Полимеразная цепная реакция: сверхчувствительная диагностика инфекций

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Разновидности полимеразной цепной реакции

Вложенная полимеразная цепная реакция - применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

"Инвертированная" ПЦР - используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов. В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.

ПЦР с обратной транскрипцией - используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную к ДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.

Асимметричная ПЦР - проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.

Количественная ПЦР - используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе.

Количественная ПЦР в реальном времени - в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.

Touchdown ПЦР - с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определённой температуре система пройдёт через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.

Метод молекулярных колоний - акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.

ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК

ПЦР длинных фрагментов - модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК. Используют две полимеразы, одна из которых - Taq-полимераза с высокой процессивностью, а вторая - ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой.

RAPD PCR. Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия, удаётся добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.

PCR с использованием горячего старта и нижней смесей с целью недопущения раннего смешивания компонентов реакции. До начала реакции амплификатор необходимо прогреть до температуры плавления парафина.

2. Материал

Таким образом, в поисках возбудителя, кроме анализа крови (хотя он тоже подходит и в большинстве случаях берется параллельно другому материалу), можно использовать:

Мазок (выделения урогенитального тракта);

Соскоб слизистых ротовой полости, конъюнктивы, носоглотки, половых путей (у женщин берут из шейки матки и влагалища, у мужчин - из уретры);

Слюну;

Сперму;

Сок предстательной железы;

Ткани плаценты и амниотиотическую жидкость (околоплодные воды);

Осадок мочи (после центрифугирования), например, для выявления некоторых ИППП и микобактерий туберкулеза;

Мокроту и плевральную жидкость с той же целью;

Экссудаты;

Спинномозговую жидкость при подозрении на инфекционное поражение ЦНС;

Биопсийный материал (биоптат), взятый из печени, 12-перстной кишки, желудка и пр.

Возбудители инфекций, обнаруживаемые методом ПЦР

Вирусы:

ретровирусы HIV-1 и HIV-2

герпетиформные вирусы

вирус простого герпеса 1 и 2 типов

цитомегаловирус

вирус Эпштейна-Барр

варицелла - Зостер вирус

герпес вирусы человека 6 и 7

вирус гепатита С, В и А

вирусы папилломы человека

вирус краснухи

аденовирусы

риновирусы

парвовирусы

пикорновирусы

Бактерии:

микобактерии

хламидии

микоплазмы

сальмонелла

легионеллы

клостридии

бледная трепонема

различные патогенные виды кишечной палочки

холерный вибрион

риккетсии

золотистый стафилококк

бактериальный возбудитель менингита

хеликобактер пилори

уреаплазма

возбудитель гонореи

дифтерийная палочка

В данном списке приведены наиболее распространенные инфекционные агенты, выявляемые методом ПЦР. На самом деле данный список гораздо шире, постоянно пополняется, так как синтезируются новые "затравки". Также следуют отметить, что список определяемых возбудителей определяется наличием "затравок" для идентификации в арсенале каждой конкретной лаборатории.

3. Применение ПЦР

Применение ПЦР:

клиническая медицина

диагностика инфекционных заболеваний

диагностика наследственных заболеваний, выявление мутаций, генотипирование

клеточные технологии

создание генетических паспортов

экология

мониторинг состояния окружающей среды

анализ продуктов питания

анализ (ГМО)

судебная медицина и криминалистика

идентификация личности

установление отцовства

фармакология, ветеринария, научные исследования (молекулярная биология, генетика)

4. Перспективные направления ПЦР-диагностики

Мутации, обусловливающие наследственные заболевания;

полиморфизмы, ассоциированные с предрасположенностью к мультифакторным заболеваниям;

онкогенетика;

фармакогенетика;

HLA-типирование;

иммуногенетика;

нарушения метаболизма и т.д.

HLA (от англ. Human Leucocyte Antigens) - система генов тканевой совместимости человека



5. Ошибки в ПЦР-диагностике

Последствия ошибок

Ошибки забора

Неправильное хран./транспорт.

Контаминация

Потери НК

Ингибиторы

Погрешности детекции

Ошибки интерпретации Ошибки преаналитического этапа

Место взятия биологического материала предполагаемая локализация инфекционного процесса (кровь, мокрота, соскоб и т.д.)

Правильность взятия биологического материала

должен содержать максимальную концентрацию искомых микроорганизмов, а также быть лишен нежелательных примесей, ингибирующих ПЦР (слизь, гной, кровь).

