Проблемы и перспективы производства лактобактерина

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. Значение и функции нормальной микрофлоры организма человека, роль лактобактерий

2. Перспективы и современные подходы к разработке биопрепаратов на основе лактобактерий

3. Технологическая схема производства лактобактерина

4. Описание технологической схемы производства лактобактерина

5. Аппаратурная схема и ее описание

6. Описание предложенного изменения в технологии

7. Изображение основного оборудования

Выводы

Источники

Дополнения

Введение

Современные условия жизнедеятельности человека характеризуются постоянным влиянием неблагоприятных био-, техно- и социогенных факторов, интенсивность воздействия которых часто превышает компенсаторные возможности микроэкологической системы макроорганизма. Нарушения микробиоценоза играют существенную роль в патогенезе большого количества заболевания различной этиологии, что позволяет рассматривать проблему коррекции дисбиозов как общемедицинскую. Этим обусловлена необходимость обеспечения практического здравоохранения широким арсеналом эффективных и доступных пробиотических препаратов, предназначенных для поддержания и восстановления симбиотических микробиоценозов человека.

Актуальной задачей биотехнологии производства пробиотиков является выпуск конкурентоспособных препаратов, которые по своим потребительским характеристикам не должны уступать импортным аналогам. Основными направлениями прикладных исследований в области пробиотиков являются: разработка новых препаратов с повышенной биологической активностью, новых лекарственных форм и оптимизация технологического процесса. Клинические исследования последних лет открывают новые стороны позитивного воздействия пробиотиков на физическое состояние человека. Это позволяет расширять сферу их применения (акушерство и гинекология, стоматология, дерматология и др.) и определяет необходимость создания лекарственных форм, адекватных новым способам аппликации и требованиям к потребительским свойствам препаратов (суппозитории, мази, кремы, порошки, капсулы, таблетки). В связи с этим разработка и усовершенствование технологий указанных фармакопейных форм, являются актуальными для производства пробиотиков, которые выпускаются в основном в виде сухой биомассы во флаконах (ампулах). пробиотик лактобактерия биопрепарат

Проблема повышения эффективности производства пробиотических препаратов предполагает решение задач, связанных с усовершенствованием всех стадий технологического процесса, включая накопление биомассы, стабилизацию бактериальных культур и изготовление лекарственных форм. В условиях массового производства пробиотиков актуальна проблема оптимизации способов и методических подходов, используемых при контроле их специфической активности.

Эффективность бактерийных препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в их состав. Повышение и расширение спектра биологической активности пробиотиков может быть достигнуто за счет разработки комплексных препаратов на основе специально подобранных бактериальных композиций, включающих совместимые и взаимодополняющие штаммы. Создание препаратов многовидового микробного состава является перспективным направлением в биотехнологии.

При разработке пробиотиков нового поколения в качестве перспективных рассматривают препараты на основе биологически активных метаболитов бактерий - представителей нормальной микрофлоры организма человека. Экзометаболиты индигенных бактерий стимулируют рост резидентной микрофлоры, подавляют патогенные микроорганизмы, способствуют регенерации эпителия слизистой оболочки и оказывают иммуномодулирующее действие. В связи с известной биологической активностью метаболитов лактобактерий и потребностью практической медицины в препаратах, обладающих комплексным пробиотическим и иммуномодулирующим действием, разработка нового лекарственного средства на основе продуктов жизнедеятельности лактобактерий является весьма актуальной.

Патентный поиск

Способ получения жидкого лактобактерина (Патент RU 2244744):

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для производства пробиотических препаратов. Способ получения жидкого лактобактерина предусматривает оживление, культивирование пассажей лиофилизированной культуры и культивирование закваски лактобацилл на жидкой питательной среде, содержащей гидролизат сухого обезжиренного молока ферментативный с содержанием аминного азота 1485 мг % - 30,0±0,3 г/л, автолизат дрожжей концентрированный - 110,0±10 г/л, агар пищевой - 0,8 г/л, воду дистиллированную до 1л. Культивирование закваски осуществляют до накопления биомассы лактобацилл 10⁹-10¹⁰ КОЕ/мл. После чего из готового продукта удаляют 10-30% надосадочной жидкости и заменяют ее равным объемом свежей питательной среды. Изобретение позволяет упростить технологию получения жидкого лактобактерина и увеличить срок хранения жизнеспособных лактобацилл. 1 з.п ф-лы, 1 табл.

