Йодпероксидаза та цитокератин №17 в доопераційній діагностиці папілярного раку щитовидної залози та визначенні резистентності його метастазів до радіойоду

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Йодпероксидаза та цитокератин №17 в доопераційній діагностиці папілярного раку щитовидної залози та визначенні резистентності його метастазів до радіойоду

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Через 4 роки після аварії на ЧАЕС частота захворювань на рак щитовидної залози у дітей України виросла в 4,8 рази, а в наступні роки перевищила доаварійні показники в 10 разів [Богданова Т.І., Козирицький В.Г., Тронько М.Д., 2000]. Встановлення вірного діагнозу на ранній стадії захворювання та своєчасне оперативне втручання є важливою умовою успішного лікування тиреоїдного раку. Найкращі результати на сьогоднішній день забезпечує доопераційна цитологічна діагностика (ДЦД) пунктатів щитовидної залози, отриманих за допомогою тонкогольчастої аспіраційної пункційної біопсії (ТАПБ) під контролем сонографії. Цей мінімально інвазивний метод має приблизно таку ж точність виявлення злоякісних новоутворень, як і інтраопераційне експрес-гістологічне дослідження [Hamming J.F., Vriens M.R., Goslings B.M., Songum I., Fleuren G.J., van de Velde C.J., 1998, Болгов М.Ю., Комиссаренко И.В., Богданова Т.И., 1999].

1. Доведено, що цитохімічне визначення активності йодпероксидази в клітинах з пунктатів пухлин щитовидної залози дозволяє ефективно визначати малігнізацію фолікулярного епітелію.

2. Встановлено, що клітини, які містять цитокератин №17 відрізняються від відомих типів епітеліальних клітин паренхіми щитовидної залози відсутністю або низьким рівнем експресії функціонально важливих антигенів, у тому числі тих, що приймають участь у процесах окислення та органіфікації йоду.

3. Встановлено, що експресія цитокератину 17, яка відбувається при малігнізації тиреоїдного епітелію, асоціюється з втратою здатності клітинами метастазів папілярного раку щитовидної залози зв'язувати радіоактивний йод.

4. Встановлено, що на підставі визначення вмісту клітин з експресією цитокератину 17 в загальній популяції тиреоцитів у пунктатах папілярних карцином можна прогнозувати появу метастазів, нечутливих до радіойоду.

Практичне значення одержаних результатів.

1. Результати цитохімічного дослідження йодпероксидазної активності в фолікулярному епітелії пунктатів новоутворень щитовидної залози дозволили розробити спосіб доопераційної диференційної діагностики злоякісних та доброякісних тиреоїдних пухлин, який може бути використаний в практичній цитології (Патент №70269 А).

2. Результати імуноцитохімічних досліджень експресії цитокератину 17 в тиреоїдному епітелії гістологічного та пункційного матеріалу довели можливість його використання в якості маркеру малігнізації в доопераційній диференційній цитологічній діагностиці карцином та аденом (Патент №36880 А).

3. Результати цитоморфологічних та імуноцитохімічних досліджень пунктатів метастазів папілярного раку щитовидної залози дозволили визначити імуноцитохімічну ознаку (експресію цитокератину 17), на підставі якої розроблено цитологічний метод доопераційного прогнозування появи резистентності до радіойодтерапії (Патент №14863 А). Прогнозування ефективності радіойодтерапії розробленим способом на етапі доопераційної діагностики необхідне для кожного пацієнта і важливе для ендокринологів, хірургів, радіологів.

Одержані результати при використанні в практичній роботі можуть значно поліпшити точність диференційної доопераційної діагностики злоякісних новоутворень щитовидної залози.

Результати досліджень впроваджені в роботу клініки Інституту ендокринології та обміну речовин ім.В.П. Комісаренка АМН України, Київської міської ендокринологічної лікарні №1, клініки лікарні «Міськбуд», Сумського обласного онкологічного диспансеру, Київських клінік «Медиком» та «Добробут».

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблений план досліджень, обрані відповідні методи, проведений аналіз отриманих результатів. Дисертантом самостійно модифікований та адаптований для використання на пунктатах щитовидної залози цитохімічний метод виявлення йодпероксидазної активності та проведені дослідження експресії цитокератину 17 при малігнізації та при втраті здатності тироцитів до зв'язування радіойоду. Самостійно розроблені спосіб диференціальної цитологічної діагностики раку щитовидної залози за допомогою цитохімічного визначення активності йодпероксидази в пунктатах та спосіб прогнозування ефективності лікування радіойодтерапією папілярного раку щитовидної залози в залежності від вмісту клітин з цитокератином 17 в пунктатах.

