Вплив випромінювання з малою потужністю дози на клітинні реакції лімфоїдних органів при хронічному запаленні

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 616.42-002-036.12:612.014.482.4

14.03.04 - патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

ВПЛИВ -ВИПРОМІНЮВАННЯ З МАЛОЮ ПОТУЖНІСТЮ ДОЗИ НА КЛІТИННІ РЕАКЦІЇ ЛІМФОЇДНИХ ОРГАНІВ ПРИ ХРОНІЧНОМУ ЗАПАЛЕННІ

Варваричева Ольга Сергіївна

Харків - 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Клименко Микола Олексійович, Харківський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри патологічної фізіології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Симонова Лариса Іванівна, Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор'єва АМН України (м. Харків), керівник лабораторії патофізіології і експериментальної терапії радіаційних уражень;

доктор медичних наук, доцент Березнякова Марина Євгеніївна, Національний фармацевтичний університет МОЗ України (м. Харків), професор кафедри клінічної лабораторної діагностики.

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться "14" червня 2007 р. о 14 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.600.03 при Харківському державному медичному університеті (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського державного медичного університету (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).

Автореферат розісланий " 08 " травня 2007 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат медичних наук, професор Терещенко А.О.

Анотації

Варваричева О.С. Вплив -випромінювання з малою потужністю дози на клітинні реакції лімфоїдних органів при хронічному запаленні. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за фахом 14.03.04 - патологічна фізіологія. - Харківський державний медичний університет МОЗ України, Харків, 2007.

Дисертація присвячена вивченню клітинних реакцій лімфоїдних органів при дії низькоінтенсивного -випромінювання у різних дозах на тлі хронічного запалення.

У роботі використані патофізіологічні, фізико-хімічні, гістологічні, імуногістохімічні, статистичні методи дослідження.

У результаті проведеного дослідження встановлено, що загальне г_опромінювання з малою потужністю дози на тлі хронічного запалення призводить до посилення процесів вільнорадикального окислення у тимусі, причому найбільш ефективною є доза 0.1 Гр; в селезінці виражені антиоксидантні властивості. Експресія білка-онкосупресора р 53 в лімфоцитах тимуса і селезінки зростає із дозою опромінювання; при цьому збільшення експресії білка р 53 при опромінюванні в дозі 0.1 Гр є незначним. г-випромінювання з малою потужністю дози призводить до уповільнення акцидентальної трансформації тимуса, яка характерна для хронічного запалення, а також до посилення проліферації тимоцитів. При цьому в селезінці виявляються морфологічні ознаки антигенної стимуляції у вигляді гіперплазії білої пульпи, посилених макрофагальної і плазмоцитарної реакцій на тлі активної міграції імунних клітин з максимальною вираженістю при дозах 0.1 і 0.5 Гр і виснаженням лімфоїдного компоненту при дозі 1.0 Гр. Низькоінтенсивне г-випромінювання в усіх дозах призводить до зміни характерного для хронічного запалення співвідношення імунних клітин в лімфоїдній тканині у вигляді уповільнення спустошення Т-хелперного компоненту, зниження проліферативної активності В-клітинного компоненту і посилення проліферації низькодиференційованого Т-клітинного компоненту. Посилення процесів вільнорадикального окислення в лімфоїдній тканині разом з недостатньою онкосупресорною активністю білка р 53 при дії низькоінтенсивного г-випромінювання в малих дозах на тлі хронічного запалення, а також стимуляція проліферації клітин тимуса і селезінки, особливо низькодиференційованого клітинного компоненту, при ослабленому імунологічному нагляді можуть вказувати на збільшення ймовірності пухлинної трансформації клітин лімфоїдної тканини. При цьому на 3-ю добу запалення в тимусі та селезінці виявляються антиоксидантні властивості, що нівелюють ефекти г_випромінювання, очевидно, завдяки наявності значних антиоксидантних резервів, які супроводжують "оксидантний вибух" макрофагів.

Ключові слова: хронічне запалення, низькоінтенсивне г_випромінювання, клітинні реакції, тимус, селезінка, лімфоцити.

Варваричева О.С. Влияние -излучения с малой мощностью дозы на клеточные реакции лимфоидных органов при хроническом воспалении. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 - патологическая физиология. - Харьковский государственный медицинский университет МЗ Украины, Харьков, 2007.

Диссертация посвящена изучению клеточных реакций лимфоидных органов при действии низкоинтенсивного -излучения в разных дозах на фоне хронического воспаления.

В работе использованы патофизиологические, физико-химические, гистологические, иммуногистохимические, статистические методы исследования. лімфоїдний випромінювання селезінка

В результате проведенного исследования установлено, что общее г-облучение в дозах 0.1, 0.5 и 1 Гр с малой мощностью дозы на фоне хронического воспаления, согласно данным хемилюминесценции, приводит к усилению процессов свободнорадикального окисления в тимусе, причем наиболее эффективной оказывается доза 0.1 Гр, относящаяся к диапазону малых доз; в то же время в селезенке имеет место обратная дозовая зависимость, связанная, по-видимому, с бьльшим содержанием макрофагов, активация которых приводит к "оксидантному взрыву" и сопровождающей ее активации антиоксидантной системы. Экспрессия белка-онкосупресора р 53 в лимфоцитах тимуса и селезенки возрастает с дозой (0.1, 0.5, 1.0 Гр) при облучении как к 3-м, так и к 7-м суткам воспаления; при этом увеличение экспрессии белка р 53 при облучении в дозе 0.1 Гр является незначительным, что свидетельствует об отсутствии его геном-регулирующей и онкосупрессорной активности при действии низкоинтенсивного г-излучения в малых дозах. г-облучение в указанных дозах с малой мощностью дозы приводит к замедлению акцидентальной трансформации тимуса, характерной для хронического воспаления, а также к усилению пролиферации тимоцитов. При этом в селезенке выявляются морфологические признаки антигенной стимуляции в виде гиперплазии белой пульпы, усиленных макрофагальной и плазмоцитарной реакций на фоне активной миграции иммунных клеток с максимальной выраженностью при дозах 0.1 и 0.5 Гр и истощением лимфоидного компонента при дозе 1.0 Гр. Низкоинтенсивное г-облучение в дозах 0.1, 0.5, 1.0 Гр приводит к существенному изменению характерного для хронического воспаления соотношения иммунных клеток в лимфоидной ткани в виде замедления опустошения Т-хелперного компонента за счет, по-видимому, уменьшения эмиграции клеток в очаг воспаления; снижения пролиферативной активности В-клеточного компонента и усиления пролиферации низкодифференцированного Т-клеточного компонента. Усиление процессов свободнорадикального окисления в лимфоидной ткани вместе с недостаточной онкосупрессорной активностью белка р 53 при действии низкоинтенсивного г-излучения в малых дозах на фоне хронического воспаления, а также стимуляция пролиферации клеток тимуса и селезенки, особенно низкодифференцированного клеточного компонента, при ослабленном иммунологическом надзоре могут указывать на увеличение вероятности опухолевой трансформации клеток лимфоидной ткани. При облучении к 3-м суткам хронического воспаления в тимусе и селезенке обнаруживаются антиоксидантные свойства, нивелирующие эффекты г-излучения, по-видимому, благодаря наличию значительных антиоксидантных резервов, сопровождающих "оксидантный взрыв" макрофагов.

