁺- і Н⁺-залежний вихід Са²⁺ з мітохондрій переважно за конкурентним типом. Отримані результати свідчать про безпосередню взаємодію катіонів одновалентних металів з іон-транспортувальними центрами Са²⁺/Н⁺- і Na⁺/Са²⁺-обмінників мітохондрій, що дозволило застосувати їх для аналізу специфічності та механізмів функціонування іон-транспортувальних систем.

Порівняльний аналіз інгібувального впливу катіонів металів на системи Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій проводили на основі констант напівінгібування (I₅₀), які визначали у системі логарифмічних координат {lg [((V₀-V_i)/V_i); [Me⁺]}, де V₀ і V_i - початкові швидкості у відсутності і за наявності у середовищі іонів досліджуваного металу [Me⁺] (Келети Т., 1990). Ці системи координат побудовано на основі дозової залежності швидкості Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки від концентрації катіонів одновалентних металів. Показано, що за ефективністю інгібування Na⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки іони одновалентних металів розміщуються у такій послідовності (І₅₀, ммоль/л) :

Катіони металів: Cs⁺ < Rb⁺ < Li⁺ < Tl⁺ І₅₀, ммоль/л: 137,11 122,63 24,59 0,541

За ефективністю інгібування Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки іони одновалентних металів розміщуються у подібній послідовності (І₅₀, ммоль/л):

Катіони металів: Cs⁺ < К⁺ < Rb⁺ < Li⁺ < Tl⁺

І₅₀, ммоль/л: 2057,69 413,57 183,26 158,68 0,33

Таким чином, ефективність інгібування систем Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій катіонами одновалентних металів залежить від їхніх фізико-хімічних властивостей і є найбільшою для Li⁺ і Tl⁺.

За кутом нахилу прямих в системі логарифмічних координат розраховано також коефіцієнти кооперативної взаємодії (n) катіонів одновалентних металів з іон-зв'язувальними центрами мітохондріальних обмінників. Так, коефіцієнти кооперативної взаємодії Tl⁺, Li⁺, Rb⁺ і Cs⁺ з Na⁺-звязувальними центрами Na⁺/Ca²⁺-обмінника становили відповідно 1,5, 1,3, 0,4 і 0,3, а Tl⁺, Li⁺, Rb⁺, К⁺ і Cs⁺ з Н⁺-звязувальними центрами Са²⁺/Н⁺-обмінника - 1,1, 0,98, 0,84, 0,43 і 0,36. Ці результати, перш за все, свідчать про зниження ступеня кооперативності у випадку взаємодії з іон-зв'язувальними центрами обмінників іонів інших одновалентних металів. Тим не менше наявність позитивної кооперативності для Tl⁺ і Li⁺ є непрямим підтвердженням можливої транслокації їх мітохондріальними обмінниками. Це узгоджується з даними окремих авторів (Crompton M. et al., 1976) про здатність Li⁺ заміщати Na⁺ в процесі транспортування Са²⁺ Na⁺/Ca²⁺-обмінником мітохондрій серця. Разом з тим від'ємна кооперативність для Rb⁺ і Cs⁺ свідчить, що у випадку стехіометрії обміну 2Nа⁺(H⁺) : 1Ca²⁺, має місце пригнічення взаємодії другого іона з іон-зв'язувальним центром обмінників в ході їхнього транспортувального циклу. Таким чином, модифікація кооперативних взаємодій іонів металів з іон-зв'язувальними центрами Na⁺/Ca²⁺- і Ca²⁺/H⁺-обмінників мітохондрій у ході транспортувального циклу може бути одним із механізмів пригнічення транслокації іонів цими іон-транспортувальними системами.

Інгібіторний аналіз взаємодії іонів двовалентних металів з Na⁺/Са²⁺- і Са²⁺/Н⁺-обмінником мітохондрій. Вплив іонів двовалентних металів на Na⁺- і Н⁺-залежний вихід Са²⁺ з мітохондрій досліджували за умов їхньої внутрішньомітохондріальної локалізації. З цією метою ці органели послідовно навантажували іонами кальцію і досліджуваних металів. Після цього реєстрували Na⁺- і Н⁺-залежний вихід Са²⁺ з матриксу цих органел. Показано, що за таких умов катіони двовалентних металів суттєво пригнічують Na⁺- і Н⁺-залежний вихід Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда. Так, за умови внесення у середовище інкубації мітохондрій Ba²⁺, Mg²⁺, Sr²⁺ i Mn²⁺ у концентрації 50,0 мкмоль/л та за умови навантаження мітохондрій кальцієм з розрахунку 5,0 нмоль/мг білка Na⁺-залежний вихід Са²⁺ з мітохондрій печінки пригнічувався відповідно на 50,8 - 89,3%. Катіони Ba²⁺, Mg²⁺, Sr²⁺ і Mn²⁺ пригнічували також Н⁺-залежний вихід Са²⁺ з мітохондрій печінки на 42,90 - 83,80%. Подібні результати було отримано на мітохондріях міокарда.

