Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ТРАВМАТОЛОГІЇ ТА ОРТОПЕДІЇ

УДК 616.72-002.2-008.8.002.69.616-071-08

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

РОЗРОБКА БІОЛОГІЧНИХ ЗАМІННИКІВ СИНОВІАЛЬНОЇ РІДИНИ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ І ЛІКУВАННЯ ОСТЕОАРТРОЗУ (експериментальне дослідження)

Пашков Олександр Євгенович

14.01.21 - травматологія та ортопедія

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті травматології та ортопедії АМН України

Наукові керівники:

доктор медичних наук, професор Герасименко Сергій Іванович, заступник директора з науково-лікувальної роботи, завідувач відділу захворювань суглобів у дорослих, Інститут травматології та ортопедії АМН України

доктор біологічних наук, професор Магомедов Садруддін, завідувач лабораторії біохімії, Інститут травматології та ортопедії АМН України

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Попов Василь Антонович, завідувач кафедри ортопедії та травматології № 2 Національної медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України

доктор медичних наук, професор Волошин Олександр Іванович, професор кафедри травматології і ортопедії Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України

Провідна установа:

Науково-дослідний інститут травматології та ортопедії Донецького державного медичного університету ім. М. Горького МОЗ України, м. Донецьк.

Захист дисертації відбудеться 24.04.2007 року о__13-30__годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.606.01 при Інституті травматології та ортопедії АМН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Воровського, 27.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту травматології та ортопедії АМН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Воровського, 27.

Автореферат розісланий 22.03.2007 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Страфун С.С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема лікування хворих з дегенеративно-дистрофічними захворюваннями, зокрема остеоартрозом, є важливою в артрології.

Остеоартроз відноситься до тяжких поширених прогресуючих захворювань суглобів, що призводять до зниження працездатності та інвалідності.

Остеоартроз у структурі захворюваності населення складає від 6,4 % до 12 % і посідає перше місце (70 %) серед патології суглобів, при цьому з віком частота захворюваності зростає і після 60 років сягає 97 % (Беневоленская Л.И., Бжезовский М.М., 1988; Насонова В.А., Астапенко М.Г., 1989; Дедух Н.В. та ін., 1992; Корж Н.А., 1997; Otte P., 1983).

Слід відзначити, що до теперішнього часу ще недостатньо розроблена патогенетична терапія остеоартрозу. Результати консервативного лікування показали, що існуючі методики малоефективні, тому в 63,8 % закінчуються інвалідизацією. При консервативному лікуванні остеоартрозу колінних суглобів негативні результати складають від 25 % до 50 % (Насонова В.А., Астапенко М.Г., 1989; Левенец В.Н., Пляцко В.В., 1992; Корж Н.А. та ін., 1997; Насонова В.А., Бунчук Н.В., 1997). Тому пошуки нових патогенетично обґрунтованих методів профілактики і лікування хворих на остеоартроз є важливою медичною і соціальною проблемою.

При остеоартрозі первинно вражається суглобовий хрящ, що при подальшому прогресуванні патологічного процесу призводить до розвитку деформації і порушення функції суглоба. У зв'язку з цим, пошуки методів і засобів ефективного захисту суглобового хряща від руйнування (хондропротекторів) є однією з важливих проблем терапії остеоартрозу.

На теперішній час достатньо повно вивчена роль і місце синовіальної рідини і суглобового хряща в життєдіяльності суглоба. Синовіальна рідина забезпечує трофіку суглобового хряща і виконує роль мастила суглобових поверхонь, тобто роль лубриканта. При остеоартрозі змінюється склад і властивості синовіальної рідини, що призводить до порушення трофіки, дистрофії і некрозу з подальшою деструкцією суглобового хряща і порушення функції суглоба. Тому корекція синовіального середовища та поліпшення трофіки суглобового хряща шляхом створення і використання біологічних замінників синовіальної рідини є перспективними. Крім трибологічної дії, біологічні замінники синовіальної рідини можуть сприяти репаративному процесу в суглобовому хрящі, позитивно впливати та, певною мірою, регулювати обмінні процеси в суглобовому хрящі.

Спроби розробки моделей штучної синовіальної рідини на основі полімерних сполук виявилися недостатньо ефективними (Василенкайтис В.В., Г. Гуобис, 1976; Василенкайтис В.В., 1983, 1999; Матулис А.А., Далоненс И.Т., 1988).

Розроблений Є.Д. Бєлоєнко засіб лікувальної корекції трибологічних властивостей синовіального середовища суглобів, що містить рідкокристалічні сполуки холестерину, які володіють хондропротекторною дією, вимагає клінічної апробації (Белоенко Е.Д., 1992). У зв'язку з цим створення біологічних замінників синовіальної рідини, які виконували б роль нативної синовіальної рідини і могли б застосовуватися для лікування і профілактики дистрофічних і запальних захворювань суглобів є важливим науковим та клінічним завданням.

Зв'язок роботи з науковими темами. Матеріали дисертації є фрагментом планової НДР: “Розроблення системи заходів з профілактики, ранньої діагностики та лікування дегенеративно-дистрофічних уражень суглобів”, яка виконана в Інституті травматології та ортопедії АМН України, № держреєстрації 0198U0002118.

Мета роботи - розробити біологічні замінники синовіальної рідини і обґрунтувати можливість їх застосування в експерименті з метою профілактики і лікування остеоартрозу.

Задачі дослідження:

створити біологічні замінники синовіальної рідини і розробити тимчасовий технологічний регламент на їх виготовлення;

вивчити лубрикаційні (змащувальні) властивості біологічних замінників синовіальної рідини в експерименті;

вивчити гостру і хронічну токсичність гіалуронової кислоти, як основного компонента біологічного замінника синовіальної рідини, і обґрунтувати можливість її застосування як головної діючої речовини при створенні препарату для профілактики і лікування остеоартрозу;

обґрунтувати в експерименті профілактичний і лікувальний ефект біологічних замінників синовіальної рідини при остеоартрозі;

розробити тимчасовий технологічний регламент на виробництво з канатиків пуповини людини гіалуронової кислоти - субстанції біологічних замінників синовіальної рідини;

розробити тимчасовий технологічний регламент на виготовлення готових лікарських форм - препаратів біологічних замінників синовіальної рідини.