Дослідження експресії цитокератину №17 в новоутвореннях щитовидної залози проведені за участю Ю.М. Божка. Аналіз залежності ефективності радіойодтерапії від експресії цитокератину 17 проведений у відділенні радіойодтерапії Інституту ендокринології та обміну речовин АМН України (завідувач - Епштейн О.В.). Патогістологічні діагнози досліджених новоутворень встановлені в лабораторії морфології ендокринної системи (завідувач - д.м.н., проф. Богданова Т.І.) та в патологоанатомічному відділенні клініки (завідувач - к.м.н. Черній Я.М.).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень оприлюднено на конференції молодих вчених (Київ, 1999 р.), на ІІ з'їзді онкологів країн СНД (Київ, 23 - 26 травня 2000 р.), на ІV з'їзді ендокринологів України (Київ, 23 - 25 травня 2001 р.), другому конгресі фахівців ультразвукової діагностики (Київ, 13-15 червня 2004 р), науково-практичному семінарі «Цитологічна діагностика новоутворень щитовидної залози. Досягнення і проблеми.» (Київ, 13-16 грудня 2006 р.)

Основний зміст роботи

радіойод щитовидний рак тиреоглобулін

Матеріали і методи досліджень. В роботі використано патогістологічний та пункційний матеріал пацієнтів чоловічої та жіночої статі, що проходили обстеження та хірургічне лікування в клініці Інституту ендокринології та обміну речовин АМН України. Вік пацієнтів коливався від 8 до 65 років.

Дослідження були проведені на матеріалі 141 злоякісного новоутворення та 86 доброякісних новоутворень щитовидної залози.

Гістохімічні та імуноцитохімічні дослідження проводили на заморожених зрізах пухлин щитовидної залози, видалених в результаті операцій. Серед них було: папілярних карцином - 21, фолікулярних карцином - 3, вузлових зобів - 11, фолікулярних аденом - 16, кіст - 4, дифузних зобів - 4, фрагментів нормальної тканини - 4.

Цитоморфологічні, цитохімічні та імуноцитохімічні дослідження проводили на матеріалі, отриманому в результаті тонкоголкових аспіраційних пункційних біопсій та на відбитках тканин, отриманих в результаті операції. Серед них - 80 папілярних карцином, 4 фолікулярні карциноми, 3 низькодиференційовані карциноми, 4 медулярні карциноми, 18 фолікулярних аденом, 33 вузлових зоби, 26 метастазів папілярних карцином щитовидної залози.

Цитоморфологічні дослідження матеріалу пункційних біопсій проводили на мазках‚ фіксованих метанолом та пофарбованих за стандартним методом Май-Грюнвальда - Гімза [Лилли Р., 1969].

Гістохімічні та імуногістохімічні дослідження тканин новоутворень виконували на кріостатних зрізах товщиною 14 мкм.

Для проведення імуноцитохімічних реакцій використовували фіксацію метанолом протягом 5 хвилин. Для виявлення неспецифічної естерази, проводили фіксацію в парах формальдегіду на протязі 2 хвилин. Для визначення активності йодпероксидази та сукцинатдегідрогенази використовували нефіксовані зрізи. Для цитохімічного та імуноцитохімічного дослідження матеріалу, отриманого в результаті тонкоголкових аспіраційних пункційних біопсій новоутворень щитовидної залози, готували мазки на зразок гематологічних мазків крові та фіксували або використовували нефіксовані мазки в залежності від вимог методу визначення тих чи інших речовин.

Визначення активності ферментів. Визначення активності сукцинатдегідрогенази проводили на нефіксованих мазках матеріалу пункційних біопсій або кріостатних зрізах пухлин тетразолієвим методом Лойда [Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т., 1982].

Визначення активності неспецифічної естерази проводили на кріостатних зрізах‚ фіксованих у парах формальдегіду протягом 2 хвилин методом Лойда (азосполучення з нафтолом AS-MX ацетатом) [Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т., 1982].

Для визначення активності йодпероксидази використовували нефіксовані кріостатні зрізи, відбитки тканин новоутворень щитовидної залози або мазки матеріалу тонкоголкових пункційних біопсій. Активність ферменту визначали бензидиновим методом [Лилли Р., 1969].

Імуноцитохімічні методи. Імуноцитохімічні реакції проводили непрямим імунопероксидазним методом із використанням у другому шарі мічених пероксидазою антитіл проти гама-глобулінів миші чи кроля (Dako Cytomation, Данія) - відповідно до перших антитіл. Для пригнічення ендогенної пероксидази препарати обробляли 1% розчином Н₂О₂ у фосфатному буфері (рН 7‚2) протягом 30 хвилин. Пероксидазну активність проявляли за допомогою 3,3'діамінобензидину (ДАБ) [Угрюмов М.В., 1991].

