Белки-маркеры патологических состояний

В качестве идеальных тестов для ранней диагностики злокачественных опухолей предлагалось множество маркеров, однако решения этой проблемы до настоящего времени не найдено. Сложности обусловлены многообразием требований, предъявляемых к идеальному маркеру. Идеальный опухолевый маркер должен продуцироваться опухолевой клеткой в достаточных количествах, чтобы его можно было определить с помощью современных методов, он не должен присутствовать у здоровых людей и при доброкачественных опухолях, маркер должен выявляться на ранних стадиях опухолевого процесса, количество опухолевого маркера должно быть прямо пропорционально объему опухоли, этот маркер должен определяться еще до клинических проявлений опухоли, уровень идеального маркера должен коррелировать с результатами противоопухолевого лечения.

В клинических исследованиях используется ряд достаточно эффективных опухолевых маркеров, которые, однако, не всегда соответствуют всем вышеуказанным критериям в полной мере. Современные биохимические и иммунологические методы позволяют выявить новообразования, когда условное число опухолевых клеток достигает 10⁹-10¹⁰, а минимальный уровень секретируемого опухолью маркера -- от одного до нескольких фемтомолей (все цифры в пересчете на 1 мл сыворотки крови). Большая эффективность использования опухолевых маркеров в клинике может быть достигнута путем комбинации разных тестов. Следует отметить, что количество предлагаемых маркеров для диагностики и мониторинга злокачественных новообразований постоянно увеличивается и наступает этап критической их переоценки с целью формирования стратегии и адекватного использования.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ МАРКЕРОВ

Определение концентрации опухолевых маркеров при различных новообразованиях требует знания факторов как in vivo, так и in vitro,влияющих на полученные результаты или искажающих их. Это необходимо в равной степени учитывать не только врачам-лаборантам, но и врачам, непосредственно отвечающим за наблюдение и лечебный процесс конкретного больного. Ниже перечислены основные факторы, влияющие на определение опухолевых маркеров.

In vivo:

степень экспрессии и синтеза маркера;

высвобождение маркера опухолевыми клетками;

прием лекарственных и химиотерапевтических препаратов;

экскреция из организма;

масса опухоли;

распространенность опухоли;

интенсивность кровоснабжения опухоли;

режим больного;

положение тела пациента во время забора образца крови;

ятрогенное воздействие;

инструментальные и неинструментальные методы обследования (например, бронхоскопия или биопсия);

катаболизм опухолевого маркера (например, функциональное состояние печени и почек);

вредные привычки (курение, прием алкоголя).

In vitro:

условия хранения образцов;

интервал времени между забором крови и центрифугированием (при отделении сыворотки);

степень гемолиза и желтушности;

контакт емкостей для забора образцов крови с кожей;

загрязнение образца слюной;

влияние лекарственных препаратов;

наличие антител к мышиным иммуноглобулинам в крови пациентов (после диагностической иммуносцинтиграфии и иммунотерапии);

методическая ошибка определения опухолевого маркера.

Необходимо учитывать, что большинство циркулирующих в крови опухолевых маркеров непригодны для скринингового обследования пациентов при отсутствии симптомов, поскольку существует ряд ограничений, связанных с зачастую низкими диагностическими чувствительностью и специфичностью, а также с ограниченностью прогностической ценности. Вместе с тем существует ряд общепризнанных случаев, когда без определения опухолевых маркеров трудно обойтись.

Это, во-первых, оценка эффективности терапии. На ранних этапах изменения концентрации опухолевого маркера могут показать, будет ли успешна выбранная химиотерапия или же (в случае устойчивого роста концентрации) необходима коррекция терапии вплоть до отмены. Конечно, тестирование опухолевого маркера абсолютно не имеет смысла в тяжелых онкологических случаях.

Во-вторых, мониторинг течения заболевания. Использование опухолевых маркеров для мониторинга течения новообразования нередко позволяет обнаружить метастазы и/или рецидив опухоли на 3-5 мес и более раньше клинических проявлений болезни. У некоторых пациентов тестирование опухолевых маркеров после хирургического удаления первичного очага опухоли может обеспечить более чувствительный мониторинг, чем эндоскопия, ультрасонография или компьютерная томография. Скорость возрастания уровня опухолевого маркера обычно позволяет в ряде наблюдений сделать заключение о природе прогрессирования заболевания, в частности о метастазировании. Знание характера изменений уровня опухолевого маркера позволяет также оптимизировать время последующего детального обследования пациента. При сохранении низкого или нормального уровня опухолевого маркера в течение достаточно длительного времени последующее обследование, включающее инвазивные или дорогостоящие методики, представляется излишним. Наоборот, если уровень опухолевых маркеров возрастает, а информация о прогрессировании заболевания необходима при решении вопроса о тактике лечения, такие исследования показаны.

В-третьих, идентификация резидуальных и рецидивных опухолей. Неадекватное слабое снижение уровня опухолевого маркера или отсутствие снижения вообще свидетельствует о неполном удалении опухоли либо о наличии множественных опухолей (метастазов). Информация такого рода может иметь терапевтическую и прогностическую значимость.

И наконец, в-четвертых, прогнозирование течения опухолевого процесса. Это крайне интенсивно развивающаяся современная область применения опухолевых маркеров, в частности таких, исследование которых связано с прогнозом и соответственно в первую очередь влияет на выбор терапии.

КОЛОРЕКТАЛЬНЫЙ РАК

В европейских странах колоректальным раком (КРР) заболевает 1 из 20 человек. Реже этот вид рака встречается в Африке и некоторых частях Азии. Сейчас в России частота выявления КРР монотонно возрастает.

В настоящее время использование молекулярных методов в диагностике КРР считается очень перспективным и важным направлением исследований, это связано с тем, что события, происходящие на уровне генома, следует считать ключевыми в возникновении и прогрессировании этих новообразований. Существует целый ряд достоверных фактов, свидетельствующих о том, что КРР на ранних стадиях развития может и должен идентифицироваться молекулярными методами. Методы молекулярной диагностики КРР позволяют также назначить адекватное лечение и достаточно точно прогнозировать результат.