Ключевые слова: хроническое воспаление, низкоинтенсивное г-излучение, клеточные реакции, тимус, селезенка, лимфоциты.

Varvarycheva O.S. The effect of low dose-rate г-radiation on cellular reactions of lymphoid organs at chronic inflammation. - A manuscript.

Dissertation for the candidate of medical science degree in speciality 14.03.04 - Pathologic Physiology. - Kharkiv State Medical University, Kharkiv, 2007.

The dissertation covers cellular reactions of lymphoid organs at action of low dose-rate г-radiation in different doses at chronic inflammation. Pathophysiological, physicochemical, histological, immunohistochemical and statistical methods were used.

The study allowed to establish that total low dose-rate г_irradiation at chronic inflammation results in intensifying of free radical oxidation in thymus, the dose 0.1 Gy appears to be most effective; antioxidant properties are highly evident in spleen. Expression of oncosuppressor р 53 protein in thymus and spleen lymphocytes increases with the dose of irradiation; at that increase of р 53 expression at irradiation in the dose 0.1 Gy appears to be negligible. Low dose-rate г_irradiation results in deceleration of accidental transformation in thymus, which is typical for chronic inflammation, and also in intensifying of thymocyte proliferation. At that morphological signs of antigen stimulation in spleen are revealed in the form of white pulp hyperplasia, increased macrophage and plasmocyte reactions on the background of active migration of immune cells with maximal intensity at doses 0.1 and 0.5 Gy and exhaustion of lymphoid component at dose 1.0 Gy. Low dose-rate г_irradiation in all doses causes change of immune cell proportion in lymphoid tissue typical for chronic inflammation in the form of deceleration of T-helper devastation, decrease of B-cell proliferation activity and intensifying of low-differentiated Т-cell component proliferation. Intensifying of free radical oxidation in lymphoid tissue along with insufficient oncosuppressor activity of р 53 protein at low dose-rate г_irradiation in small doses on the background of chronic inflammation, and stimulation of proliferation of thymus and spleen cells, especially of its low-differentiated cellular component, at weak immunological supervision can point out a high probability of tumour transformation of lymphoid tissue cells. At that, on 3rd day of inflammation antioxidative properties in thymus and spleen are revealed, which reduce irradiation effects due to considerable antioxidative reserves accompanying "oxidative burst" in macrophages.

Key words: chronic inflammation, low dose-rate г-radiation, cellular reactions, thymus, spleen, lymphocytes.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Запалення є основним типовим патологічним процесом, оскільки лежить в основі більшості існуючих хвороб. Доля хронічного запалення у структурі сучасних захворювань зростає з кожним роком (Маянский Д.Н., 1991; Ватутин Н.Т., Чупина В.А., 2000; Седоренко И.В., Кондратенко И.В. 2003). Тривала і персистуюча антигенна стимуляція флогогеном і компонентами пошкодженої тканини, що має місце при хронічному запаленні, веде до гіперстимуляції і дисфункції імунної системи з подальшим її виснаженням і розвитком імунодефіциту (Крыжановский Г.Н., 2002).

Відомо, що хронічне запалення є одним з основних факторів, що спричиняють або сприяють розвитку пухлинного росту (Coussens L.M., Werb Z., 2002; Murthy S., Winkler J.D., 2002). Імунна система відіграє, очевидно, важливу роль в трансформації хронічного запалення у пухлину, за рахунок можливих збоїв в забезпеченні належного імунологічного нагляду. Відомо також, що, ризик пухлинної трансформації значно зростає при імунодефіцитах, причому, найбільше збільшення частоти злоякісних новоутворень спостерігається у самій лімфоїдній тканині (Воробьев А.И., Кременецкая А.М., Харазишвили Д.В., 2000; Гайукова С.М., Сивак Л.А., 2003).

Незважаючи на значний прогрес в радіобіології, питання про біологічні ефекти іонізуючої радіації в малих дозах і з малою потужністю дози продовжує залишатися актуальним, оскільки такі параметри опромінювання відповідають радіаційним умовам в місцях колишніх ядерних катастроф (Бурлакова Е.В., Голощапов А.Н., Горбунова Н.В., 1996) і на низці виробництв, а з іншого боку, у зв'язку з неможливістю пояснити її ефекти з позицій класичної радіобіології. Відомо, що радіочутливість органів імунної і кровотворної систем є максимальною (Гродзинський Д.М., 2000).

Імунна система є сполучною ланкою при комбінації хронічного запалення і опромінювання, або, іншими словами, випромінювання може впливати на перебіг хронічного запалення, так само і запалення може змінювати радіаційну відповідь лімфоїдної тканини.

Підсумовуючи вищесказане, можна зробити висновок, що лімфоїдна тканина є найцікавішим об'єктом дослідження при комбінації хронічного запалення і дії г-випромінювання, особливо низькоінтенсивного і в малих дозах, оскільки події, що відбуваються у лімфоїдній тканині, можуть визначати перебіг хронічного запалення і реалізацію його онкогенного потенціалу, і в той же час лімфоїдна тканина є вразливим об'єктом відносно дії радіації при хронічному запаленні і розвитку пухлин.