Способ получения лактобактерина (Патент RU 2200566):

Изобретение относится к области медицинской промышленности и может быть использовано для производства пробиотиков. Сущностью способа является комплексное применение защитной сахарозо-желатозо-молочной среды не только в процессе лиофилизации, но и при накоплении бактериальной биомассы. Способ включает использование сахарозо-желатозной среды в качестве углеводной добавки при культивировании производственных штаммов, а также предварительное применение обезжиренного молока в качестве субстрата для выращивания лактобактерий с последующим внесением его как компонента защитной среды в состав бактериальной суспензии перед высушиванием. Для повышения биологической активности препарата предлагается дополнительно вводить лактобактерии вида Lactobacillus acidophilus. Техническим результатом является оптимизация способа получения препарата и повышение его биологической активности. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Значение и функции нормальной микрофлоры организма человека, роль лактобактерий

Организм человека заселен (колонизирован) более чем 500 видов микроорганизмов, составляющих нормальную микрофлору человека, находящихся в состоянии равновесия (эубиоза) друг с другом и организмом человека. Микрофлора представляет собой стабильное сообщество микроорганизмов, т.е. микробиоценоз. Она колонизирует поверхность тела и полости, сообщающиеся с окружающей средой. Место обитания сообщества микроорганизмов называется биотопом. В норме микроорганизмы отсутствуют в легких и матке. Различают нормальную микрофлору кожи, слизистых оболочек рта, верхних дыхательных путей, пищеварительного тракта и мочеполовой системы. Среди нормальной микрофлоры выделяют резидентную и транзиторную микрофлору. Резидентная (постоянная) облигатная микрофлора представлена микроорганизмами, постоянно присутствующими в организме. Транзиторная (непостоянная) микрофлора не способна к длительному существованию в организме.

Микрофлора желудка представлена лактобациллами и дрожжами, единичными грамотрицательными бактериями. Она несколько беднее, чем, например, кишечника, так как желудочный сок имеет низкое значение рН, неблагоприятное для жизни многих микроорганизмов. При гастритах, язвенной болезни желудка обнаруживаются изогнутые формы бактерий -- Helicobacter pylori, которые являются этиологическими факторами патологического процесса.В тонкой кишке микроорганизмов больше, чем в желудке; здесь обнаруживаются бифидобактерии, клостридии, эубактерии, лактобациллы, анаэробные кокки.Наибольшее количество микроорганизмов накапливается в толстой кишке. В 1 г фекалий содержится до 250 млрд. микробных клеток. Около 95 % всех видов микроорганизмов составляют анаэробы. Основными представителями микрофлоры толстой кишки являются: грамположительные анаэробные палочки (бифидобактерии, лактобациллы, эубактерии); грамположительные спорообразующие анаэробные палочки (клостридии, перфрингенс и др.); энтерококки; грамотрицательные анаэробные палочки (бактероиды); грамотрицательные факультативно-анаэробные палочки (кишечные палочки и сходные с ними бактерии.

Самое большее внимание как потенциальное лечебное средство привлекают лактобациллы. Именно их целебные свойства оказались наиболее хорошо изученными и научно обоснованными. В 1920-30-е гг. культура Lactobacillus acidophilus стала использоваться в форме ацидофильного молока для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, сопровождающихся запорами. Создание же таблетированных форм живых бактерий в то время оказалось безуспешным, в связи с чем интерес к применению микробных препаратов в лечебных целях несколько угас [4,5].

