14.01.14 - ендокринологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

СИРОТЕНКО ЛАРИСА АНАТОЛІЇВНА

Харків 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Державній установі «Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського Академії медичних наук України»

Науковий керівник доктор медичних наук, старший науковий співробітник Бондаренко Володимир Олександрович, Державна установа «Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського Академії медичних наук України», завідувач відділенням патології статевих залоз.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Гладкова Алла Іванівна, Державна установа «Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського Академії медичних наук України», провідний науковий співробітник лабораторії репродуктивної ендокринології

кандидат медичних наук Турчина Світлана Ігорівна, Державна установа «Інститут охорони здоров'я дітей і підлітків Академії медичних наук України», старший науковий співробітник ендокринологічного відділення

Захист відбудеться " 10 " червня 2010 р. о 13.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.564.01 при Державній установі «Інститут проблем ендокринної патології ім. В. Я. Данилевського Академії медичних наук України» (61002, м. Харків, вул. Артема, 10).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Державної установи «Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського Академії медичних наук України» (61002, м. Харків, вул. Артема, 10).

Автореферат розісланий " 30 " квітня 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук Т.М. Тихонова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Тенденція до скорочення чисельності населення в Україні внаслідок зниження рівня народжуваності та підвищення рівня загальної смертності, ставить під загрозу її майбутнє і робить проблему репродуктивного здоров'я загальнонаціональною (Возианов О. Ф., 2003; Гайдаєв Ю. О., 2007. ). Між тим в Україні налічується приблизно до одного мільйона людей, що страждають на неплідність у шлюбі (Нуріманов К. Р., 2006), яка у 30-50 % випадків, за даними різних авторів, обумовлена чоловічим фактором (Лучицький Є. В., 2005; Горпін-ченко І. І., 2008).

Однією з причин виникнення розладів репродуктивного здоров'я чоловіків є перинатально детерміновані порушення статевого розвитку та гіпогонадизм, які обумовлені негативним впливом на систему гіпоталамус-гіпофіз-гонади стресорними, хімічними та фармакологічними факторами під час вагітності (Демченко О. М., 1992; Резніков О. Г., 2001; Гладкова А. І., 2002; Плєхова О. І. і співавт., 2009). Такі негативі чинники можуть порушувати програму функціонування репродуктивної системи як на етапах пубертатного розвитку, так і в подальшому, в період статевої зрілості (Бондаренко В. О., 2004). Насамперед це зумовлено зміною секреції тестостерону у пре- та неонатальному періодах, відповідний рівень якого, в обмежений проміжок часу, необхідний для подальшого формування ознак чоловічої статі (Дигало Н. Н., 1993; Шишкін Г. Т., 1999).

На сьогодні переконливо доведено, що в пренатальному періоді під впливом різноманітних факторів, у тому числі й фармакологічних, у плода можуть сформуватися порушення, що опосередковані гуморальним середовищем вагітних жінок (Демченко О. М., 1994; Нікітін О. І., 2002; Коренєва Е. М., 2002; Hayley M. еt al., 2008). При народженні це клінічно ніяк не проявляється, але маніфестується в пубертаті. Саме тому патофармакологічні тестикулярні дисфункції у дорослих займають провідне місце серед андропатій (Нікітін О. І., 1998; Коренєва Є. М., 2002).

Вивчення дії ліків на функцію гонад не завжди визначає всю глибину патофармакологічної небезпеки для репродуктивного здоров'я, оскільки при цьому не враховується імпринтингова дія ліків, яка може змінити програму статевого розвитку та привести до порушення репродуктивної системи в дорослому віці (Nyitray M., 1998; Пенжоян Г., 2000; Зелінський А. А., 2003).

Із літературних джерел відомо, що при деяких патологіях вагітності використовують препарати дипіридамол, вінпоцетин та еуфілін з властивостями інгібіторів фосфодіестеразної активності, які покращують стан плаценти, зменшують агрегацію тромбоцитів, сприяють кращому перенесенню гіпоксії клітинами, підсилюють транспорт кисню до тканин та інше (Сідєльнікова В. М., 1997; Заболотнов В. О., 2001). Дія цих препаратів реалізується через посилене накопичення цАМФ (циклічний аденозинмонофосфат) у тканинах (Bender A. T., 2006; Башкєєв В. І., 2007). Визнаючи роль цАМФ як посередника дії багатьох гормонів та медіаторів, які виробляє нейроендокринна система плода, треба зазначити, що підвищення його вмісту в структурах мозку (гіпоталамусі та гіпофізі) або гонадах, в критичному періоді, може призвести до зміни рівня гонадотропінів та тестостерону (Evanss J. J., 1999; Richards J. S., 2001). Однак, як це вплине в подальшому на формування репродуктивної системи нащадків, не відомо.

Виходячи з вищеозначеного, дослідження наслідків впливу в пренатальному періоді інгібіторів фосфодіестеразної активності на стан репродуктивної системи чоловічого організму є актуальним для визначення нових факторів, що можуть сприяти формуванню диспрограмних гіпогонадних станів, а також для наукового обґрунтування підходів до їх профілактики та діагностики.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт ДУ «Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України» і є фрагментом двох наукових тем відділення патології статевих залоз: «Розробити та впровадити у практику методичні підходи до диференційованої терапії гіпофертильності, що обумовлена порушеннями функціональної зрілості сперматозоїдів» (№ держреєстрації 0105U000982) та «Розробити диференційовані підходи до діагностики та терапії безпліддя, яке обумовлене дисфункцією системи гіпофіз-статеві залози» (№ держреєстрації 0108U001146).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є встановлення наслідків впливу в пренатальному періоді інгібіторів фосфодіестеразної активності на статевий розвиток та функцію репродуктивної системи чоловічого організму.