Обработка биологического материала

гепарин является мощным ингибитором ПЦР

Хранение биологического материала

от 2 до 8°С в течение 24-48 часов, для более длительного хранения необходимо замораживание, цельная кровь не подлежит замораживанию.

Ошибки аналитического этапа

Генетическая изменчивость микроорганизмов

Например, у 30% пациентов с установленным диагнозом "хламидиоз", обусловленным С.trachomatis, при проведении исследований методом ПЦР результат анализа был отрицательным при полном соблюдении технологии. Это обусловлено тем, что часть коммерческих тест-систем в качестве мишени использовали плазмиду патогена, тогда как патологический процесс был связан с бесплазмидными штаммами бактерий.

Ошибки постаналитического этапа

Ошибки интерпретации результатов ПЦР

- Не принятие во внимание особенностей персистенции и элиминации возбудителя.

ДНК микроорганизма может сохраняться в течение нескольких недель после его элиминации и не свидетельствует о жизнеспособности.

- Клиническая оценка положительного результата ПЦР, определение его прогностической значимости.

Отождествлении двух принципиально различных понятий - "инфицированность" и "инфекционный процесс".

- Неверная интерпретация результатов количественного ПЦР-анализа.

ДНК HBV в крови более 10 000 копий/мл (2000 ME/мл)

"Несовпадение" результатов ПЦР и ИФА

Различная чувствительность методов

Наличие "серологического окна" 90-95% зараженных ВИЧ АТ обнаруживаются в течение 3-х месяцев после заражения, 5-9% - через 6 месяцев, 0,5-1% - более поздние сроки.

Иммуносупрессированные пациенты

Генетическая изменчивость микроорганизмов

Иммунологическая толерантность (влияние лекарственных средств)

"Несовпадение" результатов ПЦР и ИФА

Генетически обусловленная серонегативность (серонегативные спондилоартриты (ССА))

"Иммунологический след"

Родоспецифических тест-систем для ИФА С. pneumonia, C. pecorum, C. Рsitaci

Зависимость результатов анализа методом ПЦР от используемого материала. Материал для ПЦР должен быть получен из места предполагаемой локализации процесса хламидийный сальпингитeлапароскопия

ПЦР не позволяет установить стадию инфекционного процесса

Авидность - это прочность связи между антителом и антигеном, которая отражает сроки заражения и длительность инфекционного процесса.

Индекс авидности (ИА) < 30-35% - свежая первичная инфекция;

ИА ?40% анамнестические высокоавидные антитела;

ИА 31-39% поздняя стадия первичной инфекции или недавно перенесенной инфекции.

Секвенирование (от англ. sequence - последовательность) - определение нуклеотидной последовательности генома или его фрагмента организма. полимеразный инфекция урогенитальный хламидиоз

Секвенирование всего генома раковых клеток необходимо для того, чтобы сложить целостную картину развития опухоли. Это позволит определить не только эффективность стандартной терапии, но и сформулировать направления генной терапии.

6. Праймеры. Диагностика урогенитального хламидиоза

В последние годы отмечается распространение урогенитального хламидиоза - трудно диагностируемой инфекции, являющейся частой причиной бесплодия, внематочной беременности, неонатальной смертности [1]. Заболевание характеризуется бессимптомным течением, обусловленным способностью хламидий длительно существовать в условиях макроорганизма, не вызывая клинических признаков. При этом диагностика хламидиоза, даже в хорошо оснащенных лабораториях, затруднительна, так как при бактериоскопии хламидии (тельца Провацека) выявляются не более чем у 15-40% нелечившихся больных.

Бактериологические методы, основанные на выделении культуры, длительны, дорогостоящи, могут быть выполнены лишь в специализированных научно-медицинских центрах и не обеспечивают 100% выявляемость возбудителя [2, 3]. Иммунологические методы, основанные на обнаружении антигенов, относительно часто дают ложные результаты из-за нестандартности выпускаемых наборов, субъективизма в оценке результатов, недостаточной чувствительности у больных с асимптоматичной и вяло текущей инфекцией [4, 5]. Методы серологической диагностики не рекомендуются к широкому применению в связи с низкой иммуногенностью хламидий, длительной циркуляцией антител у переболевших и высокой частотой ложноположительных результатов [2, 3].