Методами кінетичного аналізу у системі координат Уебба (Келети Т., 1990) встановлено, що катіони двовалентних металів інгібують Na⁺- і Н⁺-залежний вихід Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда переважно за конкурентним типом. Отже, катіони двовалентних металів, як і катіони одновалентних металів здатні до безпосередньої взаємодії з іон-транспортувальними центрами Na⁺/Ca²⁺- і Ca²⁺/H⁺-обмінників мітохондрій. Це стало підставою для застосування їх для з'ясування механізмів специфічності і функціонування цих систем.

Порівняльний аналіз інгібувального впливу катіонів двовалентних металів на системи Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій проводили на основі констант напівінгібування (I₅₀), які визначали у системі логарифмічних координат, подібно як це було здійснено у випадку катіонів одновалентних металів. Показано, що за ефективністю інгібування Na⁺/Ca²⁺- і Ca²⁺/H⁺-обмінників катіони двовалентних металів розміщуються в однаковій послідовності (I₅₀, мкмоль/л:):

Катіони металів: Ba²⁺ < Mg²⁺ < Sr²⁺ < Mn²⁺

I₅₀, мкмоль/л (Na⁺/Ca²⁺-обмінник): 50,55 33,03 15,04 13,07

I₅₀, мкмоль/л (Ca²⁺/H⁺- обмінник): 69,11 28,69 27,66 12,75

Таким чином, ефективність інгібування систем Н⁺- і Na⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій катіонами двовалентних металів залежить від їхніх фізико-хімічних властивостей і є найбільшою для Mn²⁺.

За кутом нахилу прямих в системі логарифмічних координат, розраховано також коефіцієнти кооперативної взаємодії (n) катіонів двовалентних металів з іон-зв'язувальними центрами мітохондріальних обмінників. З'ясувалось, що величини цих коефіцієнтів для Nа⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки становлять 0,8 - 1,2, а для Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з цих органел 0,65 - 1,06, тобто є близькими до одиниці. Попередніми дослідженнями (Дубицький Л. О. та ін., 2003) встановлено також, що коефіцієнт Хілла у випадку транспортування Са²⁺ Ca²⁺/H⁺-обмінником також є близьким до одиниці. Ці результати вказують на відсутність кооперативних взаємодій Са²⁺ і інших двовалентних металів з іон-транспортувальними центрами обмінників мітохондрій в ході їхнього транспортувального циклу.

Фізико-хімічні механізми взаємодії катіонів одно- та двовалентних металів з Na⁺/Са²⁺- і Са²⁺/Н⁺- обмінниками мітохондрій печінки. Аналіз взаємодії Nа⁺/Сa²⁺- і Сa²⁺/Н⁺-обмінників мітохондрій з катіонами інших одно- і двовалентних металів є одним з важливих підходів у дослідженні специфічності і механізмів функціонування цих мітохондріальних переносників. З цією метою було застосовано методичні підходи, які ґрунтуються на аналізі залежності інгібувальних ефектів катіонів металів, зокрема констант напівінгібування (І₅₀) на функціонування Ca²⁺-транспортувальних систем мітохондрій від їхніх фізико-хімічних параметрів (константи стійкості комплексів металів з біолігандами, ентальпія гідратації, радіус іона, тощо). Такий аналіз дозволяє виділити фізико-хімічні параметри катіонів металів, які лімітують транслокацію цих іонів кальцій-транспортувальними системами мітохондрій та їх інгібування, що важливо для з'ясування молекулярних механізмів функціонування цих систем та механізмів токсичної дії катіонів різних груп металів.

Методом кореляційного аналізу (Лакин Г. Ф., 1990) показано, що ефективність інгібування Na⁺/Ca²⁺- і Ca²⁺/H⁺-обмінників мітохондрій іонами одно- і двовалентних металів (I₅₀) позитивно корелює із спорідненістю їх до кисневмісних груп лігандів (етилендиамінтетраацетат, глутамат), а також з величинами потенціалу іонізації та електронегативності атомів цих металів (табл. 1, 2). Це свідчить, що транслокація Са²⁺ мітохондріальними обмінниками та інгібування її катіонами металів пов'язані із взаємодією їх з кисневмісними групами іон-транспортувальних центрів цих Сa²⁺-транспортувальних систем.

Таблиця 1 Залежність ефективності інгібування Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки (І₅₀, ммоль/л) катіонами одновалентних металів від їхніх фізико-хімічних параметрів.

