Гибридомная технология получения моноклональных антител. Химерные и трансгенные животные

Размещено на http://www.allbest.ru/

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина

Реферат

на тему: Гибридомная технология получения моноклональных антител. Химерные и трансгенные животные

Выполнил:

Евдокимов А.

Москва 2013

План

Введение

1. Гибридомная технология получения моноклональных антител

2. Принципиальная схема получения моноклональных антител

3. Метаболическая селекция гибридов

4. Химерные и трансгенные животные

Заключение

Список использованной литературы

Введение ген химера трансгенный трансфекция

Разработка гибридомной технологии определила бурный прогресс в использовании антител как для исследовательских, так и для практических целей. Созданы десятки тысяч высокоаффинных антител, связывающихся с белками, углеводами, нуклеиновыми кислотами, а также с низкомолекулярными антигенами. На их основе получены конъюгаты с различными функциональными соединениями - токсинами, ферментами, а также магнитными частицами, радиоактивными и рентгеноконтрастными атомами. Однако все упомянутые выше антитела и их производные широко используются, в основном для целей диагностики и биотехнологии. Их применение для терапии ограничивается тем, что с помощью гибридомной технологии удается получать, главным образом, молекулы мышиных иммуноглобулинов, которые вызывают у человека иммунный ответ, что приводит к их связыванию и удалению из организма.

Создание человеческих гибридом затрудняется из-за сложности получения иммунных лимфоцитов, отсутствия подходящих миеломных клеточных линий, низкой эффективности гибридизации и нестабильности образующихся гибридных клеток. Именно это обстоятельство инициировало поиск путей снижения иммуногенности мышиных моноклональных антител (МКА) путем удаления отдельных фрагментов или замены их на аналогичные участки иммуноглобулинов человека. Для решения этой проблемы были разработаны подходы, позволяющие с помощью методов генетической инженерии избегать нежелательного иммунного ответа: создание химерных антител путем соединения вариабельных доменов антител мыши с константными доменами человеческих антител, “гуманизация” путем замены гипервариабельных районов в молекуле антитела человека на аналогичные участки из мышиного антитела, получение полноразмерных антител человека с помощью трансгенных мышей и технологии фагового дисплея. В последние годы внимание исследователей и фармацевтических компаний привлекают химерные антитела. Технология получения химерных антител относительна проста и экономически выгодна, а терапевтический эффект достаточно высок. Именно поэтому в списке рекомбинантных антител, одобренных и разрешенных FDA для терапевтических целей, подавляющее количество антител являются химерными.

Показано, что химерные антитела могут осуществлять протекцию и нейтрализацию вирусных агентов. Одним из наиболее патогенных для человека вирусных агентов на территории Российской Федерации является вирус клещевого энцефалита (КЭ), который способен вызывать серьезные поражения нервной системы. Современная эпидемическая ситуация в некоторых регионах Сибири и Дальнего Востока в отношении КЭ характеризуется значительным ростом заболеваемости (Локтев, 2007). Эта закономерность характерна не только для этих регионов России, где регистрируется большая часть случаев заболеваний, но и для многих европейских стран. В настоящее время единственным специфическим средством лечения этого заболевания является гамма-глобулин против вируса КЭ, получаемый из крови иммунизированных людей. Высокая стоимость данного препарата, его дефицит и возможный риск при его применении делают необходимым поиск альтернативных терапевтических средств. Таким альтернативным средством могли бы стать вируснейтрализующие химерные антитела против вируса КЭ.

Получение антител для нужд человека начинается с иммунизации животных. После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Такие сыворотки называются иммунные. Антитела выделяют из сыворотки в виде г-глобулиновой фракции, осаждая их из сыворотки крови сульфатом аммония, спиртом, ПЭГ и другими веществами. Самое главное, полученные антитела содержат много антител с различной специфичностью, ко многим антигенным детерминантам, как антигена, которым проводилась иммунизация, так и другим антигенам, с которыми встречалось животное-донор.

Стандартные препараты антител в иммунных сыворотках получить довольно сложно, так как их состав зависит от вида животного, его индивидуальных особенностей, цикла иммунизации, других малоконтролируемых факторов.