Реалізація поставленої мети здійснена шляхом вирішення наступних завдань:

1. Визначити показники соматостатевого розвитку самців щурів, які отримували у пренатальному періоді препарати вінпоцетин, дипіридамол та еуфілін.

2. Дослідити особливості змін органів репродуктивної системи у статевозрілих самців щурів під впливом введення в пренатальному періоді інгібіторів фосфодіестеразної активності.

3. Вивчити вплив препаратів вінпоцетин, дипіридамол та еуфілін, введених в пренатальному періоді, на реалізацію дії екзогенного тестостерону.

4. Встановити характер зміни цАМФ, тестостерону, естрадіолу та гонадотропної функції гіпофіза у неонатальних тварин під впливом інгібування фосфодіестеразної активності шляхом введенням у пренатальному періоді препаратів вінпоцетин, дипіридамол та еуфілін.

5. Дослідити рівень цАМФ, тестостерону, естрадіолу та гонадотропної функції гіпофіза у тварин пубертатного та статевозрілого віку під впливом введення у пренатальному періоді препаратів вінпоцетин, дипіридамол та еуфілін. репродуктивний аренатальний інгібітор еуфілін

6. З'ясувати, яким чином введення у пренатальному періоді препаратів вінпоцетин, дипіридамол та еуфілін впливає на генеративну функцію сім'яників та рівень фруктози у сім'яних пухирцях статевозрілих тварин.

Об'єкт дослідження - процес перинатальної детермінації програми формування чоловічої статевої системи.

Предмет дослідження - параметри статевого дозрівання самців щурів популяції Вістар, рівні цАМФ у андрогенозалежних тканинах неонатальних самців, гонадотропна функція гіпофіза, гормональний статус та генеративна функція яєчок за умов пренатальної обробки лікарськими засобами, які інгібують фосфодіестеразну активність.

Методи дослідження: фізіологічні, біохімічні, імуноферментні, гістологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше визначено патогенетичну роль блокування фосфодіестеразної активності в пренатальному періоді у розвитку гіпофункції статевих залоз у самців щурів.

Встановлено, що причиною формування порушень соматостатевого розвитку та репродуктивної системи у експериментальних тварин при введенні в пренатальному періоді вінпоцетину та дипіридамолу є неонатальне зростання тестостерону, зумовлене накопиченням цАМФ у гіпофізі та сім'яниках, та активація гонадотропної функції гіпофіза. Доведено, що зменшення відносної андрогенізації (співвідношення Т/Е₂) у неонатальних самців щурів, яким в пренатальному періоді вводили еуфілін, також сприяє порушенню пубертатогенезу та призводить до гіпофункції сім'яників у дорослому віці.

Практичне значення одержаних результатів. Визначення наслідків фармакологічного інгібування фосфодіестеразної активності в пренатальному періоді щодо подальшого соматостатевого розвитку та функціонування репродуктивної системи чоловічого організму дає можливість поповнити перелік потенційно шкідливих препаратів серед фармакологічних засобів, що застосовуються з лікувальною метою у період вагітності.

Отримано наукове обґрунтування для створення нових перинатально обумовлених гіпогормональних та гіпореалізаційних моделей порушень статевої системи, які розширять можливість для експериментальної ендокринології в дослідженні їх патогенезу та розробки методів профілактики гіпофункції сім'яників.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно здійснено постановку і проведення експерименту, визначення концентрації гормонів, аналіз та систематизацію результатів, статистичну обробку даних, обґрунтування наукових положень та висновків, а також написання дисертаційної роботи. Дизайн дисертаційного дослідження розроблено під керівництвом д.мед.н. В. О. Бондаренко. Весь фактичний матеріал, приведений у роботі, отримано на базі відділення патології статевих залоз та лабораторії фармакології ДУ «Інститут проблем ендокринної патології ім. В. Я. Данилевського АМН України». Вивчення соматичних показників розвитку проведено разом із к.б.н. Н.М. Бречкою, гістологічні дослідження проводилися за участі к.б.н. Ю.Б. Ларьяновської.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на науково-практичних конференціях: конференція молодих вчених «Медицина третього тисячоліття» (Харків, 2001 р.); 3-а міжнародна міждисциплінарна науково-практична конференція «Сучасні проблеми науки та освіти» (Ужгород, 2002 р.);1-а науково-практична конференція молодих вчених, присвячена 95-річчю з дня народження акад. В. П. Комісаренка (Київ, 2002 р.); науково-практична конференція, присвячена 150-річчю з дня народження В. Я. Данилевського (Харків, 2002 р.); науково-практична конференція „Сучасні напрямки розвитку ендокринології” (Другі Данилевські читання, Харкiв, 2003 р.); 10-а Міжнародна Пущінська школа-конференція „Биология - ХХІ века” (Пущіно, Росія, 2006 р.); ІІ з'їзд Асоціації ендокринологів України (Київ, 2007 р.); конференція молодих вчених «Биосфера Земли: прошлое, настоящее и будуще» (Єкатеринбург, Росія, 2008 р.); Всеукраїнський конгрес «Сьогодення та майбутнє фармації» (Харків, 2008 р.); науково-практична конференція з міжнародною участю «Вікові аспекти патофізіології, діагностики та терапії ендокринної патології» (Харків, 2008 р.); І-а Міжнародна науково-практична конференція «Актуальні питання репродуктивної фармакології» (Харків, 2009 р.).