До теперішнього часу механізми даних патологічних явищ вивчалися незалежно один від одного. Події в лімфоїдних органах, механізми клітинних реакцій і міжклітинних взаємовідношень в лімфоїдній тканині при дії низькоінтенсивного г-випромінювання на тлі хронічного запалення залишаються практично невивченими, що і стало метою даного дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційне дослідження виконане згідно з комплексним планом наукових досліджень ХДМУ МОЗ України і є самостійним фрагментом у рамках наукового напрямку університету "Вивчення загальних закономірностей патологічних процесів і розробка способів їх корекції" і кафедри патологічної фізіології. Комплексні теми кафедри: "Міжклітинні взаємодії та їх механізми у патогенезі запалення" (номер державної реєстрації U 004546, 2003-2005 рр.), "Гематологічні механізми хронізації запалення" (2006-2008 рр.). Автор виконувала дослідження стосовно теми дисертації.

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження - з'ясування клітинних реакцій лімфоїдних органів при дії низькоінтенсивного -випромінювання у різних дозах на тлі хронічного запалення.

Завдання дослідження:

Дослідити інтенсивність вільнорадикального окислення і стан антиоксидантної системи у тканинах тимусу і селезінки при дії низькоінтенсивного г-випромінювання у різних дозах на тлі хронічного запалення.

Визначити активність системи регуляції стабільності геному білка р 53 в лімфоцитах тимусу і селезінки при дії низькоінтенсивного г-випромінювання у різних дозах на тлі хронічного запалення.

Вивчити морфофункціональний стан тимусу і селезінки при дії низькоінтенсивного г-випромінювання у різних дозах на тлі хронічного запалення.

Об'єкт дослідження - механізми хронічного запалення в умовах дії низькоінтенсивного г_випромінювання.

Предмет дослідження - клітинні реакції лімфоїдних органів при дії низькоінтенсивного г-випромінювання на тлі хронічного запалення.

Методи дослідження: патофізіологічні, фізико-хімічні, гістологічні, імуногістохімічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показані особливості низки клітинних реакцій лімфоїдних тканин тимусу і селезінки при дії низькоінтенсивного -випромінювання у різних дозах (0.1, 0.5, 1.0 Гр), зокрема в малій дозі (0.1 Гр), на тлі хронічного запалення, а саме: посилення процесів вільнорадикального окислення у тимусі й селезінці; уповільнення акцидентальної трансформації тимусу, характерної для хронічного запалення, та посилення проліферації тимоцитів; гіперплазія білої пульпи селезінки, посилення тут макрофагальної і плазмоцитарної реакцій на тлі активної міграції імунних клітин; уповільнення спустошення Т-хелперного компоненту, зниження проліферації В-клітин і посилення - Т-клітин в лімфоїдній тканині. В той же час активність білка-онкосупресора р 53 є недостатньою, що в сукупності свідчить про зростання ймовірності пухлинної трансформації в лімфоїдній тканині при дії низькоінтенсивного _випромінювання на тлі хронічного запалення, особливо у малій дозі. Встановлені негайні й відстрочені ефекти низькоінтенсивного _випромінювання відносно показників, що вивчаються, залежність ефектів від дози опромінення та терміну запалення, до якого зроблено опромінення.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати розширюють існуючі уявлення про ефекти і механізми дії низькоінтенсивного г_випромінювання, зокрема, при хронічному запаленні, і, таким чином, мають значення для патофізіології і радіобіології. Вони можуть бути використані в подальшій науково-дослідній роботі, викладанні, при розробці принципів профілактики радіаційних впливів і патогенетичної терапії хворих із хронічними запальними захворюваннями, які піддалися впливу іонізуючого випромінювання. Дані про клітинні реакції лімфоїдних органів і дози опромінювання, при яких має місце ризик канцерогенезу в лімфоїдній тканині при хронічному запаленні, можуть мати значення для виявлення груп ризику серед осіб, що проживають на радіаційно забруднених територіях або працюють на підприємствах з підвищеним рівнем радіаційного фону.

Результати роботи впроваджено в навчальний процес на кафедрах патофізіології Харківського, Буковинського, Донецького, Луганського, Тернопільського, державних медичних університетів, Сумського державного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблений план роботи і методологія проведення досліджень, проведений патентно-інформаційний пошук за темою, виконані експерименти, обробка і підрахунок отриманих в ході експерименту даних з використанням фізико-хімічних, гістологічних, імуногістохімічних методів дослідження, статистична обробка, аналіз і узагальнення одержаних результатів, сформульовані основні положення і висновки, написані всі розділи дисертації.

Визначення хемілюмінесценції було проведене на базі ЦНДЛ ХДМУ за допомогою старшого наукового співробітника, к.мед.н. О.І. Мішури; вивчення морфологічних особливостей тимусу і селезінки - при консультаціях д.мед.н., професора кафедри патологічної анатомії ХДМУ І.В. Сорокіної, яким автор висловлює щиру подяку.

Апробація результатів дослідження. Матеріали дисертації були оприлюднені й обговорювалися на засіданні Харківського товариства патофізіологів (2006), науково-практичній конференції з міжнародною участю, присвяченій 200-річчю з дня заснування Харківського державного медичного університету (Харків, 2005), міжвузівських конференціях молодих учених "Медицина третього тисячоліття" (Харків, 2006, 2007), науковій конференції "V читання ім. В.В. Підвисоцького" (Одеса, 2006), V Міжнародному конгресі з патофізіології (Китай, 2006), Всеукраїнській науково-практичної конференції патофізіологів (Сімферополь, 2006), науково-практичній конференції з міжнародною участю "Вчені майбутнього" (Одеса, 2006), "Шостих Данилевських читаннях" (Харків, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць, з них 6 - статті в журналах за фахом, що входять до переліку ВАК України, 8 - тези у матеріалах конгресів та конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Матеріали дисертаційної роботи викладено на 168 сторінках друкованого тексту. Робота має такі розділи: вступ, огляд літератури, об'єкти і методи дослідження, 4 розділи власних досліджень, аналіз та узагальнення результатів дослідження, висновки, перелік використаних першоджерел літератури, який містить 215 назв: 131 роботу вітчизняних авторів та 84 - іноземних. Дисертаційна робота ілюстрована 41 рисунком та 29 таблицями (загальний обсяг - 1 стор).