Бактерии семейства Lactobacillus -- непатогенные грамположительные неспорообразующие облигатные или факультативные анаэробы с высокой ферментативной активностью. Они являются облигатной флорой с выраженным полиморфизмом. Среда их существования -- разные отделы желудочно-кишечного тракта, начиная с ротовой полости и заканчивая толстым кишечником, где они поддерживают уровень рН 5,5-5,6. Хотя лактобактерии (ЛБ) составляют меньшую часть флоры кишечника, их метаболические функции делают особенно значимой эту популяцию. У новорожденного ребенка 2,4 % нормальной флоры кишечника составляют лактобактерии, а патогенных организмов не содержится [6]. В кишечнике обитают следующие виды лактобацилл: Lactobacillus acidophilus, L.casei, L.bulgaricus, L.plantarum, L.salivarius, L.rhamnosus, L.reuteri.

Молочнокислые бактерии веками использовались человеком для получения различных пищевых продуктов. Лактобактерии в процессе жизнедеятельности вступают в сложные взаимоотношения с другими микроорганизмами, в результате чего угнетаются гнилостные микроорганизмы и пирогенные условно-патогенные организмы, возбудители острых кишечных инфекций за счет способности образовывать целый ряд таких веществ, как молочная кислота, лизоцим, лактоцины B, F, J, M, лактоцидин и ацидолин, обладающих антибактериальным эффектом (табл.1).

Бактериоцины, вырабатываемые лактобактериями, представлены в табл. 2

2.Перспективы и современные подходы к разработке биопрепаратов на основе лактобактерий

Основной проблемой последних лет являетсяувеличение числа резистентных к антибиотикам инфекций и снижение эффективности ряда антибиотиков. Распространение бактерий, устойчивых к антибиотикам, влечет за собой массовую аллергизацию больных и развитие дисбактериозов, частота которых быстро.

В последние годы появились новые подходы к лечению дисбактериозов, связанные с восстановлением естественной экологии организма и основанные на использовании активных биологических продуктов. Одним изаспектов такого подхода является нормализация измененного микробного пейзажа организма при помощи бактерийных препаратов.

В настоящее время в клинической практике в качестве средств лечения и профилактики острых кишечных инфекций, дисбактериозов различной этиологии и стресса широко используются биопрепараты из живых микробных культур - пробиотики. В отличие от антибиотиков, они не оказывают отрицательного воздействия на нормальную микрофлору, безвредны, экологически чисты и не имеют противопоказаний для применения. Основой пробиотиков являются либо микроорганизмы, представляющие нормальную микрофлору, либо не характерные для нормофлоры сапрофиты, способные вытеснять патогенные микроорганизмы из просвета кишечника.Лактобактерии являются неадгезивными транзисторными представителями микрофлоры кишечника. Некоторые полезные свойства делают их важным арсеналом совершенствования биопрепаратов. Прежде всего, это высокая ферментативная активность, позволяющая им существенно регулировать и стимулировать пищеварение, а также способность оказывать противоаллергенное, антитоксическое действие и повышать неспецифическую резистентность макроорганизма[7].

3.Технологическая схема производства лактобактерина

4.Описание технологической схемы производства лактобактерина

Др.1 Подготовка производственных помещений, персонала, оборудования, инвентаря и первичной упаковки.

Ежедневная уборка. На всех производственных участках 1 раз в смену проводят влажную уборку помещений, оборудования и трубопроводов для предотвращения появления постороннего микрофлоры. Деятельность, подсобных и бытовых помещений проводят уборщицы, а уборка рабочих мест - сами рабочие. При проведении влажной уборки допускают использование следующих дезинфицирующих растворов: - раствор натрия гидроксида с массовой долей 2,0%; - Раствор натрия хлорида с массовой долей 0,25%.

Генеральная уборка. Генеральная уборка помещений проводится один раз в неделю или по требованию бактериолога. Уборка производится с помощью раствора натрия гидроксида с массовой долей 2,0% или раствора натрия хлорида с массовой долей 0,25%. Потолок, стены, окна, перегородки и оборудование обрабатывают путем распыления дезраствора. По окончании орошения, лишний дезраствор удаляют путем протирания обработанных поверхностей чистой салфеткой. Уборке подлежат потолка, пола, стены, подоконники, поверхности всего оборудования, все производственные мебель.