Для визначення на одному й тому ж зрізі 2 антигенів проводили подвійну імунопероксидазну реакцію. Для цього перший антиген виявляли звичайним способом (продукт реакції брунатного кольору). Потім на тому ж препараті виявляли другий антиген‚ але у розчин ДАБ додавали CoCl₂ (продукт реакції сіро-блакитного кольору). В усіх випадках ставили необхідні негативні та позитивні контрольні реакції. Для ідентифікації у тих самих структурах ферментів і антигенів‚ їх виявлення проводили на двох послідовних серійних зрізах [Угрюмов М.В., 1991].

В роботі були використані моноклональні антитіла проти антигенів людини: тиреоглобуліну (клон RBU/01, Sigma; клон DAK-Tg 6, Dako Cytomation, Данія), Pan Cytokeratin (Sigma), цитокератинів 8 та 17 (клони Н1 та Е3, Онкологічний центр РАМН, Москва), епітеліальних глікопротеїнів м.м. 34кД та 49кД (клон Ber-Ep4, Dako Cytomation), РЕА (клон G5 ОНЦ РФ). Також використовували поліклональні антитіла проти кальцитоніну Dako - Calcitonin (Dako Cytomation).

Статистичне опрацювання даних робили за непараметричним методом Колмогорова-Смирнова [Гублер Е.В. и др., 1973]‚ та Манна-Уітні [Кремер Г.Ф., 2000].

Результати досліджень та їх обговорення.

Розробка способу цитохімічного визначення активності йодпероксидази на матеріалі тонкоголчастих пункційних біопсій новоутворень щитовидної залози.

Відомим маркером малігнізації тиреоїдного епітелію є йодпероксидаза. Сучасні біохімічні та імуноцитохімічні дослідження свідчать про зменшення експресії йодпероксидази в злоякісних новоутвореннях щитовидної залози у порівнянні з доброякісними [Mizukami Y., 1981; Fragu P., 1977; De Micco C., 1991]. Тому визначення активності йодпероксидази може бути використане в доопераційній діагностиці карцином щитовидної залози в якості негативного маркеру малігнізації [Fragu P., Nataf B.M., 1977; Takamatsu J., Hosoya T., Tsuji M, 1992].

Але ж виникає питання про придатність існуючих методів виявлення йодпероксидазної активності в доопераціній цитологічній діагностиці.

Біохімічний метод є найбільш точним методом визначення активності ферменту. Але ж його неможливо пристосувати для доопераційної цитологічної діагностиці, оскільки для здійснення цього методу необхідна значна кількість матеріалу. В той же час матеріалу, отриманого в результаті тонкогольчастої аспіраційної пункційної біопсії недостатньо.

Імуноцитохімічний метод виявлення йодпероксидази використовують в деяких лабораторіях світу, але ж він має певні недоліки [Henry J.F., 1994; De Micco., 1991]. По-перше, цей метод дозволяє виявляти лише наявність окремих детермінант антигену-йодпероксидази, а не її активність, зміни якої відбуваються при малігнізації. По-друге, висновки про малігнізацію новоутворення базуються на визначенні процентного вмісту епітеліальних клітин з йодпероксидазною активністю в пункційному матеріалі. В той же час, імуноцитохімічне виявлення йодпероксидази проводять на нефіксованих та незабарвлених препаратах, що не дозволяє об'єктивну ідентіфікацію епітеліальних клітин. Неможливо виключити з підрахунків неепітеліальні клітини, наприклад макрофаги, які теж мають йодпероксидазну активність, вміст яких в деяких пухлинах сягає 50% всіх клітин [Божок Ю.М. и др., 1997]. За таких умов важко отримати об'єктивні показники вмісту клітин з йодпероксидазою в загальній популяції епітеліоцитів пухлини та зробити висновки щодо малігнізації новоутворення. Крім того, для здійснення цього методу необхідні коштовні реактиви [Henry J.F., Denirot A., Porcelli A., 1994; De Micco C., 1991].

Активність йодпероксидази може бути визначена також гісто - або цитохімічно.

Найбільш перспективним методом визначення йодпероксидазної активності в пунктатах є цитохімічний метод. Він виявляє саме активність ферменту, не потребує підрахунків клітин та коштовних реактивів.

Але ж поодинокі спроби цитохімічного визначення йодпероксидазної активності в матеріалі ТАПБ новоутворень щитовидної залози були невдалими [Smejkalova E.‚ Smejkal V, 1977; Кудинський Ю.Г., 1973].

