Експериментально-морфологічна оцінка печінки при алкогольних інтоксикаціях в умовах впливу ендотоксину та антиоксидантної корекції

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського

УДК 616.36+616.89-008-08:663.252.6

14.03.01 - нормальна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Експериментально-морфологічна оцінка печінки при алкогольних інтоксикаціях в умовах впливу ендотоксину та антиоксидантної корекції

Захарова Ганна Миколаївна

Сімферополь - 2007

Анотація

Захарова Г.М. "Експериментально-морфологічна оцінка печінки при алкогольних інтоксикаціях в умовах впливу ендотоксину та антиоксидантної корекції". - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.01 - нормальна анатомія. - Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського МОЗ України. - Сімферополь, 2007.

Дисертація присвячена вивченню морфологічних змін печінки викликаних дією алкоголю та ендотоксину кишечної мікрофлори, а також антиоксидантих властивостей концентрату біофлаваноїдів "Еноант" та цілеспрямованості його застосування при алкогольному захворюванні печінки. Комплексно за допомогою морфологічних, морфометрічних та біохімічних методів вивчені морфологічні зміни у печінки щурів та стан вільно-радикальних процесів при хроничній алкогольній інтоксикації та інтраперітонеальному введенні ендотоксину кишечної мікрофлори на фоні попередньої алкоголізації. З'ясовано вплив алкоголю та ендотоксину на перисинусоїдальні клітини печінки. Встановлена кореляція між ступеню важкості морфологічних змін у печінці та рівнем продуктів окислювальної модифікації білків та ліпідів. Відмічен виражений гепатопротекторний ефект концентрату "Еноант", пов'язаний з його антиоксидантними властивостями. Доведена ефективність "Еноанту" при алкогольної хворобі печінки. Отриманні дані становлять практичний інтерес на різних етапах лікування, а також у плані вісцеральної та соціальної реабілітації хворих з алкогольною хворобою.

Ключові слова: алкогольна інтоксикація, ендотоксин, печінка, біофлавоноїди, вільно-радикальне окислення.

Аннотация

Захарова А.Н. Экспериментально-морфологическая оценка печени при алкогольных интоксикациях в условиях воздействия эндотоксина и антиоксидантной коррекции. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.01 - нормальная анатомия. - Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского МЗ Украины. - Симферополь, 2007.

Диссертация посвящена изучению морфологических изменений печени, вызванных раздельным и сочетанным воздействием алкоголя и эндотоксина кишечной микрофлоры. Особое внимание уделено изучению роли процессов свободно-радикального окисления в альтерации печени. В связи с этим изучен гепатопротекторный эффект естественных антиоксидантов - биофлавоноидов "Эноант", выделенных из крымских сортов винограда.

Диссертация является законченной научно-исследовательской работой, в которой использован комплекс морфологических, морфометрических, биохимических, математико-статистических методов.

Установлено, что хроническая алкогольная интоксикация вызывает у крыс преимущественно жировую дистрофию гепатоцитов, а также гемоциркуляторные расстройства во внутридольковых сосудах и синусоидах печени и развитие перипортальных гистиолимфоцитарных инфильтратов, наиболее выраженных в поздние сроки опытов. При этом выраженность морфологических изменений печени при хронической алкогольной интоксикации коррелирует с уровнем содержания первичных продуктов (коньюгированные диены и диенкетоны), вторичных продуктов (малоновый диальдегид) свободно-радикального окисления липидов и окислительной модификацией белков.

Наряду с алкогольными повреждениями гепатоцитов, установлено статистически значимое уменьшение числа перисинусоидальных клеток, по сравнению с соответствующим показателями в контроле, что отражает снижение их пролиферативной активности, вызванного ингибирующим действием алкоголя.

При интраперитонеальном введении препарата эндотоксина кишечной микрофлоры, имеет место более выраженная, чем под влиянием алкоголя жировая и вакуольная дистрофия гепатоцитов с признаками токсического повреждения их ядер, полнокровие сосудов артерий и венул, явления стаза и сладжа эритроцитов. Установлено статистически достоверное увеличение числа перисинусоидальных клеток с цитологическими признаками активации в виде многочисленных цитоплазматических отростков и мелких перинуклеарных вакуолей, что свидетельствует о нарастании их пролиферативной и фагоцитарной активности под влиянием эндотоксина.

У животных, подвергшихся воздействию эндотоксина на фоне предварительной хронической алкогольной интоксикации, отмечены более тяжелые, чем при их раздельном применении, токсические повреждения гепатоцитов преимущественно в виде гидропической дистрофии, а также дезинтегративные изменения их ядер. Одновременно наблюдается статистически значимое уменьшение количества перисинусоидальных клеток, что свидетельствует о выраженном угнетении функциональной активности последних.

Установлено, что сочетанное введение алкоголя и эндотоксина сопровождается статистически значимым увеличением сывороточного содержания как первичных, так и вторичных продуктов свободно-радикального окисления липидов, а также продуктов окислительной модификации белков (маркеров окислительного стресса). Эти показатели повышаются при всех видах поражения печени - алкогольном, эндотоксиновом и сочетанном, но достигают своей максимальной выраженности при последнем. Полученные результаты позволяют использовать их для суждения о степени тяжести повреждения печеночной ткани.

Энтеральное применение концентрата "Эноант" в течение 21 суток, непосредственно после прекращения 90-суточной алкоголизации, существенно уменьшает повреждающий эффект алкоголя. При этом отмечается восстановление трабекулярной структуры печени, вокруг крупных портальных трактов появляются двуядерные гепатоциты, большинство гепатоцитов с гиперхромными ядрами и гомогенной светлой эозинофильной цитоплазмой, без признаков гидропической дистрофии, что свидетельствует о возрастании репаративной потенции печени. Параллельно с регрессией деструктивно- дистрофических процессов в ткани печени происходит нормализация процессов свободно-радикального окисления липидов и белков

Таким образом, использование концентрата "Эноант" после прекращения алкоголизации животных приводит к сравнительно быстрому, статистически достоверному снижению уровня маркеров окислительного стресса, что коррелирует с динамикой структурного восстановления печени. Отмеченный гепатопротекторный эффект "Эноанта", как современного концентрата флавоноидов винограда, представляет практический интерес для комплексного лечения алкогольных поражений печени, а также медико-социальной реабилитации больных с алкогольной болезнью.