Публікації. Автором за темою дисертації опубліковано 21 наукову працю, з них 5 статей (2 одноосібні, 3 - у співавторстві) у спеціалізованих наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, 15 тез у матеріалах вітчизняних та закордонних з'їздів та конференцій, один патент України.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 139 сторінках друкованого тексту. Складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 4 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, списку використаних джерел, який містить 282 посилань та займає 31 сторінку. Роботу ілюстровано 33 таблицями, 17 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Роботу виконано на нащадках першого покоління білих щурів популяції Вістар та 100 білих безпородних інфантильних мишах. Експериментальні тварини утримувались у стандартних умовах віварію ДУ «Інститут проблем ендокринної патології ім. В. Я. Данилевського АМН України» при природному освітленні і раціоні, рекомендованому для даного виду тварин, та питному режимі ad libitum. Репрезентативну вибірку тварин, необхідних для одержання нащадків, було сформовано методом випадкового відбору тварин з генеральної сукупності; розподіл на експериментальні групи проведено рендомним методом Г. Лакін (1980). Усього досліджено 400 нащадків самців першого покоління, а саме 5, 65 та 100-добового віку. Дослідження проводилися відповідно до національних „Загальних етичних принципів експериментів на тваринах” (Україна, 2001), які узгоджуються з положеннями „Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985).

Дослідження наслідків впливу інгібіторів фосфодіестеразної активності на нащадків чоловічої статі було здійснено шляхом введення вагітним самкам щурів препаратів з вищеозначеними властивостями. Згідно з літературними даними, ми використовували методику тестування пренатального порушення (або деструкції) програми статевого розвитку, що рекомендована багатьма авторами (Bigsby R. E. et al., 1999; Melnick R. еt аl., 2002; John F. G., 2002; Косенко Н. Д., 2002). Введення речовин здійснювали у критичному періоді формування ознак чоловічої статі (пізній пренатальний період 15-21 доба гестації). Досліджувані препарати застосовували один раз на добу внутрішньочеревно: вінпоцетин у дозі 2 мг/кг маси тіла, дипіридамол у дозі 20 мг/кг, еуфілін - 45 мг/кг (всього по сім ін'єкцій). Контрольну групу складали нащадки чоловічої статі від самок, що отримували розчинник (воду для ін'єкцій) внутрішньочеревно в об'ємі 0,5 мл. Дози були розраховані, виходячи з терапевтичної дози для людини з урахуванням коефіцієнта видової чутливості для щурів (Риболовлев Ю. Р., 1984; Стефанов О. В., 2001), а наслідки цих впливів на нащадків самців досліджували, починаючі від 1-ї доби життя до статевозрілого віку (100 доба життя).

Визначали термін прорізування зубів, відкриття очей, відлипання вух, появи генералізованої шерсті і виходу яєчок у калитку. Реєстрували динаміку зміни маси та довжини тіла та аногенітальну відстань від народження до пубертатного віку.

Рівень цАМФ досліджували у сім'яниках, гіпофізі, печінці й мозку 5-добових щурят та у сім'яниках і гіпофізі дорослих самців нащадків. Рівень цАМФ у зразках визначали імуноферментним методом набором фірми R&D Systems (США), (діапазон вимірюваних концентрацій від 0,58 до 200 пмоль/мл). Зчитування результатів усіх імуноферментних тестів проводили на імуноферментному аналізаторі StatFax 2100, 2004 (Immunotech, США) при довжині хвилі 450 та 405 нм (діапазон хвилі від 405 до 680).

Рівень Т (тестостерону) та Е₂ (естрадіолу) визначали у сироватці периферичної крові 5, 65 та 100-добових самців імуноферментним методом за допомогою стандартних наборів: „DRG” (USA) - для визначення Е₂ (діапазон вимірюваних концентрацій від 0,5 до 500 пг/мл), та „Стероид ИФА-тестостерон” фірми „Алкор Био” (Росія) - для визначення Т (діапазон вимірюваних концентрацій від 0,5 до 50 нг/мл).

Для визначення гонадотропної функції гіпофіза використовували біологічний метод тестування на інфантильних білих мишах (Рєзников О. Г., 1986). Сумарну гонадотропну активність вивчали в екстрактах гіпофізів 5, 65 та 100-добових самців нащадків.

У віці 65 та 100 діб у тварин вивчали масу сім'яників, гіпофіза, ВПЗ (вентральної частини передміхурової залози), СП (сім'яних пухирців), СЧ (статевого члена). Визначали вміст фруктози в СП за методом Бокуняєвої. У 100-добових щурів вивчали кристалізацію секрету та гістоструктуру ВПЗ (Вартапетов Б. А., 1975).

Стан генеративної функції сім'яників у статевозрілих тварин досліджувався шляхом оцінки морфофункціональних характеристик епідидимальних сперматозоїдів та гістроструктури сім'яників (Тиктинский О. Л., 1990; Стефанов О. В., 2001).

Дослідження впливу пренатального введення вінпоцетину, дипіридамолу та еуфіліну на чутливість таргетних органів до дії екзогенного Т проводилось у статевозрілих самців щурів (Стефанов О. В., 2001). Тварини піддавалися ГЕК (гонадектомії) у віці 100 діб. Через 10 діб після ГЕК - строк, достатній для регресії акцесорних залоз статевого апарату ВПЗ та СП, які є класичними тест-об'єктами для визначення ступеня андрогенної насиченості організму (Стефанов О. В., 2001), вводили ТСП (тестостерона пропіонат) підшкірно в дозі 1 мг/кг один раз на добу протягом 10 діб. Через 24 години після закінчення експериментальної терапії тварин знеживлювали, виділяли гіпофіз, ВПЗ, СП, СЧ та вимірювали їх масу.

При статистичній обробці результатів перевіряли характер розподілу цифрового матеріалу у вибірках за допомогою критерію W Шапіро-Уілка. Здебільшого дані відповідали закону нормального розподілу.

