Векторы бактериофагеального происхождения, предназначенные для генной таргет-терапии рака

Размещено на http://www.allbest.ru/

Векторы бактериофагеального происхождения, предназначенные для генной таргет-терапии рака

1. Вступление

1.1 Обзор генной терапии в ее исторической перспективе

Генная терапия представляет собой процесс доставки функционирующего терапевтического гена в клетки-мишени, что может привести к угнетению экспрессии определенной макромолекулы, сверх-экспрессии желаемого протеина, индукции гибели клетки, или замене дефектного мутантного гена с экспрессией нормального протеина.

Концепция генной терапии появилась в ранних 1960х годах, когда Джошуа Ледерберг разработал идею о прямом контроле над нуклеотидными последовательностями в человеческих хромосомах, сочетанном с опознаванием, выделением и интеграцией желаемого гена. Он впервые высказал идею о переносе полинуклеотидных последовательностей в вирусы с помощью химических процедур.

В середине и конце 60х, ученые произвели трансформацию нормальных клеток в фенотипически неопластические, интегрируя генетическую информацию papovavirus SV40 в геномы клеток-мишеней (соблюдая принципы ковалентности, стабильности и способности к наследованию интегрируемых генов).

Следом за этим началась эра рекомбинантных ДНК, которая предоставила многообещающую основу для разработки эффективных методов переноса генов в клонированных формах.

Несмотря на все это, первое клиническое исследование с использованием переноса генов было зарегистрировано лишь в 1990 году (использовался ретровирусный вектор (RV) для переноса маркерного гена устойчивости к неомицину в инфильтрировавшие опухоль лимфоциты, полученные от 5-ти пациентов с метастатической меланомой.

Хотя изначально генная терапия разрабатывалась для лечения врожденных заболеваний, сегодня около 66% соответствующих клинических испытаний направлены на лечение рака. Со времени разработки экспериментальной схемы генной терапии в 1970, практическая деятельность расширилась во многие области исследований рака, с амбицией разработки универсального противоракового вектора, который может быть безопасно применен, переносимого нормальной человеческой физиологией, и имеющего селективное действие на опухолевые клетки.

Рак, высокогетерогенное заболевание, остается ведущей причиной смерти (по данным ВОЗ, около 7.6 миллионов смертей в 2008). Химио- и радиотерапия являются сегодняшним лечением рака, при этом химиотерапия считается более эффективной. В то же время, плохое усвоение лекарств опухолевыми клетками (из-за высокого интерсцитиального давления, лекарственной резистентности и неравномерного кровоснабжения опухоли) представляет собой извечное препятствие, позволяющие раковым клеткам найти способ уклониться даже от самой эффективной противораковой терапии. К тому же, системное назначение обычных химиотерапевтических препаратов повышает угрозу образования вторичных опухолей.

Недавно, несколько векторов генной терапии рака прошли доклинические и клинические испытания, и несколько других векторов имеют возможность пройти эти испытания в скором будущем. В этом обзоре, мы стремимся обобщить стратегии таргетирования, используемых в генной терапии рака, и разработки в области эукариотических векторов доставки с их преимуществами и недостатками. Далее, мы подчеркнем значение химерного бактериофагального (фагового) вектора, названного «адено-ассоциированный вирус/фаг (AAVP), в качестве многообещающего кандидата в прицельную системную генную терапию рака.

2. Генная терапия рака и ее специфичность

Несмотря на то, что для борьбы с раком были предложены многочисленные стратегии генной терапии, наибольшей трудностью было создать системный вектор доставки генов, который мог бы одновременно избирательно и эффективно воздействовать на опухолевую ткань.

На сегодняшний день, большинство клинических испытаний включали внутриопухолевое введение как вирусных, так и невирусных векторных систем, для избежания трансгенной экспрессии в нормальных, здоровых тканях. Локальное применение трансгена было необходимо в качестве доказательства принципа генной терапии с помощью векторов, в то время как системное применение клинически более выгодно, т.к. позволяет доставлять трансген в метастазы и первичные опухоли, требующие инвазивных процедур для предоставления необходимого доступа к ним.

Очевидно, что разработка эффективных системных векторов обеспечила бы безопасность применения путем прицельного действия на желаемые ткани, в то же время щадя здоровые соседние органы и ткани.