Развитие генно-инженерной методологии позволило в конце 80-х годов разработать новый способ детекции микроорганизмов: полимеразную цепную реакцию (ПЦР) [6]. Метод основан на обнаружении специфичного участка ДНК искомого микроорганизма и позволяет с высокой специфичностью, без этапа культивирования детектировать 100 микробных клеток и менее. ПЦР оказалась эффективной и для выявления хламидий. Праймеры для реакции соответствовали нуклеотидным последовательностям (ДНК-мишеням) родоспецифичного гена большого белка наружной мембраны (MOMP) или Chlamydia traсhomatis 7500 пар нуклеотидов. Реакция была успешно опробована при исследовании как соскобов слизистой оболочки цервикального канала и уретры, так и осадка мочи [7, 8]. Использование в качестве анализируемого материала мочи представляет собой перспективный неинвазивный метод диагностики, значительно упрощающий исследование.

Известно, что тестируемые биологические образцы могут в различной степени ингибировать ПЦР. Поэтому исследуемый материал обычно вначале подвергают специальной обработке [9]. Этот этап имеет определяющее значение при работе с клиническими образцами. Важнейшим компонентом реакции, определяющим ее специфичность и чувствительность, являются праймеры, правильный выбор которых определяет эффективность ПЦР.

Целью настоящего исследования была сравнительная оценка эффективности ПЦР при работе с материалом от больных урогенитальным хламидиозом при использовании различных способов подготовки проб и праймеров на основе плазмидной и хромосомной ДНК.

Обследовано 48 мужчин в возрасте 16-35 лет и 36 женщин в возрасте 18-25 лет. У мужчин брали первую порцию мочи (10-15 мл), центрифугировали 20 мин при 4000g, осадок использовали для анализа. Одновременно делали соскоб слизистой оболочки переднего отдела уретры. У женщин исследовали соскоб слизистой оболочки цервикального канала. Материал суспендировали в 200 мкл буфера T: сахароза - 218 мМ, KH2PO4 - 3,8 мМ, K2HPO4 - 4,9 мМ, бычий сывороточный альбумин (БСА) - 1%. При невозможности немедленного проведения анализа образцы в буфере T хранили при -20њC в течение 24-48 ч.

Перед ПЦР исследуемые пробы обрабатывали одним из следующих трех способов.

Первый способ. Материал осаждали центрифугированием (3 мин при 12000g) и ресуспендировали в буфере А [триc-HCl(pH 7,5) - 10 мМ, сахароза - 0,32 М, тритон X-100 - 1%]. Выдерживали 30 мин при 37њC, затем центрифугировали 30 мин при 12000g. Осадок суспендировали в 50 мкл буфера Б (твин 20 - 0,45%, нонидет NP40 - 0,45%, протеиназа K - 1 мг/мл, 10хПЦР-буфер - 1/10 объема).

Пробы инкубировали при 55њC в течение 2 ч и затем при 95њC в течение 10 мин. В ПЦР брали 20 мкл полученного лизата. Такая двухступенчатая обработка обеспечивала более качественную очистку проб, чем изолированное использование только буфера А или Б или их модификаций.

Второй способ. К 100 мкл материала в буфере Т добавляли 300 мкл 6 М гуанидина изотиоцианата и нуклеосорбента на основе стеклянных шариков (использовали набор для выделения ДНК производства ТОО "Гено-Гемо-Диагностика", Москва), инкубировали при 65њC в течение 10 мин, центрифугировали при 12000g в течение 30 с, осадок суспендировали в 300 мкл 4 М раствора гуанидина изотиоцианата, встряхивали на вортексе, центрифугировали при 12 000g в течение 30 с. Нуклеосорбент промывали дважды, с использованием центрифугирования в буфере: трис-HCl(pH 7,3) - 10 мМ, NaCl - 59 мМ, этанол - 50% (v/v). В последний раз осадок ресуспендировали в 20 мкл бидистиллированной воды и инкубировали 5 мин при 55њC, периодически встряхивая на вортексе. Пробы центрифугировали 30 с, водную фазу (20 мкл) использовали в ПЦР.

Третий способ. К 200 мкл образца в буфере Т добавляли 200 мкл щелочного лизирующего буфера (NaOH - 40 мМ, трис-основной - 200 мМ, додецилсульфата натрия - 5%). Инкубировали в течение 20 мин при 37њC, затем смешивали с равным объемом фенолхлороформа (1:1), встряхивали на вортексе и центрифугировали 2 мин при 12000g. Отбирали водную фазу, добавляли 1/10 объема 3 М ацетата натрия, 1/10 объема раствора тРНК (из концентрации 10 мг/мл), 2 объема 96% этанола, выдерживали 20 мин при -70њC и центрифугировали 15 мин при 12 000g. Осадок суспендировали непосредственно в реакционной смеси.