Об'єкт дослідження: 134 дорослих кроля масою 2,5 - 2,8 кг, 60 білих дорослих мишей та 60 щурів лінії Вістар масою 160-180 г.

Предмет дослідження: біохімічні показники метаболізму органічного і мінерального компонентів кісткової тканини, морфологічні зміни в кістковій тканині і суглобовому хрящі колінного суглоба тварин.

Методи дослідження: комплекс клінічних, біохімічних, біомеханічних та морфологічних методів дослідження тканин суглоба. Для вивчення терміну перебування біологічного замінника синовіальної рідини в суглобі застосований радіоізотопний метод. Трибологічні властивості біологічних замінників синовіальної рідини, створених на основі сироватки крові кроля і на 10 % медичному желатині, вивчали на апараті ТМ - 90, на якому паралельно, для порівняльного аналізу, досліджували синовіальну рідину великої рогатої худоби, 15 % полівінілпіролідон - синтетичний замінник синовіальної рідини, дистильовану воду і фізіологічний розчин. Для моделювання остеоартрозу застосовували метод часткової меніскектомії. Вивчали гостру і хронічну токсичність гіалуронової кислоти та готових лікарських форм біологічних замінників синовіальної рідини.

Наукова новизна роботи:

- розроблені нові біологічні замінники синовіальної рідини;

- визначені мастильні властивості біологічних замінників синовіальної рідини;

- встановлена профілактична і лікувальна дія нових препаратів біологічних замінників синовіальної рідини при експериментальному остеоартрозі;

- розроблені тимчасові технологічні регламенти на виробництво гіалуронової кислоти і готових лікарських форм - біологічних замінників синовіальної рідини.

Практичне значення роботи. На підставі експериментальних, клінічних, біомеханічних, біохімічних і морфологічних досліджень обґрунтовано нові можливості профілактики і лікування остеоартрозу на основі застосування створених біологічних замінників синовіальної рідини.

Особистий внесок автора. Автором дисертаційної роботи самостійно проведені експериментальні дослідження, вивчено зміни суглобового хряща при остеоартрозі, вплив біологічних замінників синовіальної рідини на суглобовий хрящ в нормальному суглобі і при експериментальному остеоартрозі. Проведено лумбрикаційні дослідження запропонованих біологічних замінників синовіальної рідини. Обґрунтовано методику внутрішньосуглобового введення біологічних замінників синовіальної рідини в експерименті. Розроблено тимчасовий технологічний регламент на гіалуронову кислоту і готові лікарські форми біологічних замінників синовіальної рідини.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації доповідались на Другій Всеросійській конференції (Москва, 1993), Республіканській науково-практичній конференції (Київ, 1995), науково-практичній конференції молодих вчених (Київ, 1995), Українській науково-практичній конференції (Вінниця, 1996), на засіданнях товариства ортопедів і травматологів м. Києва і Київської області (Київ, 1999, 2000 і 2001).

Публікації: За темою дисертації опубліковано 11 робіт в наукових журналах, матеріалах, збірках тез українських і міжнародних з'їздів, конференцій, у тому числі 3 статті надруковано у виданнях, ліцензованих ВАК України.

Структура і об'єм роботи. Дисертація виконана на 123 сторінках машинописного тексту, включає 20 рисунків і 15 таблиць, складається з вступу, п'яти глав, підсумку, висновків і списку літератури з 182 джерел, у тому числі 92 авторів країн СНД і 90 авторів далекого зарубіжжя.

ЗМІСТ РОБОТИ

гіалуронова кислота лікування остеоартроз

Матеріали та методи дослідження. Робота виконана на 134 дорослих кролях масою 2,5 - 2,8 кг, 60 білих дорослих мишах та 60 щурах лінії Вістар масою 160 - 180 г.

Гостру токсичність вивчали на 60 дорослих нелінійних білих мишах, 60 дорослих білих щурах лінії Вістар та 12 дорослих кролях породи шиншила. На білих мишах та білих щурах гостру токсичність вивчали методом пробіт-аналізу з побудовою прямої гострої токсичності на півлогарифмічному папері. На кролях гостру токсичність вивчали методом експрес-аналізу за В.Б. Прозоровським. Гіалуронову кислоту у вигляді 3 % фізіологічного розчину вводили внутрішньочеревно таким чином, щоб об'єм рідини не перевищував мишам - 1, щурам - 5 та кролям - 10 см3. Спостереження проводили на протязі двох тижнів. Хронічну токсичність вивчали на 12 дорослих кролях. Гіалуронову кислоту у вигляді 3 % розчину вводили у черевну порожнину один раз на тиждень в об'ємі 0,5 см3 протягом шести місяців. Термін вивчення - шість місяців, пов'язаний з тривалістю можливого лікування препаратом (п. 6.2 додатку 3 наказу № 220 від 19 вересня 2000 р. ДФЦ).

Трибологічні властивості біологічних замінників синовіальної рідини, створених на основі сироватки крові кроля і на 10 % медичному желатині, вивчали на апараті ТМ - 90, на якому для порівняльного аналізу досліджували і синовіальну рідину великої рогатої худоби, 15 % полівінілпіролідон - синтетичний замінник синовіальної рідини, дистильовану воду і фізіологічний розчин. Із суглобової поверхні проксимального епіфіза великогомілкової кістки телят безпосередньо після їх забиття виготовляли зразки кістково-хрящових блоків (15х10х10) мм і контртіла розміром (34х18х15) мм відповідно. Виконували зворотно-поступальні рухи кістково-хрящового зразка відносно контртіла, між стикуючими поверхнями яких вводили окремо по 10 крапель кожної з досліджуваних рідин. Дослідження проводили при температурі повітря 37 0С, навантаженням 30 г та швидкістю зміщення зразка 5 см/с. Кожний розчин досліджували п?ятикратно. Вивчали силу (грам), коефіцієнт та дисперсію сили тертя (%). Ці дослідження проведено в лабораторії фізико-хімічної механіки матеріалів інституту проблем матеріаловедення НАН України (зав. канд. тех. наук А.І. Юга). В?язкість цих розчинів вивчали при температурі 37 0С за допомогою капілярного віскозиметра типа ВК системи Ю. Пінкевича в сантистоксах (сСт).