Примітка: тут і далі р - вірогідність коефіцієнта кореляції.

Таблиця 2 Залежність ефективності інгібування Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки (І₅₀, мкмоль/л) катіонами двовалентних металів від їхніх фізико - хімічних параметрів.

Встановлено також позитивний кореляційний зв'язок ефективності інгібування (I₅₀) Ca²⁺/H⁺- і Na⁺/Ca²⁺- обмінників мітохондрій катіонами одно- і двовалентних металів з ентальпією їхньої гідратації та негативний кореляційний зв'язок ефективності цього інгібування з величинами кристалографічного радіуса іонів цих металів (див. табл. 1, 2).

Ці результати вказують на те, що процес транслокації іонів Са²⁺ мітохондріальними обмінниками та інгібування їх катіонами металів супроводжуються процесами дегідратації - гідратації іонів цих металів. Дегідратація іонів одно- і двовалентних металів супроводжує також транслокацію цих іонів Na⁺/Ca²⁺-обмінником плазматичної мембрани секреторних клітин хірономуса (Федірко Н. В., 1999) та шлункових залоз (Дубицький Л.О., Вовканич Л.С., 2001, 2001). Це свідчить про подібність фізико-хімічних механізмів транслокації іонів іонними обмінниками плазматичної мембрани і мембрани мітохондрій клітин.

Отже, проведеними дослідженнями охарактеризовано кінетичні властивості Na⁺/Ca²⁺- і Ca²⁺/H⁺-обмінників мітохондрій печінки і міокарда. Показано, що ці мітохондріальні обмінники ефективно функціонують в режимі Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з цих органел за фізіологічних рівнів концентрації Na⁺ і Н⁺ у цитозолі клітини із стехіометрією обміну не менше 2 Na⁺ (Н⁺) : 1 Са²⁺. На основі кінетичних параметрів (V_max, К_0,5) Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій досліджуваних тканин встановлено, що мітохондрії міокарда характеризуються потенційно вищою здатністю до Na⁺- і Н⁺-залежного вивільнення Са²⁺ з цих органел порівняно з мітохондріями печінки. Катіони одно- та двовалентних металів інгібують системи Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій за конкурентним типом. Інгібування мітохондріальних обмінників катіонами одновалентних металів супроводжується модифікацією кооперативних взаємодій іонів металів з їхніми іон-зв'язувальними центрами у ході транспортувального циклу. Транслокація Са²⁺, Na⁺ і Н⁺ мітохондріальними обмінниками та інгібування їх катіонами інших одно- та двовалентних металів пов'язані із взаємодією цих катіонів з кисневмісними групами іон-транспортувальних центрів цих Сa²⁺-транспортувальних систем і супроводжуються процесами дегідратації-гідратації іонів цих металів.

Висновки

У дисертаційній роботі, відповідно до поставленої мети та завдань, досліджено функціональне значення і властивості систем Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда, зокрема їхня роль у забезпеченні кальцій-акумулювальної функції цих органел. Охарактеризовано кінетичні властивості цих мітохондріальних обмінників, фізико-хімічні механізми впливу катіонів одно- та двовалентних металів на ці іон-транспортувальні системи.

У результаті проведених досліджень зроблено наступні висновки:

Встановлено, що Na⁺- і Н⁺-залежний вихід Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда спостерігаються в діапазоні фізіологічних значень концентрації Na⁺ (5,0 - 20,0 ммоль/л) та рН (7,2 - 7,4). Це свідчить, що Na⁺/Са²⁺- і Ca²⁺/H⁺-обмінники мітохондрій ефективно функціонують в режимі виходу Са²⁺ з цих органел за фізіологічних рівнів концентрації Na⁺ і Н⁺ у цитозолі клітини.

Залежність швидкості Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій від концентрації Nа⁺ і Н⁺ описується сигмоподібною кривою і характеризується коефіцієнтом Хілла, який є близьким до двох (1,6 - 1,94). Залежність швидкості Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда від вмісту кальцію у цих органелах має гіперболічний характер. Це свідчить, що цей вихід опосередковується обмінниками із стехіометрією обміну не менше 2Na⁺ (Н⁺) : 1Са²⁺.

Показано, що значення V_max систем Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій міокарда, розраховані на основі залежності швидкості цього процесу від концентрації Na⁺ і Н⁺ на порядок вищі, ніж з мітохондрій печінки. Це свідчить, що мітохондрії міокарда характеризуються потенційно вищою здатністю до Na⁺-залежної регуляції виходу Са²⁺ з цих органел порівняно з мітохондріями печінки. Разом з тим, спорідненість систем Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда до Na⁺ і Н⁺ суттєво не відрізняється.