1. Гибридомная технология получения моноклональных антител

Технология гибридом впервые была описана в 1975 году Келером и Мильштейном. Они разработали методику получения клеточных гибрилдов - гибридом. Гибридомы образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых с, взятых от иммунизированных животных, с клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro. В качестве индуктора слияния клеток использовали вирус Сендай. Гибридные клетки культивировали в полужидком агаре, содержащим метаболические ингибиторы опухолевых клеток. Таким образом, клетки, получившие ген, кодирующий недостающий фермент, активно пролиферировали, наряду с лимфоцитами из селезёнки. Однако, последние погибали в силу ограниченности срока их деления.

Для реализации проекта Кёлер поехал в Англию, в лабораторию Цезаря Мильштейна, изучавшего клоны плазмоцитом, и они вместе разработали оригинальный подход к этой проблеме: решили получить гибрид нормальной АОК и опухолевой клетки. В случае успеха такой гибрид унаследовал бы от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой - бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту. Это им удалось осуществить, создав гибридомную технологию.

Метод гибридизации соматических клеток in vitro осуществляется путем слияния разнородных клеток. Разнородные клетки, у которых слились оболочки, образовывали гибриды, которые сохраняли способность к клеточным делениям. Таким образом, возникал истинный гибрид, потомок двух соматических клеток, или гибридома. Кёлер и Мильштейн получили гибридому между нормальной АОК и опухолевой, миеломной клеткой.

В системе in vitro слияние соматических клеток может быть индуцировано вирусами, например вирусом Сендай, электрическим воздействием - электрослиянием или химическим веществом - полиэтиленгликолем (ПЭГ).

2. Принципиальная схема получения моноклональных антител

Мышей интенсивно иммунизировали определенным антигеном - белком, бактериальными клетками или клетками животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у них брали селезенку, и из неё готовили взвесь клеток (с большим содержанием В-лимфоцитов).

Если к суспензии В-лимфоцитов добавить клетки плазмоцитомы и полиэтиленгликоль, то после инкубации, требующейся для слияния клеток, в системе находились следующие клетки:

- гибриды АОК и АОК (В-лимфоцитов и В-лимфоцитов),

- гибриды АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными

- АОК и клетки плазмоцитомы (не слившиеся).

Проблема заключалась в том, как отделить заданную гибридому от присутствующих в системе отдельных не слившихся клеток и от гибридов иной специфичности.

Для достижения этой цели авторы разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селективной питательной среде, т.е. в среде, с помощью которой можно выделять желаемый клон клеток.

3. Метаболическая селекция гибридов

Метаболическая селекция гибридов основана на том, что нормальные соматические клетки (В-лимфоциты) могут использовать два метаболических пути синтеза нуклеотидов (пуринов и пиримидинов): основной путь и резервный путь.

В случае основного пути синтеза de novo нуклеотидов они образуются из аминокислот и углеводных предшественников.

При резервном пути синтез нуклеотидов осуществляется из гипоксантина (пурины) или из дезокситимидина (пиримидины).

Задача селекции сводится к отделению гибридом от миеломных неслившихся клеток. Для решения этой задачи используют селективную среду ГАТ (культуральная среда, содержащая гипоксантин - аминоптерин - тимидин). В такой среде, содержащей аминоптерин, блокируется основной путь синтеза нуклеотидов, а наличие гипоксантина и тимидина обеспечивает синтез нуклеотидов по запасному пути. В таких условиях миеломные клетки погибают и остаются функционально активными только гибридомы.

В-лимфоциты не адаптированы к росту in vitro, они достаточно быстро разрушаются, что облегчает процесс селекции.

Основные этапы получения гибридомы представлены на схеме.

1. Мыши вводят специфический антиген, который вызывает продукцию антител против этого антигена.

2. Селезенка мышей удаляется и гомогенизируется для получения суспензии клеток. Эта суспензия содержит B клетки, которые продуцируют антитела против введенного антигена.

3. Клетки селезенки затем смешивают с клетками миеломы, которые способны непрерывно расти в культуре, а так же отсутствует резервный путь синтеза нуклеотидов.

4. Некоторые из антитело-продуцирующих клеток селезенки и клетки миеломы сливаются, образуя гибридные клетки. Эти гибридные клетки теперь способны непрерывно расти в культуре, а так же продуцировать антитела.

Для получения больших объемов жидкости, содержащей моноклональные антитела, гибридомы могут быть введены внутрибрюшинно мышам реципиентам. В результате в брюшной полости вырастает солидная опухоль и накапливается асцитическая жидкость, являющаяся источником моноклональных антител.

