Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

• Введение
• 1. Традиционные и новые взгляды на качественный состав пробиотиков
• 1.1 Краткая характеристика спорообразующих бактерий
• 1.2 Доказательство эффективности препаратов в животноводстве
• 2. Технология производства пробиотиков
• 2.1 Вспомогательные работы
• 2.2 Подготовка производственных штаммов
• 2.3 Приготовление маточной культуры
• 2.4 Получение бактериальной массы
• 2.5 Приготовление препарата
• 2.6 Упаковка препарата
• Заключение

Введение

Безопасность и качество продукции животного происхождения неразрывно связаны. Невозможно гарантировать качество продуктов питания, если игнорировать биологические, токсикологические факторы риска.

Серьезную озабоченность вызывает тенденция увеличения массовой заболеваемости и падежа новорожденных телят и поросят, а также цыплят второго периода откорма от желудочно-кишечных инфекций.

Основной причиной этого является интенсивная технология выращивания животных, которая искажает процессы формирования кишечного микробиоциноза у новорожденных. В отличие от домашних и диких сородичей, у животных промышленного стада существенно снижен общий индекс кишечной микрофлоры. Состав кишечного микробиотопа молодняка характеризуется присутствием стафилококков, протея, плесневых и дрожжеподобных грибов. Количество эшерихий со сниженной ферментативной активностью может достигать 30-40%. Значительно снижен уровень молочнокислой флоры. Количество бифидобактерий минимально.

Под действием антибиотиков, вакцин, ряда технологических факторов нарушается микроэкологическое равновесие кишечного биотопа, что приводит не только к увеличению численности патогенных микробов.

Ускоряются темпы мутации условно-патогенных микроорганизмов, их лекарственной устойчивости, которая включает гены, изменяющие свойства условно-патогенных бактерий в сторону патогенности.

Включение пробиотиков в технологию выращивания молодняка - наиболее современный способ профилактики желудочных болезней, основанный на экологически безопасных механизмах поддержания высокого уровня колонизационной резистентности кишечника.

Мировая практика доказала, что пробиотики предупреждают риск заселения кишечника животных условно-патогенными бактериями. Подавление роста колоний и блокирование токсикологических факторов патогенной микрофлофры лежит в основе профилактического эффекта пробиотиков.

Бактерии-пробионты или пробиотики обеспечивают опережающее заселение кишечника животных нормальной и дружественной микрофлорой и создают биологический барьер, преграждающий доступ к ней патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Они вырабатывают комплекс биологически активных соединений, избирательно воздействующих на условно-патогенные микробы. Например, лизоцим резко снижает способность патогенных бактерий к делению и размножению, молочная кислота замедляет их рост, перекись водорода разрушает их клеточную стенку. Бактериоцины обладают общим бактериостатическим действием на грамотрицательную микрофлору.

Кроме того, пробиотики обмениваются сигнальными молекулами с иммунокомпетентными клетками слизистой кишечника, усиливая продукцию секреторного иммуноглобулина А, комплемента, лизоцима, которые блокируют прикрепление энтеропатогенных бактерий к поверхности слизистой. Пробиотики в отличие от антибиотиков не вызывают привыкания со стороны условно-патогенных микроорганизмов, обладающих R-плазмидой, кодирующей устойчивость к химиопрепаратам.

Продукты жизнедеятельности бактерий-пробионтов не накапливаются в органах и тканях животных и не влияют на товарное качество конечной продукции. Пробиотики не усиливают экологические характеристики энтеробактерий, ответственных за вирулентность. Они безопасны для окружающей среды и обслуживающего персонала.

Возможности использования пробиотиков в ветеринарии затрагивают довольно широкий круг проблем, начиная от коррекции кишечного биоценоза и распространяясь на коррекцию иммунной, гормональной и ферментативной систем животных.

В этой связи, внедрение пробиотиков в систему выращивания животных необходимо для профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка, поддержания колонизационной резистентности кишечника, повышения физиологического и иммунного статуса организма животных, стимуляции роста и развития, получения качественной продукции, безопасной в ветеринарно-санитарном отношении.