В результаті нашої роботи була запропонована нова модифікація цитохімічного бензидинового методу визначення йодпероксидази, яка дозволила виявлення її активності в пункційному матеріалі

доброякісних та злоякісних новоутворень щитовидної залози. При цьому нам вдалося позбутися недоліків методу Ван-Дейна, який ми брали за основу при розробці нашої методики [Штанге М.Б., 1962]. Так, при зміненні способу розчинення бензидину ми позбавилися кристалічного осаду та артефактного пофарбування ядер клітин. Введення до інкубаційної суміші буферу зі стабільним рН дозволило стабілізувати умови реакції та досягнути постійного яскравого пофарбування цитоплазми тироцитів. Введення обробки препарату буфером перед проведенням реакції ліквідувало проблему пофарбування еритроцитів замість цитоплазми тироцитів. Обробка препарату 1% розчином NH₄Mo посилила інтенсивність реакції.

Таким чином, нам вдалося розробити таку модифікацію цитохімічного бензидинового методу, яка дозволила ефективне визначення йодпероксидазної активності в пункційному матеріалі новоутворень щитовидної залози.

Цитохімічне визначення йодпероксидазної активності в доопераційній цитологічній діагностиці.

Розроблений спосіб визначення йодпероксидази дав нам змогу цитохімічно визначити наявність її активності на цитологічних препаратах, отриманих під час пункційних біопсій новоутворень щитовидної залози пацієнтів, які згодом були прооперовані. Згідно із патогістологічним післяопераційним діагнозом, 30 з них мали карциноми (26-папілярні, 3-фолікулярні та 1 анапластична), 26 - аденоматозні вузлові зоби та 7 фолікулярних аденом.

В пунктатах 88% доброякісних новоутворень щитовидної залози (29 з 33), практично всі епітеліальні клітини яскраво фарбувалися, що свідчило про високу активність йодпероксидази в їх цитоплазмі. В 4-х з 33-х (12%) випадках йодпероксидазна активність була виявлена не в усіх епітеліальних клітинах. В цих випадках був поставлений гістологічний діагноз - фолікулярна аденома мікрофолікулярної будови.

В той же час, епітеліальні клітини з йодпероксидазною активністю не зустрічалися в пунктатах 67% карцином (у 20-ти з 30 випадків). Серед інших 10 (33%) випадків досліджених карцином, були знайдені лише поодинокі клітини, що проявляли йодпероксидазну активність.

Таким чином, за допомогою адаптованого нами методу цитохімічного виявлення йодпероксидази в пунктатах, було доведено, що в більшості доброякісних новоутворень всі епітеліальні клітини пластів демонстрували йодпероксидазну активність. Навпаки, серед 30 карцином не зустрілося жодної, в пунктаті якої йодпероксидазну активність мали б усі клітини тиреоїдного епітелію.

При відсутності йодпероксидазної активності в пунктаті - велика ймовірність злоякісного характеру новоутворення.

Це дозволяє вважати метод цитохімічного виявлення йодпероксидази в пунктатах корисним в доопераційній цитологічній диференційній діагностиці раку щитовидної залози. У випадках, коли в пунктатах досліджуваного новоутворення щитовидної залози всі клітини пластів тиреоїдного епітелію містять йодпероксидазу, слід вважати новоутворення доброякісним.

Всі випадки, в яких у відповідності до результатів йодпероксидазної реакції в пунктатах ми надали заключення «папілярна карцинома», були підтверджені післяопераційним патоморфологічним діагнозом. В 20% від усіх випадків папілярних карцином нам вдалося діагностувати карциному на доопераційному етапі, внаслідок відсутності йодпероксидазної реакції в пунктатах, коли лише цитологічні ознаки були недостатніми (були відсутні внутрішньоядерні включення).

Таким чином, нами був запропонований спосіб доопераційної діагностики папілярного раку щитовидної залози за допомогою цитохімічного визначення йодпероксидазної активності в пунктатах новоутворень щитовидної залози, який був запатентований та впроваджений у практику (патент №70269А від 15.09.2004, Бюл. №9.).

Досить високі показники точності позитивного передбачення (100%), специфічності (88%) та чутливості (70%) методу ще раз свідчать про його корисність.

До переваг цього методу відноситься, крім того, те, що він дозволяє виявляти саме йодпероксидазну активність, та не потребує підрахунку клітин. Важливо також те, що метод дозволяє обходитися без коштовних реактивів.

Використання цитохімічного визначення йодпероксидазної активності в пунктатах є особливо доцільним в складних для цитологічної діагностики випадках, коли пунктати папілярних карцином не містять повного комплексу цитоморфологічних ознак малігнізації (наприклад внутріншньоядерних псевдовключень).

Пошук цитоморфологічних проявів нечутливості до радіойоду.