Рівність дисперсій у групах перевіряли за допомогою критерію F Фішера. Порівняння середніх арифметичних значень проводили за допомогою критерію Стьюдента t для незалежних вибірок. Розходження вважали статистично значущим при p < 0,05 (Гланц С., 1998).

Результати дослідження та їх обговорення. Проведені дослідження показали, що при досягненні самцями віку 30 діб, це відповідає початку пубертату в людини, виявлено відставання соматостатевого розвитку, а саме зменшення маси та розміру тіла, аногенітальної відстані. Ці зміни починають простежуватись з 20 доби життя, у групах тварин, що отримували вінпоцетин та дипіридамол. У групі самців, які отримували еуфілін, відмічалось вірогідне зменшення темпів зростання маси тіла. Опущення яєчок у калитку в усіх піддослідних групах, які отримували препарати з властивостями інгібіторів фосфодіестеразної активності, відбувалося, в середньому, пізніше на 3,5 доби порівняно з контрольними тваринами.

При дослідженні маси андрогенореагуючих та андрогенозалежних органів самців у віці 65 діб, виявлено статистично значуще зниження як відносної, так і абсолютної маси сім'яників, ВПЗ та СП у тварин усіх груп, які отримували інгібітори фосфодіестеразної активності в пренатальному періоді.

Зниження маси андрогенозалежних органів відбувалося на тлі зменшеної маси тіла цих тварин. Зменшення розмірів сім'яників та ВПЗ свідчить про формування гіпогонадного стану в усіх піддослідних самців. Передміхурова залоза є андрогенозалежним органом, а недостатня продукція Т призводить до зменшення її розмірів, як це відбувається при кастрації самців (Стефанов О. В., 2001). Дослідження маси сім'яників та андрогенозалежних органів статевозрілих (100-добових) щурів також виявило значне зниження цих показників (p < 0,05) в усіх експериментальних групах порівняно з контрольними тваринами (табл. 1).

Таблиця 1

Маса органів репродуктивної системи щурів самців, які отримували в пренатальному періоді препарати з властивостями інгібіторів фосфодіестеразної активності,

Мікроскопічне дослідження стану передміхурової залози 100-добових самців, що в пренатальному періоді отримували препарати з властивостями інгібіторів фосфодіестеразної активності, показало змінену функціональну активність залози. Найбільш виражені зміни спостерігалися в тварин з груп, що отримували дипіридамол та вінпоцетин. У групі тварин, яка отримувала еуфілін, зміни були менш значними. Таке зниження функціонального стану передміхурової залози піддослідних самців може бути наслідком андрогенної недостатності організму.

У роботі проведено вивчення характеру змін рівнів цАМФ у органах та тканинах, що відповідають за секрецію та метаболізм Т, у неонатальних самців щурів, матері яких отримували препарати з властивостями інгібіторів фосфодіестеразної активності. Встановлено, що на 5 добу після народження відбувалося суттєве зростання цАМФ у сім'яниках та печінці в тварин усіх піддослідних груп (табл. 2).

Таблиця 2

Рівень цАМФ в органах неонатальних самців щурів, що отримували у пренатальному періоді препарати з властивостями інгібіторів фосфодіестеразної активності,

Введення в пренатальному періоді вінпоцетину - інгібітора фосфодіестерази першого типу та дипіридамолу - інгібітора фосфодіестерази четвертого типу сприяло значному збільшенню у неонатальних тварин рівня цАМФ також у гіпофізі (p < 0,05). Цього не відбувалося при застосуванні еуфіліну - неселективного інгібітора фосфодіестеразної активності.

Враховуючи наявність зміни рівня цАМФ в органах нащадків неонатального віку, матері яких під час вагітності отримували інгібітори фосфодіестеразної активності, та порушення соматостатевого розвитку, вивчали рівні Т та Е₂ у сироватці крові та співвідношення Т/Е₂, показника, що вказує на відносну андрогенізацію чоловічого організму, в самців неонатального, пубертатного та статевозрілого віку.

Рівень Т у неонатальних тварин, матері яких отримували вінпоцетин та дипіридамол, вірогідно підвищувався порівняно з контролем (p < 0,05). Введення еуфіліну суттєво не змінювало неонатальний пік Т. При дослідженні кількості Е₂ у сироватці крові неонатальних тварин відмічено значне збільшення цього гормону в тварин тих самих груп, в яких відбувалося підвищення рівня Т. В той же час при вивченні співвідношення Т/Е₂ у неонатальних тварин статистично значущі зміни відзначено в групі, що отримувала еуфілін. Незважаючи на незначне зростання секреції Е₂ (p > 0,05) порівняно з контрольними тваринами, показник відносної андрогенізації зменшився (51,52±0,75) проти (75,63±6,55) ум. Од. у контролі (p < 0,05). Посилена секреція Е₂ у групах тварин, які пренатально отримували дипіридамол та вінпоцетин, відбувалася на тлі зростання рівня Т, тому співвідношення Т/Е₂ не мало вірогідної різниці порівняно з контрольними тваринами. При дослідженні рівня статевих гормонів та співвідношення Т/Е₂ у тварин пубертатного віку відзначено, що в групі, яка отримувала вінпоцетин вміст Т був вірогідно меншим порівняно з контрольними тваринами, в групах, які отримували дипіридамол та еуфілін, це зменшення складало, у середньому, 1,5 разів. Концентрація Е₂ у сироватці крові оброблених тварин суттєво відрізнялася від показників контрольної групи тільки у самців, матері яких отримували дипіридамол. При вивченні показника Т/Е₂ в усіх досліджуваних групах мало місце зменшення відносної андрогенізації нащадків самців, що співвідносилося зі зниженою вагою андрогензалежних органів цих тварин (табл. 3).