1. Традиционные и новые взгляды на качественный состав пробиотиков

Обнаруженный И.И. Мечниковым еще в начале ХХ века положительный эффект от приема простокваши с живыми лактобактериями, состоявший в улучшении здоровья потребителей в процессе модификации кишечной микрофлоры, был обозначен как пробиозиз (probiosis). Феномен пробиозиза определяется как "ассоциация двух организмов, которая стимулирует жизненные процессы каждого из них", а "живая микробная кормовая добавка, которая оказывает полезное действие на животное-хозяина путем улучшения его кишечного микробного баланса", получила название пробиотика. Чтобы быть включенными в группу пробиотиков, микроорганизмы должны соответствовать следующим критериям:

1) выживать при пассировании через желудочный тракт, что предполагает их резистентность к кислоте и желчи;

2) адгезироваться на эпителиальных клетках кишечника с последующей колонизацией;

3) стабилизировать кишечную микрофлору;

4) не иметь признаков патогенности;

5) сохранять жизнеспособность как в пищевых продуктах, так и в процессе получения фармакопейных лиофилизированных препаратов;

6) быстро размножаться, колонизируя кишечный тракт;

7) персистировать с проявлением родовых свойств пробиотиков.

Указанным критериям в наибольшей степени соответствует автохтонная группа содружественных микроорганизмов, включающая такие постоянные обитатели кишечной экосистемы, как лакто- и бифидобактерии, кишечная палочка.

Как показали практические наблюдения, пробиотические эффекты могут быть вызваны и некоторыми группами аллохтонных микроорганизмов. Примером тому служит пробиотическое использование культуры дрожжей Saccharomyces boulardii, которые не являются нормофлорой желудочно-кишечного тракта человека, но вместе с тем способны предотвращать повторение псевдомембранозного колита, вызываемого Clostridium difficile. Протеаза, секретируемая S.boulardii, разрушает токсинCl.difficile, образуемый на поверхности эпителиальных клеток кишечника. Оказалось, что некоторые представители обширной группы спорообразующих бактерий - Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Sporolactobacillus - способны предотвращать кишечные расстройства и порой даже в большей степени, чем традиционные пробиотики на основе лакто- и бифидобактерий. Вместе с тем спорообразующие бактерии в качестве пробиотиков применяются все же реже и с большими ограничениями, чем лакто- и бифидобактерии. Главными сдерживающими факторами являются родство спорообразующих бактерий с патогенными и токсигенными видами, такими как Bacillus anthracis, Clostridium рerfringens, С.botulinum, а также то, что они в большинстве чужеродны микрофлоре кишечного тракта.

Основной целью данной работы является анализ данных, посвященных исследованию свойств и безопасности спорообразующих бактерий как пробиотиков.

1.1 Краткая характеристика спорообразующих бактерий

Род Bacillus. Этот род, насчитывающий 77 видов, объединяет обширную группу строго аэробных или факультативно анаэробных грамположительных хемоорганотрофных микроорганизмов палочковидной формы, образующих термоустойчивые эндоспоры. Типовой вид - B.subtilis (Ehremberg) Cohn 1872, 174. Примечательно, что B.subtilis и B.cereus стали известны как микроорганизмы, с помощью которых создавали анаэробные условия роста. Особенностью этой группы бактерий является широкий диапазон G + C пар оснований - от 32 до 69 мольн. % .

Род Bacillus обычно связан с почвой, но его представители также выделяются из воды, пыли и воздуха. Эти бактерии могут вызывать порчу продуктов питания - картофеля, хлеба, молока. Терморезистентные споры бацилл, которые не погибают в процессе обезвоживания и попадают в готовые продукты, создают проблемы при производстве сухого молока. Представители Bacillus отличаются высоким и разнообразным спектром биологической активности. Часто обладая явным антагонизмом к патогенным микроорганизмам, они продуцируют целый ряд ферментов, лизирующих крахмал, пектины, целлюлозу, жиры, белки, производят различные аминокислоты и антибиотики. На Востоке вошло в традицию использование бацилл при ферментации некоторых продуктов питания. Например, при помощи штамма Bacillus natto (subtilis) готовят национальное японское блюдо натто - специальным образом ферментированные бобы. В отношении кишечного тракта животных виды Bacillus являются аллохтонными микроорганизмами, которые попадают туда в результате либо случайного поедания, либо осознанного употребления в пищу ферментированных продуктов питания.

Несмотря на то что представители Bacillus в норме не колонизируют кишечный тракт у скота и не являются его обитателями, тем не менее существует более двух десятков пробиотических препаратов, полученных на основе таких видов, как coagulans,subtilis, clausii, cereus, toyoi, lichemiformis, mesentericus, polymyxa и др. К сожалению, не всегда точно в них указывались названия использованных штаммов. Так, в препарате якобы на основе Lactobacillus sporogenes фактически находилась культура Bacillus coagulans . Такое название спорообразующей бактерии, ошибочно отнесенной к виду Lactobacillus, прослеживается от публикации в 1932 г. Проверка семи препаратов споровых пробиотиков на идентичность названий показала, что только один из них соответствовал заявленному составу. Дело в том, что идентификация представителей рода Bacillus, изначально основанная на фенотипичных признаках, всегда была недостаточно точна. Но и более прогрессивный генетический подход к идентификации на основе последовательности 16 рРНК также оказался перед проблемой неразличимости некоторых видов.