Загальну і місцеву реакції тканин суглоба на введення біологічних замінників синовіальної рідини вивчали на 48 кролях, які були розподілені на чотири групи по 12 кролів у кожній (табл. 1). Тваринам першої групи в порожнину здорового колінного суглоба вводили 0,5 мл фізіологічного розчину, другої групи - 0,5 мл 3 % розчину гіалуронової кислоти, третьої групи - 0,5 мл біологічного замінника на основі 10 % розчину медичного желатину та четвертої групи - 0,5 мл біологічного замінника на основі сироватки крові кроля. Препарати вводили щотижня. Морфологічному дослідженню піддавали суглобову капсулу, суглобовий хрящ виростків стегнової та великогомілкової кісток, серце, печінку, нирки та реґіонарні лімфатичні вузли в строки 14, 21, 30 і 45 днів після часткової резекції медіального меніска. Вимірювали загальну температуру.

Таблиця 1

Розподіл кролів за умовами досліду та строками спостереження, діб

Групи тварин	Препарат, який вводили в здоровий колінний суглоб кроля	Число тварин по строкам спостереження	Усього
		14	21	30	45
1	Фізіологічний розчин (контроль)	3	3	3	3	12
2	Замінник синовіальної рідини на основі 10 % желатину	3	3	3	3	12
3	Замінник синовіальної рідини на основі сироватки крові	3	3	3	3	12
Усього		9	9	9	9	36

Специфічну дію гіалуронової кислоти вивчали на 20 кролях. Усім тваринам, які були розподілені на 4 групи (по 5 тварин), виконано парціальну меніскектомію середньої третини медіального меніска правого колінного суглоба за методикою Moskowitz (1973). Тваринам першої групи після парціальної меніскектомії з шостого дня після операції один раз на тиждень в порожнину оперованого колінного суглоба вводили 0,5 мл фізіологічного розчину (контроль), а тваринам другої групи також з шостого дня по тій же методиці вводили гіалуронову кислоту. Тваринам третьої та четвертої груп вводили в колінний суглоб протягом шести тижнів по тій же методиці відповідно фізіологічний розчин та гіалуронову кислоту, починаючи з сьомого тижня після операції.

На моделі остеоартрозу колінного суглоба в 30 кролів визначали профілактичну та лікувальну дії біологічних замінників синовіальної рідини на виникнення і перебіг дегенеративно-дистрофічного процесу. У І групі тварин цієї серії досліджень (5 кролів) вивчали динаміку розвитку остеоартрозу колінного суглоба, який отримували шляхом часткової резекції меніска. Імобілізацію оперованого суглоба не проводили. Тваринам другої групи (5 кролів) у порожнину колінного суглоба кожні п?ять днів протягом 45 днів вводили по 0,5 мл стерильного фізіологічного розчину (контроль), третьої групи (5 кролів) - по 0,5 мл біологічного замінника синовіальної рідини на основі 10 % розчину желатину, тваринам четвертої групи (5 кролів) вводили по тій же схемі по 0,5 мл розчину біологічного замінника синовіальної рідини на основі сироватки крові кроля. Для визначення лікувальної дії біологічних замінників синовіальної рідини кролям п?ятої групи (5 тварин) через 45 діб після парціальної меніскектомії щотижня в оперований колінний суглоб протягом 1,5 міс вводили по 0,5 мл біологічного замінника синовіальної рідини на основі розчину медичного желатину та тваринам шостої групи (5 тварин) за такою самою схемою біологічний замінник синовіальної рідини на основі сироватки кроля.

Строк перебування біологічного замінника синовіальної рідини в суглобі визначали радіоізотопним методом: до 0,7 мл біологічного замінника синовіальної рідини добавляли 0,3 мл елюата Тс 91 М і протягом 15 хв інкубували при температурі 37 0С. Доза радіоактивної речовини складала 33 МБК. Цей препарат вводили в колінний суглоб, вимірювали імпульси, реєстрували евакуацію міченого препарату з колінного суглоба і місця його накопичення в організмі через 1, 8, 16, 24 і 43 год.

За дослідними тваринами проводили клінічні спостереження: змірювали загальну (ректальну) та місцеву температури, дихання, проводили рентгенографію колінних суглобів та вивчали загальну формулу крові. У кожний строк спостереження використовували не менше трьох кролів.

Після закінчення строку спостереження в тварин для проведення біохімічних досліджень із серця під ефірним наркозом брали 6?8 мл крові, які були розподілені на 3 серії: профілактична, лікувальна та інтактні тварини. У свою чергу, профілактична та лікувальна серії розподілено на 3 групи: контрольна, дослідна (синовіальна рідина на основі сироватки крові кроля) і дослідна (синовіальна рідина на основі желатину) групи. У сироватці крові визначали наступні біохімічні показники: глікозаміноглікани (ГАГ) за методом Кляцкіна С.А і Ліфшиць Р.І., активність колагенази за методом Lindy S., Halme J., фракції гідроксипроліну виділяли за методом Frey S., а гідроксипролін в них визначали за Stegemann H.

Для гістологічних досліджень у тварин усіх серій брали обидва колінних суглоби, а у тварин першої серії, окрім колінних суглобів, також і нирки, печінку та реґіонарні (пахові) лімфатичні вузли. Крім того, у тварин після забиття брали ділянку суглобового хряща проксимального епіфіза великогомілкової кістки масою 0,5?0,6 мг для визначення ГАГ за методом Bitter і Muir. Ділянки вказаних органів після гістологічного дослідження заливали в целоїдин та виготовляли тонкі зрізи. Зафарбовували гістологічні препарати гемотоксиліном та еозином, а також пікрофуксином за ван Гізон.