Подготовка оборудования для производства

С целью предупреждения загрязнения технологического оборудования и коммуникаций посторонней микрофлорой и поддержки санитарно-гигиенического состояния на производстве проводят регулярное мытье и дезинфекцию оборудования, коммуникаций, производственных помещений по разработанному графику.

Мойки оборудования и коммуникаций. Обработку оборудования и коммуникаций делают моющими растворами. (Раствором азотной кислоты с массовой долей 1 - 1,5%, раствором каустической соды с массовой долей 2,5 - 3%). Дезинфекцию оборудования и коммуникаций проводят раствором "Криодезу" с массовой долей 0,2 - 1,5% только после тщательной обработки моющими растворами.

Др.2 Приготовление растворов криопротекторов

ТП.3 Получение питательных сред, растворов криопротекторов.

Для культивирования штамма Lactobacillus acidophilus, как и для выращивания других штаммов пробиотиков, используют различные питательные среды, к конструированию которых предъявляют следующие требования:

-предварительный выбор питательных субстратов с учетом критериев биологической ценности, доступности и экономичности;

-балансирование питательных сред;

-получение питательных основ и оценка их эффективности на модели регламентированных питательных сред;

-разработка и оценка способов получения питательных основ с учетом критерия технологичности и трудоемкости.

Для культивирования штамма Lactobacillus acidophilus используются питательную среду Блаурокка и Козеиново-дрожжевое среду. Для приготовления питательной среды Блаурокка используют экстракт печени, полученный путем экстракции печени очищенной водой (при соотношении 1: 1) с последующим кипячением в течение одного часа и стерилизацией при температуре (120 ± 1) ? в течение 20 минут при давлении 0,1МПа.До экстракта печени прибавляют пептон (1,0%), хлорид натрия (0,5%), лактозу (1,0%), агар-агар (2,0%), цистеин (0,01%); устанавливают рН таким образом , чтобы после стерилизации значение рН составляло (6,8 ± 0,3); кипятят, фильтруют и стерилизуют при 112 ? 30 минут при тиску0,05 МПа.Поживне среду хранят при температуре (6 ± 2) ? не больше двух месяцев.

Приготовление Козеиново-дрожжевого среды: ферментативный гидролизат козеин, разведенный очищенной водой до содержания аминного азота (150 ± 10) мг% смешивают с дрожжевым аутолизатом (соотношение 1: 2); добавляют натрия хлорид (0,5%); устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации значение рН составляло (7,0 ± 0,2); кипятят, добавляют лактозу, агар-агар и цистеин.Сумиш фильтруют и стерилизуют пр. температуре 119-121 ? и давления 0,11МПа течение 30 минут.

ТП.4 Получение инокулята штамма продуцента.

ТП.4.1 Первая генерация

Флакон или ампулу с лиофилизированным штаммом Lactobacillus acidophilus раскрывают в асептических условиях, вносят 2-5 мл питательной среды Блаурокка.Разводят содержимое флакона и осуществляют пересел в колбу, в которой содержится среду Блаурокка. Посев инкубируют в термостате при температуре (38 ± 0,5) ? в течение 24-48 часов. На всех этапах промышленного процесса проводят контроль стерильности материала, используя питательные среды для контроля бактерий и грибов.

ТП.4.2 Вторая генерация

Выращенную культуру штамма продуцента Lactobacillus acidophilus из колб пересевают в другую колбу, которая содержат 500-550 мл питательной среды Блаурокка.Посивы второй генерации инкубируют при температуре (38 ± 0,5) ? течение 20-24 часов.

ТП.4.3 Третья генерация

Далее, убедившись в чистоте культуры, проводят пересел штамма из колб в в баллон, содержащий 9-9,5 л питательной среды Блаурокка.Посивы инкубируют при температуре (38 ± 0,5) ? в течение 24-48 часов.