Ключевые слова: алкогольная интоксикация, эндотоксин, печень, биофлавоноиды, свободно-радикальное окисление.

Summary

Zaharova A.N. An experimentally - morphological estimation of liver at drunkennesses in conditions of endotoxin effect and antiоxidative correction. - Manuscript.

The dissertation for obtaining the scientific degree of the candidate of medical sciences on a speciality 14.03.01 - normal anatomy. The Crimean State Medical University named after S.I. Gеоrgievsky, Simferopol, 2007.

The dissertation is devoted to studying of morphological changes of a liver caused by separate combinative influence of alcohol and endotoxin intestinal microflora, and also antiоxidative properties of a concentrate bioflavonoid "Enoant" and expediency of its application at alcoholic illness of a liver.

Completely with the help morphological, morphometrical and biochemical methods the morphological changes in a rats liver and state of free - radical processes are studied at a chronic drunkenness and intraperitoneal introduction of an endotoxin of an intestinal microflora on a background of a preliminary alcoholization. The alcohol and endotoxin effect is improved on perisinusoidal of liver cells. Correlation between a degree of morphological changes in a liver and a level of the maintenance products of oxidative modification of proteins and lipids is established. It is noted expressed hepatoprotective effect of a concentrate "Enoant" connected with it antiоxidative properties. Efficiency "Enoant" is proved at alcoholic illness of a liver. The received results are represented with practical interest for complex treatment of alcoholic diesis of a liver and medico-social rehabilitation of patients with alcoholic illness.

Key words: a drunkenness, endotoxin, liver, bioflavonoids, free - radical oxidizing.

Дисертація є рукопис.

Робота виконана в Кримському державному медичному університеті ім. С.І. Георгієвського МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, БАБАНІН Анатолій Андрійович, Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського МОЗ України, завідувач кафедри судової медицини з курсом права.

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук, професор, Козлов Володимир Олексійович, Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри анатомії людини;

- доктор медичних наук, професор, Лазарєв Костянтин Леонідович, Кримський державній медичний університет ім. С.І. Георгієвського МОЗ України, завідувач кафедри медичної біології, паразитології та генетики.

Провідна установа: Луганський державний медичний університет МОЗ України, кафедра анатомії людини.

Захист дисертації відбудеться 18.04.2007 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 52.600.02 при Кримському державному медичному університеті ім. С.І. Георгієвського МОЗ України (95006, Україна, АР Крим, м. Сімферополь, бульвар Леніна, 5/7).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського МОЗ України (95006, Україна, АР Крим, м. Сімферополь, бульвар Леніна, 5/7)

Автореферат розісланий 16.03. 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Г.О. Мороз.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. На сьогодні алкоголізм, як причина смертності в усьому світі, за частотністю знаходиться після серцево-судинних захворювань і злоякісних утворень. Летальність від різних причин у осіб, які непомірно вживають алкоголь у 2-3 рази вище, ніж у населення в цілому (М.В. Маєвська, 2001; А.І. Хазанов, 1998; A.A Nanji. et.al., 2002).

Універсальність впливу алкоголю на метаболізм, систему регуляції та морфологічних структур дозволяє стверджувати, що практично немає жодної системи або органа, які не втягувалися б у патологічний процес (Н.В. Марченко, Е.В. Родонежська, 2004; D.W. Crabb, 1999; C.S. Lieber, 1994). Токсичні властивості етанолу пов'язані як з його безпосереднім місцевим впливом на слизові оболонки стравоходу, шлунка, кишечника (S.W. French, 2000), так і із системним впливом його метаболітів, особливо ацетальдегіду, що підвищує токсичність етанолу в 100 разів. Особливо страждають у результаті хронічної алкогольної інтоксикації органи-мішені: печінка, головний мозок, легені, серце, підшлункова залоза, нирки, шлунок (А.А. Бабанін, Ю.А. Ромаскевич, 1990; Х.Х. Мансуров, 1986; А.С. Мухін, 1980). Системний характер захворювання дозволив виділити поняття алкогольна хвороба в самостійну нозологічну одиницю (А.В. Калінін, 2001).

Відповідно до міжнародної класифікації хвороб (МКБ-10), до алкогольної хвороби печінки (ДО70) відносять 6 видів уражень: від алкогольної жирової інфільтрації печінки до алкогольного цирозу печінки.

У свою чергу, гостре, а також хронічне алкогольне отруєння викликає підвищення кишкової проникності (C.A. Manthous, 1993). Це сприяє абсорбції з тонкого кишечнику ендотоксину, що сам собою може відігравати важливу роль в ураженні печінки цитокинами та супероксидними аніонами (супероксид аніон-радикал О2Ї, перекис водню Н2О2, гідроксил радикал ОНЇ) (Н.К. Пермяков та ін.,. 1989; V.V. Baehr et al., 2000; A.P. Bautista, 1997, 2002; M. Catala, M.T. Portoles, 2002; S. Fleming et al., 2001; B. Fromenty, A. Berson, D. Pessayre, 1997; J.B. Hoek, J.G. Pastorino, 2002; H. Jaeschke, 2000; C. Loguercio, A. Federico, 2003; A.A. Nanji, 2002)

Дослідження останнього десятиліття показали необхідність вивчення комбінованої дії етанолу й ендотоксину грамнегативних бактерій на організм, особливо на печінку (R. Batey et al., 1998, 2002; S. Kato et al., 1997; F. Parlesak, 1997). Наявні в літературі нечисленні відомості з цього питання мають фрагментарний характер, висвітлюють, в основному, клінічні аспекти, не торкаючись морфологічних особливостей комбінованої дії алкоголю й ендотоксину.

Асортименти лікарських засобів, застосовуваних у комплексній терапії при захворюванні печінки, нараховує більше 1000 найменувань, серед яких виділяють порівняно невелику групу гепатопротекторів, дія яких спрямована на підвищення стійкості печінки до впливу патогенних чинників, нормалізацію функціональної активності. (І.С. Чекман, 2000; D.Z. Hsu, M.Y. Liu, 2004; D. Li and S.L. Friedman, 1999). В останні роки дослідження Н.Н. Богданова зі співавт. свідчать про перспективність використання препарату "Еноант" - ефективного антиоксиданту та стимулятора репаративно-відновлювальних процесів (В.В. Мєшков, Н.Н. Богданов, 2002).