Результати дослідження. Одним із завдань теоретиків і клініцистів є розробка таких замінників синовіальної рідини, які б за своїми біологічними та фізичними властивостями максимально наближалися до природної, мали оптимальні трофічні та трибологічні властивості, позитивно впливали на метаболізм суглобового хряща. В Інституті травматології та ортопедії АМН України створено біологічні замінники синовіальної рідини, яким саме притаманні перераховані властивості. До складу нових біологічних замінників синовіальної рідини входять усі основні компоненти нормальної синовіальної рідини, а також лікарські препарати, застосування яких передбачено медичною фармакопеєю. Біологічні замінники синовіальної рідини створені на основі 10 % розчину медичного желатину та на основі сироватки крові кроля.

Результати проведених нами експериментальних спостережень свідчать про те, що багаторазове внутрішньосуглобове введення гіалуронової кислоти не викликало в кролів ні загальної, ні місцевої патологічної реакцій. Температура тіла, пульс, дихання та кров у всіх експериментальних тварин були в межах фізіологічної норми.

Регіональні лімфатичні вузли вірогідно не збільшені. У великих суглобах цих тварин протягом усього строку спостереження ознак запального процесу (болісність, припухлість, підвищення місцевої температури) не відзначалося. Обсяг рухів у колінному суглобі зберігався в повному обсязі.

Дані з вивчення трибологічних властивостей біологічних замінників синовіальної рідини, а також в'язкість цих розчинів порівняльно з іншими розчинами наведено у таблиці 2.

Таблиця 2

Результати вивчення мастильних властивостей біологічних замінників синовіальної рідини

Назва рідини	Сила тертя, г	Коефіцієнт тертя	Дисперсія сили тертя, %
Біологічний замінник синовіальної рідини на основі сироватки крові	1,2	0,04	±15
Біологічний замінник синовіальної рідини на основі 10 % желатину	1,1	0,038	± 11
Синовіальна рідина великої рогатої худоби	1,0	0,03	± 22
15 % полівінілпіралідон	1,9	0,063	±20
Дистильована вода	1.0	0,066	± 18
Фізіологічний розчин	1,7	0,056	± 20

Результати вивчення змащуваних властивостей біологічних замінників синовіальної та інших рідин показали, що за своїми трибологічними показниками вони наближаються до показників натуральної синовіальної рідини великої рогатої худоби. Так, коефіцієнт тертя біологічного замінника синовіальної рідини на основі 10 % медичного желатину становить 0,03, а на основі сироватки крові кроля 0,04 ( при дисперсії сили тертя відповідно ±11 % та ±15 %). Такі ж показники синовіальної рідини великої рогатої худоби, відповідно 0,03 та ±22 %. Кількісні характеристики сили тертя біологічних замінників синовіальної рідини становлять 1,1 ? 1,2, а природної рідини ? 1,0.

Відомо, що для нормального функціювання суглоба велике значення має в?язкість синовіальної рідини, яка в людини становить 4,424±0,101 сСт. В?язкість, запропонованих нами біологічних замінників синовіальної рідини, становить: у замінника на основі 10 % медичного желатину 5,121±0,163 та в замінника на основі сироватки крові ? 3,891±0,099 сСт, тобто характеристики показників в?язкості біологічних замінників синовіальної рідини наближаються до природної синовіальної рідини.

Отримані результати свідчать, що запропоновані біологічні замінники синовіальної рідини за своїми трибологічними якостями наближаються до таких, що притаманні природній синовіальній рідині (рідина великої рогатої худоби), ніж іншим препаратам.

Нами розроблена технологія одержання гіалуронової кислоти, а також технологія готових лікарських форм препаратів біологічних замінників синовіальної рідини. Гіалуронову кислоту отримували із пуповинних канатиків людини, які надходили за договором із пологового будинку № 5 м. Києва. Відібрані пуповинні канатики людини, звільняли від судин та крові, поміщали в скляний посуд, закривали герметично притертою кришкою, заливали ацетоном та зберігали у морозильній камері холодильника. Для використання виймали із морозильної камери, ацетон зливали, а пуповинні канатики занурювали в нову порцію ацетону і зберігали при температурі 5,01,0 оС. Термін зберігання до трьох місяців.

Відібрані пуповинні канатики розміщували між двома шарами фільтрувального паперу і витримували до повного зникнення ацетону. Після цього в скляному гомогенізаторі з тефлоновим пестиком їх подрібнювали до розміру не більше 1 мм3. Отриманий гомогенізат зважували та заливали холодною дистильованою водою (на 1 г гомогенізата 10 см3 води). Суміш залишали для набухання при кімнатній температурі протягом 30-40 хв. У подальшому отриману масу нагрівали до кипіння. Кип'ятили дві хвилини та у гарячому вигляді фільтрували. Термін придатності фільтрату при температурі 5,01,0 оС не більше двох діб. Використовували фільтрат з відносною в'язкістю 4,0-4,5 сСт (при температурі 20,01,0 оС). Слід враховувати, що гіалуроно-муциновий згусток при контакті з оцтовою кислотою дає стійкий мутний осадок. Для отримання робочої субстанції (гіалуронової кислоти) потрібно, щоб цей осадок був прозорим і рівномірно густим. Визначали концентрацію розчину гіалуронової кислоти за схемою (табл. 3).

Таблиця 3

Схема визначення робочого розчину гіалуронової кислоти

Інгредієнти	Одиниця виміру	Номери пробірок
		1	2	3	4	5
Гіалуронова кислота	см3	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1
Дистильована вода	см3	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9

Субстанцію і дистильовану воду змішували і поміщали в термостат при температурі 37,01,0 оС протягом 15 хв. Після цього робочий розчин доводили до температури 20,02,0 оС і витримували протягом 10 хв. Потім додавали 2 краплі 15 %-ної оцтової кислоти. Робочий розчин субстанції не повинен перевищувати 0,4 см3.

Стерилізацію проводили методом тендалізації (дрібна стерилізація). Тендалізацію повторювали 4 рази. За результатами контрольного посіву на м'ясопептонний агар (МПА) та середовище для контролю стерильності (СКС) визначали стерильність.

Виготовлення готової лікарської форми - біологічного замінника синовіальної рідини - для введення в суглоб зводиться до включення до її складу біологічних (гіалуронова кислота і 10 %-ний розчин желатину) і лікарських (розчин аскорбінової кислоти, розчин лідокаїну і гепарин) компонентів в певних пропорціях.