За даними літератури, від 7 до 30% метастазів папілярного раку щитовидної залози не піддаються радіойодтерапії [Pacini F., 1994; Mazzaferri E.L, 2001]. Відсутність або втрата здібності клітин щитовидної залози до зв'язування радіойоду є основною причиною смерті хворих з папілярним раком щитовидної залози [Batge B., 1992]. Якщо процент смертності хворих на рак щитовидної залози з поодинокими метастазами складає 3,6%, то для хворих з чисельними віддаленими метастазами цей процент складає 27,6% [Pacini F., 1994; Price D.C., 1994; Robbins R., Drucker W., 2001]. Тому дуже важливим є вивчення біології таких метастазів та прогнозування їх появи. Вкрай актуальним є визначення можливості прогнозування ефективності радіойодтерапії на матеріалі доопераційних біопсій, оскільки від цього може залежати тактика хірургічного втручання та подальшого лікування.

В літературі досі не існує чіткого уявлення про фенотипічні прояви втрати здатності до зв'язування радіойоду клітинами папілярних карцином щитовидної залози, що спонукало нас провести морфологічне дослідження пунктатів метастазів папілярного раку, які не піддавалися радіойодтерапії.

Дослідження проведено на матеріалі пункційних біопсій метастазів папілярного раку щитовидної залози, які були резистентні до радіойоду, отриманих від 20 пацієнтів.

За даними деяких авторів, наявність фолікулів з колоїдом є обов'язковою умовою чутливості метастазу до радіойоду [Batge B., 1992., Kodama T., 1988]. Але ж, ми знаходили фолікули з колоїдом та колоїдні краплини в пунктатах 30% досліджуваних метастазів папілярних раків щитовидної залози, резистентних до радіойоду. Тобто, наявність такої морфологічної структури, як фолікули, які містять колоїд, не визначає здатність метастазу до зв'язування радіойоду.

Аналіз цитоморфологічної картини пунктатів таких метастазів, показав, що загалом не було знайдено жодної унікальної цитологічної ознаки, спільної для всіх пухлин, що не піддавалися радіойодтерапії. В пунктатах таких метастазів зустрічалися різні за цитологічними ознаками типи клітин папілярної карциноми. Таким чином, втрата здатності до зв'язування радіойоду клітинами папілярного раку щитовидної залози є ознакою, яка не пов'язана з яким-небудь специфічним фенотипичним проявом.

Однак, звертає увагу той факт, що процентний вміст незруйнованих епітеліальних клітин в пунктатах метастазів папілярних раків, резистентних о радіойоду (3-50%) нижчий, ніж цей показник в пунктатах загальної популяції папілярних карцином (93%). Це спостереження може бути проявом цитоморфологічних особливостей популяції клітин таких метастазів та потребує подальшого вивчення.

Крім того, слід зазначити, що така морфологічна структура, як комплекс Нєхорошкова (компекс вакуолізованих клітин, розташованих коло псамомних тілець), зустрічалася в пунктатах метастазів, резистентних до радіойоду в 3,5 рази частіше, ніж в пунктатах загальної популяції папілярних карцином щитовидної залози [Божок Ю.М., 2004]. Можливо, ці комплекси Нєхорошкова, які спостерігаються на кріостатних зрізах дифузно-склерозуючого варіанту папілярних карцином, є проявом того, що саме цей варіант папілярного раку щитовидної залози частіше дає метастази, резистентні до радіойоду.

Пошук імуноцитохімічних особливостей клітин метастазів, нечутливих до радіойоду. Тиреоглобулін в пунктатах метастазів, які не зв'язують радіойод.

Відомо, що тиреоглобулін є субстратом, з яким зв'язується радіойод в процесі синтезу тиреоїдних гормонів [Шрейбер В., 1987]. Якщо для всіх клітин фолікулярного епітелію нормальної щитовидної залози є характерною інтенсивна імуноцитохімічна реакція з антитілами до тиреоглобуліну, то в клітинах папілярної карциноми спостерігається зниження вмісту тиреоглобуліну та гетерогенність його розподілу в межах пухлини - від інтенсивної реакції в фолікулярних ділянках пухлини до слабо позитивної та негативної в клітинах солідних зон [Богданова Т.И. и др., 2000]. В метастазах папілярного раку щитовидної залози в лімфатичні вузли описана аналогічна картина розподілу тиреоглобуліну. Можливо, зниження чутливості метастазів папілярного раку солідної будови до радіойоду може бути обумовленим саме зниженням вмісту тиреоглобуліну в пухлинах.

На сьогодняшній день не було проведено досліджень на достатній кількості матеріалу відносно вмісту та розподілу тиреоглобуліну в тканинах йодрезистентних метастазів папілярного раку щитовидної залози. Тому ми вирішили провести імуноцитохімічне виявлення тиреоглобуліну в пункт атах метастазів папілярного раку щитовидної залози, які були резистентними до радіойоду.