Род Brevibacillus. Этот род аэробных спорообразующих бактерий возник после повторной генетической классификации штаммов, ранее входивших в группу Bacillus brevis. В настоящее время все 10 видов (brevis, agri, centrosporus,choshinensis, parabrevis, reuszeri, formosus, borstelensis, laterosporus, thermoruber) официально признаны представителями родаBrevibacillus.

Пробиотические свойства представителей рода Brevibacillus исследованы мало. Тем не менее на основе бревибацилл уже созданы два пробиотика. Было обнаружено, что культура Br.laterosporus обладает ларвицидной активностью, а штаммыBr.agri, Br.brevis и Br.laterosporus даже опасны для человека. Показано, что штаммы Br.laterosporus отличаются значительным генетическим разнообразием - у 29 из них были выделены 14 отдельных фрагментов на хромосоме.

Род Clostridium. Спороносные бактерии, клетки которых при спорообразовании раздуваются в центре и приобретают форму веретена (Clostridium; от греч. kloster - веретено). В большинстве - анаэробы и хемоорганотрофы с бродильным типом метаболизма. Одни виды сахаролитические, другие - протеолитические, третьим свойственны в разной степени и те и другие качества. Некоторые виды фиксируют азот, сульфаты не восстанавливают, каталазы обычно не образуют. Встречаются в почве, осадках водоемов и в пищеварительном тракте человека и животных. Типовой вид - Clostridium butyricum Prazmowski, 1880, 24. В настоящее время описано около 60 видов.

О клостридиях больше известно как о вредных микроорганизмах. Например, клинически значимые виды клостридий - C.tetani,C.botulinum, C.perfringens в вегетативном состоянии секретируют мощные экзотоксины, вызывая такие очень тяжелые заболевания человека и животных, как столбняк, ботулизм, газовая гангрена. Еще один вид - C.difficile - опасен тем, что он, часто обитая в толстом кишечнике, при лечении антибиотиками может вызывать серьезную инфекцию. Пока только три вида Clostridium - С . thermocellulociticus, C.lochheadii и C.butyricum - являются компонентами пробиотиков. Последний из них был найден доктором Miyairi еще в 1938 г. и поныне популярен в Японии и Корее.

Род Sporolactobacillus. Клетки прямые, подвижные, грамположительные, образуют эндоспоры. Хемоорганотрофы. Метаболизм бродильный. Гексозы расщепляют по типичному гомоферментативному пути с образованием одной лишь молочной кислоты. Каталазу не образует. Факультативно анаэробные или микроаэрофильные бактерии с температурой роста 35 °C. Типовой вид - Sporolactobacillus inulinus. К настоящему времени известны 5 видов Sporolactobacillus - Sp.inulinus, Sp.kofuensis,Sp.lactosus, Sp.nakayamae subsp. nakayamae, Sp.nakayamae subsp. racemicus, Sp.terrae. Для этого рода мольное содержание G + C пар составляет 38-40 %. Первоначально представителей Sporolactobacillus относили к роду Lactobacillus, но впоследствии их повысили до статуса рода, но уже в семействе Bacillaceae . Различие Sporolactobacillus от рода Lactobacillus было выявлено по исследованию ДНК-ДНК гибридизации. Кроме того, жирнокислотная конфигурация и изопреноид-хиноновые компоненты клеток Sporolactobacillus оказались общими с группой Bacillus и отличались от таковых у Lactobacillus. Нам не удалось найти работы, посвященные использованию Sporolactobacillus как пробиотиков.