Стерилізацію ампул з готовою лікарською формою, як і субстанцію (гіалуронова кислота), проводили методом тендалізації, витримуючи їх у водяній бані при температурі 63,01,0 оС протягом 30 хв.

Обґрунтування тимчасового технологічного регламенту субстанції (гіалуронова кислота) та готової лікарської форми проведено шляхом аналізу сучасної літератури медичної та академічної наукових бібліотек, а також Галузевого Нормативного документа - ГНД 09-001-98.

Наші клінічні спостереження свідчать про те, що багаторазове внутрішньо суглобове введення в порожнину колінного суглоба кроля біологічного замінника синовіальної рідини, створеного на основі 10 % медичного желатину чи на основі сироватки крові кроля, не показали ніяких відхилень в загальному стані тварини. Температура тіла, пульс, дихання у всіх експериментальних тварин були в межах фізіологічної норми. Реґіонарні лімфатичні вузли не збільшені. В області колінного суглоба цих тварин протягом всіх строків спостереження ознаків запального процесу (болючість, припухлість, підвищення місцевої температури) не спостерігали. Об?єм рухів в колінному суглобі повний, кульгавість відсутня.

Макроскопічно при препаруванні колінного суглоба в його порожнині визначали звичайну кількість та колір рідини. Синовіальна оболонка суглобової капсули була щільною та мала характерний для неї блідо-рожевий колір. Суглобовий хрящ блискучий, гладенький, білий.

При гістоморфологічному дослідженні в пахових лімфатичних вузлах всіх тварин, яким в порожнину суглоба вводили замінник на основі сироватки крові кроля, спостерігали центри розмноження, в яких знаходили активні лімфоцити, макрофаги та ретикулярні клітини. Суглобовий хрящ мав звичайну структурно-функціональну організацію, поверхня його рівна, без дефектів. Синовіальна оболонка суглобової капсули місцями ущільнена та товща за рахунок проліферації синовіальних клітин. Внутрішні органи (печінка, нирки) без ознак проліферації, дистрофії та некрозу клітинних елементів.

Таким чином, порівняльний аналіз даних, отриманих у тварин першої серії дослідів, свідчить про те, що навіть багаторазове введення в колінний суглоб біологічних замінників синовіальної рідини на основі 10 % медичного желатину чи на основі сироватки крові кроля, загальної реакції організму та патологічних змін з боку синовіальної оболонки суглобової капсули і суглобового хряща не виникає.

Для вивчення профілактичної та лікувальної дій запропонованих біологічних замінників синовіальної рідини нами застосована модель дегенеративно-дистрофічного процесу в колінному суглобі ? остеоартроз, який отриманий шляхом часткової меніскектомії. Виявлено, що після часткової резекції медіального меніска в оперованому суглобі виникає дегенеративно-дистрофічний процес, який за своїми макро - і мікроскопічним проявам є типовим для остеоартрозу колінного суглоба. Так, уже через 21?30 діб проявляються перші гістоморфологічні ознаки остеоартрозу колінного суглоба, які мікроскопічно характеризуються змінами природного кольору суглобового хряща медіальних виростів стегнової та великогомілкової кісток в місці їх контакту, де суглобовий хрящ набув матового відтінку і став шерстистим. При подальшому спостереженні ці патологічні зміни підсилювалися і через 1,5 міс уже спостерігали більш широкі зони некрозу, деструкції, деяке утончення поверхневої зони суглобового хряща стегнової та великогомілкової кісток. Синовіальний шар суглобової капсули набуває незначного потовщення.

Отримані нами дані підтверджують результати досліджень інших авторів, що часткова резекція медіального меніска викликає в колінному суглобі, у першу чергу в суглобовому хрящі, дегенеративно-дистрофічні зміни, які характерні для початкової стадії остеоартрозу. Одержані патологічні зміни з боку суглобового хряща після часткової резекції медіального меніска спостерігали у всіх прооперованих тварин. На цій основі нами була застосована саме ця модель остеоартрозу колінного суглоба.

Проведені в цьому напрямку дослідження та їх результати довели, що з перших днів після часткової резекції медіального меніска введення в порожнину суглоба одного з біологічних замінників синовіальної рідини протягом 1,5 міс за схемою (0,5 мл препарату щотижня) запобігає розвитку дегенеративно-дистрофічного процесу. Суглобовий хрящ через 1,5 міс після часткової меніскектомії зберігав свою структурно-функціональну організацію, блиск та колір.

У всіх тварин контрольної групи, яким після часткової резекції медіального меніска в суглоб (за такою ж схемою) вводили фізіологічний розчин, розвивався дегенеративно-дистрофічний процес, який спостерігали у тварин після часткової меніскектомії. Наведені дані цієї групи досліджень дозволяють припустити, що запропоновані біологічні замінники синовіальної рідини при їх внутрішньосуглобовому введенні попереджають виникнення остеоартрозу, який завжди розвивається після часткової меніскектомії.

Також доведено, що коли у порожнину колінного суглоба, у якому через 1,5 міс після часткової резекції медіального меніска виникав остеоартроз, вводили протягом 1,5 міс запропоновані нами препарати, тоді розвиток артрозу гальмувався.

Спостереження, які проводили паралельно за контрольними тваринами, яким внутрішньосуглобово (за такою ж схемою) вводили фізіологічний розчин, показали прогресування патологічного процесу ? через 3 міс після часткової меніскектомії відмічали узурпацію, розтріскування, розширення дегенерації та некрозу, руйнування проміжної та глибокої зон суглобового хряща.

Отримані результати свідчать, що запропоновані нами біологічні замінники синовіальної рідини можуть не лише попереджати виникнення, але й призупиняти конгресування дегенеративно-дистрофічного процесу в суглобі.

Біохімічні дослідження підтвердили виражений профілактичний та лікувальний ефект гіалуронової кислоти та нових біологічних замінників синовіальної рідини при остеоартрозі.