Таблиця 3

Рівні тестостерону та естрадіолу в сироватці крові та їх співвідношення у самців щурів, що отримували в пренатальному періоді інгібітори фосфодіестеразної активності,

Рівень статевих гормонів та співвідношення Т/Е₂ у статевозрілих тварин також вказували на наявність гіпоандрогенного стану. У самців усіх досліджуваних груп Т залишався вірогідно меншим в порівнянні зі значеннями контрольних тварин. Найбільшим це зниження реєстрували у групі, яка отримувала вінпоцетин, у групах що отримували дипіридамол та еуфілін зменшення рівня Т середніх значень складало 1,5 та 1,3 відповідно. Вивчення вмісту Е₂ у статевозрілих тварин не виявило вірогідних змін цього показника. Але, як і в пубертатному періоді, мало місце зниження відносної андрогенізації щурів самців у групах, які отримували вінпоцетин та дипіридамол, зменшення співвідношення Т/Е₂ складало (55,71±2,08) та (67,24±4,81) відповідно проти (110,72±7,28) ум. Од. у контролі (p < 0,05). У групі, яка отримувала еуфілін, показники відносної андрогенізації знаходилися на рівні контрольної групи.

Таким чином, можна констатувати факт, що пренатальна обробка препаратами, здатними інгібувати фосфодіестеразну активність, приводить до гіпоандрогенії на стадії пубертатного розвитку та зберігається в статевозрілому віці. Найбільш глибоких порушень репродуктивної системи зазнала група тварин, що пренатально отримувала вінпоцетин, у якій відмічаються найбільш низькі рівні Т, Т/Е₂ та маси андрогензалежних органів у період пубертату та статевої зрілості.

Звертає на себе увагу той факт, що підвищення рівня Т у неонатальних тварин співпадало зі зростанням гонадотропної активності гіпофізів та вмісту цАМФ у цій залозі. В пубертатному періоді, навпаки, спостерігалося навіть зниження гонадотропної активності гіпофізів у групах самців, що отримували дипіридамол та еуфілін. Таке зниження гонадотропної активності в групі, що отримувала дипіридамол на тлі підвищення рівня Т у неонатальному періоді, свідчить про наявність порушення функціонування системи гіпоталамус-гіпофіз-статеві залози. Зменшення рівня гонадотропінів у пубертатному періоді в групі, що отримувала еуфілін обумовлене, ймовірно, не зміною рівня Т, а порушенням Т/Е₂ балансу. Відсутність змін гонадотропної активності у тварин, яким пренатально вводили вінпоцетин, свідчить, що в них формується диспрограмний гіпогонадизм вже на етапах пубертатного періоду, коли існує гіпореалізація дії ЛГ (лютеінізуючого гормону) на сім'яники. Гонадотропна активність гіпофізів статевозрілих тварин суттєво не відрізнялась від значень контрольної групи. Це відбувалося при незмінних концентраціях цАМФ у гіпофізах та яєчках у всіх групах експериментальних тварин.

Такі зміни гонадотропної активності гіпофізів на тлі гіпофункції статевих залоз свідчать про можливість формування в період пубертату андропатій подібно вторинному гіпогонадизму та нормогонадотропній недостатності гонад у статевозрілих тварин. Це співпадає з даними клінічних досліджень, які свідчать, що, коли існує негативний фармакологічний вплив у пренатальному періоді, характерним є відповідний нормі тип секреції гонадотропінів у дорослих чоловіків.

Дослідження, які спрямовані на з'ясування чутливості андрогензалежних органів до дії екзогенного Т у статевозрілих самців щурів, матері яких отримували препарати з властивостями інгібіторів фосфодіестеразної активності, показали, що дані препарати викликають зниження чутливості ВПЗ та СП до дії ТСП. У більшій мірі це має прояв у самців, які отримували дипіридамол. В цій групі щурів спостерігається, з одного боку, збільшена регресія СП під впливом ГЕК, а з іншого - найменша реакція андрогензалежних органів на введення ТСП. У групі, яка отримувала еуфілін, таке зниження чутливості до ТСП найменше. Відомо, що підвищення рівня Т у пренатальному періоді призводить у подальшому до порушення морфогенезу та функціональної диференціації передміхурової залози. Введення в пренататальному періоді інгібіторів фосфодіестеразної активності - дипіридамолу та вінпоцетину сприяло підвищенню рівня неонатального Т. Можливо таке зростання ендогенного Т зумовило значні зміни в рецепторному апараті передміхурової залози, що в статевозрілому віці виявило зниження чутливості залози до дії екзогенного Т (рис. 1).

Рис. 1 Вплив тестостерону пропіоната на масу андрогенозалежних органів гонадектомованих статевозрілих самців, матері яких під час вагітності отримували інгібітори фосфодіестеразної активності: - рівень значущості відносно вікового контролю (p < 0,05)

З іншого боку, підвищення концентрації Е₂ у піддослідних щурів неонатального віку, могло призвести до зменшення здатності передміхурової залози зв'язувати Т. Тим більше, що при вивченні кристалізації секрету передміхурової залози, тесту, який дозволяє визначити андрогенну насиченість органу, виявлено порушення в усіх досліджуваних групах. Подібний гіпофункціональний стан обумовлений як зменшенням секреції ендогенного Т, так і гіпореалізацією його дії.

Відомо, що сперматогенез відображає стан репродуктивної системи чоловічого організму та регулюється ендокринними та паракринними факторами. Для повноцінного перебігу всіх етапів сперматогенезу необхідна відповідна нормі секреція насамперед ФСГ (фолікулостимулюючого гормону) та Т.

