Гепатит А и его неспецифическая диагностика

Таблица 1. Данные для определения билирубина в малом объеме сыворотки крови

Колориметрию и расчет производят так же, как это рекомендуется в унифицированном методе; поскольку сыворотки взято в опыт 0,125 мл, полученный результат умножают на 4 (при учете разведения) .

Норма--до. 20,52 мкмоль/л (1,2 мг/100 мл) общего билирубина, из которого до 25 % может составлять связанный билирубин.

Примечание. Реактивы готовят так же, как и в унифицированном методе Йендрашика, Клеггорна, Грофа.

В связи с тем что билирубин сыворотки крови обладает характерной зоной светопоглощения в области 450 нм, в последние годы были предложены прямые фотометрические методы его определения. Их использование особенно важно в практике экспресс-анализа гипербилирубинемии. Л. Г. Чеховской и А. С. Циркиной был предложен колориметрический экспреcc-метод без применения каких-либо реактивов, состоящий в установлении содержания билирубина путем фотометрии проб на ФЭКе с синим светофильтром (длина волны 450 им является оптимальной). Этот способ может быть эффективен для быстрой ориентировочной оценки уровня билирубина в сыворотке крови при массовых обследованиях населения.

Hefe (1978), исследовав визуально 1691 сыворотку, нашел, что вначале необходимо провести тщательную визуальную оценку сыворотки и что количественно билирубин следует определять только в иктеричных сыворотках.

Для полуколичественного установления билирубина в сыворотке крови Schyfz разработал «Bilur Test» (ФРГ). В основе его лежит цветная реакция взаимодействия билирубина с диазониевой солью 2,6-дихлор-бензол-флюоборатдиазония. Через 1 мин после пропитывания полоски сывороткой появляющуюся окраску сравнивают с приданной цветной шкалой. С помощью этих полосок можно быстро ориентироваться в степени гипербилирубинемии.

5. Клинико-диагностическое значение определения билирубина в сыворотке (плазме) крови

Определение общего билирубина и его фракций имеет большое клиническое значение. Отмечено, что желтуха появляется тогда, когда уровень билирубина в крови превышает 27--34 мкмоль/л (Тодоров, 1968).

Возрастание содержания свободного билирубина в крови наблюдается при так называемых надпеченочных желтухах, к которым относятся гемолитические анемии разнообразного происхождения, а также функциональные гипербилирубинемии: постгепатитная гипербилирубинемия, болезнь Жильбера, желтуха новорожденных (физиологическая), семейная негемолитическая желтуха новорожденных (синдром Криглера -- Найара). Свободный билирубин в моче не появляется. Содержание уробилина в моче и стеркобилина в кале при гемолитических анемиях повышено, при остальных формах надпеченочных желтух оно нормально или понижено.

У больных с печеночными желтухами в крови повышен уровень связанного билирубина. Как известно, печеночные желтухи, паренхиматозные повреждения печени с их исходами -- это и синдром Дубина-- Джонсона и синдром Ротора. В моче появляется билирубин. Количество стеркобилина в кале понижено. Характер уробилинурии различен.

При подпеченочных желтухах, к которым относится механическая желтуха, в крови возрастает содержание как связанного, так и свободного (в меньшей степени) билирубина, в моче, обнаруживается билирубин, в кале понижено содержание стеркобилина.

В настоящее время широко известно понятие «функциональные гипербилирубинемии», под которыми понимают несколько типов желтух, отличающихся доброкачественным течением и протекающих без выраженного поражения паренхимы печени, без признаков вне-или впутрипеченочной закупорки желчных ходов, а также без повышенного гемолиза. В зависимости от того, на каком этапе нарушается обмен билирубина, различают две основные формы гипербилирубинемии, характеризующихся:

1) увеличением содержания в сыворотке крови свободного билирубина;

2) накоплением в сыворотке крови преимущественно связанного билирубина.

К первому типу функциональных гипербилирубинемии, сопровождающихся повышением концентрации свободного билирубина, относится форма, описанная Жильбером, а также постгепатитная гипербилирубинемия, физиологическая желтуха новорожденных и семейная негемолитическая желтуха новорожденных Криглера-- Найара. Эти заболевания протекают без повышенного гемолиза, с пониженным содержанием стеркобилина и уробилина.