Основний зміст роботи

Об'єкти і методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на 102 щурах-самцях лінії Wіstar масою 180 - 200 г, розведених у віварії ХДМУ. Піддослідних тварин утримували на звичайному харчовому раціоні з вільним доступом до води по 10 - 12 голів у стандартних металевих клітках. Для усунення впливу сезонних і добових коливань на показники, що вивчались, основні дослідження були проведені в осінньо-зимовий період, у ранкові години. Дослідження здійснювали відповідно до принципів Гельсінської декларації, прийнятої Генеральною асамблеєю Всесвітньої медичної асоціації (1964 - 2000 рр.), Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину (1997), відповідних положень ВООЗ, Міжнародної ради медичних наукових товариств, Міжнародного кодексу медичної етики (1983 р.), національних "Загальних етичних принципів досліджень на тваринах" (Україна, 2001), які узгоджені з положеннями "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей" (Страсбург, 18.03.1986 р.). Використовували мінімально допустиму для статистичної обробки і отримання вірогідних результатів загально прийняту кількість тварин (по 6 на групу), а також мінімальну для досягнення мети та вирішення завдань дослідження кількість експериментальних груп, тобто загальну кількість тварин. Усі болючі і стресові процедури виконували під легким ефірним наркозом. Умертвіння тварин здійснювали шляхом декапітації під ефірним наркозом. Як матеріал для досліджень було використано тканини тимусу та селезінки.

Моделлю запалення було карагіненове асептичне гранулематозне запалення, яке викликали за принципом попереднього створення підшкірного повітряного мішка. Для цього під шкіру спини вводили 8 мл стерильного повітря і через 24 години - 4 мл 2% розчину л_карагінену (Sіgma, США) в ізотонічному розчині хлориду натрію (Ghosh A.K., Hirasawa N., Niki H., 2000). Розчин карагінену автоклавували при 1210С протягом 15 хвилин.

Для опромінення використовували джерело гамма-випромінення OB-6, Німеччина (137Cs, 20 Ci) з потужністю дози 14,3 мкГр/год на відстані 1 м. Тваринами були отримані дози 0.1, 0.5 і 1.0 Гр протягом 4.8, 24 і 48 годин відповідно. Доза в 0.1 Гр лежить в області т.зв. малих доз (менш 0.2 Гр або 1 трек на ядро), ефекти дози в 1.0 Гр є достатньо вивченими при гострому опроміненні, доза в 0.5 Гр знаходиться в проміжній області. Щури першої серії були опромінені до 3-ї доби запалення. Їхнє виведення з експерименту здійснювали відразу після опромінення і на 7-у добу запалення. Тварини другої серії були опромінені до 7-ї доби. Виведення їх з експерименту проводили по закінченні опромінення і на 14-у добу запалення. Контролем були тварини, у яких викликали запалення, але опроміненню не піддавали. Крім того, 6 тварин були інтактними.

Інтенсивність вільнорадикального окислення і стан антиоксидантної системи вивчали за допомогою методу хемілюмінесценції. Хемілюмінесценцію тканин тимусу та селезінки досліджували за допомогою хемілюмінометра медичного ХЛМІЦ-01" (ЦНДЛ ХДМУ). Фільтрат тканини (50 мг тканини тимусу або 100 мг тканини селезінки на 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію) вносили до вимірювального термостатованого при 37оС бюксу хемілюмінометра. В бюкс додавали 1 мл 10% розчину перекису водню. Вимірювали інтенсивність максимального спалаху та залишкову інтенсивність хемілюмінесценції. Інтенсивність максимального спалаху відбиває інтенсивність вільнорадикального окислення, залишкова інтенсивність хемілюмінесценції визначає антиоксидантний резерв.

Експресію білка р 53 у клітинах тимусу і селезінки досліджували імуногістохімічно з використанням первинних моноклональних антитіл миші до білка p53 Mouse Anti-p53 PAb240 і лабораторної системи DakoCytamotion EnVision + Dual Link System-HRP DAB+ (Dako, США) (Brambilla E., Gazzeri S., Moro D., 1993). Гістологічні зрізи проводили через ксилол, спирти низхідних концентрацій (абсолютний спирт, 96% спирт, 70% спирт), дистильовану воду, розчин для демаскування антигену (DakoCytamotion Target Retrieval Solution, 30 хв. при 95 - 990С), після чого на препарати послідовно наносили розчин для інактивації ендогенної пероксидази (Dual Endogenous Enzyme Block, 10 хв. при кімнатній температурі), первинні антитіла в розведенні 1:100 з наступною інкубацією у вологій камері протягом 30 хв. при кімнатній температурі, вторинні антитіла, мічені пероксидазою хрону, з наступною інкубацією у вологій камері протягом 30 хв при кімнатній температурі, розчин діамінобензидину для візуалізації пероксидази (Substrate-chromogen + DAB), потім препарати забарвлювали гематоксиліном Майєра і закріплювали (Permanent Mounting Medium). Після кожного етапу препарати двічі промивали у фосфатному буфері протягом 5 хв. Мікроскопічне вивчення препаратів проводили з використанням мікроскопа "Olympus" BX51 при збільшенні х 400. Експресію білка p53 визначали за характерним оранжево-коричневим забарвленням ядер клітин. Показником був p53-індекс:

Морфологічні особливості тимусу і селезінки вивчали на парафінових зрізах товщиною 5-6 мкм за допомогою оглядового забарвлення гематоксиліном-еозином. Забарвлення препаратів за методом Ван Гізона використовували для виявлення і диференціювання сполучнотканинних структур. Для оцінки функціональної активності регенеруючих тканин використовували ШИК-реакцію. Імуногістохімічне дослідження проводили за допомогою прямого методу Кунса по методиці Brosman (Brosman M., 1979). Імунні клітини в тимусі та селезінці дифференціювали за допомогою щурячих моноклональных антитіл до CD3-, CD4-, CD8-, CD45RA- антигенів. Препарати вивчали в люмінесцентному мікроскопі ЛЮМАМ И-2. Підраховували відносні об'єми CD-імунопозитивних клітин, які експресують поверхневі рецептори до різних клонів імунних клітин, також підраховували імунорегуляторний індекс (відношення відносних об'ємів CD4+-клітин і CD8+-клітин).