КРР развивается в результате последовательных изменений (дисплазия/аденома-аденокарцинома), в основе которых лежат генетические нарушения. Однако механизмы, ответственные за возникновение и накопление в эпителиальной клетке таких нарушений, изучены не до конца. Примером трудностей, стоящих на пути изучения этой проблемы, является тот факт, что имеются различия в частоте возникновения доброкачественных и злокачественных фаз болезни, а именно в последовательности дисплазия/аденома-аденокарцинома. Доказано, что колоректальные аденомы возникают более чем у половины населения к 9-му десятилетию жизни, а КРР развивается только у 5% населения. Следовательно, только единичные из предраковых изменений трансформируются в рак.

Так, наряду с пожилым возрастом и хроническими воспалительными заболеваниями (неспецифический язвенный колит, болезнь Крона или шистосомоз с вовлечением толстой кишки) наличие КРР у кровных родственников -- признанный, если не основной, фактор повышенного риска. Причины, которые вызывают развитие КРР у членов одной семьи, могут варьировать от редких аутосомных доминантных синдромов с высокой заболеваемостью КРР (семейный аденоматозный полипоз, синдром наследственного неполипозного КРР) до менее ясных в генетическом отношении состояний, таких, например, как обнаружение аденомы у ближайших кровных родственников (родитель, родной брат или ребенок). Известно, что чем в более молодом возрасте возник КРР, тем выше статистический риск возникновения его у близких родственников. Наследственные синдромы КРР представлены в табл. 4.6 согласно фенотипу и мутациям в соответствующих генах.

Следует отметить, что изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе редких наследственных синдромов, способствовало пониманию патогенеза спорадического КРР, который наблюдается значительно чаще в популяции, но в основе которого лежат аналогичные или похожие молекулярные события.

Роль молекулярно-генетических нарушений в возникновении КРР и, в частности, нестабильности генома стала интенсивно изучаться относительно недавно. В 1993 г. у членов семей, больных наследственным неполипозным раком толстой кишки (РТК), была найдена нестабильность микросателлитов (MSI). Это открытие послужило основой гипотезы мутаторного фенотипа возникновения рака, выдвинутой Loeb, согласно которой клетка должна пережить целый ряд мутаций, чтобы стать злокачественной. Но для этого она исходно должна иметь способность мутировать чаще, чем в норме, а это в свою очередь может быть связано с инактивацией механизмов, отвечающих в норме за сохранность структуры ДНК.

Почти во всех случаях РТК отмечается или хромосомная нестабильность, или нестабильность MSI. Фактически между этими двумя нарушениями существует обратная зависимость. Так, злокачественные опухоли, в которых имеется нестабильность MSI, обычно диплоидные и не имеют хромосомных аберраций. Опухоли, в которых имеется хромосомная нестабильность, характеризуются анеуплоидией и часто сопровождаются потерей или появлением добавочных хромосом. Столь частое обнаружение хромосомной нестабильности или нестабильности MSIсвидетельствует в данном случае не о том, что это весьма распространенное и неспецифическое явление в процессе возникновения любой злокачественной опухоли, а о том, что нестабильность генома тесно ассоциирована с туморогенезом.

И хромосомная нестабильность, и нестабильность MSIмогут быть обнаружены на самых ранних стадиях РТК. Так, используя сравнительную гибридизацию генома для определения среднего числа ошибок при копировании, удалось показать их постепенное увеличение при прогрессировании аденомы с дисплазией легкой степени в аденомы с дисплазией тяжелой степени и последующей трансформацией в рак (табл. 4.8).

У пациентов с наследственной предрасположенностью вследствие нарушений гена АРС, включающих нарушения последовательности нуклеотидов и экспрессии гена, возникают опухоли, обычно развивающиеся вследствие хромосомной нестабильности, которая характеризуется потерей аллелей и цитогенетическими нарушениями. Опухоли у части пациентов со спорадической формой КРР возникают таким же путем.

Напротив, у пациентов с синдромом наследственного неполипозного КРР вследствие мутации в гене, исправляющем ошибки ДНК, возникают опухоли, характеризующиеся нестабильностью MSIи нуклеотидов, выявляемых в виде повторяющихся нуклеотидных последовательностей, некоторые из которых располагаются в кодонах генов. Потеря аллелей наблюдается редко. Такой тип молекулярной патологии также наблюдается примерно в 15% случаев спорадических КРР и часто связан с патолого-анатомическими особенностями, такими, как расположение в проксимальных отделах кишки (восходящей ободочной кишке); низкая дифференцировка клеток опухоли с ослизнением, медуллярным или перстневидно-клеточным компонентом; наличие значительного числа лимфоидных фолликулов с зародышевыми центрами по периферии опухоли; инфильтрация опухоли лимфоцитами.

Неэффективная транскрипция генов в результате аберрантного метилирования последовательностей цитозин-гуанин (Ц-Г- 13 Клиническая биохимия островки) в промоторных участках генов в настоящее время рассматривается как один из компонентов молекулярного патогенеза третьего подвида КРР.

Использование методов молекулярной диагностики у пациентов имеет большой потенциал как в ранней диагностике и оценке ответа опухоли на терапию, так и в прогнозе заболевания. При такой диагностике можно использовать различные объекты исследования.

У тех пациентов, у которых уже имеется КРР, молекулярные методы могут быть использованы для идентификации микрометастазов, для более точной оценки стадии опухолевого процесса, в частности выявления микрометастазов в лимфатических узлах, или для оценки возможной гематогенной диссеминации опухолевых клеток в костный мозг.

Диагностика микрометастазов и оценка гематогенной диссеминации Диагностика, скрининг и динамическое наблюдение Диагностика наследственных синдромов.

Кроме того, молекулярная диагностика обладает большим потенциалом для выявления генотипических и фенотипических характеристик опухоли, которые обусловливают целую цепь событий, приводящих к метастазированию клеток, -- так называемый метастатический генотип и фенотип. Маркеры этого типа могли бы указывать на большую вероятность прогрессирования опухолевого процесса после радикальной операции.