Полагают, что при указанном виде гипербилирубинемии ухуд-

шается конъюгация билирубина в печеночной клетке вследствие снижения активности глюкурониловой трансферазы или нарушения захвата билирубина печеночной клеткой. Последнее может быть обусловлено и внепеченочными факторами.

Увеличение концентрации связанного и отчасти свободного билирубина свойственно желтухам, возникающим в результате поражения паренхимы печени факторами инфекционного и токсического характера. Помимо нарушения экскреции связанного билирубина в желчные капилляры, вследствие чего он попадает непосредственно в кровь, отмечается ослабление конъюгации свободного билирубина и поступление его в печеночную клетку. Это влечет за собой повышение уровня и свободного билирубина в плазме крови у таких больных.

Характерно возрастание связанного билирубина для второй группы функциональных гипербилирубинемии, к которым относятся болезнь Дубина -- Джонсона и синдром Ротора. Развитие подобных желтух вызвано нарушением транспорта связанного билирубина печеночной клеткой [5].

6. Определение активности аминотрансфераз (трансаминаз)

При участии аминотрансфераз (КФ 2.6.1) в организме человека осуществляются процессы переаминирования (обратимого переноса аминогрупп аминокислот на кетокислоты). Наибольшее значение имеет исследование активности аспартатаминотрансферазы (L-аспартат: 2-оксоглутарат-аминотрансферазы; КФ 2.6.1.1) и аланинамино-трансферазы (L-аланин: 2-оксоглутарат-аминотрансферазы; КФ 2.6.1.2). Эти ферменты обладают большой каталитической активностью и широко распространены в различных органах и тканях -- печени, мышце сердца, скелетной мускулатуре, почках и других.

Аспартатаминотрансфераза (АсТ) катализирует реакцию:

Глютаминовая + Щавелевоуксусная > Аспарагиновая + б-кетоглутаровая кислота кислота < кислота

Аланипаминотрансфераза (АлТ) катализирует реакцию:

Глютаминовая + Пировиноградная >б-аланин + б-кетоглутаровая кислота кислота кислота <

Существующие методы определения активности указанных аминотрансфераз в сыворотке крови можно разделить на две основные группы: колориметрические и спектрофотометрические.

В основе спектрофотометрических методов лежит использование оптического теста Варбурга. Эти методы являются наиболее специфичными и точными для исследования активности аминотрансфераз в сыворотке крови. Однако применение труднодоступных и дорогостоящих реактивов, а также необходимость измерения результатов на спектрофотометре не дают возможности широкого использования этих методов в клинических лабораториях.

Группа колориметрических методов основана на образовании окрашенного динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты, освобождающейся в результате реакции переаминирования. Интенсивность окраски пропорциональна активности фермента.

Пировиноградная кислота+Динитрофенилгидразин = Динитрофеннлгидразон пировиноградной кислоты

Динитрофепилгидразоновые методы впервые предложили в 1950 г. Тангази, Уайт, Умбрайт. У нас в стране они получили известность в модификации Т. С. Пасхиной.

В последние годы появился облегченный и упрощенный метод Райтмаиа и Френкеля, основанный па том же принципе, что и способ в модификации Т. С. Пасхиной, но имеющий перед ним ряд преимуществ. Они состоят в исключении из хода определения активности ферментов: 1) перевода щавелевоуксусной кислоты в пировиноградную с применением анилина, 2) экстракции 2,4-ДНФ-гидразона пирувата толуолом. Метод Райтмана и Френкеля нашел широкое применение за рубежом. Будучи технически простым, он вместе с тем выявляет изменения активности фермента при различных заболеваниях и дает воспроизводимые результаты.

Азометоды основаны на образовании цветного соединения между щавелевоуксусной кислотой и 6-бензамидо-4-метокситолуидиндиазо-ниевым хлоридом. Колориметрические методы этой группы просты и при наличии соответствующих все еще дефицитных реактивов могут быть использованы для быстрого ориентировочного определения активности аспартатаминотрансферазы [5].

Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод исследования активности аминотрансфераз в сыворотке крови (по Райтману, Френкелю, 1957)

Принцип. В результате переаминирования, происходящего под действием АсТ и АлТ, образуются Щавелевоуксусная и пировиноградная кислота. Щавелевоуксусная кислота способна в процессе ферментативной реакции превращаться в пировиноградную кислоту. При добавлении кислого 2,4-динитрофенилгидразина энзиматический процесс останавливается и получается гидразон пировиноградной кислоты. Последний в щелочной среде дает окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты [5].