В качестве ДНК-матриц для амплификации выбраны фрагменты ранее секвенированных гена MOMP (хромосома) и плазмиды хламидий [10, 11]. Нуклеотидный состав праймеров на основе ДНК гена MOMP; CH1-5'-ГАА ААА АЦТ ЦТТ ГАА АТЦ ГГ-3', CH2-5'-АТТ ТТЦ ТАГ АТТ ТЦА ТТТ ТГТ Т-3'; на основе ДНК плазмиды: C1-5'-ТТЦ ЦЦЦ ТТГ ТАА ТТЦ ГТТ ГЦ-3', C2-5'-ТАГ ТАА ЦТГ ЦЦА ЦТТ ЦАТ ЦА-3'.

Праймеры C1-C2 использовали во всех анализах. При тестировании соскобов слизистой оболочки цервикального канала у женщин (36 случаев) одновременно ставили реакцию с праймерами на основе гена MOMP.

Реакцию проводили на программируемых амплификаторах ("Techne", Англия, и AMPLY-250 "Биокомсервис", Россия). Реакционная смесь (объем 50 мкл) содержала: ПЦР-буфер [трис-HCl(pH 8,4) - 67 мМ, (NH 4)2SO4 - 16,6 мМ, MgCl2 - 2,5 мМ, 2-меркаптоэтанол - 10 мМ, БСА - 1,5 мг/мл], каждого дНТФ - 2 мМ, каждого праймера - 12 пмоль, Taq-полимеразы - 2 ед. ПЦР выполняли в течение 35 циклов со следующим режимом каждого цикла: 1 мин - 92њC, 1 мин - 48-55њC, 1 мин - 72њC. Результаты реакции учитывали путем гельэлектрофореза реакционной смеси в окрашенном бромидом этидия 2% агарозном геле с последующим просмотром в УФ-свете. Амплифицированные фрагменты ДНК идентифицировали по размеру. В качестве положительного контроля в реакцию вносили лизат культуры хламидий, в отрицательном контроле вместо образца брали дистиллированную воду.

Полученные данные об эффективности различных способов обработки проб свидетельствуют, что подготовительный этап во многом определяет чувствительность методики. Наибольшее число положительных реакций имело место при использовании двухступенчатой обработки лизирующими буферами, при этом они всегда совпадали с положительными результатами, полученными при обработке материала методами нуклеосорбции и фенол-хлороформной экстракции (см. таблицу). Обращает на себя внимание идентичность результатов анализов соскобов слизистой оболочки уретры и мочи у мужчин при обработке материала лизирующими буферами. Это свидетельствует о возможности исследования осадка мочи для лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза.

Таблица 1. Количество положительных результатов ПЦР при различных способах подготовки исследуемого материала и использовании праймеров на основе плазмиды (C1-C2) и гена MOMP (CH) хламидий

Способ подготовки исследуемого материала	Мужчины	Женщины
	соскоб слизистой уретры	осадок мочи	соскоб слизистой цервикального канала
	праймеры
	C1-C2	C1-C2	C1-C2	CH
Последовательная обработка лизирующими буферами	22	22	18	18
С использованием нуклеосорбента	20	18	16	18
Щелочной лизис с очисткой ДНK фенол-хлороформной экстракцией	21	20	17	17

В экспериментах по сравнению эффективности праймеров с материалом, полученным от женщин, положительные и отрицательные результаты совпадали во всех случаях. Однако следует заметить, что при использовании CH праймеров полоски амплифицированной ДНК на электрофорезе, как правило, были значительно менее четкими по сравнению с C1-C2 праймерами.

Таким образом, применение для подготовки проб лизирующих буферов обеспечивало наибольшую чувствительность методики и может быть рекомендовано при исследовании как соскобов слизистых оболочек, так и осадка мочи на наличие хламидий методом ПЦР. Случаи меньшей эффективности способа подготовки материала, основанного на использовании нуклеосорбента, можно, на наш взгляд, объяснить непригодностью марки силикагеля из примененного набора для полной сорбции плазмидной ДНК, являющейся матрицей для C1-C2 праймеров. При работе с CH праймерами, матрицей для которых служит хромосомная ДНК, способ обработки проб с нуклеосорбентом обеспечивал такие же результаты, как и при воздействии лизирующими буферами. Возможно, что применение другого типа нуклеосорбента, отличающегося размером частиц и адсорбционной активностью в отношении небольшой по размерам плазмидной ДНК, позволит адаптировать данный подход для работы с C1-C2 праймерами. Целесообразность проведения исследований в этом направлении очевидна, так как методика подготовки проб с нуклеосорбентами является наиболее простой и легко воспроизводимой.