Большими проблемами в клинических испытаниях генной терапии являются прицельность векторов и высокая цена их производства. Таким образом, разработка прицельных векторов, способных обеспечить эффективную и долгосрочную экспрессию терапевтического гена в опухолевой ткани после системного применения, обеспечила бы значительный прогресс в генной терапии рака.

На сегодня, два главных подхода были использованы для прицельного действия на опухоли:

I) Воздействие на транскрипцию: использование промоторов, активных только в исследуемых опухолях.

II) Лиганд - опосредованное действие: векторы специфичны к определенным рецепторам, экспрессированным в опухолевой ткани.

Каждый из этих подходов был опробован индивидуально в ходе многочисленных исследований, и показал многообещающие результаты для векторной доставки и трансгенной экспрессии в доклинических опухолевых моделях.

2.1 Воздействие на транскрипцию

Селективное уничтожение опухолевых клеток является основной задачей современной генной терапии рака. Помещение трансгена под влияние клетко-специфического промотора повышает шансы на его экспрессию в данной конкретной клетке. Обычно данные промоторы избыточно экспрессируются в определенных тканях (напр. Злокачественных опухолях) и находятся на низких базальных уровнях экспрессии в нормальных тканях. Использование промотеров вроде цитомегаловирусного (CMV) вместе с аденовирусными (Ad) векторами в составе генной терапии получило хорошие отзывы за их конститутивную активность, как in vitro, так и in vivo. Несмотря на это, промотор сам по себе не различает разные типы клеток, скорее, экспрессируется на более высоких уровнях во многих тканях млекопитающих, что проблематично для генной терапии рака. С другой стороны, промоторы, активные в опухолевых клетках, были использованы только лишь для прицельной (локальной) доставки гена в опухоли, для того, чтобы селективно спровоцировать экспрессию трансгена в опухолевой ткани.

Действие на транскрипцию было впервые доложено в двух исследованиях в 1997 году. Rodriguez et al. Удалось добиться экспрессии трансгена только лишь в клетках, продуцирующих простат-специфический антиген - для этого промотор простат-специфического антигена интегрировали в ДНК аденовируса 5 типа, который после этого обозначили как «attenuated replication-competent adenovirus» (аттенуированный, способный к репликации аденовирус).

Кроме того, используя промотор альбумина, интегрированный в вирус простого герпеса 1 типа (HSV-1), удалось создать вектор, работающий только с клетками печени, экспрессирующими альбумин. С тех пор, несколько промоторов было описано и использовано в прицельной генной терапии рака. (Таблица 1)

2.1.1 Тканеспецифичные промоторы

Эта группа промоторов остается активной и осуществляет экспрессию трансгена только в специфических тканях. В генной терапии рака было использовано несколько тканеспецифичных промоторов, которые работали только в опухолях единого происхождения. Примеры :

- Яичник-специфичный промотор для рака яичников.

- Промотор альбумина для гепатоцеллюлярной карциномы.

- Промотор тиреоглобулина для рака щитовидной железы.

- Промотор тирозинкиназы - для меланомы (как in vitro, так и in vivo).

- Промотор простат-специфичного антигена - для рака простаты, при этом как в культуре клеток, так и in vivo, промотор PSA запускал экспрессию тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk) гена самоуничтожения во всех PSA - положительных клетках. При этом трансгенная экспрессия не была отмечена в клетках, не экспрессирующих PSA.

Несмотря на то, что эти промоторы доказали свою эффективность в доставке трансгена и инициации его экспрессии, их активность, как в нормальных, так и в опухолевых клетках является существенным недостатком (?)

Таблица 1. Примеры лиганд- и транскрипционного таргетинга, используемого в эукариотных вирусных векторах в прицельной терапии рака:

AAV: адено-ассоциированный вирус; ANGPTL-3: человеческий ангиопоэти-подобный белок 3; BIRC5: Baculoviral IAP repeat-containing 5; E2F-1: фактор транскрипции 1; GH: гормон роста; PSA/E: простат-специфичный антиген/усилитель; hSCF: фактор человеческих стволовых клеток; HSNS/HAA: modified attachment protein H on MV; LV: lentivirus; MV: вектор вируса кори; PRC1: белок-регулятор цитокинеза1; RRM2: субединица рибонуклеотидредуктазы 2; rTG: крысиный тиреоглобулин; SIGYPLP, CGKRK, SIKVAV: наводящие пептиды; RV: retrovirus; TRE: элемент ответа на тетрациклин; VEGFR2: Рецептор фактора роста эндотелия сосудов2; * ND: не определено.