Полученные клоны можно заморозить при -700С и длительно сохранять. Их можно культивировать и накапливать антитела в культуральной среде, а можно привить мышам, где они будут расти и накапливать колоссальные количества моноклональных антител. От одной мышки можно получить антител не меньше, чем от кролика. Эти антитела не содержат посторонних антител и настолько однородны, что могут рассматриваться как чистые химические реагенты.

Таким образом, клоны-продуценты моноклональных антител (гибридомы) получают слиянием антителообразующих клеток лимфоидной ткани иммунизированного животного и клеток плазмацитомы. Полученные в результате клетки наследуют от лимфоцитов способность к секреции антител и от клеток миеломы способность к неограниченному росту in vitro.

Гибридомы революционизировали иммунологию и создали в ней совершенно новые области. Благодаря гибридомам возникли новые методы диагностики многих заболеваний и открылись новые пути для изучения злокачественных опухолей и многих заболеваний.

После недолгого культивирования одиночные АОК, а также гибриды АОК и АОК погибали, так как нормальные В-лимфоциты (АОК) смертны и быстро погибают в культуре, они не способны длительно культивироватться.

Плазмоцитомные клетки и их гибриды также погибали, так как аминоптерин блокировал основной путь синтеза предшественников нуклеиновых кислот, а гипоксантин и тимидин их не спасали.

Выживали, следовательно, только гибриды АОК и плазматических клеток, так как бессмертие они унаследовали от плазмоцитомы, а резервный путь - от нормальной клетки. Такие гибриды, гибридомы, сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела, а так же пролиферировать.

Следующий этап после получения гибридом - клонирование и отбор нужных клонов. Выжившие в ГАТ клетки рассевали в пластиковые планшеты. В каждую лунку помещали в среднем по 10 гибридомных клеток. После нескольких дней культивирования содержимое каждой лунки проверяли на присутствие антител нужной специфичности. Клетки из лунок, содержащих нужные антитела, клонировали, то есть повторно рассевали по лункам, но из расчета 1 клетка на лунку, вновь культивировали и проверяли на присутствие нужных антител. Процедуру повторяли 1-2 раза.

А, В, С - многокомпонентная смесь антигенов, использованная для иммунизации (или сложные антигены с множеством антигенных детерминант);

АОК - антителообразующие клетки селезенки;

Пл - клетки плазмоцитомы, не растущие в селективной ГАТ- среде;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

ГАТ - среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин;

анти-А, анти-В, анти-С - моноклональные антитела соответственно к А-, В-, С-антигенам (или антигенным детерминантам).

Моноклональные антитела оказались исключительно удобным и широко применяемым в настоящее время диагностическим средством. С их помощью определяют маркеры клеточных популяций (фенотипирование клеток крови и в частности лимфоцитов), гормоны, медиаторы, опухолевые маркеры и т.д.

С помощью гибридом можно обнаружить антигены, характерные для опухолей определенных тканей, получить к ним антитела и использовать их для диагностики и типирования опухолей.

Для клеток в определенной стадии развития или функционирования характерно наличие на поверхности определенных молекулы. На определении этих CD антигенов основана идентификация субпопуляций лимфоцитов человека.

С помощью моноклональных антител в опухоль и ее метастазы можно доставить радиоактивные вещества, позволяющие обнаружить небольшие узелки опухоли по локализации в них радиоактивности если их связать с изотопом.

Именно применение моноклональных антител в диагностике позволило значительно увеличить специфичность и чувствительность тест-систем основанных на реакции антиген-антитело.

С развитием гибридомной технологии методика претерпела существенных изменений. В качестве индуктора слияния клеток в современных работах используется полиэтиленгликоль. На смену полужидкому агару пришла техника лимитирующих разведений. Еще одним направлением развития данной технологии стало создание и оптимизация клеточных линий плазмацитом. Большинство культивируемых клеточных линий плазмацитом были созданы в рамках исследований Национального института здоровья в США, посвященных изучению структур и функций иммуноглобулинов. Интересно, что практически все используемые для создания гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, клеточные линии, были получены из штамма плазмацитомы MOPC21, индуцированных у мышей линии Balb/C. Однако, для использования этих клеточных линий необходимо было преодолеть ряд препятствий. Так, плазмацитомы, будучи клетками с высоким уровнем дифференцировки, обладают слабой способностью к росту вне организма. Поддержания культуры клеток стало возможным при использовании различных ростовых факторов, источником которых могут быть перитонеальные макрофаги, спленоциты или сыворотка крови мышей, иммунизированных полным адъювантом Фрейнда. Культивируемую линию выводили чередованием культивирования in vitro и пассированием в сингенных мышах. В результате многочисленных попыток была получена клеточная линия P3K. Дальнейшая работа по выведению гибридомных клеточных линий была связана с разработкой оптимальной методики метаболической селекции. В основе метода лежит возможность использования нормальными соматическими клетками двух путей синтеза нуклеотидов. Для селективного отбора сначала блокируют с помощью метаболических ядов основный тип синтеза, где предшественниками нуклеотидов являются аминокислоты и углеводы. Если же клетки дефицитны по ферментам второго (запасного) пути синтеза нуклеотидов, то она гибнет. От гибели клетку может спасти гибридизация с клеткой, содержащей дефицитный ген. Этот принцип лег в основу метода получения гибридомных клеточных линий.