Генетические нарушения, связь которых с прогнозом или ответом на химиотерапию КРР была установлена, включают потери аллелей в 18q, исчезновение экспрессии продукта гена DCC, нарушения в гене р53, потерю аллелей на коротком плече хромосомы 1 и 5, RAS-мутации. Исследования клинической эффективности использования таких молекулярных маркеров были убедительно сформулированы, в настоящее время проводятся и включают в себя репрезентативную популяционную выборку. Для широкого использования в клинической практике исследования молекулярных маркеров должны удовлетворять всем требованиям, предъявляемым к рутинным лабораторным тестам, таким, как воспроизводимость, доступность, адекватный контроль качества. Наконец, результаты исследования молекулярных маркеров должны легко интерпретироваться клиницистами и иметь терапевтическое значение.

Сложность и многоступенчатость генетических и биохимических процессов, протекающих в раковых клетках, которые позволяют им метастазировать, обусловливают трудность интерпретации значений таких маркеров. Кроме того, факторы, не связанные с опухолью непосредственно, например качество хирургической техники, значительно влияют на конечный результат. Среди маркерных генов опухоли, прогнозирующих терапевтический ответ, внимание было сосредоточено на р53 и генах, ответственных за апоптоз, которые регулируются р53.

Одной из областей молекулярно-генетического изучения опухолей является выявление молекулярных нарушений, характерных для более позднего развития метахронных опухолей, иногда ошибочно рассматриваемых как рецидив основной опухоли. Такие исследования включают изучение колоректальных аденом в качестве мишени для идентификации маркерного гена из-за их высокой частоты в популяции как предракового изменения по сравнению с низкой частотой выявления злокачественных опухолей. Молекулярный маркер, указывающий на высокую вероятность развития метахронных аденом, особенно аденом, способных трансформироваться в злокачественную опухоль, мог бы быть полезен для определения групп риска с целью последующего колоноскопического скрининга.

Напротив, тех пациентов, у которых метахронные аденомы вряд ли будут прогрессировать, можно исключить из скрининга. Стратегия удаления аденом показала, что она связана с уменыие- нием частоты КРР и молекулярные маркеры, идентифицирующие пациентов с более высоким риском, могли бы быть полезны.

Исследование проб кала и крови имеет так же большой потенциал. Так, использование весьма простого теста на скрытую кровь в кале позволило снизить смертность от КРР, однако его специфичность остается относительно низкой. Молекулярные тесты на обнаружение в кале фрагментов опухолевой ДНК являются более прогрессивными. Целый ряд исследований показал, что ДНК, содержащая мутации, может быть идентифицирована в кале и крови пациентов, у которых имеются опухоли с этими мутациями. Диагностика опухолей, скрининг и динамическое наблюдение за больными могут существенно улучшиться, если будут преодолены определенные технические трудности и сбалансированы затраты на их проведение.

В настоящее время большое внимание исследователи уделяют изучению перспектив использования молекулярно-генетических маркеров КРР. Ниже дается краткая характериситика опухолевых маркеров, которые уже сейчас наиболее часто используются в клинической практике.

Раково-эмбриональный антиген

Впервые раково-эмбриональный антиген (РЭА) обнаружили в 1965 г. Goldn Freedman при исследовании тканей желудочно- кишечного тракта человека и аденокарциномы толстой кишки. Позже РЭА был выявлен в сыворотке крови больных КРР. Эти первые работы были весьма обнадеживающими. Тогда многим казалось, что найден высокоспецифический тест для диагностики РТК. Однако в последующем по мере совершенствования методов обнаружения РЭА и накопления клинических данных этот маркер удалось выделить и при других опухолях (раке поджелудочной железы, печени, легкого, щитовидной железы и нейробластоме), а также при неопухолевых заболеваниях (циррозах печени, язвенных колитах, панкреатитах, хронических бронхитах, эмфиземе, вирусном гепатите, дивертикулите, полипах, почечной недостаточности). Поэтому нельзя при выявлении РЭА абсолютно точно утверждать, что у больного данный тип рака. Вместе с тем до сих пор РЭА остается маркером первого выбора при КРР и используется с высокой эффективностью в мониторинге заболевания, но главное внимание при этом уделяют количественным параметрам метода.

У 99% здоровых людей уровень РЭА равен менее 5 нг/мл. При КРР чувствительность теста колеблется от 25 до 80% и зависит от размеров и степени дифференцировки опухоли, а также распространенности процесса. Уровень РЭА коррелирует со стадией опухолевого процесса. Так, по суммированным данным разных авторов в соответствии со стадиями по классификации Dukesдля антигена было характерно нарастание его концентрации: при стадии А -- 7,8 нг/мл, В -- 30,3 нг/мл, С -- 58,1 нг/мл, D-- 134,3 нг/мл. При этом частота выявления РЭА (при пороговом значении маркера 5 нг/мл) в группах больных с указанными стадиями нарастала и соответствовала 3, 25, 45 и 65%, а при пороговом значении маркера > 2,5 нг/мл обнаруживалась еще чаще при вышеуказанных Dukes-стадиях и соответствовала 28, 45, 75 и 84%. С учетом того что при стадии А и В опухолевый маркер повышен только у 3-28% больных, его использование в ранней диагностике КРР проблематично. Высокодифференцированные опухоли активнее продуцируют РЭА.

По данным многих авторов, маркер обладает прогностической значимостью, которая заключается в том, что высокий исходный уровень РЭА в сыворотке крови (более 25 нг/мл) свидетельствует о высоком риске развития раннего рецидива КРР после хирургического удаления опухоли.

Одним из примеров использования РЭА является определение радикальности хирургического вмешательства при КРР. Как правило, после радикального хирургического удаления опухоли уже к концу 6-й недели концентрация антигена становится ниже нормы. Если уровень маркера не падает после удаления первичной опухоли, следует думать, что у больного есть метастазы. Рекомендуется определять РЭА у больных в послеоперационном периоде через 3 мес на протяжении 2 лет. Регулярный мониторинг больных КРР с включением определения РЭА улучшает показатели 5-летней выживаемости. Адъювантная химиотерапия (5-фторурацил и левамизол) у больных КРР может вызывать преходящее повышение уровня РЭА в сыворотке крови. Не рекомендуется рутинно определять РЭА в мониторинге ответа на терапию, однако никаких альтернативных тестов в оценке ответа на лечение у больных КРР пока нет.