2.1.2 Опухолеспецифичные промоторы

Представляют собой идеальный выбор для прицельной генной терапии рака, так как они показали высокую активность в опухолевых клетках, и низкую или полное отсутствие активности - в нормальных клетках. Основываясь на их характеристиках, опухолеспецифичные промоторы были разделены на 4 группы:

I) Промоторы, специфичные к раку

II) Промоторы, специфичные к опухолям

III) Промоторы, действующие на сосуды опухолей

IV) Промоторы, действующие на микроокружение опухолей.

-Промоторы, специфичные к раку :

Например, промотор к гену теломеразы, активны исключительно в злокачественных клетках, и имеют большой потенциал в генной терапии рака, так как способны поражать большое количество разных опухолей. Теломераза высокоактивна в 85%-90% человеческих раковых клетках, в то же время оставаясь практически неактивной в нормальных тканях. Теломераза состоит из двух активных субединиц: РНК теломеразы (hTR) и каталитического компонента человеческой обратной транскриптазы теломеразы (hTERT). Промоторы данных двух субединиц высокоактивны в теломеразопозитивных клетках напр. Опухолевых или фетальных). Таким образом, эти два промотора были индивидуально использованы во многих исследованиях прицельной генной терапии рака для инициации экспрессии терапевтического гена, демонстрируя при этом улучшенную способность уничтожать теломеразопозитивные клетки. Но, несмотря на это, они все еще ограничены в использовании в клинической практике, так как иногда демонстрируют низкую активность и являются потенциально токсичными для определенных нормальных клеток и тканей.

-Промоторы, специфичные к опухолям :

Являются промоторами онкофетальных генов, которые часто избыточно экспрессируются в определенных видах опухолей, и не экспрессируются в нормальных тканях. Наиболее известные среди них :

Промотор б-фетопротеина (AFP) - активен в фетальной печени и гепатоцеллюлярной карциноме.

Промотор карциноэмбрионического антигена (CEA) - активен в раковых опухолях молочной железы, легких, прямой и толстой кишок и поджелудочной железы. Этот промотор был широко использован в разных векторных системах с целью избирательной доставки разных терапевтических генов, таких как цитозиндеаминаза или HSVtk в CEA - позитивные клетки с последующей экспрессией, и в результатах получали значительное снижение скорости роста опухоли или даже ее регрессию, при этом не проявляя токсичности по отношению к печени и других органов, с последующим применением пролекарства 5-фторцитозина или ганцикловира. Несмотря на такой положительный результат исследований, их применение ограничено из-за того, что они неприменимы при лечении многих видов опухолей.

-Промоторы, действующие на сосуды опухолей :

Гены, кодирующие эту группу промоторов, избыточно экспрессируются в эндотелии микрососудистого русла опухолей. К ним относятся Е-селектин и рецептор к эндотелий-специфичной киназе (KDR/flk-1). Промоторы этих генов эффективно экспрессировали фактор некроза опухоли-б (TNF-б) - его количество в клетках эндотелиомы было в 10 раз большим, чем в других клетках.

Применение данных промоторов также ограничено, так как было доказано, что они проявляют активность в сосудах небольшого размера, а также травмированных сосудах.

-Промоторы, действующие на микроокружение опухоли.

Относятся к генам, активизирующимся в ответ на микроокружение опухоли и ее физиологию (наиболее типичные ее характеристики - гипоксия, ацидоз и недостаток глюкозы - следствие отставания ангиогенеза от скорости роста опухоли, а также значительное поглощение глюкозы опухолевыми клетками). Примеры: элементы ответа на гипоксию (hypoxia response elements, HREs), ген регулируемого глюкозой протеина 78 (Glucose regulated protein 78 (Grp78)). К достоинствам Grp78 следует отнести то, что он эффективен в большом количестве разных видов опухолей, а также способен действовать в участках опухолей, устойчивых к нынешним формам лечения (напр. Традиционной химиотерапии) - например в участках гипоксии и ишемии. Экспрессия терапевтического трансгена достигает настолько высоких значений, что в доклинических испытаниях использование Grp78 привело к полной эрадикации опухоли. Это, плюс ограниченное действие только в опухолевой ткани, обеспечивает возрастающий интерес к Grp78 и делает его оптимальным промотором для использования в прицельной генной терапии рака.