Аналіз отриманих даних показав, що у тварин (профілактична серія), яким вводили препарати на основі сироватки крові, або на основі 10 % медичного желатину концентрація ГАГ - основного компонента суглобового хряща складала відповідно 0,064±0,001 та 0,061±0,001 г/л або 112 % та 107 % по відношенню до показників у контрольних тварин (табл. 4, рис. 1).

Таблиця 4

Біохімічні показники сироватки крові тварин при введенні біологічних замінників синовіальної рідини для профілактики остеоартрозу

Показники	Інтактні тварини	Контроль	БЗСР на основі сироватки крові	БЗСР на основі желатину
ГАГ, г/л	0,024±0,003	0,057 0,003	0,064 0,001	0,0610,001
Колаген аза, мкмоль/л•г	1,52±0,16	4,33±0,27	5,10±0,17	3,84±0,81
Вільний ГП, мкмоль/л	11,63±0,20	8,10 0,27	4,200,64	6,170,84
Білковозв?язан. ГП, мкмоль/л	10,14±0,55	8,75 0,65	16,100,85	10,660,5

Примітка. ГП - гідроксипролін, БЗСР - біологічний замінник синовіальної рідини

Рис.1. Концентрація ГАГ сироватки крові тварин при введенні біологічних замінників синовіальної рідини для профілактики остеоартрозу

Дані, що відображають активність одного з ключових ферментів у метаболізмі колагену - колагенази - показують, що активність цього ферменту у тварин (профілактична серія), яким вводили препарат на основі сироватки крові, має тенденцію до зростання і досягає 5,10±0,17 мкмоль/л·г, а у тварин, яким вводили препарат на основі желатину, знизилась і склала 3,84±0,81 мкмоль/л·г по відношенню до показників контрольних тварин. Концентрація вільної фракції гідроксипроліну - біохімічного маркера резорбції кісткової і хрящової тканин - знизилась по відношенню до норми і сягає 4,20±0,64 мкмоль/л (52 %) у тварин, яким вводиди препарат на основі сироватки крові та 6,17±0,84 (76 %) на основі медичного желатину. Фракція білковозв?язаного гідроксипроліну - біохімічного маркера синтезу кісткової і хрящової тканин - становить 16,10±0,85 мкмоль/л (на основі сироватки крові) та 10,66±0,50 мкмоль/л (на основі желатину) по відношенню до контрольних тварин. Перевищення фази синтезу над катаболізмом в метаболізмі білка колагену може бути пов'язане з відновленням хрящової тканини, зруйнованої моделюванням артозу (табл. 4).

Та ж тенденція спостерігається при введені біологічних замінників синовіальної рідини для визначення лікувального ефекту (табл. 5, рис. 2).

Таблиця 5

Біохімічні показники сироватки крові тварин при лікуванні остеоартрозу біологічними замінниками синовіальної рідини

Показники	Інтактні тварини	Контроль	БЗСР на основі сироватки крові	БЗСР на основі желатину
ГАГ, г/л	0,024±0,003	0,054 0,0035	0,069 0,016	0,055 0,0036
Колагеназа, мкмоль/л·г	1,52±0,16	4,00 0,41	4,58 0,63	3,68 0,48
Вільний ГП, мкмоль/л	11,63±0,20	6,27 1,83	3,96 0,50	5,33 0,61
Білковозв?язан. ГП, мкмоль/л	10,14±0,55	14,24 1,16	24,87 1,49	23,78 1,60



Рис. 2 Концентрація ГАГ сироватки крові у тварин при введенні біологічних замінників синовіальної рідини для лікування остеоартрозу

Це підтверджують дані, отримані при дослідженні концентрації ГАГ у хрящовій тканині виростків стегнової кістки у цієї групи тварин після лікування. Так, у тварин, яким вводили препарат на основі сироватки крові вміст ГАГ складав 19,8±0,9 мкг/мг, тоді як у тварин контрольної групи цей показник майже в 2 рази нижче за норму і складав 10,7±0,8 мкг/мг. Показник інтактних тварин становив 27,5±1,5 мкг/мг (табл.6, табл. 7).

Таблиця 6

Вміст глікозаміногліканів у суглобовому хрящі тварин, яким проводили профілактику розвитку остеоартрозу біологічними замінниками синовіальної рідини

Групи тварин	Вміст ГАГ у суглобовому хрящі тварин, мкг/мг
	До введення БЗСЖ	Після проведення курсу профілактики остеоартрозу БЗСЖ
Контрольна група	18,3 2,1	10,7 0,8
Введення препарату на основі сироватки крові кроля	16,6 2,5	19,8 0,9
Введення препарату на основі 10 % желатину	17,8 2,8	21,8 0,7
Інтактні тварини	27,5±1,5

Таблиця 7

Вміст глікозаміногліканів в суглобовому хрящі тварин, яким проводили лікування остеоартрозу біологічними замінниками синовіальної рідини

Групи тварин	Вміст ГАГ у суглобовому хрящі тварин, мкг/мг
	До введення БЗСЖ	Після курсу лікування остеоартрозу БЗСЖ
Контрольна група	18,3 2,1	10,7 0,8
Введення препарату на основі сироватки крові кроля	16,6 2,5	24,2 0,9
Введення препарату на основі 10% желатину	17,8 2,8	22,1 0,7
Інтактні тварини	27,5±1,5

Отримані біохімічні дані підтверджують терапевтичну дію препаратів, а показники метаболізму органічної основи, які відображають її стан, підтверджують позитивний профілактичний та лікувальний ефект біологічних замінників синовіальної рідини.

Вважаємо, що створення нових біологічних замінників синовіальної рідини та їх всебічне вивчення, є одним з перспективних напрямків сучасної артрології.

ВИСНОВКИ

Запропоновані біологічні замінники синовіальної рідини за фізико-хімічними, структурними і трибологічними властивостями близькі до натуральної синовії.

В експериментальних дослідженнях біологічні замінники синовіальної рідини як на основі 10 % медичного желатину, так і на основі сироватки крові з наявністю в них гіалуронової кислоти сприяє трофічним і лумбрикаційним властивостям суглобового хряща.