1.2 Доказательство эффективности препаратов в животноводстве

Важным шагом в оценке пробиотической эффективности препаратов является изучение их физиологической пользы на модельных животных. И.Б. Сорокулова и др. исследовали эффективность против Campylobacter препаратов на основе Bacillus - Биоспорина, Субалина, Бактисубтила, Цереобиогена. В опытах in vitro только два препарата - Биоспорин, содержащий B.subtilis и B.licheniformis, а также Субалин на основе B.subtilis - ингибировали некоторые штаммы C.jejuni иC.coli. По результатам опытов на мышах, инфицированных кампилобактериями, авторы пришли к выводу об эффективности этих препаратов при пероральном применении. Hattori и др. показали, что Bacillus coagulans P-22 ингибировали изменения, вызываемые Vibrio в кишечной ткани кроликов. И.Г. Осиповой и др. были установлены весьма существенные различия адгезивной активности штаммов бацилл к эпителиальным клеткам кишечника мышей в зависимости от происхождения штаммов. При этом, как справедливо замечают авторы, высокая адгезивность к энтероцитам, равно как наличие гемолитической, гиалуронидазной и лецитиназной активности, следует расценивать как нежелательное явление для пробиотических бактерий.

Пробиотик Споровит, как было представлено в работе, наделяют уникальным сочетанием таких качеств, как избирательное подавление роста бактериальной, вирусной и грибковой флоры (кандидозы, трихофития, микроспория и др.), высокая ферментативная и биосинтетическая активность, безвредность для макроорганизма и его микрофлоры, высокая устойчивость к неблагоприятным условиям внешней среды.

Сравнительно часто в исследованиях по выяснению пользы пробиотиков для животных встречаются работы, в которых спорообразующие бактерии применяются как кормовая добавка. К примеру, Cavazzoni и др. оценили эффективность Bacillus coagulans как стимулятор роста и компонент, улучшающий качество корма для птиц. В их экспериментах три группы цыплят в течение 49 дней кормили равным количеством корма и вместе с ним одной группе давали культуру B.coagulans, второй - антибиотик virginiamycin, а третьей - контрольной - только корм. В результате первая опытная группа, которой давалиB.coagulans, превосходила контрольную и была эквивалентна или лучше группы, которой давали антибиотик.

Duc и др. установили, что при оральном применении на мышах в виде спор все используемые штаммы - B.cereus IP 5832, B.clausii, B.pumilus, B.cereus var. vietnami, стимулировали выработку IgG. Генерируя гуморальные ответы, антигены споры могли взаимодействовать с лимфоидной тканью кишечника. При этом спорыB.subtilis входят в бляшки Пейера и лимфоузлы брыжейки. По утверждению авторов, величина иммунного ответа на споры может почти в 10 раз отличаться в зависимости от штамма.

В.В. Подберезный и Н.И. Полянцев показали эффективность перорального применения живой культуры B.pulvifaciens -основы Эндобактерина - при лечении мастита у коров и в повышении их иммунного статуса.

С.Р. Резник и др. наблюдали у мышей, которых вначале пропаивали В.subtilis и В.licheniformis в дозе 2,5 ґ 107 КОЕ, существенное повышение уровня серологического ответа на последующее введение сальмонелл. При изучении влияния пробиотиков Биоспорина и Субалина на функциональную активность макрофагов И.Б. Сорокулова показала их стимулирующее действие на клетки мононуклеарной фагоцитарной системы животных. Стимуляция макрофагов происходила и в опытах на обезьянах при пероральном введении Биоспорина. В более ранней работе этого автора [95] показано, что пероральное применение Субалина обеспечивает защиту 73 % животных при гриппозной инфекции и 65 % - при экспериментальном герпетическом менингоэнцефалите. Реаферон - рекомбинантный человеческий б2-интерферон при таком же применении не оказывал столь высокого защитного действия на животных. Далее, чтобы оценить иммунологическую активность этого штамма, работы были продолжены на добровольцах. В результате их проведения В.М. Бондаренко и В.А. Белявская подтвердили антивирусное действие штамма B.subtilis 2335/рВМВ-105 .

2. Технология производства пробиотиков

В качестве основы для разработки лечебно-профилактических препаратов, перспективных для использования в ветеринарии, привлекают внимание исследователей экологически чистые живые культуры спорообразующих аэробных бактерий из рода Bacillus, что наряду с их полной безвредностью обусловлено высокой антагонистической активностью этих культур в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, продукцией БАВ. Бактерии рода Bacillus широко применяются для производства ферментов, биопрепаратов, средств защиты растений и т.п.

Способность к росту на простых по составу и недорогих средах, высокий выход готового продукта, стабильность при хранении штаммов Bacillus делают их технологичными и позволяют создавать высокоэффективные технологии.