Неудовлетворительные результаты анализа при выделении ДНК методом щелочного лизиса с последующей фенол-хлороформной экстракцией и преципитацией нуклеиновых кислот этанолом можно объяснить ингибированием ПЦР остатками фенола. Следует учитывать возможность потери минимальных количеств ДНК при осаждении ее этанолом, особенно в случаях одновременного проведения большого числа анализов. Многоэтапность способа, основанного на фенольной эстракции, может приводить к погрешностям при работе с большим количеством клинических проб и получению ложноотрицательных результатов. Поэтому данный подход, несмотря на свою популярность в качестве способа получения ДНК в научных лабораториях, на наш взгляд, малопригоден при массовых обследованиях.

Трудности в интерпретации результатов ПЦР с CH праймерами указывают на целесообразность использования в реакции олигонуклеотидов на основе плазмиды хламидий. Одинаковые результаты, полученные со всеми испытанными праймерами, свидетельствуют о присутствии обоих вышеназванных ДНК-мишеней у выявленных нами популяций хламидий, поэтому очевидна возможность использования CH праймеров в качестве контрольных для проверки результатов ПЦР.

Результаты проведенной работы позволяют рекомендовать для ПЦР-анализа на хламидии праймеры на основе плазмиды C. trachomatis и метод подготовки исследуемых проб с помощью последовательной обработки лизирующими буферами. Показано, что описанный способ дает возможность выявлять возбудитель урогенитального хламидиоза в осадке первой порции мочи с такой же эффективностью, как и в соскобах уретры. http://nature.web.ru/db/msg.html?mid=1174444

Официальное становление метода ПЦР в России связано с выходом в 1995 г. двух методических рекомендаций:

- "Диагностика хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекций методом цепной полимеразной реакции"(№95-106,утверждены МЗ РФ 08.08.95), в них ПЦР впервые рекомендована к применению в практическом здравоохранении;

- "Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции" (утверждены 22.06.95 Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора РФ), связаны с организацией работы в ПЦР-лаборатории.

В 1995 г. была впервые подготовлена техническая документация (инструкции, технические условии и др.) и зарегистрирован в Минздраве России отечественной набор реагентов для ПЦР-диагностики Chlamydia trachomatis.

За прошедшие годы появилось большое количество модификаций ПЦР, позволивших значительно увеличить потенциальные возможности первоначально предложенного метода: мультипраймерная ПЦР, гнездовая ПЦР, ПЦР in situ, ПЦР в режиме реального времени и др. При использовании метода ПЦР для идентификации РНК, а не ДНК применяется модифицированный ОТ-ПЦР метод. Одним из существенных преимуществ метода ПЦР является высокая чувствительность и специфичность. Чувствительность определяется сочетанием следующих трех факторов: эффективностью выделения ДНК возбудителя, чувствительностью собственно ПЦР и выбранного метода детекции.



Литература

1. Гинцбург А.Л. // Микробиология, иммунология и вирусология. - 1999. - №5. - С.22-26.

2. Ключенович В.И. // М-лы республ. конф. "Медико-социальные проблемы ВИЧ-инфекции, парентеральных гепатитов и инфекций, передаваемых половым путем". 10-11 дек. 2003 г., Минск. - С. 3-6.

3. Козлова В.И., Пухнер А.Ф. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий. - СПб.: Ольга, 2000.

4. Лопухов Л.В., Эйдельштейн Н.В. // Клин. микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000. - Т.2, N 3. - С. 96-106.

5. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. // Клин. лабор. диагностика. - 2000. - №4. - С. 25-33.

6. Навроцкий А.Л. // М-лы республ. конф. "Медико-социальные проблемы ВИЧ-инфекции, парентеральных гепатитов и инфекций, передаваемых половым путем". 10-11 дек. 2003 г., Минск. - С. 11-13.

7. Организация лаборатории и правила работы в лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции: Метод. рекомендации МЗ РФ/Разработчик ЦНИИ Э и М МЗ РФ; сост. Т.А. Бектимиров, В.В. Блоха. - Мн., 1995. - С. 10.

Размещено на Allbest.ru

...