Біологічні замінники синовіальної рідини відповідають загальноприйнятій концепції еластогідродинамичної взаємодії синовії і хряща та мають хондропротекторний ефект.

В експерименті запропоновані біологічні замінники синовіальної рідини не викликають негативних реакцій як з боку суглоба, у порожнину якого їх вводили, так і з боку організму.

Експериментальні дослідження показали, що біологічні замінники синовіальної рідини не тільки попереджають розвиток, але й прогресування остеоартрозу після часткової меніскектомії.

Біологічні замінники синовіальної рідини можуть бути застосовані в клініці при остеоартрозі на ранніх стадіях з метою поліпшення трофіки суглобового хряща і поліпшення функції суглоба.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Враховуючи дані доклінічного дослідження, високий профілактичний та лікувальний ефект нових замінників синовіальної рідини, підготувати необхідні матеріали для фармкомітету з проведення клінічного етапу подальшого дослідження запропонованих препаратів.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Пашков О.Є. Моделювання деформуючого артрозу колінного суглоба // Ортопедія, травматологія та протезування. - 1993. - № 23. - С. 24-25.

2. Пашков О.Є. Біологічні замінники синовіальної рідини та їх значення при лікуванні деформуючого артрозу // Тез. Науково-практичної конференції молодих вчених та фахівців м. Києва з актуальних питань травматології, ортопедії та суміжних дисциплин. К., 1995. - С. 1-2.

3. Пашков О.Є. Обгрунтування застосування біологічних замінників синовіальної рідини для профілактики і лікування деформуючого артрозу // Тез. Теоретичні та практичні аспекти проблеми дегенеративно-дистрофічних і нейротрофічних ушкоджень опорно-рухівного аппарату. К., 1995. - С. 66-67.

4. Березкін О.Г., Бруско А.Т., Тер-Вартонян С.Х., Пуцева Н.М., Пашков О.Є. Радиоактивное определение сроков нахождения биологического заменителя синовиальной жидкости в суставе // Актуальные вопросы биологии опорно-двигательного аппарата. Материалы VIII школы стран СНГ. - 1996. - С. 9.

Особистий внесок здобувача полягає в проведенні експерименту та участі в аналізі отриманих даних.

5. Пашков А.Е. Биологические заменители синовиальной жидкости для профилактики и лечения артроза // Актуальные вопросы биологии опорно-двигательного аппарата. Материалы VIII школы стран СНГ. - 1996. - С. 9.

6. Бруско А.Т., Пашков Є.П., Березкін О.Г., Пашков О.Є. Нові біологічні замінники синовіальної рідини // Ортопедія, травматологія та протезування. - 1997.-№ 3. - С. 39-40.

Особистий внесок дисертанта полягає в участі обґрунтування хімічного складу нових біологічних замінників синовіальної рідини.

7. Гайко Г.В., Скляренко Є.Т., Герасименко С.І., Бруско Є.Т., Березкін О.Г., Магомедов С., Пашков Є.П., Тер-Вартонян С.Х., Пашков О.Є. Експериментально-морфологічне обгрунтування можливості застосування біологічних замінників синовіальної рідини для профілактики та лікування остеоартрозу // Проблеми остеології - 1999. - № 4. Т 2. - С. 15-22.

Особистий внесок дисертанта полягає у проведенні експерименту та аналізу отриманих даних.

8. Пашков А.Е. Физико-механические свойства биологических заменителей синовиальной жидкости // Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении - М., 2004. - № 2 - С. 113-114.

9. Пашков А.Е. Модели биологических заменителей синовиальной жидкости // Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении. - М., 2004. - № 2 - С. 114.

10. Магомедов С., Бруско А.Т., Пашков А.Е., Кузуб Т.А. Коррекция метаболизма суставного хряща // Вісник морської медицини. - 2006. - № 3 - С. 173-176.

Особистий внесок дисертанта полягає у виведенні тварин із досліду, заборі суглобового хряща для проведення біохімічних досліджень та аналізі отриманих результатів.

11. Магомедов С., Бруско А.Т., Пашков А.Е., Кузуб Т.А. Коррекция метаболизма суставного хряща при внутрисуставных повреждениях // Травма. - 2006. - Том 7. - № 5. - С. 91-98.

Особистий внесок здобувача полягає в участі аналізу отриманих даних, підготовці до друку статті.

АНОТАЦІЯ

Пашков О.Є. Розробка біологічних замінників синовіальної рідини для профілактики і лікування остеоартрозу (експериментальне дослідження). Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук із спеціальності 14.01.21 - травматологія і ортопедія.

Інститут ортопедії і травматології АМН України, Київ, 2007.

Проблема лікування хворих з дегенеративно-дистрофічними захворюваннями, зокрема остеоартрозом, є важливою в артрології. Остеоартроз відноситься до важких, поширених та прогресуючих захворювань суглобів, що призводить до зниження працездатності і тяжкої інвалідності.

Остеоартроз в структурі захворюваності населення складає від 6,4 % до 12 %, а гонартроз займає перше місце (70 %) серед патології суглобів, причому з віком частота захворювання зростає і після 60 років досягає 97 %. Результати консервативного лікування показали, що існуючі методики малоефективні, тому в 63,8 % випадків не попереджують інвалідність. При консервативному лікуванні остеоартрозу колінних суглобів негативні результати складають від 25 % до 50 %.

Для виконання поставлених задач в експерименті на білих мишах (80 тварин), щурах лінії Вістар масою 160-180 г (60 тварин) та 134 кроликах розроблено тимчасовий технологічний регламент на виготовлення біологічних замінників синовіальної рідини та вивчена профілактична та лікувальна дії біологічних замінників синовіальної рідини при остеоартрозі. Теоретичне значення роботи полягає у вивченні фізичних властивостей нових біологічних замінників синовіальної рідини та обґрунтуванні їх застосування для профілактики та лікування остеоартрозу. Практична цінність досліджень полягає в тому, що розроблено технологічний регламент для виготовлення біологічних замінників синовіальної рідини.