Существенным этапом в становлении гибридомной технологии стало создание штаммов плазмацитом, лишенных способности продуцировать иммуноглобулины и их фрагменты.

Для этого плазмацитомы обрабатывали сыворотками к мышиным иммуноглобулинам, отбирали и клонировали клетки, не продуцирующие Ig.

На данный момент выведено множество линий клеток плазмацитом: X63Ag8.653, NSO, SP-2/O-Ag14. Все они различаются по способности производить после слияния стабильные клоны, продуцирующие значительные количества моноклональных антител. Гибридомы X63, NSO, получаемые из исходных миеломных клеток - стабильнее чем те, что являются гибридными производными. Однако, все эти линии имеют существенный общий недостаток - острая необходимость в присутствии экзогенных ростовых факторов. Чаще всего применяют коровьи эмбриональные сыворотки. Реже используют сыворотки других животных, в частности сыворотку пуповинной крови человека. Работа с сыворотками вносит и негативный вклад в методику, так как создаёт необходимость тщательного контроля контаминации микоплазмами, которые конкурируют с клетками за предшественников нуклеотидных оснований.

Важным этапом создания гибридом является эффективная иммунизация животных. На титр антител может влиять как природа антигена, так и генотип животного. Успех иммунизации определяется рядом факторов: свойствами иммуногена, сочетанием с адъювантами или носителями. Так, полный адъювант Фрейнда применяют для получения иммунного ответа на целый спектр антигенов и коиньецируемых примесей. Однако, его применение имеет ряд побочных эффектов, в частности - болезненные очаги воспаления, чего не наблюдается при иммунизации с неполным адъювантом Фрейнда. Если же целью является получение иммуноглобулинов класса E, то в качестве адъювантов используют алюмокалиевые квасцы. Для получения высокого титра антител необходимо оптимизировать также схему иммунизации. Известными фактом является то, что с увеличением длительности стимуляции антигеном увеличивается аффинность, получаемых моноклональных антител, но снижается олигоклональность иммунного ответа. Следует помнить, что частые повторные введения антигена ведут к снижению ответа до фонового уровня. Однако, имеет смысл увеличить концентрацию антигена у животных непосредственно перед взятием у них лимфоидных клеток. Еще одним способом увеличить выход моноклональных антител является использование механизма адаптивного переноса спленоцитов от иммунизированных мышей облученным реципиентам. Таким же образом пытались изменить спектр специфичности антител.

Эффективная иммунизация помимо всего вышеперечисленного опосредована генотипом иммунизируемых животных. Общепринятым ныне является подход с использованием генетически инбредных линий мышей Balb/C, как для иммунизации, так и для получения культивируемых линий плазмацитом. Очевидным плюсом его является разрешение проблемы гистосовместимости, минусом - сужение спектров эпитопов, распознаваемых получаемыми моноклональными антителами.

Приняв во внимание все ключевые моменты эффективной иммунизации и получив необходимый титр антител, переходят к этапу получения спленоцитов и их слиянию. В качестве источника лимфоцитов обычно используют селезенку, реже лимфоузлы или костный мозг.

Перед слиянием клеток их обогащают плазмобластами. Для этого существует несколько различных подходов. Наиболее простой заключается в повторном введении антигена в течение нескольких дней предшествующих получению клеток. Другой подход состоит в использовании различных манипуляций с лимфоидными клетками in-vitro с целью обогащения суспензии плазмобластами. К примеру, предварительное выделение клеток с плавучестью 1,06-1,07 на градиенте Percoll существенно увеличивало выход гибридом, продуцирующих моноклональные антитела. Сегодня для выделения специфических лимфобластов используют клеточный сортер. Для повышения выхода гибридом используют миеломные клетки, нагруженные специфическим антигеном, что приводит к образованию контактов между опухолевыми клетками и антиген-специфичными плазмобластами.