Встановлено, що Na⁺- і Н⁺-залежний вихід Са²⁺ з матриксу мітохондрій печінки є температурнозалежними процесами. Високі значення енергії активації Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій, розраховані за даними аналізу отриманих температурних залежностей у координатах Арреніуса є додатковим доказом того, що ці іон-транспортувальні процеси здійснюються за участю специфічних білків-переносників внутрішньомітохондріальної мембрани, які забезпечують повільне вивільнення кальцію з цих органел. Активність систем Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ мітохондрій залежить від в'язкості фосфоліпідного бішару мембрани мітохондрій тканин.

Катіони одно- та двовалентних металів пригнічують швидкість Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда переважно за конкурентним типом. За ефективністю інгібування Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда (І₅₀) іони одновалентних металів розміщуються у такій послідовності: Cs⁺ < К⁺ < Rb⁺ < Li⁺ < Tl⁺. Ефективність інгібування Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки і міокарда катіонами двовалентних металів збільшується у такій послідовності: Ba²⁺ < Mg²⁺ < Sr²⁺ < Mn²⁺.

Ефективність інгібування Na⁺/Ca²⁺- і Ca²⁺/H⁺-обмінників мітохондрій іонами одно- і двовалентних металів (I₅₀) позитивно корелює із спорідненістю їх до кисневмісних груп лігандів (EDTA, глутамат), потенціалом іонізації, електронегативністю атомів цих металів та ентальпією їхньої гідратації. Встановлено також негативний кореляційний зв'язок ефективності цього інгібування з величинами кристалографічного радіуса іонів цих металів. Це свідчить, що транслокація іонів Са²⁺ мітохондріальними обмінниками та інгібування її катіонами металів пов'язані із взаємодією їх з кисневмісними групами іон-транспортувальних центрів цих Сa²⁺-транспортувальних систем та супроводжуються процесами дегідратації - гідратації іонів цих металів. мітохондрія печінка міокард катіон

Вплив іонів одновалентних металів на системи Na⁺- і Н⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій супроводжується модифікацією кооперативних взаємодій іонів цих металів з їхніми іон-зв'язувальними центрами. Така модифікація є одним із механізмів пригнічення транслокації іонів цими іон-транспортувальними системами.

Список друкованих праць за темою дисертації

1. Крив'як Н., Вовканич Л., Дубицький Л. Ідентифікація і кінетичний аналіз Nа⁺-залежного виходу Са²⁺ з ізольованих мітохондрій печінки щурів // Вісник Львівського ун-ту. Серія біологічна. - 2004. - Вип. 35. - С. 231-235.

2. Крив'як Н. В., Вовканич Л. С., Дубицький Л. О. Порівняльний аналіз кінетичних властивостей Н⁺- і Na⁺- залежного виходу Cа²⁺ з мітохондрій печінки // Експерим. та клін. фізіологія і біохімія . - 2005. - 2(30). - С.14 -19.

3. Дубицький Л., Вовканич Л., Наливайко Н. Вплив катіонів одновалентних металів на функціонування Ca²⁺/H⁺-обмінника мітохондрій печінки щурів // Вісник Львівського ун-ту. Серія біологічна. - 2006. - Вип. 41. - C. 103-108.

4. Наливайко Н. В., Вовканич Л. С., Дубицький Л. О. Інгібіторний аналіз взаємодії катіонів одновалентних металів з системою Na⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки // Укр. біохім. журн. - 2006 - Т. 78, № 5. - С. 34-40.

5. Наливайко Н. В., Вовканич Л. С., Дубицький Л. О. Порівняльний аналіз механізмів взаємодії катіонів двовалентних металів з Na⁺/Ca²⁺- і Ca²⁺/H⁺-обмінниками мітохондрій печінки // Біофізичний вісник. - 2006 - Вип. 1 (17). - С.74-79.

6. Наливайко Н. В., Кравенська Є. В., Дубицький Л. О. Температурна залежність швидкості H⁺- І Nа⁺-залежного виходу Са²⁺ з мітохондрій печінки // Експерим. та клін. фізіологія і біохімія . - 2006. - 4(35). - С.7-12.

7. Krivyjak N., Vovkanych L., Dubitsky L. Kinetic analysis of Na⁺-dependent efflux of Ca²⁺ from the rat liver mitochondria // First Ukr. Congress Cell. Biol., Lviv (Ukraine), April 25-28, 2004. - Lviv, 2004. - P. 237.

8. Вовканич Л.С., Крив'як Н.В., Дубицький Л.О. Вплив катіонів одновалентних металів на Na⁺/Ca²⁺-обмінник внутрішньої мембрани мітохондрій печінки щурів // Матеріали міжнародної конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи”, Львів, 2004, 7-9 жовтня. - Львів, 2004. - С.16.