Аналіз зміни функціонального стану епідидимальних сперматозоїдів щурів нащадків, матері яких отримували під час вагітності інгібітори фосфодіестеразної активності, показав, що рівень рухомості був істотно зниженим, в середньому на 20-30 %, в усіх досліджуваних групах (табл. 4).

Таблиця 4

Параметри спермограм у щурів, які в пренатальному періоді отримували інгібітори фосфодіестеразної активності

Порушення рухливості сперміїв у самців, які отримували інгібітори фосфодіестеразної активності у пренатальному періоді, пов'язано зі зниженою функцією СП, про що свідчить зменшення концентрації в них фруктози. Кількість фруктози вважають маркером реалізації дії Т, яка залежить не тільки від його кількості, але й чутливості таргетних органів до дії андрогенів. Зниження вмісту фруктози відбувалося в групах, які отримували вінпоцетин, дипіридамол та еуфілін на 50, 48 та 34 % відповідно відносно середніх значень контрольної групи. Кількість патологічних форм сперматозоїдів вірогідно збільшувалась в групі, яка отримувала вінпоцетин. Концентрація сперматозоїдів у групах, що отримували вінпоцетин та дипіридамол, була суттєво зменшеною (p < 0,05).

Гістологічне дослідження сім'яників частково підтвердило пригнічення сперматогенезу у групах, що отримували вінпоцетин та дипіридамол. Кількісний аналіз стану сперматогенного епітелію показав зменшення кількості канальців з наявністю 12 стадії мейозу, збільшення канальців зі злущеним епітелієм та зниження індексу сперматогенезу в групі, що отримувала вінпоцетин. Все це, в цілому, можна розцінити як деяке пригнічення сперматогенезу.

При кількісному аналізі процесу сперматогенезу в групі, що отримувала дипіридамол, виявлено зменшення чисельності нормальних сперматогоній у канальцях, зниження індексу сперматогенезу, зменшення кількості канальців з наявністю 12 стадії мейозу. Тобто можна констатувати зменшення резерву сперматогенезу (зменшення сперматогоній).

У групі, яка отримувала еуфілін, ніяких значних змін гістоструктури яєчок не виявлено. Ймовірно зміни, що спостерігаються в спермограмі цих тварин, пов'язані з недостатньою андрогенною насиченістю організму, яка призводить до порушення процесу дозрівання сперматозоїдів у придатках сім'яників.

Таким чином, проведені дослідження свідчать, що пренатальне застосування препаратів, які мають властивість інгібіторів фосфодіестеразної активності, може призводити до посилення секреції Т у неонатальному періоді, або навпаки, до порушення андроген-естрогенного балансу.

Як неонатальна гіперандрогенемія, так і зниження відносної андрогенізації може призводити, в подальшому, до порушення програми функціонування системи гіпофіз-статеві залози в період пубертату, яке зберігається й у дорослому віці. Результатом цього є недостатність процесів соматичного і статевого розвитку.

Гіпотестостеронемія в період пубертату може бути як результатом зниження гонадотропної активності, так і відбуватися на тлі відповідної нормі секреції гонадотропінів. У подальшому, в дорослому віці, зберігається зменшена маса органів статевої системи на тлі гіпоандрогенемії та відповідних контролю показників гонадотропної активності, що свідчить про гіпореалізацію дії насамперед ЛГ на клітини Ляйдіга. Існуючі при цьому негативні зміни в параметрах спермограм, насамперед порушення їх рухомості на тлі відповідних контролю показників концентрації сперміїв, свідчать, що ймовірно існує достатня секреція ФСГ, яка необхідна для ініціації та підтримки сперматогенезу. Крім того наявність у дорослих тварин зниження андрогенного ефекту на периферії дає підставу вважати, що застосування в пренатальному періоді інгібіторів фосфодіестеразної активності призводить в подальшому до формування патології репродуктивної системи подібно диспрограмному перинатально детермінованому гіпогонадизму. Для даної форми андропатій характерним, насамперед, є нормогонадотропний варіант гіпогонадизму зі зниженням реалізації дії як ЛГ, так і Т.

Ці положення необхідно враховувати при застосуванні в акушерській практиці препаратів, які мають властивість інгібіторів фосфодіестеразної активності. Хлопців з ознаками порушень процесів статевого дозрівання та наявності в анамнезі пренатального застосування вищевказаних лікарських засобів необхідно брати на диспансерний облік для проведення відповідних заходів щодо корекції патології пубертату. Крім того, отримані результати розширюють уявлення стосовно можливих патогенетичних механізмів формування репродуктопатій у дорослих чоловіків, які зазнали впливу в пренатальному періоді не тільки препаратів, що досліджувались, але й інших фармакологічних засобів, які мають властивість інгібіторів фосфодіестераз.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичне обґрунтування та подано нове вирішення наукового завдання в галузі ендокринології щодо визначення наслідків впливу інгібіторів різних типів фосфодіестераз в пренатальному періоді на параметри соматостатевого розвитку та репродуктивну систему самців щурів.

1. У самців щурів, пренатально оброблених інгібіторами фосфодіестеразної активності, спостерігається порушення процесів соматичного та статевого розвитку.

2. У статевозрілих тварин, що пренатально отримували інгібітори фосфодіестеразної активності, зберігається ретардація процесів статевого дозрівання та відбувається порушення функціонального стану передміхурової залози.

3. У дорослих нащадків самців, матері яких отримували інгібітори фосфодіестеразної активності, існує зменшена чутливість андрогензалежних органів ВПЖ та СП до дії тестостерону.