На сьогодні пошук і оцінка ефективності зазначеної групи препаратів є досить актуальним завданням.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію виконано відповідно до плану наукових досліджень Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського і є фрагментом проблемної теми кафедри судової медицини "Судово-єкспертна оцінка алкогольної хвороби". Державний реєстраційний номер 0100U003140, шифр теми 2.203.

Мета дослідження - встановити особливості морфологічних змін печінки та біохімічних показників сироватки крові, як при самостійній хронічній алкогольній інтоксикації, так і в експерименті, а також гепатопротекторну ефективність концентрату поліфенолів винограду “Еноант” при хронічній алкогольній інтоксикації.

Задачі дослідження:

1. Вивчити характер морфологічних змін у печінці експериментальних тварин (білих щурів) при хронічній алкогольній інтоксикації в умовах роздільного й поєднаного застосування алкоголю й ендотоксину.

2. З'ясувати в експерименті на моделях алкогольного, ендотоксинового й алкогольно-ендотоксинового ушкоджень печінки стан біохімічних показників сироватки крові в умовах окисного стресу, викликаного токсичною дією продуктів метаболізму алкоголю й ендотоксину.

3. Встановити характер залежності між гістологічними, ультрамікроскопічними змінами тканини печінки та біохімічних показників сироватки крові при хронічній алкогольній інтоксикації в умовах впливу ендотоксину.

4. Вивчити характер впливу концентрату "Еноант" на морфологічні зміни печінки й біохімічні показники, викликані хронічною інтоксикацією алкоголем.

5. Експериментально перевірити й обґрунтувати доцільність застосування концентрату поліфенолів винограду "Еноант" як антиоксиданту при алкогольній хворобі печінки.

Об'єкт дослідження - морфофункціональні зміни в печінці при алкогольній хворобі.

Предмет дослідження - морфологічна оцінка печінки при алкогольній інтоксикації в умовах впливу ендотоксину та антиоксидантної корекції.

Методи дослідження.

1. Морфологічні: світова мікроскопія з морфометрією - для вивчення структурних змін в печінці на тканинному рівні; електронна мікроскопія - для вивчення морфофункціонального стану клітинних структур.

2. Біохімічні: визначення кон'югованих дієнів, дієнкетонів, малонового діальдегіду, продуктів окисної модифікації білків, пептидів середньої маси - для вивчення окисно-відновлюваних процесів у печінці.

3. Математико-статистичні: канонічний, дисперсійний і кореляційний аналізи - для оцінки та встановлення вірогідності кількісних показників морфометричних та біохімічних досліджень.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше на експериментальному матеріалі комплексно за допомогою морфологічних і біохімічних методів вивчено динаміку морфологічних змін у печінці білих щурів при алкогольній, ендотоксиновій і алкогольно-ендотоксиновій інтоксикаціях. При цьому оцінений вплив ендотоксину й алкоголю при їх роздільній та поєднаній дії на гепатоцити та перисинусоїдальні клітини печінки.

Отримано нові дані про особливості реакції перисинусоїдальних клітин (ПСК) на дію алкоголю й ендотоксину. Вивчено окисну модифікацію білків сироватки крові, як одного з основних маркерів окисного стресу. Установлено кореляційний зв'язок між нею й виразністю дистрофічних змін у печінці.

Уперше за допомогою морфологічних і біохімічних методів вивчено антиоксидантні властивості концентрату "Еноант", що містить поліфеноли кримського винограду сортів "Каберне" і "Совіньон". Доведено доцільність його застосування як високоефективного гепатопротекторного засобу при алкогольній хворобі печінки. Установлено стимулюючу дію поліфенолів винограду на репаративні процеси в печінці та зворотний розвиток запальних змін.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані уточнюють уявлення про морфологічні особливості ендотоксинового й алкогольно-ендотоксинового уражень печінки та дозволяють обґрунтувати застосування антиоксидантів нової групи для лікування алкогольної хвороби печінки й реабілітації хворих на хронічний алкоголізм. Результати досліджень дозволяють обґрунтувати можливість застосування концентрату поліфенолів винограду "Еноант" при різних видах ураження печінки.

Матеріали роботи можуть бути також використані як наукове підґрунтя для розробки лекційних курсів з метою антиалкогольної пропаганди.

Особистий внесок дисертанта.

Автором проведено самостійно: аналіз літературних джерел, визначення мети та задач дослідження, моделювання алкогольної та алкогольно-ендотоксинової інтоксикацій в експерименті на білих щурах, а також усі експериментально-морфологічні дослідження (гістологічні, електронно-мікроскопічні та біохімічні). Проведена статистична обробка та інтерпретація отриманих результатів, сформульовані висновки та основні положення дисертації.

Апробація результатів дисертації. Результати отриманих експериментальних даних повідомлені й обговорені на науковій конференції "Еколого-фізіологічні проблеми адаптації" (Партеніт, 2003), на науковій конференції з міжнародною участю "Біологічно активні природні по'єднання винограду: гігієнічні й медичні ефекти застосування продуктів з високим змістом поліфенолів винограду" (Ялта, 2004), на засіданні Кримського відділення товариства АГЕТ України (м. Сімферополь, 2006).

Публікації. Основні положення та зміст отриманих експериментальних даних відображено в 3-х наукових статтях у виданнях, ліцензованих ВАК України.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 102 сторінках друкованого тексту й складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, трьох розділів власних досліджень, аналізу й обговорення отриманих результатів, висновків і списку використаних джерел. Бібліографічний список містить 226 найменувань (закордонних та вітчизняних авторів).

Основний зміст роботи

Матеріал і методи дослідження. Матеріалом дослідження слугували тканина печінки та сироватка крові 260 нелінійних щурів.

Вибій експериментальних тварин проводився шляхом декапітації. Макроскопічна оцінка й опис печінки тварин виконувалися після вилучення органокомплексу.