Метод статистичного оброблення результатів. Статистичне оброблення результатів дослідження проводили з використанням t - критерію Стьюдента та непараметричного тесту Манна-Уітні за допомогою комп'ютерної програми SPSS 10.0 на ПЕОМ "Pentіum-4".

Результати дослідження та їхній аналіз. При визначенні хемілюмінесценції тимусу було виявлено, що опромінювання до 3-ї доби запалення викликає негайний радіаційний ефект, який полягає в збільшенні інтенсивності максимального спалаху хемілюмінесценції при дозах 0.5 і 1.0 Гр і падінні залишкової інтенсивності при всіх дозах. Відстрочений же радіаційний ефект відсутній. Отримані результати обумовлені, очевидно, високою радіочутливістю лімфоїдної тканини до опромінювання, оскільки 3-я доба запалення характеризується інтенсивною лімфоцитарною інфільтрацією вогнища хронічного запалення (Клименко М.О., Онищенко М. І. 2004) і, очевидно, посиленою проліферацією в лімфоїдній тканині. Відсутність ефекту на 7-у добу, можливо, говорить про виражену активацію компенсаторно-пристосувальних реакцій в лімфоїдній тканині, що приводить до швидкого відновлення тих змін, які відбулися при опромінюванні до 3-ї доби в якості негайного ефекту. При опромінюванні до 7-ї доби лише доза в 0.1 Гр виявляється ефективною, причому як негайно після опромінювання, так і через 7 діб. Слід зазначити, що на 7-у добу запалення лімфоцитарна реакція помітно стихає, відповідно лімфоїдна тканина в цей період є відносно радіорезистентною (порівняно з 3-ю добою запалення). В той же час, затихає "оксидантний вибух" і разом з ним активація антиоксидантної системи. Мабуть, саме тому доза в 0.1 Гр, будучи достатньо малою, щоб самостійно активувати антиоксидантну систему, призводить до значного збільшення інтенсивності максимального спалаху і залишкової інтенсивності хемілюмінесценції, тоді як дози в 0.5 Гр і 1.0 Гр активують антиоксидантну систему і, таким чином, не спричиняють ефекту.

При аналізі даних хемілюмінесценції тканини селезінки можна відзначити те, що у тварин всіх експериментальних груп виявляється зниження пікової інтенсивності хемілюмінесценції при опромінюванні в порівнянні з контролем, що вказує на зниження процесів перекисного окислення в тканинах селезінки при дії г-випромінювання. Очевидно, хронічне запалення, будучи фоном в даній постановці експерименту, змінює радіаційну відповідь і веде до незвичайної залежності пікової інтенсивності хемілюмінесценції тканин селезінки від дози опромінювання. При аналогічній постановці експерименту (Клименко М.О., Онищенко М.І., 2004) пікова інтенсивність хемілюмінесценції сироватки крові, в цілому, збільшувалася при опромінюванні до 3-ї доби запалення, а при опромінюванні до 7-ї доби дозова залежність мала бімодальний характер; при вивченні нами цього параметра в тканинах тимуса також спостерігалося зростання пікової інтенсивності хемілюмінесценції на 3-ю добу запалення, причому лінійне, а на 7-у добу виявлялося зростання тільки при дозі 0.1 Гр; в той же час при вивченні хемілюмінесценції вогнища запалення (Онищенко М.І., 2005), що визначає ланцюг патологічних подій в організмі в цілому, як і в даній роботі, виявляється зворотній дозозалежний ефект на 3-ю добу запалення і бімодальний на 7-у добу запалення. Зворотню дозову залежність можна, очевидно, пов'язати з "оксидантним вибухом", який супроводжує макрофагальну реакцію при запаленні. Як відомо, в селезінці велика кількість макрофагів, які, в свою чергу, також реагують "оксидантним вибухом" на запалення. При цьому посилюється антиоксидантна реакція, що може парадоксально змінювати радіаційну відповідь у вигляді появи зворотної дозової залежності пікової інтенсивності хемілюмінесценції. При аналізі змін показників хемілюмінесценції тканин селезінки при опромінюванні в пізніший термін, до 7-ї доби запалення, в цілому, значних змін параметрів, що вивчаються, в порівнянні з контролем не виявляється.

З метою визначення активності системи регуляції стабільності геному в лімфоцитах тканин тимусу і селезінки при опромінюванні на тлі хронічного запалення було проведене дослідження експресії білка р 53. Аналіз отриманих результатів показує, що при запаленні інтенсивність експресії білка р 53 в лімфоцитах тимуса і селезінки зростає в порівнянні з такою у інтактних тварин, за винятком запалення в терміні 14 діб. Збільшення може бути пов'язане з підвищеним пошкодженням ДНК медіаторами запалення, на що вказує пік в збільшенні експресії на 3-ю добу запалення, коли, як вказувалося, переважає ліфоцитарно-макрофагальна реакція. Лімфоцитарна реакція супроводжується підвищеною проліферативною активністю і, відповідно, більшою чутливість відносно факторів, що ушкоджують ДНК; макрофагальна реакція супроводжується "оксидантним вибухом", що призводить до збільшення вмісту активних форм кисню і оксиду азоту, причому не лише у вогнищі і крові, але і в інших тканинах, особливо в периферичних органах імунної системи. На 7-у добу запалення, коли макрофагально-лімфоцитарна реакція стихає, інтенсивність експресії р 53 в лімфоцитах тимуса і селезінки знижується і наближається до показників у інтактних тварин. Відсутність експресії р 53 на 14-у добу запалення, очевидно, можна пояснити апоптотичною загибеллю потенційно вразливих відносно пошкодження ДНК клітин, що вже трапилася протягом попереднього періоду запалення. Дія низькоінтенсивногог-випромінювання у всіх експериментальних групах веде до практично лінійного зростання експресії білка р 53 в лімфоцитах тимуса і селезінки здозою опромінення незалежно від терміну запалення. При цьому достовірне підвищення експресії щодо контролю спостерігається лише при дозі 1.0 Гр і у ряді випадків при дозі 0.5 Гр. На також лінійну дозову залежність експресії р 53 в клітинах вогнища хронічного запалення при аналогічній постановці експерименту вказують результати Klimenko N.A., Onyshchenko M.I. (2005). Отже, при дозі 0.1 Гр, яка характеризується найбільшою можливою ушкоджувальною дією на клітини активних форм кисню й азоту, продуктів перекисного окислення, спостерігається, навпроти, найнижча активність системи регуляції стабільності геному. У цих умовах особливо висока вірогідність реалізації онкогенного потенціалу хронічного запалення, яке супроводжується інтенсивною лімфоцитарною проліферацією в лімфоїдних органах.