Для более длительного сохранения физико-химических и лечебных свойств пробиотики выпускают в основном в лиофилизированном виде в герметичных ампулах и флаконах. Однако наряду с известными достоинствами такие лекарственные формы пробиотиков не лишены и определенных недостатков: высокие затраты на индивидуальную и транспортную тару; наличие определенных технологических и иных ограничений, приводящих к нерациональному использованию ампул (флаконов) и относительно высокому проценту их выбраковки при производстве и контроле качества; специфические условия применения, отличающиеся рядом особенностей и др.

Большинство недостатков, свойственных производству пробиотиков в ампулах или флаконах, исключит серийный выпуск пробиотиков в порошках, жидкой, таблеточной и других лекарственных формах (ЛФ), упакованных во вмещающие большое количество доз емкости, что позволит применять эти препараты для терапии и профилактики инфекционных заболеваний разных видов сельскохозяйственных животных и птиц.

2.1 Вспомогательные работы

В производственных помещениях предусмотрена эффективная система приточно-вытяжной вентиляции воздуха. Система приточной вентиляции состоит из приточного вентилятора, воздуховода, который имеет воздухораспределительные окна. Система вытяжной вентиляции состоит из вытяжного вентилятора, вытяжных зонтов, и воздуховода с воздухозаборные окнами.

Подготовка производственных помещений состоит из: ежедневной, генеральной уборки и контроля микробной контаминации. Помещение производства лекарственных средств в соответствии с МУ 42-51-3-93 делятся на 4 группы чистоты. В производстве биоспорин используются помещения 2, 3, 4 классов чистоты. Подготовка помещения 2-3 классов частоты включает в себя совокупность мер, которые состоят из влажной уборки, дезинфекции, УФ-облучение пола, стен, потолка и др.. В качестве моющих средств используется "Лотос" и т.п., а в качестве дезинфицирующих средств-пероксид водорода, этанол, хлорамин. В качестве материалов для протирки стен используют поролоновые губки или салфетки с заделанными краями из капроновых тканей. Для протирки полов используют тряпки из суровых тканей. Уборка проводится в специально предназначенных для этого резиновых сапогах, резиновых перчатках, резиновой фартуке, а при необходимости-в респираторе. После уборки инвентарь на протяжении 2-3 часов обеззараживают путем замачивания в растворе Н₂О₂ (6%), растворе хлорамина (4%), или обесцвеченная растворе хлорной извести (5%). Обработка производственных помещений 2 класса чистоты проводится Н₂О₂ (6%) с моющим средством. Ежедневная уборка помещений 3 класса чистоты проводится Н₂О₂ (1%) с моющим средством. По окончании отделки помещения освобождают от персонала и включают настенные и потолочные бактерицидные лампы на 2 часа. Генеральная уборка проводится один раз в 6 дней. При генеральной уборке потолки, двери и другие поверхности очень часто смачивают рабочим раствором из расчета 150-200 мл/мІ и закрывают помещение на 30-60 минут. Определение микробной контаминации воздуха проводится 2 раза в неделю во время производственного процесса и 1 раз в 2 недели непосредственно после обработки помещений дезинфицирующими растворами. Контроль микробной контаминации воздуха осуществляется с помощью аппарата Кротова (открытую чашку Петри с агаризованных средой помещают в аппарат Кротова и отбирают пробу в течение 5-х минут при скорости прохождения воздуха 40 л / мин) или методом седиментации (на 15 мин. Открытые чашки Петри с МПА и средой Сабуро). После отбора проб аппаратом Кротова чашки помещают в термостат и выдерживают 20-30 минут в течение 2 суток при температуре 20-25°С и 30-35°С. После отбора методом седиментации при температуре 20-25°С в течение 3 суток со средой Сабуро и при 37°С в течение 2 суток-с МПА. Допускается не более 50 непроизводственных микроорганизмов на 1мі воздуха для 2 класса чистоты и не более 2 колоний микроорганизмов на одной чашке Петри. Допускается не более 100 непроизводственных микроорганизмов на 1мі воздуха для 3 класса чистоты и не более 5 колоний микроорганизмов на одной чашке Петри.