Подготовка плазмацитомы к слиянию заключается в выбраковке ревертантов из гомогенной синхронизированной культуры в логарифмической фазе роста; проверка её соответствия основным параметрам; рассеивание её с максимальной частой и поддержание её постоянной пролиферации.

Гибридизацию лимфобластов и плазмацитомы проводят путем клеточного слияния, опосредованного различными агентами, приводящими к изменению мембран, формированию цитоплазматических контактов и формированию дикарионов. Для индукции гибридизации используют несколько различных подходов. Первым изученным и вошедшим в практику было использование вируса Sendai, посредством вовлечения клеточных рецепторов, липидных компонентов мембран, гликопротеидов вируса. Этот подход имел ряд недостатков, связанных с воспроизводимостью результатов и жизнеспособностью гибридов. Альтернативным агентом является ПЭГ. Механизм слияния, индуцированного ПЭГ до конца не раскрыт. Для слияния используют ПЭГ с ММ 1000-4000 и концентрацией 30-55%. Сегодня появился более современный способ индуцировать слияние клеток - подвергнуть их воздействию электрических импульсов. В результате слияния получают несколько типов дикарионов. Для отбора интересующего дикариона (лимфобласт-миелома) используют ростовые среды, содержащие, помимо аминоптерина, гипокстантин и тимидин, которые опосредуют альтернативный путь синтеза ДНК. Таким образом, в ходе селекции выживают дикарионы, возникшие в результате слияния а) двух лимфобластов и б) лимфобласта и плазмацитомы. Первые быстро погибают ввиду ограниченности пролиферативного потенциала. Остаются целевые гибридные клетки. Данная схема имеет множество модификаций в отношении культивирования. Для культивирования можно использовать мягкий агар с уже включенными селектирующими агентами, либо жидкую селективную среду в 96 луночном планшете, либо же культивирование клеток проводят в условиях массовой среды, с их последующим переносом в селективную среду в 96-луночном планшете.

Помимо селективных агентов в питательные среды добавляют ростовые факторы, так как клетки мышиных плазмацитом и полученные из них гибриды нуждаются в присутствии ростовых факторов, в частности IL6. Для этого в среду помимо сыворотки добавляют кондиционированные среды - надосадочные жидкости, полученные при культивировании первичных клеточных культур, чаще перитонеальных макрофагов.

Еще одна стратегия по увеличению выхода гибридом, заключается в совместном рассевании гибридных клеток с другими клетками, к примеру, тимоцитами мышей, облученными ксеногенными или аллогенными фибробластами. Предполагается, что помимо создаваемого эффекта клеточной массы благоприятное влияние могут оказывать продуцируемые такими клетками различные цитокины. Если же в качестве таких клеток использовать перитонеальные макрофаги, то они будут выполнять крайне важную функцию расчистки культур от погибающих клеток.

Итак, дальнейшим этапом является скрининг гибридов-продуцентов моноклональных антител. Наиболее распространенными методами тестирования продуктов секреции гибридомных клеток являются методы иммуноанализа на основе ферментных и флуоресцентный меток. Тестирование моноклональных антител против клеточно-ассоциированных антигенов проводят непрямой иммунофлуоресценцией на живых или фиксированных клетках. Поиск моноклональных антител, направленных против антигенов клеточной поверхности, проводят микроцитотоксическим тестом. Выявление культур, синтезирующих специфические иммуноглобулины, является лишь первым этапом отбора растущих гибридов. Расширенный скрининг заключается в проведении как позитивного, так и негативного отбора, с целью выявить наличие специфических взаимодействий моноклональных антител с другими антигенами.

Так как все гибридомные клетки анеуплоидны, им присуща генетическая нестабильность и тенденция к выщеплению вариантов, утративших способность синтезировать иммуноглобулины. Основная потеря хромосом гибридомами происходит в течение первого месяца после слияния, затем в процессе длительного культивирования отмечается постепенная сегрегация хромосом. Клонирование является основным методом получения стабильных гибридомных штаммов. Этот процесс облегчает использование клеточного сортера. Однако, в практике довольно широко применяется более дешевые методы, такие как - клонирование в жидкой среде методом лимитирующих разведений. Процедура состоит в рассеве клеток с убывающей концентрацией.