Морфологічне дослідження тимуса і селезінки полягало в описі структури тканини цих органів з подальшими морфометрією і визначенням різних типів клітин імуногістохімічним методом. Встановлено, що хронічне запалення призводить до акцидентальної транформації тимуса різних ступенів у всі досліджувані терміни запалення, що є адекватною відповіддю на тривале антигенне і медіаторне стимулювання, властиве для хронічного запалення, причому, в пізніші терміни запалення (7-а і 14-а доба) виявляється гіперплазія тимуса, очевидно, як результат тривалого стресу, а також, можливо, внаслідок стимуляції кістковомозкового лімфопоезу. При дії низькоінтенсивного г_випромінювання практично у всіх випадках спостерігається посилення процесів проліферації в тканинах тимуса, що призводить до гіперплазії мозкової і кіркової речовин тимуса на тлі зниження темпів акцидентальної транформації на 3-ю добу запалення, що в ряді випадків приводить до нормалізації структури тканин. При цьому не виявляється чіткої дозової залежності інтенсивності проліферації, проте, у ряді випадків має місце бімодальний характер дозової кривої, що виявляє схожі клітинні відповіді при дозах 0.1 Гр і 1.0 Гр. При морфологічному вивченні селезінки було встановлено, що, очевидно, внаслідок антигенної та медіаторної стимуляції імунної системи відбувається посилення проліферації у фолікулах селезінки і міграції імунних клітин в селезінку, що морфологічно виявляється в збільшенні об'ємної частки білої пульпи. При цьому, в раніший термін запалення має місце макрофагальна реакція, яка стихає до пізніших термінів, що до певної міри відповідає клітинній динаміці вогнища хронічного запалення (Клименко Н.А., Шевченко А.Н., 2004).

Аналіз співвідношень різних типів клітин в лімфоїдній тканині показав, що на 3-ю добу хронічного запалення відбувається перерозподіл між зрілими і незрілими тимоцитами в тканині тимуса у бік збільшення кількості зрілих клітин з максимальним накопиченням Т-супресорів. У пізніші терміни запалення (7-а і 14-а доба) показники повертаються до норми. Вказана динаміка Т-клітинної ланки у тимусі може бути пов'язана з інтенсивним виходом Т-хелперів, які є зрілими клітинами, у напрямку вогнища запалення і периферичних органів імунної системи, оскільки саме в ранні терміни запалення відбувається інтенсивна антигенна стимуляція. Внаслідок цього відбувається клітинне спустошення тимусу. Крім того, запалення характеризується гіперплазією В-клітинного компоненту в тимусі з максимальною вираженістю також на 3-ю добу запалення. Як вказувалося, при цьому спостерігається акцидентальна трансформація різних ступенів поряд із стимулюванням процесів проліферації в тканині тимуса, особливо в пізніші терміни запалення. Подібні зміни спостерігаються і в периферичних лімфоїдних органах (у селезінці), де також відбувається зсув в структурі Т-клітинної ланки у бік збільшення Т-супресорного компоненту, а також помірна гіперплазія В-клітинного компоненту. Відзначені імуноморфологічні особливості підтверджують вищенаведені дані гістологічного дослідження селезінки. Слід вважати, що вказані реакції лімфоїдних органів є адекватними при хронічному запаленні (Дергачева Т.И., Шурлыгина А.В., Старкова Е.В., 2000) і полягають, очевидно, в інтенсивній еміграції лімфоцитів у вогнище запалення (найбільшою мірою - Т-хелперів), інтенсифікації проліферації і в апоптозі, що супроводжує проліферацію. Дія низькоінтенсивного г-випромінювання суттєвим чином видозмінює клітинні реакції лімфоїдних органів при хронічному запаленні. Так, у тимусі при опромінюванні до ранішого терміну запалення спостерігається збільшення відносного об'єму низькодиференційованої частини тимоцитів, що вказує на інтенсифікацію проліферації Т-клітинного компоненту тканини тимуса, тоді як гіперплазія В-клітинного компоненту суттєво сповільнюється. Крім того, очевидно, сповільнюється вихід Т-хелперів з тимусу у вогнище запалення, про що говорить збільшення відношення CD4/CD8 із ростом дози опромінювання. Подібні зміни в клітинній структурі спостерігаються також і в лімфоїдній тканині селезінки, проте тут дозова залежність має нелінійний характер з максимальною вираженістю ефекту при проміжній дозі опромінювання - 0.5 Гр. Крім того, спостережувані ефекти в периферичній лімфоїдній тканині виявляються і в пізніші терміни запалення (7-а і 14-а доба).