4. Пренатальне введення дипіридамолу та вінпоцетину призводить до збільшення цАМФ у сім'яниках, печінці та гіпофізі, наслідком чого є зростання гонадотропної активності, підвищення рівнів Т та Е₂ у неонатальних тварин. Пренатальне введення еуфіліну сприяє зростанню рівня цАМФ у сім'яниках та печінці, що не змінює гонадотропної активності гіпофіза та рівня Т, але посилює секрецію Е₂ та сприяє зменшенню рівня відносної андрогенізації у неонатальному періоді самців щурів.

5. У самців пубертатного віку та статевозрілих щурів, які були пренатально оброблені препаратами з властивостями інгібіторів фосфодіестеразної активності, існує зменшення секреції Т та величин його відношення до Е_2. В періоді статевого розвитку гіпогонадний стан у тварин, що пренатально отримували дипіридамол та еуфілін, є наслідком зниження гонадотропної активності гіпофіза.

6. Пренатальне введення інгібіторів фосфодіестеразної активності призводить до погіршення функціонального стану сперматозоїдів у дорослих тварин, а при застосуванні вінпоцетину та дипіридамолу й до пригнічення сперматогенезу, що співпадає зі зниженням утворення у СП енергозабезпечуючого фактора еякуляту - фруктози. Відсутність у експериментальних тварин, що отримували еуфілін, суттєвих змін концентрації сперматозоїдів свідчить, що існуючі патологічні зміни обумовлені порушенням процесів дозрівання сперміїв внаслідок андрогендефіциту.

7. Пренатальне застосування препаратів з властивостями інгібіторів фосфодіестеразної активності є фактором, який може стати передумовою формування у осіб чоловічої статі ознак нормогонадотропного гіпогонадного стану в період статевої зрілості.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Сиротенко, Л. А. Показники соматостатевого розвитку та сперматогенна функція дорослих щурів, які пренатально отримували препарати, що мають властивість інгібіторів фосфодіестерази [Текст] / Л. А. Сиротенко // Пробл. ендокрин. патол. 2007. № 2. С. 61-65.

2. Сиротенко, Л. А. Влияние фармакологического ингибирования фосфодиэстеразной активности на реализацию андрогенного эффекта [Текст] / Л. А. Сиротенко, Н. М. Бречка // Пробл. ендокрин. патол. 2008. № 3. С. 68-73. (Дисертантом самостійно виконано експеримент, зібрано і систематизовано матеріал, оформлено результати у вигляді статті).

3. Сиротенко, Л. А. Постнатальний розвиток самців щурів під впливом введення в пренатальному періоді інгібіторів фосфодіестеразної активності [Текст] / Л. А. Сиротенко, Н. М. Бречка // Експерим. і клініч. мед. 2009. № 3. С. 43-46. (Дисертантом самостійно виконано експеримент, зібрано і систематизовано матеріал, оформлено результати у вигляді статті).

4. Сиротенко, Л. А. Рівень циклічного аденозинмонофосфату у самців щурів неонатального віку за умов пренатального фармакологічного блокування фосфодіестеразної активності [Текст] / Л. А. Сиротенко // Ендокринологія. 2009. Т. 14, № 1. С. 157-160.

5. Сиротенко, Л. А. Стан андрогензалежних органів та рівень андрогенізації самців щурів під впливом введення в пренатальний період інгібіторів фосфодіестеразної активності [Текст] / Л. А. Сиротенко, В. О. Бондаренко, Н. М. Бречка // Пробл. ендокрин. патол. 2009. № 2. С. 68-73. (Дисертант самостійно виконував експеримент, гормональні дослідження, проводив збір і систематизацію матеріалу, оформлення результатів у вигляді статті).

6. Пат. 40738 Україна, МПК⁵¹ G09B 23/28 (2008. 04). Спосіб моделювання пренатально обумовлених патоспермій [Текст] / Л. А. Сиротенко, В. О. Бондаренко, Н. Г. Малова Н. М. Бречка, Є. М. Коренєва, О. В. Щербак, Т. С. Божко, Г. В. Зайченко (UA) ; заявник і патентовласник ДУ «Інститут проблем ендокринної патології ім. В. Я. Данилевського АМН України» (UA). - № u200812998 ; заявл. 10.11.08 ; опубл. 27.04.09, Бюл. № 8 - 6 с. (Дисертант самостійно отримував експериментальні данні, проводив їх аналіз та оформлення у вигляді патенту).

7. Сиротенко, Л. А. Особливості змін андрогензалежних органів та показники сім'яної рідини у статевозрілих самців щурів, яким в пренатальному періоді вводили дипіридамол [Текст] / Л. А. Сиротенко, Н. М. Бречка // Ендокринологія. 2007. Т. 12, додаток. С. 262. (Дисертантом самостійно виконано експеримент, зібрано і систематизовано матеріал, оформлено результати у вигляді статті).

8. Сиротенко, Л. А. Становление системы воспроизведения особей мужского пола под влиянием ингибиторов фосфодиэстеразной активности [Текст] / Л. А. Сиротенко, Н. М. Бречка // Биосфера Земли: прошлое, настоящее, будущее : материалы конф. молод. ученых, Екатеринбург 21-25 апреля. 2008 г. Екб., 2008.- С. 271-272. (Дисертантом самостійно виконано експеримент, зібрано і систематизовано матеріал, оформлено результати у вигляді доповіді та тез).

9. Сиротенко, Л. А. Параметры соматополового развития самцов крыс под влиянием пренатального введения ингибиторов фосфодиэстеразы [Текст] / Л. А. Сиротенко, В. А. Бондаренко, Е. М. Коренева, Н. М. Бречка // Актуальні питання репродуктивної фармакології : матеріали міжнар. наук.-практ. конф., Харків 21 листопада 2008 р. Х., 2008, С. 74. (Дисертантом самостійно виконано експеримент, зібрано і систематизовано матеріал, оформлено результати у вигляді доповіді та тез).