3. Grp78 как эндогенная макромолекула в раковой ткани

Ген Grp78 кодирует 78-kDa протеин, действующий как шаперон ответа на стресс эндоплазматического ретикулума. На 60% гомологичен по аминокислотному составу с протеином теплового шока 70-kDa (HSP70), и, в связи с этим, Grp78 был категоризирован внутри семейства HSP70. Несмотря на эту гомологию, Grp78 не индуцируется тепловым стрессом, и преимущественно локализуется в просвете эндоплазматического ретикулума, и, судя по всему, функционирует как АТФ-зависимый молекулярный шаперон. Недавно этот протеин был также обнаружен в цитоплазме и на поверхности клеточных мембран, в связи с чем он может быть использован как биомаркер клеток, испытывающих стресс (напр. Опухолевых).

Также известный как протеин, связывающий тяжелые цепи иммуноглобулинов (BiP), Grp78 контролирует реакцию ответа на развернутые протеины (unfolded protein response (UPR)), связывая развернутые (белки, не профедшие присущий им фолдинг) и неправильно гликозилированные протеины в просвете ЭР. В эукариотических клетках, когда продукция протеина превышает вместимость ЭР, рахвернутые протеины запускают реакцию развернутых протеинов. В нормальных условиях, Grp78 остается связан с тремя трансмембранными сенсорными протеинами:

-Киназоподобный белок эндоплазматического ретикулума (PERK)

-Инозитол-требующий энзим 1 (IRE1)

-Активирующий транскрипцию фактор 6 (ATF6)

Как только накапливается определенное количество неправильно структорированных (непрошедших свойственный им фолдинг) белков, Grp78 отходит от вышеперечисленных сенсорных белков и связывает эти протеины. Процесс диссоциации Grp78 запускает сигнальный каскад - реакцию развернутых протеинов, исходом которой становится снижение биосинтетической активности ЭР путем десенсибилизации клеток к стрессу ЭР, что в конечном итоге приводит к экспрессии генов, ответственных за выживание, например повышенная экспрессия Grp78. Если же гомеостаз ЭР не удается восстановить, реакция развернутых протеинов запускает запрограмированную гибель клетки.

Микроокружение опухоли и недостаточная скорость неоваскуляризации и ангиогенеза приводят к неконтролируемой продукции мутантных и раскрытых протеинов в ЭР, что в свою очередь запускает реакцию раскрытых протеинов, а значит, сопровождается высвобождением Grp78.

Таким образом, экспрессия Grp78 минимальна в здоровых органах и тканях, и резко возрастает в разных опухолях (при этом выраженность экспрессии коррелирует со стадией опухолевого процесса - чем он тяжелее, тем больше экспрессия Grp78.

Grp78 играет большую роль в выживании раковых клеток, т.к в ходе своей функции активирует экспрессию генов, ответственных за выживание клетки. Это было доказано в опытах на мышах : гетерозиготы по гену Grp78 (Grp78+/-) лучше отвечали на противоопухолевую терапию, а сами опухоли имели меньшую скорость роста и были более склонными к апоптозу.

Кроме того, высокий уровень Grp78 наблюдается и в метастазах, что увеличивает их устойчивость к апоптозу и дает им время, необходимое на ангиогенез, который, в свою очередь, поддерживает их дальнейшее развитие.

Pyrko (Пирко) и коллеги продемонстрировали позитивную корреляцию между сверхэкспрессией Grp78 и скоростью пролиферации глиобластомы путем выключения экспрессии Grp78, что привело к уменьшению скорости пролиферации.

4. Grp78 как промотор в генной терапии рака

Такое использование Grp78 впервые было предложено группой Ли. Ретровирусный вектор, несущий трансген HSVtk, был использован для инфицирования опухолевые клетки, которые затем имплантировались в мышей. Применение GCV, вместе с экспрессией HSVtk, вызванной промотером Grp78, привело к подавлению и эрадикации ксенографтов рака молочной железы в этих мышах.

Кроме того, другая группа исследователей подтвердила эффективность HSVtk под контролем промотора Grp78 при работе с клетками аденокарциномы желудка и желудочно-пищеводного соединения - при лечении GCV (ганцикловир?) была получена гибель клеток in vitro и регрессия опухоли in vivo.