7. Клинико-диагностическое значение определения активности аминотрансфераз в сыворотке крови

Исследование активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет исключительно важное значение для диагностики и дифференциальной диагностики болезней печени. При болезни Боткина активность аминотрансфераз повышается с большим постоянством в очень ранние сроки -- еще до появления желтухи. Резкое увеличение активности фермента наблюдается и у больных с безжелтушной формой. В связи с этим проба находит широкое применение при обследовании лиц, бывших в очаге инфекции. При болезни Боткина вначале коэффициент АсТ/АлТ становится значительно меньшим . Большей чувствительностью отличается аланинамииотрансферазная проба, которая в первые 10--15 дней болезни (5--10 дней от начала желтухи) практически во всех случаях бывает повышенной. С увеличением сроков заболевания активность аминотрапсфераз постепенно снижается, как правило, быстрее при легком его течении, чем при средне-тяжелом и тяжелом. У детей отмечается более ранняя нормализация данного показателя. У больных с затяжным течением наблюдается длительная гиперферментемия; у больных с рецидивами и обострениями активность аминотрансфераз вновь возрастает. Проба в определенной степени служит критерием полноты выздоровления, однако при дистрофии печени активность аминотрансфераз может быстро снижаться, несмотря на ухудшение течения болезни.

При токсическом гепатите и обострении хронического гепатита часто бывают большие цифры ферментативной активности.

Цирроз печени даже в активной фазе не сопровождается столь значительной гиперферментемией.

У больных с механической желтухой на почве новообразований или заболеваниями желчевыводящих путей активность аминотрансфераз чаще всего нормальна или незначительно повышена. Возрастание показателей обычно свидетельствует о вторичном вовлечении печени в патологический процесс (холецистогепатит, холангиогепатит, обширные метастазы опухоли в печень). Для больных с гемолитическими анемиями и функциональными гипербилирубинемиями характерны нормальные показатели.

Не менее важное значение имеет определение активности трансаминаз и для диагностики заболеваний сердца. При инфарктах миокарда в 95 % всех случаев содержание АсТ повышено. Возрастание активности наступает через 4--6 ч. Оно четко выртжено спустя 24-- 36 ч и лишь на 3--7-й день снижается до нормального уровня. Повышение активности АсТ и лактатдегидрогеназы наблюдается при таких инфарктах миокарда, которые не диагностируются электрокардиографически.

Возрастание активности фермента у больных с инфарктом легкого бывает в тех случаях, когда заболевание сопровождается перегрузкой правой половины сердца и застоем крови в печени.

Крупноочаговые поражения миокарда дают среднее повышение АсТ--1,54 ммоль/(ч-л) (при максимальном возрастании до 3,28 ммоль/(ч-л), АлТ--1,90 ммоль/(ч-л) (при максимальном отклонении до 3,80 ммоль/(ч-л).

При мелкоочаговых поражениях, по данным С. Р. Белоуса и Ф. Л. Салимона, среднее арифметическое для АсТ составляет 0,70 ммоль/(ч-л), для АлТ--1,27 ммоль/(ч-л) при норме соответственно 0,50 ммоль/(ч-л) и 0,80 ммоль/(ч-л). Авторы отметили, что Умеренное повышение активности аминотрансфераз наблюдалось у обследованных ими больных с пароксизмалыюн тахикардией, гипертоническими кризами [5].

8. Тимоловая проба

Тимоловая проба, предложенная в 1944 г. Маклаганом, основана на определении степени помутнения смеси при взаимодействии сыворотки с насыщенным раствором тимола в вероналовом буфере.

Химическая сущность тимоловой пробы окончательно не выяснена. Многие авторы полагают, что проба становится положительной

при уменьшении содержания альбуминов и увеличении уровня (в-, г-глобулинов и связанных с в-глобулинами липидов (липопротеидов) в сыворотке крови. Считают, что помутнение смеси обусловлено взаимодействием коллоидных частиц тимола и некоторых крупнодисперсных белков ---г-глобулинов и в-липопротеидов. По представлению Маклагана, эта реакция вызвана образованием глобулин-тимол-ли-пидного комплекса, содержащего 40 % глобулинов, 32 % тимола, 18 % холестерина и 10 % фосфолипидов.