Подготовка оборудования состоит из: подготовки кассет и контейнеров для мойки и стерилизации ампул, аппарата для мытья ампул, бюретки - дозатора, кассеты для розлива препарата, морозильной камеры сублимационной установки и контроля микробной контаминации техоборудования. Оборудование подлежит обработке, которое непосредственно соприкасается с препаратом: оборудование для приготовления и розлива в ампулы, оборудование для сублимационной сушки препарата и др. В качестве моющих средств используют "Лотос", а в качестве дезсредств - пероксид водорода, спирт. Уборка и дезинфекция оборудования проводят аналогично подготовке помещений. Используемый технологический одежда - комплект одежды из без ворсовой ткани, предназначенный для защиты материалов, полупродуктов или готового продукта от контаминации м/о выделяемого персоналом. Санитарная одежда состоит из халата, тапочек, косынки или шапочки. Обработка технологического одежды включает в себя стирку, высушивания и стерилизацию. Стерилизацию одежды и перчаток проводят в автоклавах (ГФ-13) при 120 давления 1,1 кгс/см 45 минут. Контроль микробной контаминации осуществляется микробиологом ОТК 2 раза в неделю во время производственного процесса в каждом производственном помещении 2-3 класса чистоты избирательно и 1 раз в 2 недели - после стерилизации одежды.

2.2 Подготовка производственных штаммов

При производстве биоспорин используются два штамма Bacillus subtilis 3 и Bacillus licheniformis 31. Все операции осуществляются отдельно с каждым штаммом. Эталоне штаммы были получены из НИИ микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного Киев в лиофилизированном состоянии в ампулах. Ампулы хранят в холодильнике и используют при необходимости в течение 3 лет. Для высева микроорганизмов ампулу разводят в 1 мл физиологического раствора NaCl и высевают на 2-3 чашки Петри с МПА для получения изолированных колоний с последующим инкубирования в термальной комнате (ГФ-17) при +37°С на протяжении 20 часов. По окончании инкубации штамм контролируют визуально на соответствие культуральных признаков при росте на МПА, среде Гаузе-2, морфологию клеток путем микроскопии мазков окрашенных по методу Грама, а также определяют активность в тест-культур.

С целью использования на стадии ТП "Выращивание" маточных "культур" или с целью хранения штаммов, микроорганизмов, отвечающие требованиям, отсеивают из чашки Петри на 10 пробирок со скошенным агаризованных средой (среда Громыко). Пробирки со штаммом инкубируют 20 часов при температуре +37°С в термической комнате. Контроль температуры осуществляется с помощью термометра. Регулируют температуру с помощью термостатического прибора. По истечении времени инкубации микробиологические штаммы контролируют на чистоту посевов путем микроскопии мазков, контролируют по Граму, и посева на чашке Петри с МПА для выявления атипичных колоний.

2.3 Приготовление маточной культуры

Приготовленные на операции производственные штаммы отсеивают на питательную среду Громыко, предварительно приготовленное в бактериологических матрасах. Для приготовления "матрацев" взвесь микроорганизмов на 1 серию препарата, которая состоит из 15000 единиц сеют 6-7 матрасов. Матрасы со штаммами выращивают при +37 (в течение 20 часов в термальной камере. По истечении времени инкубации микробиологические штаммы контролируют на чистоту посевов.

Маточное взвесь каждого штамма для последующего рассева Bacillus subtilis 3 и Bacillus licheniformis 31 на агаризованных пивное сусло готовят порознь. С этой целью с поверхности питательной среды Громыко делают соскоб шпателем микробной пленки, эмульгируют ее в 0,85% растворе NaCl с таким расчетом, чтобы в 1 мл взвесь помещалось 7 млрд. бактерий по оптическому стандарту мутности. При смыве микробной пленки с 1 матраса получается 450 мл "маточной" взвесь, приготовленной в 1 бутылке объемом 450 мл. Штаммы контролируют на чистоту посевов.

2.4 Получение бактериальной массы

Для получения одной серии препарата, которая содержит преимущественно 15000 ампул, использующих биомассу, которую засевают на 250 матрасов с производственной питательной средой (агаризованное пивное сусло). Для того, чтобы засеять вышеуказанное количество матрасов необходимо на стадии приготовить 6-7 бутылок "маточной" взвеси, так как 450 мл микробной взвесь из одной бутылки используется для посева 45-50 матрасов. Перед выполнением всех этих операций на этой стадии матрасы с производственной средой проверяют на Прорист посторонней микрофлоры и при наличии роста посторонней микрофлоры их отбраковывают с последующим обеззараживанием в камере Крупин. Посев "маточной" взвеси на матрасы делается врозь, при этом следует соблюдать соотношение Bacillus subtilis 3 и Bacillus licheniformis 31 соответственно 9:1. В каждый матрас в стерильных условиях вносят 7-10 мл посевного материала, который равномерно распределяется по всей поверхности питательной среды. Матрасы помещают в термическую камеру. Bacillus subtilis 3 инкубируют 10-12 суток при +37. Bacillus licheniformis 31 - 8-10 суток при +37. По окончании срока инкубации матрасы с посевами просматривают в Прорист посторонней микрофлоры: визуально, микроскопией, посевом на чашки Петри с МПА. Из бактериальной массы делают мазки по Граму и микроскопируют их. Слив из матрасов делают только в том случае, если в мазках оказывается не менее 60-80% микроорганизмов в споровой форме.