ТП.5 Производственная генерация

Производственную культуру выращивают методом глубинного культивирования в реакторах. Производственную культуру выращивают методом глубинного культивирования в реакторах.Реакторы должны быть оснащены паровой рубашкой .В реакторе проводят стерилизацию питательной среды.Биоректор оборудован устройствами для измерения и регуляции температуры, рН среды, концентрации растворимого кисло рода в культуральной жидкости. Помимо этого, биореактор должен быть обеспечен специальными опциями для подачи питательной среды и углеводов, введение инокулята, подачи растворов, например аммиака и пробоотборником.Для перемешивания биомассы реактор должен быть обязательно снабжен механической мешалкой. Тщательное перемешивание культуры необходимо, во-первых, для равномерной доставки питательных веществ к клеткам и, во-вторых, для предотвращения накопления токсических продуктов метаболизма в каком-то одном отсеке реактора.Помимо того реактор должен быть обеспечен опцией, которая позволит разливать препарат во флаконы или контейнеры для проведения лиофилизации.

В асептических условиях в реактор, содержащий 160 литров козеиново-дрожжевого среды, переносят микробной суспензию (20% от объема среды).

ТП.5 Добавление криопротектора: сахароза, желатин

В реактор с смесью питательной среды и инокулята добавляют 8-9 литров 40% стерильного раствора лактози.Выращивание биомассы в реакторе проводят при температуре (38 ± 0,5) ? в течение 72 времен при периодическом перемешивании.Пид культивировании производят корректировку величины рН с помощью 10% раствора аммиака до значения рН (6,6 ± 0,5) .Стабилизация роста величины рН свидетельствует о прекращении роста бактерий.

Проводят добавления к жидкому полуфабрикату криопротекторов. В реактор последовательно добавляют защитную среду (сахарозу-5-10%, желатин -3%, раствор лактозы 5-7%) и др.Вместимость реактора перемешивают и проводят взятие образца для проверки подлинности и чистоты культуры.

В контрольной пробе определяют:

-Стерильность -отсутствие Посторонней микрофлоры (грибов);

-количество Микробных клеток - в одной дозе препарата должно содержаться не менее 107 микробных клеток;

-Микроскопическое исследование;

ТП.6 Разлив в контейнеры

Разлив препарата в контейнеры проводят при непрерывной перемешивании.В процессе разлива проводится контроль на наличие по посторонней микрофлоры.

ТП.7 Лиофилизация и герметизация препарата

Контейнеры с препаратом загружают в аппарат для лиофилизации и доводят температуру продукта до минус 50-60 ? .Замораживают препарат в течение 48 часов при указанной температуры.Час и режим сушки определяется в зависимости от марки оборудования, толщины слоя биомассы, используемых криопротекторив и других факторов.

ТП.8 Маркировка и упаковка препарата

ТП.9 Контроль качества готового препарата

-аномальная Токсичность - контроль проводят пероральным вводом белым мышам 1 дозы препарата;

- Стерильность - отсутствие посторонней микрофлоры (грибов);

-количество Микробных клеток в одной дозе - в одной дозе препарата должно содержаться не менее 107 микробных клеток;

-Антогонистическую активность штаммов пробиотика;

Микроскопическое исследование [8].

5.Аппаратурная схема и ее описание

Гидропневматическая схема представлена в дополнении А.

6.Описание предложеного изменения в технологи

Лактобактерин представляет собой монопрепарат, содержащий один штамм лактобактерий вида Lactobacillus plantarum или Lactobacillus fermentum, а ацилакт и аципол - ассоциацию штаммов вида Lactobacillus acidophilus. Способ получения лактобактерина и его аналогов включает культивирование бактерий производственного штамма (штаммов) в жидкой питательной среде с внесением углеводной добавки, в качестве которой применяют растворы глюкозы или лактозы. Полученную бактериальную взвесь смешивают с защитной средой и подвергают лиофилизации. В качестве комплексной защитной среды используют обезжиренное молоко (20-30% от объема бактериальной взвеси) и сахарозо-желатозную среду (10-20% от объема бактериальной взвеси) .