Імуноцитохімічні дослідження пунктатів метастазів папілярних карцином щитовидної залози, резистентних до радіойоду показали, що вміст клітин з тиреоглобуліном варіює від пухлини до пухлини. В 3-х з 10-ти випадків зустрічалися лише поодинокі клітини, що містили тиреоглобулін. У 3-х пацієнтів вміст клітин з тиреоглобуліном складав 27-79%. У решті 4-х пацієнтів майже всі клітини містили детермінанти тиреоглобуліну.

Отримані в цьому дослідженні результати, як і дані досліджень розподілу тиреоглобуліну на гістологічному матеріалі, показують, що зменшення вмісту, або відсутність імунореактивного тиреоглобуліну в метастазах папілярних карцином, не корелює з їх здатністю зв'язувати радіойод. Таким чином, експресія тиреоглобуліну в клітинах папілярного раку щитовидної залози не може бути фактором прогнозу резистентності до радіойоду.

Дослідження експресії цитокератину 17 в клітинах пунктатів метастазів, резистентних до радіойоду.

Наші попередні дослідження, виконані на матеріалі хірургічно видалених злоякісних і доброякісних новоутворень щитовидної залози, показали, що малігнізація фолікулярного епітелію супроводжується значним збільшенням експресії одного з цитоскелетних білків епітеліальних клітин - цитокератину 17 (середній відсоток 0,39% - в доброякісних утвореннях і 30,85% - в злоякісних). [Божок Ю.М., Зелинская А.В., 1994].

Ця закономірність проявляється і на матеріалі пункційних біопсій. При підрахунку відсотку клітин з експресією ЦК 17 у загальній популяції клітин фолікулярного епітелію було знайдено статистично достовірну різницю (р<0,001) між вмістом клітин з ЦК 17 у пунктатах доброякісних (середній процент 0,03%) та злоякісних пухлин (середній процент 7,77%) [Зелинская А.В.‚ Божок Ю.М, 2000].

За матеріалами цих досліджень запатентовано «Спосіб доопераційної діагностики злоякісних новоутворень щитовидної залози, що базується на виявленні клітин з ЦК 17 у матеріалі пункційних біопсій (патент №36880 А).

В наших роботах також було показано, що клітини, які містять цитокератин 17, не проявляють активності ферментів, та майже не містять антигенів, характерних для А-, Б - та С-клітини паренхими щитовидної залози.

Клітини, які експресують цитокератин 17, не містять притаманних фолікулярним та парафолікулярним тироцитам епітеліальних глікопротеїнів. В цих клітинах не знайдені властиві С-клітинам кальцитонін та раково-ембріональний антиген. Клітини, які реагують з антителами до цитокератину 17, не містять властивого А-клітинам щитовидної залози ферменту - йодпероксидази. Крім того, переважна більшість цих клітин не реагує з антитілами до тиреоглобуліну, який також є маркером А-клітин. Але ж, наряду з цим, зустрічалися клітини, які дуже слабко фарбувалися одночасно антитілами до цитокератину 17 та тиреоглобуліну. Наявність таких «перехідних форм» клітин дає можливість припустити, що клітини з експресією цитокератину 17 генетично пов'язані саме з А-клітинами. Можливо, з початком експресії цитокератину 17 у фолікулярних клітинах щитовидної залози припиняється продукція тиреоглобуліну. [Божок Ю.М., Зелинская А.В., 1994, Зелинская А.В., Божок Ю.М., 2000].

Зважаючи на відсутність в клітинах, які містять цитокератин 17 антигенів, причетних до зв'язування радіойоду (йодпероксидази та вкрай низької експресії тиреоглобуліну), можна припустити, що популяція цих клітин може бути одним з факторів, що обумовлюють резистентність метастазів папілярного раку щитовидної залози до радіойодтерапії. Тому наступним етапом нашого дослідження було визначення вмісту клітин, які зв'язують антитіла до цитокератину 17 в популяції епітеліальних клітин метастазів папілярних карцином щитовидної залози, які були резистентними до радіойоду.

Для цього було проведено імуноцитохімічне дослідження за допомогою моноклональних антитіл до цитокератину 17 пунктатів метастазів папілярного раку щитовидної залози, нечутливих до радіойоду. Дослідження показало, що клітини, які експресують цитокератин 17, складають значний процент від загальної популяції тироцитів пунктату радіойодрезистентних метастазів (від 3 до 100%). (Рис. 2).

Якщо пухлинні клітини, які містять цитокератин 17, можуть впливати на чутливість метастазів до радіойодтерапії, то у випадках папілярних карцином з високим вмістом цитокератину 17, такі метастази повинні розвиватися частіше, ніж у випадках з малим відсотком клітин з експресією цитокератину 17. Інакше кажучи, можна очікувати, що ефективність радіойодтерапії за умов папілярних карцином з різним вмістом цитокератину 17, буде різною. Для того, щоб перевірити це припущення, були проведені наступні дослідження.