2.5 Приготовление препарата

Из полученной на стадии биомассы микроорганизмов готовят серию препарата биоспорин. Составные части препарата соединяют в соотношениях Bacillus subtilis 3 на Bacillus licheniformis 31 соответственно 9:1.

Наполнитель (15% сахарозо - желатиновое среда) добавляется с таким расчетом, чтобы концентрация микробных клеток была 100 млрд. клеток в 1 мл. по ОСВ. При этом содержание наполнителя был не менее 1-1,5% в единице препарата. Полученный препарат перекачивают в герметичные баллоны (С-24) под действием вакуума с разряжением 0,03-0.04 МПа и передают в бокс разлива препарата на стадию ТП.6.3 Наполнение ампул.

Биомассу контролируют на соотношение двух штаммов в препарате путем посева взвесь на чашки Петри с МПА.После тщательного перемешивания наполнителя и биомассы делают определения концентрации м/о в 1 мл по ОСО и рассчитывают в каком количестве разливать в ампулы готов препарат (0,8-2,0) с тем, чтобы в ампуле содержалось 100 млрд. кл. Баллоны с раствором препарата (С-24) заносят в бокс разлива предварительно вытерев 76% раствором этилового спирта, устанавливают в защитных чехлах на разливочного столе на баллон краткое очищенный воздух с давлением 0,03-0,04 МПа. В бокс разлива вносят кассеты со стерильными ампулами и кассеты для наполненных переполнения ампул. С помощью бюретки - дозатора идет отражение дозы. Наполненные ампулы помещают вертикально в кассету куда вкладывает 2 этикетки, в которых указано: название препарата, номер серии, дата розлива. По мере заполнения кассеты прикрывают стерильной капроновой-марлевой салфеткой. Края салфетки закрепляют бельевой резинкой. По окончании разлива кассеты передают в передбоксник, где их укладывают в транспортные тележки, которые сверху накрывают марлевым простыней и медицинской клеенкой с последующей передачей на сублимационного высушивания. Препарат контролируют на чистоту: микроскопия мазков, посев на МПА.

Сушку препарата ведут в сублимационных сушильных установках ТГ -50. Сушилка установка состоит из прямоугольного бокса, изготовленного из коррозионного материала с дверью. Оборудована двойной шарнирной подвеской и 2-мя смотровыми окнами, которые служат дополнительно для непосредственного визуального контроля за препаратом. Жидкость под действием замораживания и глубокого вакуума, а впоследствии и температуры сублимируется в виде водяного пара выветривается из ампул. Водяные пары попадают в ледоконденсатор, на пластинах которого температур -60 идет десублимации и осадки в виде инея. Температуру повышают по 3 в час и к 30 часов сушки она достигает +40. При +18 препарат выдерживают 18 часов. Весь процесс длится в течение 48 часов.

По окончании процесса сушки камеру отсекают от вакуумной установки и тушат вакуум. Открывают камеру, выгружают продукцию и передают на запайки.

Запайки проводят в помещении для запайки бакпрепаратов на машине для запайки ампул.

2.6 Упаковка препарата

пробиотик бактерия штамм спорообразующий

После лиофилизации и запайки ампул контроллер ОТК вместе с сотрудником микробиологического цеха производит отбор из серии в количестве 70 ампул для серии около 15000 ампул. Отобранные ампулы контролируют по физико-химическим, биологическим, микробиологическим показателям в соответствии с ФС 42У-200/8-142-97. При соответствии препарата требованиям ампулы передаются на операцию просмотра ампул. Просмотр ампул осуществляется визуально. Визуальный просмотр делается в хорошо освещенном помещении за столом для просмотра. Ампулы складывают в пакеты с запором, в каждый вкладывают этикетку с названием препарата, номер серии, датой пересмотра и передают на маркировку. Маркировка делается на машине АП-20М. На каждую ампулу наносят название препарата на украинском и русском языках, количество доз, номер серии. Ампулы после маркировки размещают в ящиках, которые передают в помещение фасовки. На коробке отмечают "Украина" "ОАО Днепрофарм", его товарный знак и адрес, название препарата на латинском и украинском или на латинском и русском языках, количество доз, ампул, условия хранения, регистрационный номер, штриховой код.

