Підвищення ефективності протипухлинної глікопептидної вакцини за допомогою CрG ДНК З Bacillus subtilis

На різних експериментальних моделях пухлинного росту встановлено, що застосування бактеріальної CpG ДНК з культуральної рідини B. subtilis супроводжується протипухлинним та антиметастатичним ефектами, вираженість яких залежить від штаму пухлини, режиму застосування та способу введення бактеріальної CpG ДНК. Експериментально доведена можливість використання CpG ДНК з культуральної рідини B. subtilis в якості ад`юванта для підвищення ефективності протипухлинної глікопептидної вакцини.

Отримані результати свідчать про перспективність застосування імунотерапевтичних підходів на основі CpG ДНК в клінічній практиці для лікування хворих на злоякісні новоутворення.

Ключові слова: ад`ювант, бактеріальна CpG ДНК, імунологічні показники, протипухлинна глікопептидна вакцина, протипухлинний ефект, Bacillus subtilis.

Аннотация

Олишевский С.В. Повышение эффективности противоопухолевой гликопептидной вакцины с помощью CрG ДНК из Bacillus subtilis (экспериментальные исследования). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 - Онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев - 2007.

Диссертация посвящена разработке нового адъюванта на основе ДНК бактериального происхождения, исследованию его иммунобиологических свойств, а также изучению эффективности применения отдельно и совместно с противоопухолевой гликопептидной вакциной в иммунотерапии злокачественных новообразований.

Основные задачи исследования состояли в том, чтобы выделить бактериальную ДНК из культуральной жидкости Bacillus subtilis и охарактеризовать ее молекулярно-биологические свойства; исследовать иммунобиологические эффекты этой бактериальной ДНК; на различных экспериментальных моделях опухолевого роста определить ее противоопухолевую и антиметастатическую эффективность, а также экспериментально обосновать возможность повышения эффективности противоопухолевой гликопептидной вакцины путем применения адъюванта, созданного на основе бактериальной CpG ДНК из культуральной жидкости B. subtilis.

В результате проведенных исследований удалось выделить, идентифицировать и охарактеризовать ДНК из культуральной жидкости B. subtilis, а также проследить динамику ее накопления в процессе культивирования бактерии. Показано, что внеклеточная ДНК накапливается в культуральной жидкости B. subtilis достаточно неравномерно. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле выявлено, что ДНК, высвобождаемая B. subtilis в культуральную жидкость, состоит из нескольких компонентов, наиболее выраженными из которых являются два фрагмента ДНК с величиной молекул 2650 и 3050 пар нуклеотидов. С помощью рестрикционного анализа показано, что фракции ДНК, полученные на 7-9-е сутки культивирования B. subtilis GP1-807-03, являются наиболее чувствительными к действию эндонуклеазы НраІІ, что может свидетельствовать об относительно высоком содержании в их составе неметилированных CG-динуклеотидов. Определено, что 7-9-е сутки культивирования B. subtilis GP1-807-03 являются оптимальными для получения наибольшего выхода внеклеточной ДНК, обогащенной остатками неметилированного цитозина.

Показано, что бактериальная CpG ДНК обладает иммуногенными свойствами и, в отличие от ДНК из эритроцитов цыпленка, при подкожном введении экспериментальным животным вызывает развитие транзиторной локальной гиперплазии лимфатических узлов, тогда как при внутрибрюшном введении - спленомегалию и воспалительную реакцию в брюшной полости. Отмечена способность бактериальной CpG ДНК из культуральной жидкости B. subtilis in vitro, а также in vivo повышать фагоцитарную и метаболическую (в НСТ-тесте) активность перитонеальных макрофагов здоровых мышей и животных с трансплантированными опухолями. С использованием метода электронного парамагнитного резонанса, получены данные относительно модулирующего влияния бактериальной CpG ДНК на способность перитонеальных макрофагов генерировать супероксидные радикал-анионы и продуцировать оксид азота (NO). В условиях in vitro показано, что бактериальная CpG ДНК потенцирует цитотоксическую активность естественных киллерных клеток (на уровне эталонного стимулятора - форбол миристат ацетата), а также является мощным индуктором интерферонов б и г (на уровне эталонного индуктора - рolyІ:polyС). Введение животным бактериальной CpG ДНК оказывает положительное модулирующее влияние на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа на эритроциты барана и комплемент-зависимую цитотоксичность сыворотки крови мышей. Следует отметить, что применение бактериальной CpG ДНК из культуральной жидкости B. subtilis у животных с привитыми опухолями позволяет преодолеть вызванную опухолевым ростом иммуносупрессию, что проявлялось повышением исследуемых иммунологических показателей.

На различных экспериментальных моделях опухолевого роста установлено, что применение бактериальной CpG ДНК из культуральной жидкости B. subtilis сопровождается противоопухолевым и антиметастатическим эффектами, выраженность которых зависит от штамма опухоли, режима применения и способа введения бактериальной CpG ДНК. Отмечена противоопухолевая эффективность применения пери- и внутриопухолевых инъекций CpG ДНК бактериального происхождения у животных с подкожно трансплантированными опухолями. Экспериментально доказана возможность применения CpG ДНК из культуральной жидкости B. subtilis в качестве адъюванта для повышения эффективности противоопухолевой гликопептидной вакцины.

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности иммунотерапевтического применения CpG ДНК в клинической практике для лечения больных злокачественными новообразованиями.

Ключевые слова: адъювант, бактериальная CpG ДНК, иммунологические показатели, противоопухолевая гликопептидная вакцина, противоопухолевый эффект, Bacillus subtilis.

Annotation

Olishevsky Sergiy. Enhancement of the cancer glycopeptide vaccine efficacy using CpG DNA of Bacillus subtilis (experimental studies). - Manuscript.

Dissertation for the candidate of biological science degree in speciality 14.01.07 - Oncology. - R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv - 2007.

The present work is focused on the development of novel adjuvant based on bacterial DNA. Results of studies directed on investigation of immunobiological effects of novel adjuvant and research of the efficacy of its immunotherapeutic application alone or combined with cancer glycopeptide vaccine are provided and discussed in detail.

Bacterial DNA was isolated from Bacillus subtilis culture medium, identified and characterized. The present findings suggest that 7th-9th days of cultivation are optimal to obtain the bacterial extracellular DNA containing unmethylated CpG-motifs for the following immunotherapeutic application.

The presented results have demonstrated that B. subtilis CpG DNA possesses immunogenic properties and in contrast to chicken erythrocyte DNA causes transitory changes of lymphoid follicles and inflammation into peritoneal cavity of challenged mice. Evidence from our studies showed that in vitro and in vivo applications of B. subtilis CpG DNA were associated with positive modulation of functional activity of innate immunity cells and with strong induction of interferon б/г. Moreover, B. subtilis CpG DNA challenged to mice caused significant stimulation of delayed type hypersensitivity and potentiated the humoral immune response detected using complement-dependent blood serum cytotoxicity.

The efficacy of immunotherapeutic application of B. subtilis culture medium CpG DNA was evaluated using various experimental tumor models. Significant anticancer and antimetastatic effects of B. subtilis CpG DNA that depended on tumor strain, application regimen and mode of bacterial CpG DNA introduction were obtained. The possibility of application CpG DNA from B. subtilis as an adjuvant for enhancement of cancer glycopeptide vaccine efficacy was proved in experiments.

Thus, results obtained may be important for development of future immunotherapeutic approaches that implicate immunostimulatory CpG DNA.

Key words: adjuvant, antitumor effect, Bacillus subtilis, bacterial CpG DNA, cancer glycopeptide vaccine, immunologic indices.

Размещено на Allbest.ru