Виходячи з вищесказаного, можна таким чином уявити клітинні реакції лімфоїдних органів та їхні механізми при дії г-випромінювання в різних дозах і з малою потужністю дози на тлі хронічного запалення. Як показано на рисунку, хронічне запалення разом з дією г_випромінювання призводить, за даними хемілюмінесценції, до активації процесів перекисного окислення, часто з нелінійною дозовою залежністю. Активні форми кисню та оксиду азоту, що накопичуються, а також продукти, що утворюються внаслідок перекисного окислення, здатні призводити до поломок в структурі геному клітин лімфоїдної тканини. У випадку, якщо пошкодження ДНК зберігаються у часі, тобто помилки в структурі ДНК передаються іншим поколінням клітин так, що останні зберігають життєздатність, виникають мутації. Посилена проліферація, яка має місце при хронічному запаленні, стаючи ще більш вираженою при опромінюванні в малих дозах, призводить до закріплення мутацій, що утворилися. Крім того, посилення проліферації відбувається за рахунок низькодиференційованого клітинного компоненту лімфоїдної тканини. Вказані події, на тлі низького рівня експресії білка-онкосупресора р 53 і виснаження лімфоїдної тканини внаслідок тривалого антигенного та медіаторного стимулювання при хронічному запаленні, можуть вказувати на підвищений ризик пухлинної трансформації клітин лімфоїдної тканини, що мутували. Крім того, як вказувалося вище, збільшення

вмісту Т-хелперів у тимусі при дії г_випромінювання може вказувати на зменшення їх еміграції до вогнища запалення, що, поряд із загальним виснаженням лімфоїдних органів при хронічному запаленні, опромінюванні і посиленій проліферації в лімфоїдній тканині за рахунок низькодиференційованого клітинного компоненту, може призводити до зниження імунологічного нагляду у вогнищі запалення, і таким чином підсилювати його онкогенний потенціал. Слід зазначити, що інтенсифікація проліферації в лімфоїдних органах при дії г_випромінювання на тлі хронічного запалення, порушення співвідношення різних імунних клітин лімфоїдної тканини, зменшення еміграції Т-хелперів з тимусу на тлі виснаження лімфоїдних органів може говорити про порушення звичайного перебігу хронічного запалення, а саме, у вигляді зниження його вираженості, на що також вказують дані про зменшення вмісту макрофагів, лімфоцитів і фібробластів у вогнищі хронічного запалення при аналогічній постановці експерименту (Клименко М.О., Онищенко М.І., 2004). Крім того, згідно з паралельними даними (Клименко Н.А., Золотухин В.В., 2006), низько інтенсивне г_випромінювання при хронічному запаленні приводить до ослаблення моноцитарної і лімфоцитарної реакцій і посилення нейтрофільної реакції вогнища і периферичної крові, що також вказує на зниження вираженості хронічного запалення і загострення процесу. В той же час, можна стверджувати, що запалення має протирадіаційні антиоксидантні властивості у разі, якщо опромінювання здійснюється в ранні терміни запалення, в пік макрофагальної реакції, завдяки наявності значних антиоксидантних резервів, які супроводжують "оксидантний вибух" макрофагів. Особливо вираженим вказаний ефект є у селезінці, очевидно, завдяки великому вмісту в ній макрофагів.

Висновки

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове рішення актуальної наукової медичної задачі, що полягає у з'ясуванні впливу г_випромінювання з малою потужністю дози на клітинні реакції в лімфоїдних органах при хронічному запаленні. Характер встановлених клітинних реакцій може вказувати на збільшення ймовірності пухлинної трансформації в лімфоїдних органах при хронічному запаленні під впливом низькоінтенсивного г_випромінювання в малих дозах.

1. Загальне г-опромінювання в дозах 0.1, 0.5 і 1.0 Гр з малою потужністю дози на тлі хронічного запалення, згідно з даними хемілюмінесценції, призводить до посилення процесів вільнорадикального окислення у тимусі, причому найбільш ефективною є доза 0.1 Гр, що належить до діапазону малих доз; в той же час в селезінці має місце зворотня дозова залежність, пов'язана, очевидно, з великим вмістом макрофагів, активація яких призводить до "оксидантного вибуху" та активації антиоксидантної системи, що супроводжує його.

2. Експресія білка-онкосупресора р 53 в лімфоцитах тимуса і селезінки зростає із дозою (0.1, 0.5, 1.0 Гр) при опромінюванні як до 3-ї, так і до 7-ї доби запалення; при цьому збільшення експресії білка р 53 при опромінюванні в дозі 0.1 Гр є незначним, що свідчить про відсутність його геном-регулюючої і онкосупресорної активності при дії низькоінтенсивного г-випромінювання в малих дозах.

3. г-опромінювання у зазначених дозах з малою потужністю дози призводить до уповільнення акцидентальної трансформації тимуса, яка характерна для хронічного запалення, а також до посилення проліферації тимоцитів. При цьому в селезінці виявляються морфологічні ознаки антигенної стимуляції у вигляді гіперплазії білої пульпи, посилених макрофагальної і плазмоцитарної реакцій на тлі активної міграції імунних клітин з максимальною вираженістю при дозах 0.1 і 0.5 Гр і виснаженням лімфоїдного компоненту при дозі 1.0 Гр.

4. Низькоінтенсивне г-опромінювання в дозах 0.1, 0.5, 1.0 Гр призводить до суттєвої зміни характерного для хронічного запалення співвідношення імунних клітин в лімфоїдній тканині у вигляді уповільнення спустошення Т-хелперного компоненту за рахунок, очевидно, зменшення еміграції клітин до вогнища запалення; зниження проліферативної активності В-клітинного компоненту і посилення проліферації низькодиференційованого Т-клітинного компоненту.

5. Посилення процесів вільнорадикального окислення в лімфоїдній тканині разом з недостатньою онкосупресорною активністю білка р 53 при дії низькоінтенсивного г-випромінювання в малих дозах на тлі хронічного запалення, а також стимуляція проліферації клітин тимуса і селезінки, особливо низькодиференційованого клітинного компоненту, при ослабленому імунологічному нагляді можуть вказувати на збільшення ймовірності пухлинної трансформації клітин лімфоїдної тканини.

6. При опромінюванні до 3-ї доби хронічного запалення в тимусі та селезінці виявляються антиоксидантні властивості, що нівелюють ефекти г_випромінювання, очевидно, завдяки наявності значних антиоксидантних резервів, які супроводжують "оксидантний вибух" макрофагів.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Клименко М.О., Варваричева О.C. Вплив низькоінтенсивного г-випромінювання на хемілюмінесценцію тканин тимуса при хронічному запаленні // Експерим. і клін. медицина. - 2006. - №2. - С. 17 - 21. (Здобувачеві належать 80% роботи: отримані експериментальні результати, проведено їхній аналіз і узагальнення; інтерпретація отриманих даних здійснена спільно з науковим керівником).