Запропоновані біологічні замінники синовіальної рідини за фізико-хімічними, структурними і трибологічними властивостями близькі до натуральної синовіальної рідини. Експериментальні дослідження показали, що біологічний замінник синовіальної рідини як на основі 10 % медичного желатину, так і на основі сироватки крові кроля з наявністю в них гіалуронової кислоти має трофічні і лумбрикаційні властивості суглобового хряща. Виявлено, що біологічні замінники синовіальної рідини сприяють ковзанню суглобових поверхонь, механічному змащуванню суглобів, відповідають загальноприйнятій концепції еластогідродинамічної взаємодії синовії і хряща, володіють хондропротекторним ефектом. В експерименті встановлено, що запропоновані біологічні замінники синовіальної рідини не викликають негативних реакцій як з боку суглоба, у порожнину якого вони вводилися, так і з боку організму в цілому.

Експериментальні дослідження показали, що біологічні замінники синовіальної рідини попереджають розвиток та прогресування остеоартрозу після часткової меніскектомії, у чому проявляється їх лікувальний ефект.

АННОТАЦИЯ

Пашков А.Е. Разработка биологических заменителей синовиальной жидкости для профилактики и лечения остеоартроза (экспериментальное исследование). Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.21 - травматология и ортопедия.

Институт ортопедии и травматологии АМН Украины, Киев, 2007.

Проблема лечения больных с дегенеративно-дистрофическими заболеваниями, в частности остеоартрозом, является одной из важных в артрологии. Остеоартроз относится к тяжелым, распространенным и прогрессирующим заболеваниям суставов, которые приводят к снижению работоспособности и тяжелой инвалидности. Остеоартроз в структуре заболеваемости населения составляет от 6,4 % до 12 % и занимает первое место (70 %) среди патологии суставов, причем с возрастом частота заболевания нарастает и после 60 лет достигает 97 %. Результаты консервативного лечения показали, что существующие методики малоэффективны, поэтому в 63,8 % случаев наступает инвалидность. При консервативном лечении остеоартроза коленных суставов негативные результаты составляют от 25 % до 50 %.

Для выполнения поставленных задач в эксперименте на белых мышах (60 животных), крысах линии Вистар массой 160-180 г (60 животных) и 134 кроликах разработан временный технологический регламент на изготовление биологических заменителей синовиальной жидкости и изучено профилактическое и лечебное действия биологических заменителей синовиальной жидкости при остеоартрозе. Теоретическое значение работы заключается в изучении физических свойств новых биологических заменителей синовиальной жидкости и обосновании их применения для профилактики и лечения остеоартроза. Практическая ценность исследований состоит в том, что разработан временный технологический регламент для изготовления биологических заменителей синовиальной жидкости.

Предложенные биологические заменители синовиальной жидкости по физико-химическим, структурным и трибологическим свойствам близки к натуральной синовии. Экспериментальное исследование показало, что биологический заменитель синовиальной жидкости как на основе 10 % медицинского желатина, так и на основе сыворотки крови кролика с наличием в них гиалуроновой кислоты, обладают трофическими и лумбрикационными свойствами суставного хряща. Выявлено, что биологические заменители синовиальной жидкости обусловливают скольжение суставных поверхностей, механическое смазывание суставов, соответствуют общепринятой концепции эластогидродинамического взаимодействия синовии и хряща, обладают хондропротекторным эффектом. В эксперименте установлено, что предложенные биологические заменители синовиальной жидкости не вызывают негативных реакций как со стороны сустава, в полость которого они вводились, так и со стороны организма.

Экспериментальные исследования показали, что биологические заменители синовиальной жидкости предупреждают развитие и прогрессирование остеоартроза, после частичной менискэктомии, в чем и проявляется их профилактический и лечебный эффекты.

ANNOTATION

Pashkov A.E. Development of biological substitutes of sinovialnoy liguid for prophylaxis and medical treatment of osteoarthrosis (experimental investigation). Manuscript.

Dissertation on competition of academic degree of candidate of medical sciences on specialty 14.01.21 - тraumatology, and orthopedy.

Institute of orthopedy and traumatology of AMN Ukraine, Kiev, 2007.

Problem of medical treatment of patients with the degeneration - dystrophic diseases, in particular is osteoarthrosis, important in arthrology. Osteoarthrosis belong to serious, widespread progressive diseases of joints, which bring to a decrease of capacity for work and difficult disability. Osteoarthrosis in morbidity of population makes from 6,4 % to 12 % and comes first (70 %) among pathology of joints, and with age the prevalence grows and after the 60 years run up to 97 %. The results of conservative treatment showed, that existent methods are not enough effective, therefore in 63,8 % cases the disability comes. During conservative treatment of osteoarthrosis of knee-joints the negative results make from 25 % to 50 %.

For implementation of problem put by in the experiment on the white mise - 60; Wistar's rats weighing a 160-180g. - 60; and 134 crawls a temporal technological regulation for making biological substitutes of synovial fluid is developed and prophylactic and therapeutic action of biological substitutes of synovial fluid during osteoarthrosis is trained. The theoretical meaning of work consists in studying of physical properties of new biological substitutes of synovial fluid and grounding their use for prophylaxis and medical treatment of osteoarthrosis. The practical value of investigations consist in developing temporal technological regulation for making biological substitutes of synovial fluid.

Offered biological substitutes of synovial fluid by physicochemical, structural and by tribological behavior characteristics are similar to natural synovia. The experimental investigation showed, that biological substitute of synovial fluid both in terms of 10 % medical gelatin, and in terms of blood serum of rabbit in the presence of hyaluronic acids possess trophic and lubricating properties for an articular cartilage. It is discovered, that biological substitutes of synovial fluid make for sliding of articular surface, the mechanical greasing of joints, correspond to generally accepted conception of elastohydrodynamic effect of synovial fluid and of cartilage, have a hondroprotectornim effect. During experiment it is ascertained, that offered biological substitutes of synovial fluid do not cause negative reactions both from the direction of joint, in the cavity of which they were injected, and from the direction of organism.

The experimental investigation showed, that biological substitutes of synovial fluid prevent formation of osteoarthrosis after partial excision of meniscus . The experimental investigation showed, that biological substitutes of synovial fluid prevent progress of osteoarthrosis, and this is it's medical result.

Размещено на Allbest.ru

...