У большинства больных РТК (79,1%) по сравнению с группой контроля (10%) обнаружены IgM- и IgG-антитела к РЭА, что также позволяет использовать этот показатель как диагностический маркер и независимый фактор прогноза. При этом выявление антител к РЭА в сыворотке крови больных КРР ассоциируется с лучшим прогнозом и значительным увеличением показателя 2-летней выживаемости.

Анализ уровня РЭА в смывах толстой кишки до проведения рутинного эндоскопического исследования показал, что этот простой тест может быть полезным в практической медицине для выявления группы пациентов с высоким риском развития КРР.

Применение РЭА в диагностических целях ограничено его низкой специфичностью, обусловленной повышением концентрации антигена в сыворотке крови при неопухолевых заболеваниях, а также влиянием на синтез этого маркера некоторых экзогенных и эндогенных факторов. Поэтому при обследовании больных с опухолями толстой кишки в качестве маркера второго выбора используют СА-19-9 (см. ниже). Особое значение это имеет при РЭА-негативных новообразованиях.

Учитывая низкую чувствительность и специфичность, также не рекомендуется использовать определение РЭА в скрининге КРР. В случае 5-кратного повышения РЭА в сыворотке крови и наличия клинических жалоб у больного следует предполагать КРР.

СА-19-9 и а-фетопротеин

Сравнительный анализ 3 опухолевых маркеров (СА-19-9, РЭА и а-фетопротеина) в сыворотке крови больных РТК при различных стадиях опухолевого процесса, у больных хроническим язвенным колитом и у практически здоровых людей выявил достоверное различие между больными локализованным РТК и хроническим язвенным колитом по уровню СА-19-9 и РЭА, а также между локализованным и генерализованным РТК по двум вышеуказанным опухолевым маркерам. Значения опухолевых маркеров при хроническом язвенном колите не превышали таковые в норме. При локализованном процессе уровень СА-19-9 не превышает 1000 ед/мл, РЭА -- 20 нг/мл. Показатели а-фето- протеина у больных КРР находятся в пределах нормы и повышаются, как правило, только при генерализации опухолевого процесса, что не позволяет использовать этот маркер в диагностике заболевания. При использовании комплекса СА-19-9+РЭА диагностическая чувствительность составляет 91% и значительно превышает таковую при использовании только одного опухолевого маркера. Присоединение к инструментальным методам диагностики данных по определению опухолевых маркеров (СА-19-9 и РЭА) повышает частоту выявления локализованного КРР на 14%, а при генерализации процесса -- на 9%.

Маркеры апоптоза

Для опухолей характерен дисбаланс между процессами пролиферации и апоптоза. Эндотелии-1 -- полипептид из 21 аминокислотного остатка -- обладает вазоконстрикторной и митогенной активностью, а также вовлечен в механизмы регуляции апоптоза. В эксперименте показано, что эндотелии-1 является фактором выживания и способен invitro защищать клетки РТК от FasL-индуцированного апоптоза.

Частота выявления и уровень растворимого Fas-антигена (sFas) -- ингибитора апоптоза -- в сыворотке крови больных РТК выше, чем у практически здоровых людей. Отмечена тенденция к повышению содержания sFasв сыворотке крови больных РТК с метастазами в регионарных лимфатических узлах и печени, что позволяет обсуждать роль Fas/FasL-системы как возможную мишень противоопухолевой терапии у больных КРР.

Показано, что высокая активность каспазы-3 коррелирует с высоким риском рецидива РТК, особенно в случаях правосторонней его локализации. Также выявлена корреляция активности каспазы-3 с CD57+ опухольинфильтрирующими клетками.

Важную роль в механизмах регуляции апоптоза при РТК играет bcl-2, который экспрессируется в норме клетками, выстилающими донную часть крипт толстой кишки. Показано, что экспрессия bcl-2 при РТК DukesВ-стадии ассоциируется с лучшей выживаемостью больных и соответственно пациентам, у которых опухоли не экспрессируют bcl-2, целесообразно проводить адъювантную терапию.

Экспрессия иммунореактивного р53 в первичной опухоли при КРР является маркером высокого риска рецидива заболевания после хирургического ее удаления и чаще после 1-го года наблюдения. При этом повышенная экспрессия р53 выявлялась в 47, а РЭА -- в 34,4% опухолей. Полагают, что при оценке прогноза КРР необходимо определение обоих маркеров.

Известно, что генетические повреждения отличают первичные карциномы проксимального и дистального отделов толстой кишки. Так, многофакторный анализ экспрессии р53 в первичных КРР чаще выявляет повышенную экспрессию р53 в дистальных (58,5%), чем проксимальных (41,7%) РТК. При этом безрецидивный период меньше в р53+ опухолях (75 и 38%; соответственно р=0,006). Высокий риск рецидива КРР отмечен среди р53+ опухолей при их дистальной локализации. Следовательно, оценка экспрессии р53 при КРР может служить маркером раннего рецидива заболевания и связана с локализацией опухоли в органе.

Доказано, что неудачи химиотерапии КРР связаны с множественной лекарственной резистентностью этих новообразований. Показано, что экспрессия различных изоформ CD44 ассоциируется с агрессивным поведением опухоли и ставит вопрос о том, модулирует ли сигнал от этого рецептора лекарственную чувствительность опухоли. Также доказано, что CD44 индуцирует активацию src-семейства тирозинкиназы LYNи Akt. Способность супрессировать апоптоз может играть решающую роль в развитии опухолей толстой кишки, что связано с экспрессией CD44.

Активаторы и ингибиторы системы плазминогена

В последние годы пристальное внимание исследователей привлекает изучение металлопротеиназ внеклеточного матрикса, которые тесно связаны с процессами инвазии и метастазирования опухолей. При развитии метастазов должна иметь место цепь последовательных событий, приводящих к выходу опухолевых клеток из их первоначального окружения и образованию опухолевых узлов в отдаленных органах и тканях. Предполагается, что для обеспечения процессов инвазии и метастазирования нужна комплексная протеолитическая цепочка, включающая различные протеазы. Считается, что плазмин, уменьшающий уровень внеклеточных матричных гликопротеидов и активирующий некоторые про-металлопротеазы, играет решающую роль в процессах инвазии и метастазирования, при этом в многоступенчатой цепочке протеаз ключевую позицию занимает сериновая протеаза -- активатор плазминогена урокиназного типа (иРА), поскольку она катализирует образование плазмина из его предшественника плазминогена. Важную роль играет также рецептор иРА (Рц-иРА), так как при связывании иРА с рецептором его способность активировать плазминоген увеличивается. С другой стороны, в тканях РТК могут присутствовать ингибиторы иРА -- PAI-1 и PAI-2. Показано, что уровень иРА и PAI-1 в КРР выше, чем в гомологичной нормальной ткани и доброкачественных опухолях.