Полученные генетически стабильные штаммы гибридом используют для выделения целевого продукта в необходимых количествах. Существуют два пути наработки моноклональных антител в больших количествах. Первый заключается в массовом культивировании in vitro. Метод имеет ряд недостатков, связанных с необходимостью выщепления сыворотки из компонентов среды. Решением этой проблемы стало внедрение бессывороточных сред, содержащих различные компенсирующие компоненты (инсулин, трансферрин). Для массового культивирования гибридом в ферментерах необходима длительная адаптация гибридомных штаммов, некоторые штаммы не удается адаптировать и их продолжают выращивать методом пассирования на животных.

Альтернативный путь наработки моноклональных антител применяется только в странах, в которых не приняты правила гуманного обращения с животными, в частности в России. Метод основывается на опухолевой природе гибридом и их способности расти в сингенных животных. Для получения больших объемов жидкости, содержащей моноклональные антитела, гибридомы вводят внутрибрюшинно мышам реципиентам. В результате в брюшной полости вырастает солидная опухоль и возможно накопление асцитической жидкости, являющейся источником моноклональных антител. Увеличить количество асцита, содержащего моноклональные антитела, можно путем внутрибрюшинного введения нетоксического масла за несколько дней до инокуляции гибридом. Однако, в организме мыши-реципиента развитию гибридомной опухоли противодействует ряд факторов. Во-первых, естественная резистентность организма, опосредованная NK клетками, активирующимися в ответ на различия в экспрессии молекул гистосовместимости. Во-вторых, активация Т лимфоцитов в ответ на опухолевые антигены. В-третьих, синтез антиидиотипических антител. Возможна еще активация антивирусного иммунного ответа, при наличии вируса в гибридомных клетках. Первостепенной задачей исследователей было разрешение проблемы сингенности клеток опухоли и организма реципиента. Одним из таких решений было использование бестимусных мышей.

Из двух перечисленных методов наработки моноклональных антител второй является наиболее продуктивным: выход моноклональных антител 1-25 мг/мл при культивировании in vitro и 20-100 мкг/мл при массировании гибридом на животных.

Таким образом, мы видим, что процесс создания моноклональных антител является трудоемким процессом. Однако, преимущества их использования во много раз окупают затраты. Моноклональные антитела стандартны в своих свойствах и могут быть получены в неограниченных количествах; обладают абсолютной специфичностью к одному эпитопу целевого антигена; изменение конфигурации эпитопа коррелирует со снижением сродства моноклональных антител к эпитопу; возможно создание моноклональных антител против ранее неизвестных антигенов.

4. Химерные и трансгенные животные

Химерами называют организмы или их части, состоящие из генетически разнородных тканей. Впервые этот термин применил немецкий ботаник Г. Винклер (1907) для форм растений, полученных в результате сращивания паслена и томата. В дальнейшем (1909) Э. Баур, изучая пеларгонию пестролистные, выяснил природу химер. Различают несколько типов причудливых организмов:

· химеры мозаичные (гиперхимеры) - в них генетически разные ткани образуют тонкую мозаику;

· химеры векториальни - у них разнородные ткани расположены большими участками;

· химеры периклинальных - ткани с разными генотипами лежат слоями друг над другом;

· химеры мериклинальни - их ткани состоят из смеси секториальних и периклинальных участков. Химеры могут возникать в результате прививок растений и под влиянием мутаций соматических клеток. Компоненты химер могут отличаться друг от друга генами ядра, числом хромосом или генами пластид или митохондрий. Причудливые организмы часто используются в научных исследованиях.

Принцип получения химер сводится главным образом к выделению двух или большего числа ранних зародышей и их слияния. В том случае, когда в генотипе зародышей, использованных для создания химеры, есть отличия по ряду характеристик, удается проследить судьбу клеток обоих видов. С помощью причудливых мышей было, например, решен вопрос о способе возникновения в ходе развития многоядерных клеток поперечнополосатых мышц. Изучение химерных животных позволило решить множество проблем, и в будущем благодаря применению этого метода появится возможность решать сложные вопросы генетики и эмбриологии. Получение таких эмбрионов осуществляется во многих лабораториях. Принцип получения химер сводится главным образом к выделению двух и большего числа ранних зародышей и их слиянию. В том случае, когда в генотипе зародышей, использованных для создания химеры, есть отличия по ряду характеристик, удается проследить судьбу клеток обоих типов.