Вирізка матеріалу для гістологічного дослідження здійснювалася в перші 20-40 хвилин. Гістологічні зрізи завтовшки 10-15 мкм фарбували гематоксилін-еозином і пікрофуксином за методом ван Гізона. Ліпіди виявлялися в заморожених зрізах фарбуванням жировим червоним О. Для електронної мікроскопії, матеріал готувався за загальноприйнятою методикою.

Для морфометричного аналізу використали гістологічні зрізи зі шматочків печінки, залиті в один парафіновий блок, що гарантувало однакову товщину зрізів порівнюваних груп. Підрахунок кількості вакуолей і кількості перисинусоїдальних клітин виконували за допомогою окуляра Hennig (Г.Г. Автанділов, 1990). Підрахунок виконували в десяти випадково вибраних полях зору при збільшенні мікроскопа х 640 (про. 40, бл. 16). Крім того, підраховувалася кількість гепатоцитів з ознаками токсичного та дезитегративного ураження ядер (Хесін).

Біохімічні дослідження виконувалися на сироватці крові всіх груп тварин, визначалися такі біохімічні показники:

1) зміст кон'югованих дієнів і дієнкетонів, як первинних продуктів перекисного окислювання ліпідів, за методикою І.Д. Стальної (1977) у модифікації К.С. Казакова і Л.Л. Сидорової (1994).

2) вміст малонового діальдегіду , як вторинного продукту перекисного окислювання ліпідів, що визначали за допомогою діагностичних наборів Тбк-агат за методикою M. Mihara (1980).

3) проводилося вивчення спонтанної окисної модифікації білків за методом R.L. Levine (1990) в модифікації Е.Е. Дубініної (1995, 2000).

4) молекули середньої маси визначали за методом Н.І. Габріелян (1984) у модифікації Д.Л. Брасюк (1995).

Результати морфологічних і біохімічних досліджень піддавали математичній обробці з використанням варіаційно-статистичних методів, дисперсійного та кореляційного аналізів. Для порівняння отриманих відносних величин використали кореляційний аналіз, розраховуючи коефіцієнт рангової кореляції Спірмена. Коефіцієнт кореляції 0,55 - 0,75 - указував на середній ступінь тісноти зв'язку, 0,8 - 0,98 - указував на високий ступінь тісноти зв'язку. Статистично достовірними вважалися розходження при р < 0,05.

Результати досліджень та їх аналіз. Морфологія печінки та біохімічні показники були вивчені в групах експериментальних тварин з різними термінами алкоголізації - 30 діб, 90 діб, 180 діб (1, 2, 3 серії відповідно), а також при роздільній (4 серія) і поєднаній дії ендотоксину на тлі попередньої алкоголізації: 30 діб, 90 діб, 180 діб (5, 6, 7 серії). Після 90-добової алкоголізації з метою вивчення гепатопротекторної дії був застосований концентрат поліфенолів винограду "Еноант" (8 серія).

Аналіз мікропрепаратів першої серії (після 30-добової алкогольної інтоксикації) виявив осередкове порушення трабекулярної структури часточок, поява дифузійної вакуолізації гепатоцитів особливо в перипортальних зонах. При цьому спостерігалася як великокраплинна, так і дрібнокраплинна жирова дистрофія гепатоцитів. Відзначалися дисциркуляторні зміни: синусоїди були розширені та переповнені еритроцитами, з ознаками стазу й гемаглютинації. У перипортальній зоні зустрічалися одиничні лімфогістіоцитарні інфільтрати, що містять іноді невелику кількість лейкоцитів.

При електронній мікроскопії ядра гепатоцитів були деформованими, з нерівномірною конденсацією хроматину, що розцінювалося як феномен токсичного ушкодження. Вакуолізація гепатоцитів мала дифузійний характер, визначався перинуклеарний набряк цитоплазми. Мітохондрії втрачали свою характерну будову, здобували сферичну форму, кристи погано диференціювалися. Відзначалися розширення та везикуляція канальців ендоплазматичного ретикулуму. Привертало на себе увагу зменшення кількості рибосом, що прийнято пов'язувати з порушенням метаболічних процесів. печінка алкогольний інтоксикація ендотоксин

У другій серії (при введенні алкоголю протягом 90 діб) зберігався феномен токсичного ушкодження ядер ГЦ, про що свідчили підкресленість каріолеми, фрагментація оболонки, нерівномірна конденсація хроматину під оболонкою, іноді - каріолізис. У багатьох гепатоцитах ядерний хроматин мав вигляд великих, безладно розташованих глибок, при цьому оболонка ядра була переривчастою, поступово ядро перетворювалося в грубозернисту слабко пофарбовану масу без оболонки (каріорексис). Перисинусоїдальні клітини виявлялися значно рідше, ніж у контролі. Крім того, відзначалося посилення лімфо-гістіоцитарної інфільтрації портальних трактів. При цьому, місцями в інфільтратах, а також у синусоїдах виявлялися сегментоядерні лейкоцити, а також проліферація дуктального епітелію, що можна розцінювати як ознаки інтерстиціального гепатиту.

У третій серії дослідів (180-добова алкоголізація) у печінці відзначалася різка дискомплексація трабекулярної структури часточок, а також дифузійна вакуолізація гепатоцитів, особливо в перипортальних зонах. Були різко виражені набряк і вакуольна дистрофія цитоплазми перипортальних гепатоцитів, порушення гемоциркуляції. У розширених синусоїдах наростали стаз і гемаглютинація. У портальних трактах і навколо жовчних проток виявлялися гістіолімфоцитарні інфільтрати, плазморагії стінок артерій, і частини центральних вен, а також виражений фіброз і гіаліноз строми портальних трактів.

У результаті морфологічного дослідження встановлено, що найбільш характерні алкогольні ураження печінки в щурів умовно укладалися в три типи: а) дисциркуляторні (гіперемія синусоїдів і центральних венул); б) альтеративні, у вигляді жирової та гідропічної дистрофії гепатоцитів; в) мононуклеарні інфільтрати портальних трактів і перипортальної ділянки. Ці процеси досягали максимуму через 90 діб алкогольної інтоксикації (друга серія дослідів).