Вопрос о том, является ли иРА при РТК у человека производным самих раковых клеток или элементов окружающей стромы (фибробласты, макрофаги, лейкоциты), долгое время оставался без ответа. В конце концов Harveyи соавт. удалось доказать, что активатор происходит из самих раковых клеток, а не заимствуется ими из элементов стромы, при этом антиген наиболее интенсивно выявляется в апикальной и базальной областях клеток РТК.

Наиболее репрезентативное исследование компонентов системы активации плазминогена в образцах КРР было проведено Fujiiи соавт., они анализировали также экспрессию генов иРА и PAI-1 с использованием метода ПЦР. Экспрессия иРА была обнаружена в 58,8% опухолей. У пациентов с положительными результатами теста на иРА и отрицательными результатами на PAI-1 прогноз 5-летней выживаемости был достоверно хуже. Многофакторный анализ показал, что результаты одновременного определения иРА и PAI-1 в КРР являются независимыми прогностическими показателями.

Выживаемость больных после операций не коррелировала с содержанием иРА в строме опухоли, однако была отмечена закономерность, связанная с его уровнем в эпителии опухоли, т. е. определение уровня иРА вполне может быть тестом для диагностики РТК еще без метастазов, а также риска раннего развития рецидива после операции. Возможно, что протеазы могут быть мишенью лекарственных препаратов, предотвращающих инвазию и метастазирование КРР.

Метастазы в печень -- важный фактор, ограничивающий прогноз у больных РТК. Существует корреляционная связь между иРА и печеночными метастазами. Трансдукция гена tPAв клетки РТК может быть полезна с точки зрения противодействия печеночным метастазам.

Наименее изученным в клиническом плане компонентом системы активации плазминогена считается Рц-uPA, который представляет собой мембранно-связанный трехдоменный гликопептид. Этот рецептор может также существовать в растворимой форме (рРц-uPA) в экстрактах из опухоли, а также в плазме крови как здоровых людей, так и больных раком. Растворимый Рц-uPAв плазме является практически неизмененной молекулой, однако ни точный механизм его высвобождения с поверхности клеток, ни его биологическая функция до конца не изучены. Повышенный уровень рРц-uPAв плазме крови был обнаружен у больных РТК, а концентрация рРц-uPAсвязана с прогнозом заболевания. Возможно, что Рц-uPAмогут вносить весомый вклад в усиление ангиогенеза вокруг опухоли, равно как и в процессы метастазирования по микрососудам.

Таким образом, повышенная экспрессия Рц-uPA, характеризующая инвазивную способностью опухоли invitroпо крайней мере в некоторых субпопуляциях клеток РТК, является частично следствием постоянной активации сигнального каскада, зависящего от митогенактивированных протеинкиназ.

Рецепторы факторов роста

Одной из важных регуляторных систем передачи митогенного сигнала является семейство тирозинкиназных рецепторов -- продуктов онкогенов группы с-erbB, в которое входят 4 сходных по структуре трансмембранных рецептора -- рецептор эпидермального фактора роста (РЭФР или ErbBl), а также ЕгЬВ2 (HER2/neu), ЕгЬВЗ (HER3) и ErbB4 (HER4). Помимо структуры, эти рецепторы различаются между собой по относительной специфичности и сродству к различным общим лигандам. После активации в результате связывания лигандов и димеризации внутренняя тирозинкиназа рецепторов активируется и приобретает способность фосфорилировать как сам рецептор, так и другие клеточные белки, участвующие в передаче митогенного сигнала.

В аутокринной и паракринной регуляции пролиферации клеток КРР участвуют различные ростовые факторы. В последние годы активно изучается клиническое значение рецепторов факторов роста и их лигандов при КРР, в первую очередь РЭФР, рецептора инсулиноподобного фактора роста типа 1 (РИФР-1), рецептора фактора роста эндотелия сосудов (R-VEGF).

РЭФР -- продукт онкогена с-erbBl, представляющий собой трансмембранную тирозинкиназу, -- наиболее изученный в клиническом плане маркер данной группы при опухолях различной локализации, но недостаточно исследованный при КРР.

Рецепторы семейства ЕгЬВ могут образовывать как гомо-, так и гетеродимеры, при этом во многих случаях наиболее активными являются гетероструктуры с участием второго представителя этого семейства -- HER2/neu, не имеющего собственного лиганда. Таким образом, HER2/neuявляется ключевым звеном передачи митогенных сигналов ЭФР-подобных факторов роста и его блокирование может существенно замедлить или остановить рост опухолей, зависимых от подобных стимулов. Полагают, что повышенная экспрессия HER2/neuв опухолях, в том числе и при КРР, может служить маркером чувствительности и мишенью для более эффективной биотерапии этих новообразований. Клинические исследования продолжаются, и в литературе представлены предварительные работы, посвященные изучению экспрессии HER2/neuв прогнозе опухолей ЖКТ.

РИФР-1 и РИФР-2 являются потенциальными митогенами и сильными стимуляторами роста опухолевых клеток. Ростостимулирующие эффекты обоих типов РИФР опосредуются, главным образом РИФР-1. Единого мнения относительно клинической ценности РИФР-1 при КРР до настоящего времени не существует.

В большинстве исследований показана обратная взаимосвязь между обнаружением рецепторов стероидных гормонов (эндокринный тип регуляции) и РЭФР (ауто- и паракринный тип регуляции) в опухолях.