Два метода получения химер: 1) агрегационный - объединение двух и более морул или бластоцист в один эмбрион; 2) инъекционный - микроинъекция клеток внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона-реципиента. Имеются внутривидовые и межвидовые химеры лабораторных животных и с/х животных. В потомстве химерных животных не сохраняется родительский генотип, происходит расщепление, и нарушаются ценные генетические комбинации.

Развитие генной инжинерии создало принципиально новую основу для конструирования последовательностей ДНК, необходимых исследователю. Успехи в области экспериментальной эмбриологии позволили создать методы введения таких искусственно созданных генов в ядра сперматозоидов или яйцеклеток. В результате возникла возможность получения трансгенных животных.

Трансгенные организмы

Трансгенными называют растения и животных, содержащие в своих клетках ген чужого организма, входящий в хромосомы. Их получают, используя методы генной инженерии. Трансгенные организмы могут иметь большое значение для повышения эффективности сельского хозяйства и в исследованиях в области молекулярной биологии.

Первые генетически модифицированные организмы, полученные с помощью методов молекулярной биологии, появились на свет только в 80-х годах XX века. Ученые сумели изменить геном растительных клеток, добавляя в них необходимые гены других растений, животных, рыбы и даже человека.

Первый трансгенный организм (мышь) был получен Дж. Гордоном с сотрудниками 1980 г. На начале 90-х годов в Китае было проведено первое коммерческое испытания генетически модифицированных сортов табака и томатов, устойчивых к вирусам. А в 1994 г. в США впервые поступили в торговую сеть продуктов питания плоды генетически измененных томатов с сокращенным сроком созревания.

В ряде экспериментов было установлено, что мыши, развивающиеся из зиготы, в которую была введена чужеродная ДНК, содержат в своем геноме фрагменты этой ДНК, а иногда у них происходит и экспрессия чужеродных генов.

Целью создания трансгенных организмов является получение организма с новыми свойствами. Клетки трансгенного организма производят белок, ген которого был внедрен в геном. Новый белок могут производить все клетки организма (неспецифическая экспрессия нового гена), либо определенные клеточные типы (специфическая экспрессия нового гена).

Создание трансгенных организмов используют:

- в научном эксперименте для развития технологии создания трансгенных организмов, для изучения роли определенных генов и белков и биологических процессов; огромное значение в научном эксперименте получили трансгенные организмы с маркерными генами

- в сельском хозяйстве для получения новых сортов растений и пород животных;

- в биотехнологическом производстве плазмид и белков.

В настоящее время получено большое количество штаммов трансгенных бактерий, линий трансгенных животных и растений. Близко по смыслу и значению к трансгенным организмам находятся трансгенные клеточные культуры. Ключевым этапом в технологии создания трансгенных организмов является трансфекция -- внедрение ДНК в клетки будущего трансгенного организма.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками.

Заключение

С помощью гибридом можно обнаружить антигены, характерные для опухолей определенных тканей, получить к ним антителы использовать их для диагностики и типировная опухолей. Такие моноклональные антитела нашли широкое применение в онкологической клинике. Благодаря гибридомам возникли новые методы диагностики многих заболеваний и открылись новые пути для изучения злокачественных опухолей.

Изучение химерных животных позволило решить немало трудных вопросов, и в будущем благодаря применению этого метода появиться возможность решать сложные проблемы генетики и эмбриологии.

Список использованной литературы

1. Абелев Г.И. Моноклональные антитела. Соросовский Образовательный журнал, 1998

2. Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве // Дубровицы, 2000

3. Иванов А.А., Белецкий И.П. Терапия моноклональными антителами - панацея или паллиатив? Ремедиум, 2011

4. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Дж,Бехтол К.Б. Моноклональные антитела:Гибридомы:Новый уровень биологического анализа, М.:Медецина,1983

5. Леванов Л.Н. Вируснейтрализующие рекомбинатные антитела против вируса клещевого энцефалита, 2009

6. Никитин Е. А., Глазкова О. И. «Волшебные пули»: моноклональные антитела в онкологии Лечащий врач, 2007

7.Ройт А. Основы иммунологии. М.:Мир,1991

8. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. Норма и патология: Учебник. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2010.

9. Ю.И.Будчановым, Моноклональные антитела, 2010

Размещено на Allbest.ru