Для напівкількісної оцінки характеристики ступеню тяжкості й обсягу алкогольних уражень печінки в різних експериментальних серіях визначали тип алкогольного ушкодження й умовний ступінь тяжкості (0, 1, 2). Де 0 - відсутність змін; 1 - слабковиражені, переважно осередкові ураження; 2 - помірний та важкий ступінь переважно дифузійних уражень. У порівнюваних серіях підраховували кількість тварин з однаковим ступенем тяжкості того або іншого типу уражень. У 1-ій серії тяжкий ступінь уражень відзначений у 37% спостережень, у 2-ій і 3-ій серіях 63% і 62% відповідно.

Для кількісного аналізу робили підрахунок перисинусоїдальних клітин, а також гепатоцитів з ознаками токсичного ушкодження ядер і кількість вакуолізованих гепатоцитів (табл.1).

Для вивчення впливу алкоголю на обмінні процеси в організмі визначали біохімічні маркери вільно-радикального окислювання ліпідів і білків. При цьому проводилося дослідження вмісту кон'югованих дієнів і дієнкетонів, малонового діальдегіду.

Згідно з останніми даними, окисній модифікації піддаються не тільки ліпіди, але й білки (Е.Е. Дубініна, 1995). Тому проводилося вивчення спонтанної окисної модифікації білків сироватки крові й вмісту молекул середньої маси. При цьому встановлено, що вміст кон'югованих дієнів у першій серії було вище, ніж в інтактних тварин у 2 рази, у 2-ій серії в 1,95 рази, а в 3-ій серії 2,2 рази.

Таблиця 1

Морфометрична оцінка токсичного впливу етанолу на печінку щурів при хронічній алкогольній інтоксикації

№ серії	Кількість випадків	Кількість ПСК в 100 полях зору мікроскопа (х640)	Кількість ГЦ с ознаками токсичного ушкодження ядра	Кількість вакуолізованих гепатоцитів
	n	M ± m	M ± m	M ± m
Контроль	10	12,71 ± 0,24*	1 ± 0,3*	0
1 серія	10	4,68 ± 0,12*	6,54 ± 0,268*	15,14 ± 1,26*
2 серія	10	3,71 ± 0,28*	6,85 ± 0,70*	19,14 ± 2,14*
3 серія	10	3,85 ± 0,73*	17,71 ± 0,99*	24,57 ± 0,89*

Примітка: * - p < 0,01

Аналогічна закономірність виявлена для дієнкетонів. Так, підвищення вмісту кон'югованих дієнів у першій серії становило 16% у порівнянні з інтактними тваринами, у другій серії підвищення було на 13% і в третій серії перевищення становило 17%. Вміст малонового діальдегіду також виявилося підвищеним при всіх термінах алкогольної інтоксикації. При цьому, підвищення малонового діальдегіду в першій серії становило 29%, у другій серії 25%, а в третій серії перевищення було до 39% у порівнянні з контролем.

З метою вивчення процесів окисної модифікації білків, визначали вміст карбонільних поєднань, що утворюються в стані окисного стресу, викликаного впливом алкоголю в різний термін. Так, вміст карбонільних продуктів у першій і в другій серіях було підвищено в 4,5 рази, а в третій серії в 5 разів порівняно з нормою. Підвищений вміст продуктів окисної модифікації білків супроводжувався збільшенням вмісту пептидів середньої маси.

Для хронічної алкогольної інтоксикації характерний розвиток дисбактеріозу, що сприяє збільшенню продукції ендотоксину. Поряд із цим спостерігаються ультраструктурні ушкодження епітеліальних клітин слизової оболонки кишечника. Підвищується проникність стінки кишки (феномен "негерметичної кишки"), і тим самим створюються умови для потрапленння ендотоксину в портальний кровоток. З цих позицій для оцінки стану печінки при роздільній та поєднаній дії алкоголю й ендотоксину були проведені порівняльні морфологічні та біохімічні дослідження тварин, що піддавалися 7 добовому впливу одного ендотоксину, а також ендотоксину на тлі попередньої алкоголізації протягом 30, 90 і 180 діб (5, 6, 7 серії відповідно).

Після 7-добового впливу ендотоксину відбувалося помірне порушення трабекулярної структури часточок, контури гепатоцитів ставали нечіткими, наростала слабко виражена базофілія цитоплазми. Виявлялися більш глибокі ушкодження ядер, ніж у серіях з алкогольною інтоксикацією. Ядра печінкових клітин нерівномірно сприймали фарбування гематоксиліном, зустрічалися пікнотичні та набряклі ядра, спостерігалася підкресленість каріолеми, фрагментація оболонки, нерівномірна конденсація хроматину під оболонкою, каріолізис. У багатьох гепатоцітах ядерний хроматин мав вигляд великих, безладно розташованих глибок, при цьому оболонка ядер ставала переривчастою.

На електронограмах ядра гепатоцитів мали розпушену зовнішню мембрану із зонами лізису. Ядерний хроматин визначався як у конденсованій, так і в неконденсованій формі, зовнішня оболонка ядра місцями була лізована. Перинуклеарна зона цитоплазми в деяких гепатоцитах була дрібно вакуолізованою, оптично порожньою, що вказувало на гідропічну дистрофію. Фарбування жировим червоним виявляло дифузійні відкладення дрібнозернистого та дрібнокрапельного матеріалу в гепатоцитах, переважно в центральних зонах часточок. Ультрастуктурні дослідження виявили істотні зміни в клітинах печінки дистрофічного, а також деструктивного характеру. Мітохондрії гепатоцитів набухали, містили електронно-прозорий матрикс, кристи їх були частково зруйновані. Цистерни гранулярного ендоплазматичного ретикулума були розширені та являли собою різної форми й розмірів елетронно-прозорі вакуолі. На мембранах гранулярної ендоплазматичної мережі локалізувалися рибосоми, кількість яких була значно меншою, ніж у групі інтактних щурів і тварин, що піддавалися тільки алкогольній інтоксикації.

Кількість перисинусоїдальних клітин була значно збільшеною, порівняно з контролем і алкогольним ураженням печінки при різних термінах алкоголізації. У стінках синусоїдів визначалися макрофаги із цитологічними ознаками активації; численними цитоплазматичними відростками та дрібними перинуклеарними вакуолями (табл. 2).