В трансгенных мышах, трансген LacZ, под контролем промотора Grp78, показал высокие уровни экспрессии в раковых клетках, при этом оставаясь неактивным во многих органах взрослых особей.

Кроме того, контролируемая Grp78 транскрипция генов может усиливаться с течением времени, так как, в отличие от вирусных промоторов (таких как CMV), промоторы млекопитающих не угнетаются в эукариотных клетках, что приводит к более выраженной и продолжительной экспрессии трансгена.

5. Лиганд-опосредованное действие гарантирует специфическую и эффективную доставку трансгена

Прогресс в прицельном воздействии на сосуды опухолей предоставил платформу для безопасной, эффективной и селективной передачи разных агентов в опухолевые ткани. Использование скрининговых фаговых дисплеев in vivo существенно способствовало в идентификации таких рецепторов в эндотелии сосудов опухолей в животных моделях.

Так как ангиогенез является важной частью опухолевой прогрессии, прицельное использование этих опухолеспецифичных эндотелиальных рецепторов теоретически имеет большой потенциал для лиганд-опосредованного таргетинга в генной терапии рака. (Таб. 2)

Вирусные векторы могут быть построены таким образом, что, имея на своей поверхности подходящий пептид, они будут инфицировать только те клетки, имеющие рецептор к этому пептиду, не воздействуя при этом на другие клетки.

Гипотеза о том, что селективно препятствуя кровотоку в опухоли можно получить сильный противоопухолевый эффект, появилась давно. К тому же, влетки сосудов всегда легко доступны векторам, которые циркулируют в системном кровотоке. Таким образом, прицельное воздействие на сосуды опухолей и их уничтожение всегда вызывало большой интерес у ученых.

Новообразованные сосуды, сопровождающие рост опухолей, экспрессируют другие маркеры на своем эндотелии, отличающиеся от маркеров нормальных сосудов. Например, б_vв₃- интегрин (молекула адгезии) - экспрессируется на эндотелиоцитах сосудов опухолей (удалось рассчитать, что один такой эндотелиоцит поддерживает существование окола 100 опухолевых клеток). Кроме того, его также экспрессируют несколько опухолей - глиобластома, меланома и др.

Это общее понимание физиологии и биохимии опухолей привело к разработке лиганд-опосредованных векторов, прицельно действующих на сосуды опухолей через рецепторы к бvв3- интегрину.

Таблица 2. Список рецепторов, использующихся в прицельной генной терапии рака.

* ЭК - эндотелиальные клетки

5.1 Лиганд-опосредованное действие и вирусные векторы в генной терапии рака

В последнее десятилетие разрабатывались разные техники создания вектора, избирательно действующего на определенные клетки после системного применения.

На сегодняшний день, невирусные векторы (генная пушка, магнитофекция, липоплексы, неорганические наночастицы, иньекции ДНК), обладают тем же потенциалом, что и разрабатывающиеся вирусные - благодаря своему массовому производству, безопасности, низкой иммуногенной реактивности хозяев. Но, несмотря на эти достоинства, их недостатки (низкий уровень трансфекции и экспрессии трансгена) все еще представляют значительные препятствия на пути их использования в клинике.

Таким образом, в обозримом будущем вирусные векторы станут векторами выбора, так как они естественным образом эволюционировали для способности инфицировать клетки млекопитающих, и могут обеспечить высокий уровень трансдукции.

На 2007 год, несколько видов векторов было использовано в 70% клинических испытаний генной терапии, многие из которых были направлены на улучшение качеств вирусных векторов.

Наибольшего прогресса удалось достичь с lentivirus (LV), adenovirus (Ad), и адено-ассоциированным вирусом (AAV).

- Аденовирусы (Ad) : наиболее часто используются, т.к содержат большую молекулу ДНК (36 kb), что предоставляет достаточно места для вставления больших фрагментов последовательностей. К тому же, они быстро размножаются и опосредуют эффективную экспрессию трансгена как в делящихся, так и в неделящихся клетках. Несмотря на эти преимущества, они могут индуцировать иммунный ответ хозяина после системного применения в необходимой дозе. Для борьбы с иммуным ответом хозяина были разработаны аденовирусные векторы, имеющие специфическую делецию в своем геноме, подавляющую их репликацию, а значит, ингибирующую инфекционный процесс. Данные векторы могут потом быть модифицированы для целенаправленной репликации только в опухолевых клетках и запускания их лизиса. Один из примеров такого аденовирусного вектора - ONYX-015. Он не может защищать себя от продуктов гена суппрессии опухолей p53, а значит, уничтожается в здоровых клетках. Напротив, так как ген p53 дефектен во многих клетках опухолей, ONYX-015 может пролиферировать в них и инициировать их лизис. Кроме того, если просто опосредованный вирусом лизис опухоли будет недостаточным, можно внедрить в геном аденовирусного вектора нужный нам терапевтический ген.