Блокирование любого из этапов передачи митогенного сигнала факторов роста может в принципе привести к нарушению регуляции пролиферации опухолевых клеток и потенциально к торможению роста опухоли. В эксперименте уже исследовано достаточно большое количество препаратов, влияющих на вышеперечисленные процессы: специфические и неспецифические блокаторы связывания РЭФР с лигандами, ингибиторы тиро- зинкиназы и других киназ, блокаторы связывания БН2-доменов эффекторных белков с активированным рецептором, соединения, подавляющие активацию гена ras, в том числе ингибиторы фарнезилирования. Большинство из них находятся на стадии клинического изучения, хотя некоторые, в частности, герцептин, уже прошли клинические испытания и показали себя достаточно эффективными при некоторых видах опухолей.

Известно, что РТК являются тканями-мишенями стероидных гормонов и в 25-60% случаев сохраняют функциональную способность первичного звена механизма действия одного или нескольких стероидов, а именно рецепторы эстрогенов (РЭ; 40,9%), андрогенов (РА; 15,5%), прогестерона (РП; 32,6%) и глюкокортикоидов (РГ; 59,1%). Однако только наличие РЭ и РП в опухоли может быть использовано как критерий благоприятного прогноза 10-летней выживаемости больных КРР. При этом чаще РЭ выявляются в РТК у женщин (60,5%), чем у мужчин (39,5%), при локализованной стадии заболевания (63,1%) и поражении опухолью правых отделов толстой кишки (59,4%).

Опухолевые маркеры ангиогенеза

Большой интерес исследователи проявляют в последние годы к изучению ангиогенных факторов в опухоли и в частности к VEGF. Появляется все больше доказательств, что метастазиро- вание на разных этапах опухолевого процесса зависит от степени васкуляризации опухоли.

При гематогенном метастазировании клетки опухоли должны прикрепиться к эндотелиальным клеткам, пройти в просвет сосуда, выжить в циркулирующей крови, остановиться в определенном органе или ткани и образовать там колонию. Высокоангиогенные первичные опухоли, к которым относится и КРР, с высокой внутриопухолевой плотностью сосудов с большой вероятностью могут дать в отдаленном органе ангиогенный клон, который при благоприятных условиях способен образовать метастаз. Большинство исследователей полагают, что высокая степень васкуляризации опухоли является статистически значимым маркером наличия метастазов в регионарных лимфатических узлах. В 77% ранее проведенных исследований обнаружена значимая связь между опухолевым ангиогенезом и развитием отдаленных метастазов. И хотя имеются значительные различия в исследованных группах пациентов и используемых методах оценки ангиогенеза, большинство исследователей продемонстрировали обратную связь межд> васкуляризацией опухоли и выживаемостью больных КРР. Кроме того, недостаточная васкуляризация и как следствие ее гипоксия увеличивают экспрессию генов, связанных с устойчивостью (Pg-гликопротеина, гидрофолатредуктазы) к химиотерапии и представляют важный фактор неэффективности неоадъювантной лучевой и химиотерапии.

У большинства больных (73,4%) с регио нарными метастазами в лимфатических узлах безрецидивный период достоверно выше при отсутствии экспрессии VEGFи низком индексе SPF (S-phasefraction) в опухоли. В дополнение к прогностической значимости VEGFпоказано, что блокирование VEGF-рецептора-2 ингибирует рост метастазов КРР в печени.

В настоящее время ангиогенной активностью обладают более 200 соединений, и по ингибирующему действию все они могут быть разделены на две группы. В первую входят соединения, влияющие на передачу ангиогенных сигналов эндотелиальными клетками (антагонисты факторов роста эндотелия, ингибиторы продукции ангиогенных факторов, миграции эндотелиальных клеток), а во вторую -- соединения, влияющие на пролиферацию эндотелиальных клеток. Наиболее перспективны такие антиан- гиогенные препараты, как маримастат, бати мастат -- ингибиторы матриксных металлопротеиназ, SU6661.

Следует отметить, что за последние годы наши знания о биологических процессах, вовлеченных в формирование новых микрососудов в опухоли, значительно расширились. И хотя прогностические и терапевтические принципы еще только формируются, достижения в понимании патофизиологических механизмов неоангиогенеза в опухоли уже внедряются в клиническую практику.

Ферменты

Одним из наиболее эффективных маркеров лекарственной резистентности и прогноза КРР считается уровень экспрессии тимидилатсинтетазы в опухоли. Фермент необходим для синтеза ДНК и катализирует метилирование дезоксиуридинмонофосфата в дезокситимидинмонофосфат в качестве кофактора 5,10-мети- лентетрагидрофолата (5,10-CH2FH4). Известно, что 5-фторура- цил (5-ФУ), один из наиболее широко используемых антиметаболитов в лечении гастроинтестинальных опухолей, при введении больному образует 5-фтор-2^,-дезоксиуридин-5'-монофосфатные формы, связывающиеся ковалентно с тимидилатсинтетазой, блокируя, таким образом, процесс синтеза ДНК в опухоли. Изучение показателей экспрессии тимидилатсинтетазы в опухолях больных КРР позволило считать его независимым фактором прогноза у данной категории больных. При этом показатели 10-летней выживаемости были достоверно ниже среди пациентов, в опухоли которых выявлена экспрессия фермента.

На основании ретроспективного многофакторного анализа и высокой степени достоверности результатов по определению в опухолях экспрессии тимидилатсинтетазы считают, что этот маркер может быть использован в клинике как независимый фактор прогноза локального рецидива, отдаленных метастазов, длительности безрецидивного периода и общей выживаемости больных РТК. Лучший прогноз имели больные ТРК с низкой экспрессией тимидилатсинтетазы в первичной опухоли. При этом исследователи убедительно продемонстрировали, что никакие другие факторы прогноза, в том числе возраст, пол, степень дифференцировки опухоли, экспрессия р53 не могут считаться независимыми маркерами прогноза, в частности, рецидива этого заболевания.

Уровень экспрессии тимидилатсинтетазы при генерализованном или рецидивирующем КРР может быть маркером чувствительности опухоли к 5-ФУ. Чаще наиболее высокие показатели экспрессии фермента обнаруживались в абдоминальных метастазах КРР (82%) по сравнению с метастазами опухоли в печени (47%). Полагают, что это необходимо принимать во внимание при прогнозе чувствительности диссеминированных форм опухоли к 5-ФУ и индивидуально изменять стратегию химиотерапии у пациентов.