Таблиця 2

Порівняльна морфометрична характеристика альтеративних змін гепатоцитів і перисинусоїдальних клітин при ендотоксиновій і алкоголь-ендотоксиновій інтоксикаціях

№ серії	Кількість випадків	Кількість ПСК в 100 полях зору мікроскопа (х640)	Кількість ГЦ с ознаками токсичного ушкодження ядра	Кількість вакуолізованих гепатоцитів
	n	M ± m	M ± m	M ± m
Контроль	10	12,71 ± 0,24*	1 ± 0,3*	0
4 серія	10	15,0 ± 0,28**	9,40 ± 0,42**	12 ± 0,69**
5 серія	10	5,54 ± 0,19**	16,9 ± 0,26**	30,85 ±1,35**
6 серія	10	6 ± 0,89**	17,71 ± 1,56**	36,57 ± 3,16**
7 серія	10	4,85 ± 0,67**	18,85 ± 0,63**	49,71 ± 2**

Примітки: 1.*- р<0,001

2.**- р<0,01

Аналіз результатів біохімічних досліджень показав, що під впливом ендотоксину вміст кон'югованих дієнів підвищувався в четвертій серії в 2,5 рази порівняно з інтактними тваринами. Аналогічна закономірність виявлена для дієнкетонів. Вміст дієнкетонів перевищував норму в 1,5 рази. Вміст малонового діальдегіду також був підвищеним у 1,5 рази порівняно з інтактними тваринами. Рівень продуктів окисної модифікації порівняно з контролем був підвищений в 4,3-4,6 рази. Підвищення рівня ПСМ у четвертій серії становило 1,69 рази порівняно з контролем. Таким чином, застосування ендотоксину призводило до більш важкого ушкодження тканини печінки порівняно з алкогольною інтоксикацією, що проявлялося більш вираженою гідропічною дистрофією. Ці зміни, очевидно, пов'язані із прямою токсичною дією ендотоксину та з наслідками окисного стресу, потужним індуктором якого є ендотоксин.

У п'ятій серії (при поєднаній дії ендотоксину та 30-добової алкоголізації) цитоплазма гепатоцитів навколо центральних вен печінкових часточок містила дрібні вакуолі. Жирова дистрофія зберігалася, як і в серіях з алкогольною інтоксикацією (1, 2, 3 серії). Феномен токсичного ушкодження ядер зберігався й підсилювався. На ультраструктурному рівні переважали деструктивні зміни в клітинах і органелах. Ядра гепатоцитів набували дуже низької електронної щільності, хроматин був представлений у вигляді окремих безладно розташованих глибок. Ядерна оболонка місцями була повністю зруйнована. Підсилювалися набряк і набрякання мітохондрій. Знижувалася кількість крист, вони були вкорочені, частково зруйновані. Кількість гепатоцитів з ознаками альтерації ядер була в 1,8-2 рази більше, ніж при впливі одного ендотоксину, що вказувало на більш тяжкий характер ураження печінки. Кількість перисинусоїдальних клітин зменшилася при цьому в 2 рази порівняно з чистою ендотоксиновою інтоксикацією. Цей ефект обумовлений впливом алкоголю.

У шостій і сьомий серіях (при поєднаній дії ендотоксину на тлі попередньої 90 і 180-добової алкогольної інтоксикації) морфологічні ознаки ушкодження гепатоцитів були більш виражені, ніж у п'ятій серії та сягали свого максимального розвитку. Брускова структура часточок була майже повністю стертою, переважала дрібно- і великокрапельна вакуолізація цитоплазми ГЦ поряд з їх зернистою дистрофією. У більшості ГЦ ознаки каріолізису. Відзначено велику кількість синусоїдів, у просвітах, яких спостерігалися еритроцитарні скупчення, що часто зливаються в гомогенні маси. В ультраструктурній організації гепатоцитів виявлялися виражені деструктивні зміни з великими зонами лізису ядерної оболонки. Перинуклеарній простір був розширений. У перинуклеарній зоні цитоплазми зменшувалася кількість органел, вона виглядала оптично спустошеною. Мітохондрії були набряклі, сферичної форми із проясненим матриксом усередині. З'являлися мітохондрії, кристи яких були повністю зруйновані. Пластинчастий цитоплазматичний комплекс скорочений. При морфометричному дослідженні виявлено статистично значуще збільшення кількості гепатоцитів з ознаками токсичного ушкодження ядер, яке більш ніж в 2 рази перевищує таке ж в 1 серії. Методом напівкількісного аналізу виявлено достовірне розходження ступеню тяжкості ушкодження печінки при роздільному й комбінованому впливі ендотоксину й алкоголю.

Аналіз морфологічних даних у серіях тварин при ендотоксиновій і поєднаній дії алкоголю й ендотоксину показав, що помірний і тяжкий ступінь усіх видів ушкоджень печінки у вигляді циркуляторних розладів, різних видів дистрофії та перипортальної інфільтрації відзначалися в усіх спостереженнях. Однак, при впливі тільки одного ендотоксину тяжкий ступінь ушкоджень був відзначений в 57% тварин, тоді як при поєднаній дії алкоголю й ендотоксину ці показники сягали 78%. Помірний і легкий ступінь тяжкості спостерігався при ендотоксиновій інтоксикації в 33% і 10% тварин, при алкогольно-ендотоксиновій інтоксикації становив 28% і 3% відповідно.

Біохімічні показники свідчили про збереження тенденції до підвищення маркерів окисного стресу. Вміст кон'югованих дієнів у 5, 6 і 7 серіях було підвищено приблизно в 3 рази порівняно з контролем. Це відзначалося й з дієнкетонами в даних серіях. Так, вміст останніх був збільшений у 1,5 рази. Зберігався надлишковий вміст вторинних продуктів ліпопероксидації в 5, 6 і 7 серіях порівняно з інтактними тваринами, що залишалося на одному рівні в цих серіях. Окисна модифікація білків найбільш виражена була в п'ятій серії. У шостій і особливо сьомій спостерігалося деяке зниження відповідних показників. Аналогічна закономірність була виявлена в цих серіях і при визначенні значень пептидів середньої маси. Пік їх значень був зафіксований у шостій групі. Найменше значення показників ПСМ порівняно з контролем спостерігалося в п'ятій серії. У сьомій серії, порівняно з шостою, показники вмісту пептидів середньої маси були дещо зниженими.