К недостаткам способа получения лактобактерина и его аналогов следует отнести использование одного вида лактобактерий, что ограничивает биологический потенциал препарата. К тому же в ациполе и ацилакте неизвестно количественное соотношение составляющих бактериальной композиции, так как данный вид контроля, основанный на выявлении межштаммовых отличий, достаточно сложен и не используется при их изготовлении. Недостатком способа получения лактобактерина и аналогов следует считать использование различных углеводосодержащих растворов, используемых в процессе культивирования и в составе защитной среды для лиофилизации.

С целью устранения указанных недостатков предлагается способ получения лактобактерина, сущность которого заключается в следующем. Использование сахарозо-желатозной среды в качестве углеводной добавки в процессе культивирования лактобактерий позволяет исключить другие углеводы и унифицировать рабочие растворы, применяемые при накоплении биомассы лактобактерий и в составе защитных сред. Для повышения биологического потенциала препарата получаемую бактериальную взвесь лактобактерий вида Lactobacillus plantarum или Lactobacillus fermentum, как основы лактобактерина, смешивают с культурой одного из штаммов вида Lactobacillus acidophilus, применяемых для изготовления ацилакта или аципола. В получаемой бактериальной композиции возможен раздельный учет КОЕ каждого штамма с помощью простых и общедоступных способов благодаря выраженным межвидовым различиям. Для предотвращения разведения бактериальной взвеси обезжиренное молоко, как компонент защитной среды, предварительно используют в качестве питательного субстрата для накопления биомассы лактобактерий. Это позволяет уменьшить расход бактериальной суспензии для получения 1 дозы сухого препарата.

Достигаемый технический результат заключается в оптимизации способа получения препарата и повышении его биологической активности.

7.Изображение основного оборудования

Изображение основного оборудования представлено в дополнении Б.

Выводы

В ходе выполнения данной работы:

На основе патентного поиска была разработана оптимальная технологическая схема получения фармацевтических препаратов на основе лактобактерий. Предложена усовершенствованная схема производства лактобактерина, методом глубинного культивирования в реакторе.

Источники

Изменение биологических свойств Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli под влиянием метаболитов вагинальных лактобацилл в эксперименте / С.В. Черкасов и др. // Журн. микробиологии. 2001. - № 4. -С.114-116.

Калмыкова, А.И. Пробиотики: терапия и профилактика заболеваний. Укрепление здоровья / А.И. Калмыкова. -- Новосибирск : НПФ «Био-Веста», 2001.208с.

Хавкин, А.И. Микробиоценоз кишечника и иммунитет / А.И. Хав-кин //Рус. мед. журн.-2003.-Т. 11,№3.-С. 122- 126.

Коршунов В.М., Володин Н.Н., Агафонова С.А. и др. Влияние пробиотиков и биотерапевтических препаратов на иммунную систему организма хозяина // Педиатрия. -- 2002. -- № 5. -- С. 92-100.

Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Липницкий Е.М. и др. Исследование пристеночной микрофлоры желудочно-кишечного тракта у человека в норме и при патологии // Вестн. РАМН. -- 2004. -- № 2.-- С. 43-47.

Jiang H.Q., Bos N.A., Cebra J.J. Timing, localization and persistence of colonisation by segmented filamentous bacteria in the neonatal mouse gut depend on immune status of mothers and pups // Infect. Immun. -- 2001. -- Vol. 69. -- P. 3611-3617.

Воробьев А.А. и др., 1997; Панин А.Н. и др., 1998;

Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000; Rolfe D., 2000; Митрохин С.Д.,

Ю.М.Краснопольский, М.И.Борщевская «Фармацевтическая биотехнология.Технология производства иммунологических препаратов», Учебное пособие. Харьков НТУ «ХПИ»2009

Дополнение А

Дополнение Б

Размещено на Allbest.ru