Заключение

Во всем мире наблюдается рост производства пробиотиков, поскольку они все больше интересуют людей, поддерживающих свое здоровье при помощи натуральных средств. Продукция, содержащая пробиотические бактерии, востребована в качестве полезного функционального питания, а также в лечебно-профилактических целях. Лечебно-профилактические препараты из живых коли-, лакто-, бифидобактерий уже почти 80 лет применяются в практическом здравоохранении. Однако их недостаточный антагонизм в отношении некоторых патогенных бактерий и грибов, а также неблагоприятная экологическая обстановка, повлекшая за собой снижение их лечебного действия, подтолкнули ученых к поиску новых, более эффективных микроорганизмов.

Привлекательной оказалась группа спорообразующих бактерий в составе родов Bacillus, Brevibacillus, Clostridium и Sporolactobacillus . Это наиболее древние и широко распространенные в природе сапрофитные микроорганизмы, с которыми на протяжении всей истории своего существования сталкивался человек. Несмотря на то что пробиотические штаммы бацилл являются аллохтонными по отношению к микрофлоре кишечника человека и животных, некоторые полезные свойства делают их важным арсеналом пополнения полезных для здоровья биопрепаратов. Антагонизм в отношении широкого круга патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и самостоятельная элиминация из желудочно-кишечного тракта представляют конструирование лечебно-профилактических препаратов из пробиотических бацилл особенно перспективным. Привлекает также их стимулирующее влияние на пищеварение, противоаллергенное, антитоксическое, санирующее и общеукрепляющее воздействие на организм.

В то же время нет еще четких положений относительно пригодности различных бактерий в качестве компонентов пищевых продуктов либо самостоятельных препаратов. Для большинства стран продукция из категории фармацевтических средств должна удовлетворять всем критериям по эффективности и безопасности. Такой подход направлен на обеспечение потребителей качественной продукцией. Обычно для использования пробиотиков как компонентов диетических добавок или продуктов питания не требуются специальные разрешения, что не дает оснований для доступа на рынок продукции без детальной сертификации ее безопасности. Во всех случаях изготовитель независимо от сфер продаж должен руководствоваться стандартом безопасности на продукт. Для категории фармацевтических средств это вполне оправданно, тогда как для продуктов функционального питания или биодобавок, включающих пробиотические штаммы в незначительных концентрациях, такая оценка безопасности покажется слишком строгой. Многие компании заинтересованы в терапевтическом использовании Bacillus и других спорообразующих бактерий, что предполагает применение этих микроорганизмов в концентрированных дозах. Для получения заключения о безвредности спорообразующих бактерий необходимы в обязательном порядке полноценные испытания всей номенклатуры препаратов.

Потребителей привлекают к своей продукции порой не самыми важными ее свойствами. Так, некоторые производители включают в аннотацию на споросодержащий препарат такое качество, как "стойкий в хранении", и рекламируют его при продаже. Однако это свойство никогда не станет решающим в выборе препарата, если будут хоть какие-то сомнения относительно его эффективности и безопасности. Даже если на продукте будет точно указан штамм, это не всегда может гарантировать его безопасность. Так, кормовая добавка Рaciflor по результатам оценки SCAN ЕС была недавно снята с производства, поскольку в ней присутствовали энтеротоксины Hbl и Nhe. Заключение о риске Рaciflor для здоровья человека было сделано из-за возможности инфицирования людей при забое скота. Интересно, что основой Рaciflor был штамм IP 5832 B.cereus. Этот же штамм указывается и в пробиотике b actisubtil для медицинского применения. В этом препарате le Duc и др. обнаружил лишь Hbl энтеротоксин. Штамм с идентичным обозначением, как предположили авторы, мог представлять производные общего предка, и потеря Nhe энтеротоксина может быть связана с преднамеренной инактивацией гена nheA.

Достаточное количество публикаций убеждает в безопасности и эффективности пробиотиков на основе лактобацилл и бифидобактерий, но даже и среди них имеются небезопасные штаммы. По безопасности для препаратов на основе спорообразующих бактерий Bacillus, Brevibacillus, Clostridium и Sporolactobacillus еще много вопросов, хотя они весьма широко внедрены не только в ветеринарную практику но и в медицину. Поэтому своего продолжения требуют исследования, направленные на развитие доказательной базы безопасности перспективных представителей спорообразующих бактерий с целью их дальнейшего использования в качестве пробиотиков.

Размещено на Allbest.ru