Все известные к настоящему времени пробы тимолового помутнения отличаются главным образом способом приготовления буферного раствора. Если в оригинальной методике Маклагана тимол растворяют в вероналмединаловом буфере при его нагревании (что приводит к частичному окислению тимола), то в утвержденном в качестве унифицированного методе Хуэрго и Поппера тимол предварительно растворяют в этаноле и полученный раствор добавляют к барбитуратовому буферу, приготовленному по прописи Маклагана.

Тимоловая проба (по Хуэрго и Попперу)

Принцип. При взаимодействии сыворотки с тимолово-веронало-вым буфером появляется мутность вследствие образования глобулин-тимол-липидного комплекса.

Норма -- 0--4 ед. 5--Н.

Клинико-диагностическое значение тимоловой пробы

Подобно остальным флокуляционным тестам тимоловая проба является неспецифической реакцией. Вместе с тем она гораздо более специфична для функционального исследования печени, чем другие коллоидноосадочные пробы. Считают, что проба Маклагана положительна в 90--100 % случаев болезни Боткина (уже в преджел-тушной ее стадии и при безжелтушной форме), токсического гепатита. Реакция положительна у больных с постгепатитным и постнекротическим, особенно желтушным, циррозом (в отличие от таковой у больных другими формами циррозов), коллагеновымн заблеваниями, малярией и вирусными инфекциями. При механической желтухе она (в 75 % случаев) отрицательна. Последнее обстоятельство имеет дифференциально-диагностическое значение.

У больных механической желтухой проба становится положительной лишь в случае, если процесс осложняется паренхиматозным гепатитом.

Для дифференциации механической желтухи от паренхиматозной большую роль играет применение тимоловой пробы с пробой Бурштейна (на в- и пре-в-липопротеиды).

При паренхиматозной желтухе обе пробы положительны, при механической желтухе тимоловая проба отрицательна, проба Бурштейна-- резко положительна.

Важно отметить, что, по данным И. В. Степкиной (1973), у 30 % больных, перенесших инфекционный гепатит, показатели тимоловой пробы оказываются повышенными на протяжении 6 месяцев после выписки из стационара. Отсюда следует, что тимоловую пробу, "дополненную тестом определения уробилина в моче, можно использовать и в периоде диспансерного наблюдения за больными, лечившимися в стационаре по поводу болезни Боткинa [5].

Заключение

Диагноз «вирусный гепатит А» устанавливается на основании клинических, лабораторных и эпидемиологических данных. Окончательная верификация проводится на основании выявления антител класса IgM.

Известен только один серологический тип вируса ГА. Из определяемых в настоящее время специфических маркеров важнейшим являются антитела к ВГА класса IgM (анти-HAV IgM), которые появляются в сыворотке крови уже в начале заболевания и сохраняются в течение 3-6 мес. Наличие анти-HAV IgM свидетельствует о ГА, используется для диагностики заболевания и выявления источников инфекции в очагах. Появление анти-HAV IgG возможно с 3-4-й недели заболевания, антитела сохраняются длительно, что свидетельствует о перенесенном ГА, позволяет оценить динамику специфического иммунитета населения. Антиген ВГА обнаруживают в фекалиях больных за 7-10 дней до клинических симптомов и в первые дни заболевания, что используют для ранней диагностики и выявления источников инфекции.

Неспецифическим биохимическими анализоми, подтверждающими гепатит А являются: общий билирубин, показатели аминотрансфераз, особенно аланиновой аминотрансферазы (АлАТ), показатели тимоловой пробы.

Так увеличение концентрации связанного и отчасти свободного билирубина свойственно желтухам, возникающим в результате поражения паренхимы печени факторами инфекционного и токсического характера. Помимо нарушения экскреции связанного билирубина в желчные капилляры, вследствие чего он попадает непосредственно в кровь, отмечается ослабление конъюгации свободного билирубина и поступление его в печеночную клетку. Это влечет за собой повышение уровня и свободного билирубина в плазме крови у таких больных.

При болезни Боткина активность аминотрансфераз повышается с большим постоянством в очень ранние сроки -- еще до появления желтухи. Резкое увеличение активности фермента наблюдается и у больных с безжелтушной формой. В связи с этим проба находит широкое применение при обследовании лиц, бывших в очаге инфекции. Проба в определенной степени служит и критерием полноты выздоровления, однако при дистрофии печени активность аминотрансфераз может быстро снижаться, несмотря на ухудшение течения болезни.