До восьмої серії входили тварини, яким протягом 90 діб щодня внутрішньошлунково вводився 40% етанол, після чого на тлі повної алкогольної депривації тварини одержували протягом 21 доби концентрат біофлавоноїдів "Еноант". Це проводилося для вивчення протекторного впливу даного препарату на стан печінки. Головною особливістю цієї серії було порівняно раннє й виражене відновлення трабекулярної структури печінки. Границі синусоїдів чіткі, явища гіперемії були відсутні або були виражені мінімально. Альтеративні зміни в більшості мікропрепаратів виявлялися в одиничних гепатоцитах. Чітко розрізнялися темні та світлі гепатоцити, серед яких часто визначалися клітини з двома ядрами. Спостерігалася помірна гістіо-лімфоцитарна реакція в портальних трактах. Відзначено портальну проліферацію перисинусоїдальних клітин. На ультраструктурному рівні клітинні органели добре візуалізувались. Ядра гепатоцитів були округлої форми, розташовувалися в центрі або дещо ексцентрично. Зовнішня та внутрішня мембрани ядер чітко контурувалися. Хроматин був рівномірно розподілений у нуклеоплазмі. Мітохондрії мали типову будову. Кристи були щільно впаковані. Цистерни гранулярної ендоплазматичної мережі були незначно розширені. Субмікроскопічна організація ендотеліоцитів синусоїдних капілярів істотно не відрізнялася від норми. У зірчастих ретикулоендотеліоцітах відзначалася активація внутрішньоклітинних метаболічних процесів. Це проявлялося в помірному розширенні цистерн гранулярного ендоплазматичного ретикулума та гіпертрофією комплексу Гольджи.

Збільшувалася кількість перисинусоїдальних клітин, вміст яких наближався до норми. Кількість гепатоцитів з ознаками ушкодження ядер становила 1,85±0,63 (у другій серії з 90-добовою алкоголізацією цей показник становив 6,85±0,7). У той же час у 63% щурів, що одержували протягом 90 діб алкоголь без "Еноанта", відзначалося помірне та сильно виражене дифузійне повнокрів'я синусоїдів, вакуолізація гепатоцитів мононуклеарні перипортальні інфільтрати. У 27% тварин ці зміни мали осередковий характер незначної інтенсивності, а відсутність зазначених змін відзначено тільки в 10% тварин. Після 21-добового застосування препарату "Еноант", інтенсивність і поширеність перерахованих змін значно зменшилася в 29% тварин, а в 60% тварин була відсутня.

Біохімічні дослідження, проведені у двох оцінюваних серіях: у 2 (алкоголізація протягом 90 діб) і в 8 (введення концентрату "Еноант" після 90-добової алкогольної інтоксикації - повна алкогольна депривація) показали значне зменшення вмісту продуктів окисних процесів у 8 серії порівняно з другою серією. Однак, ці показники не досягали норми й були незначно підвищені порівняно з 9 (контрольною серією).

При алкогольній інтоксикації протягом 90 діб, вміст кон'югованих дієнів був підвищеним, порівняно з контролем у 2 рази (4,2±0,06 і 2,15±0,03 відповідно). Вміст дієнкетонів, у цій серії, був лише незначно підвищеним, порівняно з контролем, і становив 0,49±0,02 і 0,43±0,007 відповідно. Установлено, що підвищення вмісту кон'югованих дієнів корелює з виразністю та глибиною морфологічних змін у печінці. Однак, незначне підвищення вмісту дієнкетонів не є характерним маркером для оцінки морфологічних наслідків алкогольної інтоксикації.

Після застосування концентрату "Еноант", вміст кон'югованих дієнів знизився до 2,77±0,05. Зниження рівня вмісту дієнкетонів становило 0,47±0,016, що дещо перевищувало показники контролю. Рівень вторинних продуктів перекисного окислювання ліпідів при алкогольній інтоксикації був підвищений порівняно з контролем і доходив до 25%, становлячи відповідно 3,02±0,12 і 2,41±0,006. Після застосування концентрату "Еноант", значення вмісту малонового діальдегіду знизилося стосовно серії тварин із хронічною алкогольною інтоксикацією (2 серія) і становило 2,72±0,009.

Рівень продуктів окисної модифікації білків у другій серії (при хронічній алкоголізації) був підвищений порівняно з контролем приблизно 4,5 рази й становив 0,93±0,04 і 0,20±0,006 відповідно. Після застосування концентрату "Еноант" значення показників ОМБ різко знизилися й становили 0,3±0,003, що вище показників контролю всього лише в 1,5 рази. Вміст пептидів середньої маси в другій серії був підвищений порівняно з контролем до 2 разів і становив 0,42±0,03 і 0,26±0,017 відповідно. Після застосування концентрату "Еноант", значення показників вмісту ПСМ знизилися й становили 0,37±0,05.

Отже, отримані експериментальні дані показують чітку кореляцію морфологічних змін у печінці та біохімічних показниках сироватки крові. При цьому посилення вільнорадикального окислювання виявлене в ході біохімічних досліджень, є маркером виразності та необоротності змін у гепатоцитах, що розвиваються внаслідок алкогольних ушкоджень, і супроводжується нагромадженням у печінці й крові високотоксичних продуктів перекисних процесів. Застосування концентрату "Еноант" призводить до істотного зниження біохімічних показників, що є маркерами окисного стресу й зменшення інтенсивності вільнорадикальних процесів. Як наслідок, зменшується ступінь тяжкості морфологічних змін у печінці, отриманої в результаті хронічної алкогольної інтоксикації, наростають репаративно-відновлювальні процеси.