- Адено-ассоциированные вирусы (AAV) : также широко используются всвязи с низкой иммуногенной активностью. Кроме того, было доказано их стабильная и долгосрочная генная экспрессия in vivo. Также, как и аденовирусные векторы, быстро размножаются до высоких титров, и могут индуцировать экспрессию трансгена как в делящихся, так и в неделящихся клетках. Несмотря на это, значительным ограничением данного вектора является их ограниченная емкость клонирования генов (чуть более 4 kb).

Аденоассоциированные вирусы содержат единственную 4.7 kb цепь ДНК, кодирующую 2 гена : rep - ответственный за репликацию вирусной ДНК и cap, ответственный за покрытие вирусного генома. При входе в клетку хозяина, эта цепь ДНК превращается в транскрипционно-активную двойную цепь ДНК, и располагается эписомально.

Для получения рекомбинантного вектора, rep и cap заменяются на кассеты трансгенов.

Несмотря на то, что эукариотические векторы, такие как AAV, обеспечивают эффективную доставку трансгена и крайне стабильную и долгосрочную его экспрессию, их «врожденная» политропность к разным клеткам млекопитающих создает риск индуцирования иммунного ответа в организме хозяина, который повышает риск в необходимости повторного введения вектора. Кроме того, опять же из-за своей политопности, эукариотические вирусные векторы часто захватываются гепатоцитами, клетками ретикуло-эндотелиальной системы и другими нежелательными тканями после внутривенного введения.

6. Бактериофаг-опосредованная генная терапия рака

Бактериофаги представляют собой альтернативную и более безопасную стратегию в прицельной доставке трансгенов, так как они не имеют тропности к клеткам млекопитающих, но все же способны опосредовать умеренную экспрессию генов в клетках млекопитающих после генетической модификации.

Производство бактериофагов более дешевое и простое, и может проводиться в более высоких титрах. Кроме того, бактериофаги использовались для антибактериальной терапии в доантибиотиковую эру, и были безопасно применены даже на детях (при системном введении). В 2006 году, FDA (Food and Drug Administration - департамент продуктов питания и лекарств) одобрил использование некоторых препаратов бактериофагов в качестве антибактериальных пищевых добавок в мясо, готовое к употреблению и в продукты птицеводства.

Наиболее важно то, что, в отличие от эукариотных вирусов, бактериофаги не требуют дальнейшей сложной модификации своего капсида, так как поверхностные пептиды избираются и изолируются по способности взаимодействовать с определенными рецепторами поверхности клетки, после проведения скрининга библиотеки пептидов фагового дисплея. Хотя в прошлом они считались плохим способом доставки генов, так как они эволюционировали только для инфицирования бактерий и не имеют оптимизированных стратегий к экспрессии трансгена после проникновения в эукариотическую клетку.

Для преодоления этих ограничений, Hajitou и коллеги представили новое поколение гибридных прокарио-эукариотических вирусный вектор - химера между эукариотическим AAV (адено-ассойиированные вирусы) и нитевидным бактериофагом М13. Название - AAVP (AAV/phage). При этом оба содержат геном в виде 1 нити ДНК (рисунок 1). Этот вектор экспрессирует 3-5 копий циклического RGD4C (CDCRGDCFC) лиганда на фаговом протеине pIII, что позволяет системно и избирательно действовать на рецепторы к бvв3-интегрину, которые экспрессируются в основном на поверхности эндотелия сосудов опухолей и на самих опухолевых клетках, при этом практически отсутствуют на здоровых эндотелиоцитах и других клетках.