Также показано, что экспрессия тимидилатсинтетазы и тими- динфосфорилазы в опухолях нелеченых больных КРР не только имеет прогностическое значение в выборе химиотерапии 5-ФУ вместе с такими маркерами пролиферации, как р53 и Ki-67, но и коррелирует с показателями безрецидивной и общей выживаемости. При этом активность 2 указанных ферментов изучали биохимическим методом в свежезамороженных образцах опухоли и сравнивали их экспрессию с помощью иммуногистохими- ческого метода в парафиновых срезах вместе с р53 и Ki-67. Выявлена также значимая корреляционная связь между показателем ферментативной активности тимидинфосфорилазы и связывающей активностью 5-фтор-2^,-дезоксиуридин-5'-монофосфата (метаболит 5-ФУ). Стало известно, что с процессами ангиогенеза и пролиферации при КРР имеют тесную связь активность тимидилатсинтетазы и тимидинфосфорилазы. При этом экспрессия VEGFзначительно коррелировала с активностью тимидинфосфорилазы и индексом Ki-67 в опухоли, а также длительностью безрецидивного периода.

При изучении дигидропиримидиндегидрогеназы -- первого фермента, который метаболизирует 5-ФУ в 5-фтордигидроура- цил, обнаружено, что показатель экспрессии этого фермента в опухоли может быть использован как маркер в оценке чувствительности КРР к 5-ФУ.

Высокая активность индуцированной синтетазы оксида азота может служить маркером более агрессивного течения КРР.

Предложено использовать высокочувствительный и специфичный метод определения теломеразной активности в эпителиальных клетках КРР, циркулирующих в крови. Активность фермента выявлена в 72% опухолей при стадиях С и D(классификация Dukes) КРР. Полагают, что данный маркер в этом малоинвазивном методе может быть использован в ранней диагностике, прогнозе и мониторинге больных ТРК.

Обнаружено, что повышенная экспрессия СОС25В-фосфата- зы в клетках КРР в 43% случаев указывает на плохой прогноз заболевания. Поэтому эти пациенты нуждаются в адъювантной терапии. Полагают, что CDC25Bможет служить независимым прогностическим маркером и даже контролировать такие факторы, как метастазы в регионарных лимфатических узлах, диаметр первичной опухоли, степень ее дифференцировки, глубину инвазии. Более того, уровень экспрессии CDC25Bубедительно указывает на возможный ранний рецидив КРР стадий В и С по Dukes.

В последнее время появились работы, свидетельствующие о возможности использования фермента синтеза простагланди- нов и эйкозаноидов -- циклооксигеназы-2 (СОХ-2), известной также как простагландинэндопероксидсинтетаза, -- в качестве маркера ранней диагностики и прогноза КРР. Экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о важной роли СОХ-2 в патогенезе КРР. Показаны отсутствие СОХ-2 в эпителии нормальной слизистой оболочки и экспрессия белка в 40% полипов и 80-90% злокачественных опухолей толстой кишки, что является подтверждением участия СОХ-2 в неопластических процессах и в прогрессии КРР. Установлена положительная корреляция между экспрессией СОХ-2 и размером, стадией опухоли по классификации Dukes. Увеличение экспрессии СОХ-2 в РТК стало основой для попыток использования ее ингибиторов, в частности нестероидных противовоспалительных препаратов, в качестве профилактических средств, предотвращающих развитие КРР и малигнизацию полипов толстой кишки. В экспериментах на животных было показано, что ингибиторы СОХ-2 проявляют защитное действие при колоректальном канцерогенезе. Кроме того, эти препараты предотвращали образование новых полипов и способствовали регрессии уже существующих в толстой кишке. С другой стороны, данные некоторых экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что противоопухолевое действие нестероидных противовоспалительных препаратов связано также с тем, что они индуцируют апоптоз в клетках РТК и ингибируют ангиогенез в экспериментальных опухолях.

Другие маркеры КРР

Вкратце остановимся на некоторых опухолевых маркерах, применение которых представляется перспективным при КРР.

Уровень экспрессии MUC1 в опухолях может быть использован как маркер в оценке прогрессирования и прогноза КРР.

Циклинзависимый ингибитор киназы Р27 (KIP1) может быть использован как маркер выявления ранних стадий КРР. Однако он не может быть использован в качестве маркера раннего прогрессирования этих новообразований.

Также совсем недавно предложено использовать при оценке распространенности РТК новый маркер -- TA90-IC, который присутствует в сыворотке крови в форме циркулирующих иммунных комплексов. Основанием для проведения исследования послужил тот факт, что, по данным многих авторов, уровень РЭА повышен только у 70% больных в распространенной стадии болезни У 86% обследованных больных были выявлены отдаленные метастазы, хотя многие из этих пациентов клинически имели локализованную опухоль без признаков генерализации опухолевого процесса. Анализ уровня вышеуказанных маркеров показал, что концентрация TA90-ICбыла увеличена у 82,9%, а РЭА -- только у 70,2% больных. Комбинация обоих маркеров позволила установить распространенность опухолевого процесса в 93,5% наблюдений. Исследователи считают, что данную работу необходимо продолжить и доказать роль TA90-ICв скрининге и мониторинге прогрессирования КРР.

Необходимо отметить, что наиболее адекватным с клинической точки зрения может быть одновременное определение только небольшого числа взаимодополняющих показателей, способных охарактеризовать пролиферативную активность КРР, ее метастатический потенциал, чувствительность к различным типам центральной и локальной регуляции. Задачей исследователей, работающих в данной области, является выбор оптимального в количественном и качественном отношении сочетания молекулярных маркеров в диагностике, мониторинге и прогнозе КРР.

РАКОВЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ЖЕЛУДКА, ПИЩЕВОДА И ПЕЧЕНИ

Поджелудочная железа

В Западной Европе рак поджелудочной железы выявляется приблизительно в 10 случаев на 100000. Около 90% всех опухолей поджелудочной железы составляют аденокарциномы из протоков и только 5% -- нейроэндокринные новообразования и ацинарный рак.