Пацієнти, прооперовані з приводу папілярного раку щитовидної залози, які проходили обстеження та лікування за допомогою радіойоду, були розподілені на дві групи в залежності від ефективності радіойодтерапії. В усіх випадках в пунктатах первинної пухлини було проведено імуноцитохімічне виявлення цитокератину 17 за допомогою непрямої імунопероксидазної реакції з використанням моноклональних антитіл.

До першої групи були включені пацієнти, які отримали лише одну лікувальну дозу радіойоду, та на протязі 5-10 років спостереження не мали рецидівів раку щитовидної залози. До другої групи увійшли пацієнти, які отримали від 2-х до 7-ми лікувальних курсів радіойодтерапії, та у яких виявлялись поодинокі або чисельні метастази папілярного раку в лімфовузли шиї, легені, середостіння.

Виявилось, що в пунктатах первинної пухлини пацієнтів першої групи у 10 з 14 пацієнтів не було знайдено клітин з цитокератином 17. В пунктатах інших 4-х пацієнтів відсоток цих клітин складав 1-4,7% від загальної популяції епітеліальни клітин пунктату.

На відміну від першої групи, в пунктатах пацієнтів другої групи процентний вміст клітин з цитокератином 17 був значно вищим. У 67% пацієнтів цієї групи, процентний вміст клітин, що реагували з цитокератином 17 в пунктатах складав від 5 до 100%.

У 90% пацієнтів другої групи, в пунктатах первинної пухлини яких процентний вміст клітин з цитокератином 17 був найбільш високим та складав 55-100%, спостерігався розвиток чисельних метастазів папілярного раку щитовидної залози, які зникали лише після 5-7 лікувальних курсів радіойодтерапії, а в 4-х випадах - не піддавалися лікуванню радіойодом та були видалені хірургічно. Важливо відмітити, що останні 4 пацієнти мали дифузно-склерозуючий варіант папілярної карциноми щитовидної залози, всі епітеліальні клітини якої містили цитокератин 17.

Математична обробка за методом Колмогорова-Смирнова та Манна-Уітні показала, що різниця за процентним вмістом клітин з цитокератином 17 в пунктатах папілярного раку щитовидної залози між двома групами пацієнтів з різною ефективностю радіойодтерапії, є статистично підтвердженою (р< 0,05).

Як бачимо, радіойодтерапія є більш ефективною для пацієнтів з папілярним раком щитовидної залози, в пунктатах первинної пухлини яких процентний вміст клітин з цитокератином 17 менший 5%. У більшості таких хворих не розвивалися рецидиви папілярного раку та для їх вилікування було достатньо одного курсу радіойодтерапії. На відміну від цього, в 67% випадків у хворих, в пунктатах первинної пухлини яких процент клітин з цитокератином 17 перевищував 5%, розвивалися метастази папілярного раку щитовидної залози, для зникнення яких необхідно було 5-7 курсів радіойодтерапії, або з'являлися метастази, нечутливі до радіойоду.

Таким чином, цитокератин 17 може бути розглянутий, як прогностичний фактор ефективності радіойодтерапії. Якщо процентний вміст клітин з цитокератином 17 в пунктаті папілярного раку щитовидної залози перевищує 5%, можна прогнозувати ускладнення в лікуванні радіойодом, аж до появи метастазів, не чутливих до радіойоду.

На основі отриманих нами даних запатентовано спосіб прогнозування ефективності радіойодтерапії за процентним вмістом клітин з цитокератином 17 в пунктаті папілярного раку щитовидної залози (патент №14863). Цей спосіб є простим у виконанні та дозволяє прогнозувати чутливість папілярного раку до радіойоду ще на етапі пункційної біопсії, тобто до хірургічного втручання з вірогідністю 67%. Доречно згадати, що запропонований раніше метод прогнозування зв'язування радіойоду за наявністю протеїну - натрій-йод симпортеру здійснюється на післяопераційному матеріалі, а точність прогнозування появи метастазів, що нечутливі до радіойоду, складає 46% [Min J.J., 2001].

Важко пояснити фізіологічні причини існування кореляції між резистентністю до радіойойдтерапії та експресією цитокератину 17. Однак, в літературі знайдені поодинокі повідомлення про зміни в організації цитоскелету, які здійснюються в тироцитах в процесі захвату йоду тироцитами [Takasu N., Ohno S., Takasu M, 1988]. Для більш глибокого розуміння кореляції між експресією цитокератіну 17 та чутливістю до радіойоду, необхідні подальші дослідження біології цих клітин, виконані на матеріалі великої кількості хворих.