2. Клименко Н.А., Сорокина И.В., Варваричева О.С. Морфологические изменения тимуса под влиянием низкоинтенсивного г-облучения при хроническом воспалении // Медицина сьогодні і завтра. - 2006. - № 3 - 4. - С. 42-49. (Здобувачеві належать 70% роботи: отримані експериментальні результати, проведено їхній аналіз і узагальнення; інтерпретація отриманих даних здійснена спільно з науковим керівником та патоморфологом д.мед.наук, проф. І.В. Сорокіною).

3. Клименко Н.А., Сорокина И.В., Варваричева О.С. Морфологические изменения в селезенке при действии низкоинтенсивного гамма-излучения на фоне хронического воспаления // Експерим. и клін. медицина. - 2006. - № 4. - С. 18-23. (Здобувачеві належать 70% роботи: отримані експериментальні результати, проведено їхній аналіз і узагальнення; інтерпретація отриманих даних здійснена спільно з науковим керівником та патоморфологом д.мед.наук., проф. І.В Сорокіною).

4. Клименко Н.А., Варваричева О.C. Хемилюминесценция тканей селезенки при действии гамма-излучения с малой мощностью дозы на фоне хронического воспаления // Медицина сьогодні і завтра. - 2007. - №1. - С. 4 - 8. (Здобувачеві належать 80% роботи: отримані експериментальні результати, проведено їхній аналіз і узагальнення; інтерпретація отриманих даних здійснена спільно з науковим керівником).

5. Клименко Н.А., Сорокина И.В., Варваричева О.C. Соотношение различных типов иммунных клеток в тимусе и селезенке при действии низкоинтенсивного гамма-излучения на фоне хронического воспаления // Експерим. і клін. медицина. - 2007. - №1. - С. 46 - 52. (Здобувачеві належать 70% роботи: отримані експериментальні результати, проведено їхній аналіз і узагальнення; інтерпретація отриманих даних здійснена спільно з науковим керівником та патоморфологом д.мед.наук, проф. І.В. Сорокіною).

6. Клименко М.О., Варваричева О.С. Експресія білка р 53 у лімфоцитах тимуса й селезінки щурів при дії низькоінтенсивного гамма-випромінювання на тлі хронічного запалення // Укр. радіол. журн. - 2007. - Т.15, № 1. - C. 71 - 75. (Здобувачеві належать 80% роботи: отримані експериментальні результати, проведено їхній аналіз і узагальнення; інтерпретація отриманих даних здійснена спільно з науковим керівником).

7. Клименко М.О., Ліпшиць Р.У., Єщенко В.Ю., Татарко С.В., Шевченко О.М., Павлова О.О., Кратінова М.А., Онищенко М.І., Козирєва Г.Ф., Шутова Н.А., Литвиненко О.Ю., Золотухін В.В., Бєда О.С. (Варваричева О.С.). Досягнення і перспективи досліджень Харківської школи патофізіологів // Матер. наук.-практ. конф. з міжнарод. участю, присвяченої 200-річчю з дня заснування Харківського державного медичного університету (Харків, 17 - 18 січня 2005 року). - Харків, 2005. - С. 285 - 286. (Здобувачеві належать 20% роботи, а саме: дані про вплив г-випромінювання на хемілюмінесценцію тканин тимусу при хронічному запаленні).

8. Бєда О.С. (Варваричева О.С.). Стан про- та антиоксидантної систем тканин тимусу при хронічному запаленні на фоні дії низькоінтенсивного гамма-випромінення // Матер. міжвуз. конф. молодих вчених "Медицина третього тисячоліття" (Харків, 2006). - Харків, 2006. - С. 3 - 4.

9. Klimenko N.A., Onyshchenko M.I., Varvarycheva O.S., Zolotukhin V.V. Cellular response on low dose - rate gamma - irradiation at chronic inflammation in rats // Chin. J. Pathophysiol. - 2006. - Vol. 22, №13. - P. 353. (Здобувачеві належать 30% роботи, а саме: дані про вплив г-випромінювання на експресію білка р 53 в лімфоцитах тимусу при хронічному запаленні).

10. Клименко М.О., Ліпшиць Р.У., Татарко С.В., Шевченко О.М., Павлова О.О., Онищенко М.І., Золотухін В.В., Шутова Н.А., Литвиненко О.Ю., Варваричева О.С., Савенко І.О., Перін В.О., Лупир М.В. Клітинні та молекулярні, локальні та системні механізми гострого та хронічного запалення // Проблемы достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения: Тр. Крым. гос. мед. ун-та. им. С.И. Георгиевского. - Симферополь, 2006. - Т. 142, № 3. - С. 218 - 219. (Здобувачеві належать 20% роботи, а саме: дані про вплив г-випромінювання на лімфоїдну тканину при хронічному запаленні).

11. Клименко М.О., Варваричева О.С. Вплив низькоінтенсивного гамма-випромінення на стан про- та антиоксидантної систем тканин тимусу при хронічному запаленні // Бюл. матер. наук. конф. ''V читання ім. В.В. Підвисоцького'' (Одеса, 2006). - Одеса, 2006. - С. 76 - 77. (Здобувачеві належать 80% роботи: отримані експериментальні результати, проведено їхній аналіз і узагальнення; інтерпретація отриманих даних здійснена спільно з науковим керівником).

12. Варваричева О.С. Морфологічні особливості тимусу щурів при дії низкоінтенсивного г-випромінювання на тлі хронічного запалення // Тез. доп. наук.-практ. конф. молодих вчених з міжнарод. участю "Вчені майбутнього"(Одеса, 2006). - Одеса, 2006. - С. 40-41.

13. Варваричева О.С. Морфологические изменения лимфоидных органов под влиянием низкоинтенсивного г-облучения при хроническом воспалении // Матер. міжвуз. конф. молодих вчених "Медицина третього тисячоліття" (Харків, 2007). - Харків, 2007. - С. 4 - 5.

Размещено на Allbest.ru