Наиболее широко в диагностике рака поджелудочной железы используется маркер СА 19-9. Специфичность его определения варьирует от 76 до 99%, а чувствительность -- от 69 до 93%. Однако повышенная концентрация СА 19-9 в сыворотке крови не является специфичной только для аденокарцином поджелудочной железы. Высокий уровень СА 19-9 обнаружен при других заболеваниях ЖКТ (остром и хроническом панкреатите, циррозе печени, воспалении желчных протоков).

Показано, что только 55% больных раком поджелудочной железы при диаметре опухоли менее 3 см имеют повышенный уровень СА 19-9 (> 37 U/ml). Следовательно, использование маркера СА 19-9 в диагностике рака поджелудочной железы, в частности ранних его форм, ограничено, поскольку уровень его повышается и при вышеперечисленных доброкачественных процессах в печени и поджелудочной железе. Рекомендуется определение показателей СА 19-9 для оценки прогноза рака поджелудочной железы, но не для рутинной практики.

В перспективных исследованиях изучается-также ряд других маркеров при раке поджелудочной железы: муцины типа СА50, СА242, СА195, DU-PAN2, САМ 17.1/WGA. Однако в настоящее время СА 19-9 следует считать «золотым стандартом» в диагностике рака поджелудочной железы.

Желудок

Рак желудка -- одна из наиболее распространенных форм опухоли в мире. В Западной Европе частота его в последнее десятилетие снизилась, тогда как в Азии показатель смертности вырос и приблизительно равен 100 на 100000. В США от рака желудка умирает ежегодно 6 больных на 100000.

Достаточно подробно изучаются при раке желудка три маркера: РЭА, СА 19-9 и СА 72-4, однако наиболее чувствительным и специфичным считается СА 72-4. РЭА и СА 19-9 обладают одинаковой специфичностью, хотя СА 19-9 может быть более чувствительным, чем РЭА, однако ни один из вышеуказанных маркеров не может быть использован в скрининге и ранней диагностике рака желудка.

Рак пищевода

Частота выявления рака пищевода значительно варьирует. Так, в Центральной Азии заболеваемость им составляет 50-100 случаев на 100000, тогда как в Европе и США -- 2-3 случая на 100000. В 90% рак пищевода представлен плоскоклеточной карциномой и менее чем в 10% -- аденокарциномой.

По сравнению с другими опухолями ЖКТ биохимические маркеры рака пищевода исследовались недостаточно. Однако считается, что наилучшими маркерами в диагностике рака пищевода из плоскоклеточного эпителия следует считать SCCи цитокератины (CYFRA21-1, ТРА, TPS), тогда как предпочтение при диагностике аденокарцином пищевода отдают СА 19-9. Вместе с тем опухолевым маркерам в диагностике опухолей пищевода уделяется незначительное внимание ввиду их неспецифичности.

Гепатоцеллюлярная карцинома

Другое название этого заболевания -- «злокачественная ге- патома». Такой диагноз ставится в Западной Европе с частотой 5-10 случаев на 100000, а в Южной Европе -- менее 5 случаев на 100000. Наиболее часто рак печени выявляется в Китае, где рекомендуется популяционный скрининг эндемического очага этого вида опухоли с целью выявления новообразования.

Основным маркером в диагностике гепатоцеллюлярной карциномы является а-фетопротеин, который при скрининге позволяет выявить опухоли небольшого размера, что способствует увеличению послеоперационной выживаемости у этой категории больных. Однако следует заметить, что роль а-ФП в скрининге гепатоцеллюлярной аденокарциномы не определена проспективными рандомизированными исследованиями. Ввиду очень редкого выявления этих новообразований в Западной Европе полагают, что проведения скрининга гепатоцеллюлярной карциномы не требуется. Однако с 1986 г. рекомендуются проведение каждые 6 мес ультрасонографии печени и определение каждые 3 мес концентрации а-ФП у больных, позитивных на поверхностный антиген гепатита В, а также страдающих хроническим активным гепатитом или циррозом печени. Полагают также, что пациентов с персистирующей инфекцией, в частности больных вирусным гепатитом С, также следует считать угрожаемыми по гепатоцеллюлярной аденокарциноме. Доказано, что риск развития этой опухоли при вирусном гепатите С и циррозе печени в 100 раз выше, чем у неинфицированных людей.

Одной из важных проблем при использовании а-ФП в дифференциальной диагностике гепатоцеллюлярной аденокарциномы являются гепатиты и цирроз печени, при которых уровень опухолевого маркера также повышается. Поэтому в дифференциальной диагностике вышеуказанных заболеваний помогает отделение фукозилированного а-ФП от нормального а-ФП путем связывания с лектинами. Определение этих фракций а-ФП помогает в дифференциальной диагностике гепатоцеллюлярной карциномы. Кроме того, при доброкачественных заболеваниях уровень а-ФП может увеличиваться временно, тогда как при гепатоцеллюлярной карциноме он повышен в сыворотке крови постоянно. Поэтому определение а-ФП несколько раз в течение 2-3 нед позволяет исключить ложноположительные его значения. Кроме того, недавно появился новый маркер в диагностике гепатоцеллюлярной аденокарциномы -- des-gamma-carboyprothrombin (DCP), также известный как PIVKAII (белок, индуцированный отсутствием витамина К). Сочетание этого маркера с а-ФП позволяет выявить в 86% гепатоцеллюлярную карциному и в 78,3% солитарную опухоль, и в этих случаях один из этих маркеров будет положительным.

НОВООБРАЗОВАНИЯ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ

Новообразования половых органов у женщин составляют 15% всех опухолей, и они распределяются по частоте убывания в еледующем порядке: рак тела матки, яичников и шейки матки. Однако в структуре смертности рак яичников занимает первое место, затем следует рак шейки и тела матки. Так, например, в США ежегодно регистрируются 20000 новых случаев рака яичников и 12000 умерших от этой опухоли. Этиология заболевания неизвестна, однако факторами риска считаются ановуля- ция, использование некоторых контрацептивов, а также семейная предрасположенность.

Опухоли яичников

Более 90% опухолей яичника имеют эпителиальную природу, т. е. возникают из целомического эпителия. Эпителиальные опухоли яичников классифицируются на основании типа клеток: серозные, муцинозные, эндометриоидные, светлоклеточные, смешанные эпителиальные, недифференцированные, плоскоклеточные. Чаще всего рак яичников развивается из серозных клеток.