Таким чином, проведені дослідження показали, що в якості нових ефективних маркерів малігнізації в доопераційній цитологічній діагностиці можуть бути використані цитокератин 17 (імуноцитохімічний маркер) та йодпероксидаза (цитохімічний маркер).

Крім того, в результаті цитоморфологічного та імуноцитохімічного досліджень клітин пунктатів метастазів папілярного раку щитовидної залози, які нечутливі до радіойоду, вдалося встановити, що експресія цитокератину 17 асоціюється як з малігнізацією, так і з втратою здатності тиреоїдного епітелію до зв'язування радіойду.

На основі цих даних розроблений спосіб прогнозування появи метастазів папілярного раку щитовидної залози, резистентних до радіойоду за допомогою визначення проценту клітин, які експресують цитокератин 17 в пунктатах первинних пухлин.

Висновки

1. Отримані наукові результати дають нові уявлення про зміни активності йодпероксидази, які відбуваються при малігнізації клітин щитовидної залози, та зміни складу білків цитоскелету тиреоцитів, що відбуваються при втраті ними чутливості до радіоактивного йоду. Це дозволило розробити нові методи прогнозування появи метастазів папілярного раку, нечутливих до лікування радіоактивним йодом та підвищити ефективність доопераційної цитологічної діагностики новоутворень щитовидної залози.

2. Встановлено, що цитохімічне визначення активності йодпероксидази в клітинах з пунктатів пухлин щитовидної залози, дозволяє встановити малігнізацію фолікулярного епітелію, на основі чого розроблено спосіб доопераційної диференційної діагностики злоякісних та доброякісних тиреоїдних пухлин.

3. Цитологічні особливості та експресія тиреоглобуліну в клітинах папілярного раку щитовидної залози не можуть бути фактором прогнозу резистентності до радіойодтерапії.

4. Доведено, що в папілярних карциномах та їх метастазах, нечутливих до лікування радіойодом, збільшується процентний вміст епітеліальних клітин, що експресують цитокератин №17.

5. Встановлено, що клітини, які містять цитокератин №17, відрізняються від відомих типів епітеліальних клітин паренхіми щитовидної залози відсутністю або низьким рівнем експресії функціонально важливих антигенів, у тому числі тих, що приймають участь у процесах окислення та органіфікації йоду.

6. Встановлено кореляцію між вмістом клітин з експресією цитокератину 17 в пунктатах папілярних карцином та ефективністю радіойодтерапії їх метастазів. Це дозволяє при вмісті таких клітин більше за 5% прогнозувати появу метастазів, резистентних до радіойоду з вірогідністю 67%.

Практичні рекомендації

1. При відсутності в клітинах пунктатів новоутворень щитовидної залози повного комплексу цитоморфологічних ознак злоякісності, для встановлення правильного цитологічного діагнозу, слід застосовувати імуноцитохімічні (цитокератин №17) та цитохімічні (йодпероксидаза) маркери малігнізації.

2. Рекомендується з метою прогнозування ефективності застосування радіойодтерапії, імуноцитохімічно визначати в пунктатах первинних пухлин вміст клітин з експресією цитокератину 17. При вмісті таких клітин вище за 5%, слід повідомляти клініцистів про можливість появи метастазів, резистентних до радіойоду з вірогідністю у 67%.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Зелинская А.В.‚ Божок Ю.М. Использование иммуноцитохимического выявления детерминант цитокератина №17 в дооперационной цитологической диагностике злокачественных новообразований щитовидной железы // Онкология. - 2000. - Т. 2‚ №1-2. - С. 56-60. (Автором самостійно здійснювались аналіз літератури, планування експериментів, проводились імуноцитохімічні та цитоморфологічні дослідження, аналіз отриманих результатів).

2. Божок Ю.М, Зелинская А.В, Васько В.В. Клетки, экспрессирующие детерминанты цитокератина 17, в злокачественных и доброкачественных новообразованиях щитовидной железы человека // Экспериментальная онкология. - 1994. - Т. 16, №2-3. - С. 154-158. Автор приймала участь у плануванні експериментів, проводила імуногістохімічні та імуноцитохімічні дослідження, приймала участь у аналізі та узагальненні отриманих результатів.

3. Божок Ю.М.‚ Зелінська Г.В.‚ Кулініченко Г.М.‚ Устименко Г.Я. Маркери малігнізації в сучасній доопераційній цитологічній діагностиці карцином щитоподібної залози (огляд літератури і власні дані) // Ендокринологія. - 2003. - Т.8, №1. - С. 99-111. Автором здійснювались: пошук літератури за темою, участь у цитоморфологічних та імуноцитохімічних дослідженнях, узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті.

Размещено на Allbest.ru