Рисунок 1. Структура гибридного вектора AAV\phage. Частица содержит химерный геном CMV-трансгена, окруженный 3' ITR и 5' ITR, геном AAV-2 и геном М13 нитевидного бактериофага. Наружный капсид принадлежит М13 бактериофагу, а значит лишен тропности к клеткам млекопитающих. Капсид содержит большую часть протеина pVIII и четыре малых протеина pIII, pVI на одной стороне и pVII pIX на другой. бv-интегрин связывающий лиганд, RGD4C, экспрессирован на протеин pIII AAVP для осуществления лиганд-опосредованного прицельного действия на сосуды опухоли и опухолевые клетки.

6.1 Описание Гибридного вектора генной терапии: AAVP

Геном гибридного вектора был разработан путем вставки модифицированного трансгена AAV (рекомбинантный AAV\rAAV) в межгеномную область генома фага, под регуляцией промотора CMV и окружив его полными инвертированными концевыми повторами (ITR) от 2го серотипа AAV (рис.1). Использование ITR от AAV в прицельном AAVP (RGD4C-AAVP) улучшает эффективность трансдукции и улучшает экспрессию трансгена с помощью образования и поддержания конкатемеров эукариотических трансгенных кассет. Экспрессия трансгена HSVtk под контролем промотора CMV (RGD4C-AAVP\CMV-HSVtk) и последующее лечение GCV (ганцикловиром) вызывает значительную суппрессию опухолей в мышах и крысах.

Вектор находился в исследованиях, в том числе доклинических, с самого момента своего создания. Национальный Институт Рака США использовал лиганд-прицельное действие RGD4C-AAVP для того, чтобы доставить фактор некроза опухолей альфа (ФНО-а) в сосудистое русло ксенографтов человеческой меланомы в голых мышах. В данном эксперименте, системное использование этой фаговой частицы привело к прицельному действию на сосуды опухолей, что привело к выраженной экспрессии ФНО-а в них с последующим апоптозом эндотелеоцитов и значительной задержкой роста опухоли, в то же время отмечалось полное отсутствие этого эффекта во всех других тканях и органах, включая печень и селезенку (хотя в этих двух органах и были обнаружены частицы RGD4C-AAVP). Схожая эффективность данного вектора была достигнута и в экспериментах на одомашенных собаках с саркомой мягких тканей. Внутривенное введение фаговой частицы (в том числе мультидозовое) приводило только лишь к прицельному действию на опухоль. Повторные введения вектора привело к полной эрадикации опухолей у нескольких собак и стабильности у других, несмотря на наличие выраженного иммунного ответа на фаговые частицы - несмотря на иммуногенное действие у собак и иммунокомпетентных мышей, повторные введения данных векторов оказывают выраженный противоопухолевый эффект.

Специфичность и безопасность RGD4C-AAVP делают данный гибридный вектор многообещающим инструментом в системной генной терапии рака.

6.2 Разработка вирусных частиц AAVP

6.2.1 Ограничения промотора CMV при использовании в фаге: заглушение экспрессии генов

Несмотря на то, что использование промотора CMV в генной терапии, основанной на аденовирусных векторах было хорошо характеризовано за его надежную активность как in vitro, так и in vivo, промотор остается высокоактивным в широком ряду тканей млекопитающих. К тому же, заглушение экспрессии генов, связанных с данным промотором, возможно в тканях млекопитающих благодаря нескольким механизмам: метилирование ДНК и деацетилирование гистонов. Активность промотора CMV было полностью подавлена при метилировании цитозина в 5'CpG динуклеотидов внутри последовательности ДНК метилтрансферазы Sssl спироплазм (Spiroplasma). Гиперметилирование - феномен, наблюдаемый во многих опухолях и влияющий на гены, ответственные за регулирование клеточного цикла (p16^INK4a, p15^INK4a), починку ДНК (BRCA1, MGMT), апоптоз (DAPK, TMS1), устойчивость к лекарствам, ангиогенез и метастазирование. Склонность раковых клеток к гиперметилированию, скорее всего, играет роль в метилировании промотора CMV.

Деацетилирование гистонов - еще один механизм подавления промотора CMV, в итоге приводящий к появлению участков конденсированного, неспособного к транскрипции хроматина. Репрессия хроматина, и его транскрипционное ремоделирование гена LacZ в клетках HeLa, трансдуцированных вектором rAAV-CMV-LacZ произошло после устранения ингибитора деацетилазы гистонов - trichostatin-A. Эта, и другая информация, показывает, что заглушение промотора CMV со временем может стать препятствием в генной терапии с использованием вирусных векторов, т.к приводит к снижению экспрессии желаемого трансгена в клетках млекопитающих. Это приводит нас к необходимости разработки вектора, гарантирующего долгосрочную экспрессию генов, а значит и высокую противоопухолевую активность.