Тимоловая проба является неспецифической реакцией. Вместе с тем она гораздо более специфична для функционального исследования печени, чем другие коллоидноосадочные пробы. Считают, что проба Маклагана положительна в 90--100 % случаев болезни Боткина (уже в преджелтушной ее стадии и при безжелтушной форме), токсического гепатита.

Важно отметить, что, по данным И. В. Степкиной (1973), у 30 % больных, перенесших инфекционный гепатит, показатели тимоловой пробы оказываются повышенными на протяжении 6 месяцев после выписки из стационара. Отсюда следует, что тимоловую пробу, "дополненную тестом определения уробилина в моче, можно использовать и в периоде диспансерного наблюдения за больными, лечившимися в стационаре по поводу болезни Боткина.

Список литературы

1.Балаян М.С. Вирусный гепатит В// Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1995. - Т. 20. - С. 32-37

2.Бунин К.В. Дифференциальная диагностика инфекционных болезней.--М.; Медецина, 1965.

3.Возианова Ж.И. Инфекционные болезни и паразитарные болезни. В трех томах. Том первый.//Киев, «Здоров'я»-2000, с.601-676

4.Ивашкин В.Т., Хазанов А.И., Васильев А.С. и др. Вирусы гепатитов В и С: эпидемиология, роль в патогенезе острых и хронических заболеваний печени// Рос. журн. гастроэнтерол. и гепатол. - 1994. - №. 2. - С. 12-15.

5.Колб В.Г., Камышников В.С.Справочник по клинической химии//Минск «Беларусь» - 1982 - с.62-65,110-115,248-257

6.Комаров Ф.И., Коровкин Б.Ф.,Меньшиков В.В. Биохимические исследования в клинике//Ленинград-1976-383

7.Лобзин Ю.В.. Руководство по инфекционным болезням//

Санкт-Петербург «Фолиант»-2000.- Часть 2.-с.25-49

8.Матковский В.С. Инфекционные болезни// Л.; Медецина 1975

9.Подымова С.Д., Буеверов А.О. Современный взгляд на перспективы диагностики и лечения гепатита С. Клиническая фармакология и терапия, 1996; 1: 28-31.

10.Покровский В.И.,Лобан К.М. Руководство по инфекционным болезням// Москва «медецина»--1986--с. 93-107

11.Покровский В.И. Инфекционные болезни. Руководство для врачей - Мссква.: Медицина, 1996, 528 с.

12.Соринсон С.Н. Вирусные гепатиы//Сант-Петербург.-1997, 5-16

Тареев Е.М.,Шубладзе А.К. Эпидемический гепатит//Москва «Медецина» - 1964 - с.36-41

13.Учайкин В.Ф. “Вирусные гепатиты у детей” Москва 1994 г., стр 89-96.

14.Шахгильдян И.В., Кузин С.Н., Хухлович П.А. и др. Эпидемиологическая характеристика гепатита// Рос. журн. гастроэнтеролог., гепатол., колопроктол. - 1995. - № 2. - С. 15-20.

15.Шувалова Е.П. Инфекционные болезни//Москва «Медецина» - 1982--с.139-163.

16.Alter MJ. Transmission of hepatits C virus - route, dose, and titer (editorial). N Engl J Med 1994; 330:784.

17.Gumber S.C. et al. Hepatitis C: A Multifaceted Disease. Review of Extrahepatic Manifestations. Ann Intern. Med. 1996; 23:615-20.

18.Simons F.N., Pilot-Martias T.F., Leary T.P., Dawson O.T., Desai S.M., Schlauder G.G. et al. Identification of two flavivirus-like genomes in the GB hepatitis agent. Proc Nat Acad Sci USA 1995; 92:3401-5.

19.Linnen J., Wages J., Zhang-keck Z., Ery K.E. et al. Molecular Cloning and Disease association of Hepatitis G Virus: A Transfusion - Transmissible Agent. Hepatitis GB - Virus GBV-C Selected Bibliography 1996. Science 1996: 271;43-7.

20.Yoshiba M., Okamoto H., Mishiro Sh. Detection of the GBV-C hepatitis virus genome in serum from patients with fulminant hepatitis of unknown actiology. Lancet 1995; 346:1131-2.

Размещено на Allbest.ru