Висновки

1. Хронічна алкогольна інтоксикація в експерименті викликає у щурів дистрофію гепатоцитів, циркуляторні розлади, переважно у внутрішньочасточкових судинах і синусоїдах печінки, а також розвиток перипортальних гістіолімфоцитарних інфільтратів, найбільш виражених у пізній термін дослідів. При електронній мікроскопії в гепатоцитах виявляється розширення та прогресуюча везикуляція канальців гладкого й шорсткуватого ендоплазматичного ретикулуму, а також зменшення кількості рибосом, що свідчить про порушення метаболічних процесів у печінці.

2. Виразність і глибина морфологічних змін у печінці при хронічній алкогольній інтоксикації корелює з динамікою вмісту первинних продуктів вільнорадикального окислювання ліпідів (кон'юговані дієни та дієнкетони), а також його вторинних продуктів (малоновий діальдегід). Щодо окисної модифікації білків у сироватці крові тварин під впливом алкогольної інтоксикації, то має місце тенденція до зростання цих показників у всіх серіях експерименту, які сягають максимальних показників при 180-денній алкогольній інтоксикації.

3. Поряд з алкогольними ушкодженнями гепатоцитів, установлено статистично значимуще зменшення кількості перисинусоїдальних клітин, порівняно з відповідними показниками в контролі, що відбиває зниження їх проліферативної активності.

4. При поєднаному впливі алкоголю й ендотоксину кишкової мікрофлори, має місце більш виражена жирова та вакуольна дистрофія гепатоцитів з ознаками токсичного ушкодження їх ядер, вираженого інтрацелюлярного набряку, різкого повнокров'я судин артеріоло-венулярного басейну з явищами стазу та сладжа еритроцитів. Разом з тим, спостерігається статистично достовірне збільшення кількості перисинусоїдальних клітин із цитологічними ознаками активації у вигляді численних цитоплазматичних відростків і дрібних перинуклеарних вакуолей, що свідчить про наростання їх проліферативної і фагоцитарної активності під впливом ендотоксину.

5. У тварин із поєднаним 7-добовим впливом ендотоксину на тлі попередньої хронічної алкогольної інтоксикації відзначено більш тяжкі, ніж при роздільному їх впливі, токсичні ушкодження гепатоцитів переважно у вигляді гідропічної дистрофії, так і дезінтегративні зміни їх ядер, при різкому, статистично значущому, зниженні кількості перисинусоїдальних клітин. Це свідчить про більш виражене пригнічення функціональної активності останніх під впливом поєднаної дії етанолу й ендотоксину.

6. Поєднаний вплив алкоголю й ендотоксину супроводжується статистично значущим збільшенням сироваткового вмісту як первинних, так і вторинних продуктів вільнорадикального окислювання ліпідів, а також продуктів окисної модифікації білків (маркерів окисного стресу). Ці показники підвищуються при всіх видах ураження печінки - алкогольному, ендотоксиновому та поєднаному, але досягають своєї максимальної виразності при останньому. Так, вміст кон'югованих дієнів при поєднаній дії алкоголю й ендотоксину підвищується в 2,8 рази порівняно з контролем, вміст малонового діальдегіду перевищує норму в 1,7 рази, а вміст продуктів окисної модифікації білків у 5 разів вищий порівняно з контролем.

7. Ентеральне застосування концентрату "Еноант" протягом 21 доби, безпосередньо після припинення 90-добової алкоголізації, істотно зменшує ушкоджувальний ефект алкоголю. Під впливом "Еноанта" спостерігається значне відновлення трабекулярної структури печінки, навколо великих портальних трактів з'являються двохядерні гепатоцити, що свідчить про зростання репаративної потенції печінки, більшість гепатоцитів з гіперхромними ядрами та гомогенною світлою еозинофільною цитоплазмою, без ознак гідропічної дистрофії. Лише в окремих препаратах виявляються одиничні великі, очевидно, ліпідні вакуолі, що чітко диференціюються на електронограмах.

8. При застосуванні концентрату "Еноант" виявлено зниження біохімічних показників вільнорадикального окислювання ліпідів: зменшення вмісту кон'югованих дієнів у 1,5 рази порівняно з експериментальною групою при 90-добовій алкогольній інтоксикації, вміст малонового діальдегіду зменшувався в 1,2 рази. Вміст продуктів окисної модифікації білків знижувався в 3 рази. Разом з тим, маркери окисного стресу залишалися незначно підвищеними, порівняно з контрольною групою, що корелює з неповною редукцією перипортальних запальних інфільтратів, які персистують у 12 з 20 тварин у даний термін експерименту.

9. Використання концентрату "Еноант", після припинення лкоголізації тварин, призводить до порівняно швидкого, статистично достовірного зниження рівня маркерів окисного стресу, тобто зменшення інтенсивності вільнорадикального окислювання, що корелює з морфологічними показниками вираженого структурного відновлення печінки. Ця особливість "Еноанта", як сучасного поширеного антиоксиданту флавоноїдів винограду, становить практичний інтерес на різних етапах лікування, а також у плані вісцеральної та соціальної реабілітації хворих з алкогольною хворобою.

Перелік умовних скорочень

ГЦ - гепатоцити

ОМБ - окислювальна модифікація білків

ПСК - перисинусоїдальні клітини

ПСМ - пептиди середньої маси

ЕТ - ендотоксин кишечної мікрофлори

МДА - малоновий діальдегід

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Бабанин А.А., Нестеров Е.Н., Захарова А.Н., Белоглазова И.И., Куцевол Б.Л. Морфология поражения печени, вызванных алкоголем и эндотоксином кишечной микрофлоры в эксперименте // Таврический медико-биологический вестник. - 2003. - Т. 6, №1. - С. 152-154. (Співавторами була здійснена консультаційна допомога ).

2. Бабанин А.А., Нестеров Е.Н., Захарова А.Н., Куцевол Б.Л. Экспериментально-морфологическая оценка печени при алкогольной и алкогольно-эндотоксиновой интоксикациях // Таврический медико-биологический вестник. - 2003. - Т. 6, №4. - С. 30-32. (Співавторами була здійснена консультаційна допомога).

3. Захарова А.Н. Гепатопротекторные свойства концентрата полифенолов винограда "Эноант" при экспериментальном поражении печени алкоголем // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения: Тр. Крым. гос.мед. ун-та им. С.И. Георгиевского. - 2005. - Т. 141, часть 1.- С. 112-116.

Размещено на Allbest.ru

...