6.2.2 Двунаправленный фаговый вектор с промотором Grp78

Комбинирование обеих стратегий прицельного действия на опухоли (использование лигандов и опухолеспецифических промоторов) может быть трудным заданием, но оно определенно было бы большим успехом в прицельной генной терапии рака.

В 2012 году, группа ученых разработала двухнаправленную AAVP фаговую частицу, использующую одновременно лиганд-опосредованную (RGD4C) и транскрипционно-опосредованные стратегии (при этом вирусный промотор CMV был заменен на опухолеспецифичный промотор Grp78 в трансгенной кассете AAV). Данная комбинация, в теории, должна вызывать экспрессию трансгенов только лишь в сосудах опухолей и опухолевых клетках.

Kia и коллеги в исследованиях показали долгосрочную экспрессию трансгена AAVP под регуляцией крысиного промотора Grp78 в линиях клеток глиобластомы - гораздо более лучший результат по сравнению с использованием промотора CMV, который со временем подвергался заглушению.

Анализ проточной цитометрии экспрессии зеленого флюоресцентного протеина (green fluorescent protein (GFP)) под регуляцие Grp78, трансдуцированных RGD4C-AAVP/Grp78-GFP клетках 9L, показало значительное улучшение с 57% (39 дней после трансдукции вектора) до 85% (97 дней после трансдукции вектора). В то же время, только 37% клеток, трансдуцированных RGD4C-AAVP/CMV-GFP показали экспрессию GFP на 39й день, и только 11% - на 97й день.

Также при использовании HSVtk/GCV под контролем Grp78 наблюдалась более выраженная гибель опухолевых клеток, нежели при использовании промотора CMV, как in vitro, так и in vivo.

Исследования in vivo показали, что при повторном росте опухолей после терапии, повторное применение GCV привело к ингибированию роста опухоли в мышах, получивших RGD4C-AAVP/Grp78-HSVtk, и почти полное отсутствие эффекта у мышей, получивших RGD4C-AAVP/CMV-HSVtk.

Также, при использовании анализа Вестерн блот, было показано, что при использовании HSVtk\GCV наблюдается активация обоих промоторов - эндогенного Grp78 и RGD4C-AAVP/Grp78-HSVtk вектора.

6.2.3 Нынешние разработки: Ингибирование деацетилирования гистонов и метилирование ДНК восстанавливают генную экспрессию, подконтрольную промотору CMV, и улучшают Grp78-подконтрольную экспрессию

Ингибирование деацетилирования гистонов восстановило экспрессию генов, связанных с промотором CMV в человеческих (U87) и крысиных (9L) линиях клеток глиобластомы, трансдуцированных вектором RGD4C-AAVP/CMV. Как было ранее сказано, деацетилазы гистонов (ДГ) обильно экспрессируются в раковых клетках. Ингибиторы ДГ классов I и II - трихостатин-А и субероиланилид гидроксамовой кислоты, комбинированные с RGD4C-AAVP, несущим промоторы CMV или Grp78 реактивировали RGD4C-AAVP/CMV, и улучшили активность RGD4C-AAVP/Grp78 в раковых клетках.

В то же время ингибитор метилирования ДНК 5-Азацитидин повторил этот эффект в линиях клеток крысиной глиобластомы 9L, трансдуцированных RGD4C-AAVP/CMV, но при этом не было отмечено изменений в клетках, трансдуцированных RGD4C-AAVP/Grp78.

Данные находки являются важными в исследовании долгосрочной экспрессии трансгенов, и должны быть учтены при планировании будущих клинических испытаний.

генный терапия рак клетка

Выводы

Генная терапия рака - многообещающий подход в лечении рака. Но для этого крайне необходим вектор, потенциально способный преодолеть многие вызовы, такие как недостаточная специфичность, риск цитотоксичности для здоровых клеток после системного применения.

RGD4C-AAVP, с его двойным (промотор- и лиганд-опосредованным) действием и стабильной долгосрочной экспрессией трансгена (благодаря промотору Grp78) является многообещающим инструментом в прицельной, системной генной терапии рака, и должен быть опробован в будущих клинических испытаниях

Размещено на Allbest.ru