10. Сиротенко, Л. А. Влияние пренатального введение винпоцетина на андрогенную насыщенность организма половозрелых самцов крыс [Текст] / Л. А. Сиротенко, Н. М. Бречка // Вікові аспекти патофізіології, діагностики та терапії ендокринної патології: матеріали наук.-практ. конф. з міжнар. учасю, Харків 4-5 грудня. 2008 р. Х., 2008, С. 79. (Дисертантом самостійно виконано експеримент, зібрано і систематизовано матеріал, оформлено результати у вигляді тез).

АНОТАЦІЯ

Сиротенко Л. А. Вплив введення інгібіторів фосфодіестеразної активності у пренатальному періоді на стан репродуктивної системи самців щурів (експериментальне дослідження). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.14 - ендокринологія. Державна установа «Інститут проблем ендокринної патології ім. В. Я. Данилевського АМН України», Харків, 2010.

Дисертація присвячена вивченню наслідків пренатального введення інгібіторів різних типів фосфодіестераз на параметри соматостатевого розвитку та репродуктивну систему щурів самців. Встановлено, що пренатальне введення дипіридамолу та вінпоцетину призводить до збільшення цАМФ у сім'яниках, гіпофізі та печінці, а також гонадотропної активності гіпофіза та підвищення рівнів Т та Е₂ у неонатальних тварин. Введення еуфіліну підвищувало рівень цАМФ у сім'яниках та печінці, але не змінювало гонадотропної активності гіпофіза й рівня Т, та сприяло зменшенню рівня відносної андрогенізації. На етапі пубертатогенезу у експериментальних тварин відмічено порушення процесів соматостатевого розвитку, зменшення продукції Т та зниження гонадотропної активності гіпофіза. У статевозрілому віці у піддослідних тварин зберігається ретардація процесів статевого дозрівання та гіпоандрогенемія, що обумовлена гіпореалізацією дії гонадотропінів на сім'яники. Відзначено також зменшення чутливості ВПЗ та СП до дії екзогенного тестостерону у дослідних самців. Вивчення морфофункціонального стану сперматозоїдів виявило порушення з боку рухливості, а при застосуванні вінпоцетину та дипіридамолу й до пригнічення сперматогенезу. Такі зміни реєстрували на тлі зниженої концентрації енергозабезпечуючого фактора еякуляту - фруктози. Відсутність змін в кількості сперміїв при введенні еуфіліна може свідчити, що патологічні зміни виникають на етапі процесів дозрівання, як наслідок існуючого андрогенодефіциту.

Ключові слова: пренатальний період, інгібітори фосфодіестеразної активності, вінпоцетин, дипіридамол, еуфілін, соматостатевий розвиток, сперматогенез, андрогенореагуючі органи.

АННОТАЦИЯ

Сиротенко Л.А. Влияние введения ингибиторов фосфодиэстеразной активности в пренатальном периоде на состояние репродуктивной системы самцов крыс (экспериментальное исследование). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.14 - эндокринология. Государственное учреждение «Институт проблем эндокринной патологии им. В.Я. Данилевского АМН Украины», Харьков, 2010.

Диссертация посвящена исследованию последствий экспериментального влияния ингибиторов разных типов фосфодиэстераз, в пренатальном периоде, на параметры соматополового развития и репродуктивную систему крыс самцов.

В результате выполнения данной работы установлено, что пренатальное введение дипиридамола и винпоцетина приводит к увеличению количества цАМФ в семенниках, гипофизе и печени у неонатальных животных. У животных данных экспериментальных групп отмечается достоверное повышение гонадотропной активности гипофиза и концентрации половых гормонов. Введение эуфиллина приводило к увеличению цАМФ в семенниках и печени, при этом уровень гонадотропной активности гипофиза и концентрация Т не изменялись, а концентрация Е₂ достоверно повышалась, что приводило к снижению относительной андрогенизации неонатальных самцов этой гркппы. В дальнейшем у экспериментальных животных, получавших в пренатальном периоде ингибиторы фосфодиэстеразной активности, отмечалось отставание соматического и полового развития.

В возрасте 65 дней, что соответствует пубертатному периоду, у самцов регистрировали сниженную продукцию Т. Группы самцов, которые в пренатальном периоде получали дипиридамол и эуфиллин, гипогонадное состояние сопровождалось снижением гонадотропной активности гипофиза.

Установлено, что в половозрелом возрасте сохраняется ретардация процессов полового созревания как следствие гипоандрогенемии, обусловленной гипореализацией гонадотропинов на семенники.

При исследовании чувствительности ВПЖ и СП к действию экзогенного тестостерона у кастрированных самцов, пренатально обработанных ингибиторами фосфодиэстеразной активности, была выявлена сниженная реакция андрогензависимых органов.

Изучение морфофункционального состояния сперматозоидов выявило нарушения со стороны подвижности, а при введении дипиридамола и винпоцетина и снижения количества сперматозоидов. Данные изменения происходили на фоне сниженной концентрации в СП энергообеспечивающего фактора эякулята - фруктозы. Отсутствие изменений в количестве сперматозоидов может свидетельствовать о том, что патологические изменения происходят на этапе процессов созревания спермиев, как следствие существующего андрогенодефицита.

Результаты проведенных исследований расширят представления о факторах формирования нарушений соматополового развития и перенатально детерминированных форм гипогонадных состояний у мужчин.

Ключевые слова: пренатальный период, ингибиторы фосфодиэстеразы, дипиридамол, винпоцетин, эуфиллин, соматополовое развитие, сперматогенез, андрогенреагирующие органы.

ANNOTATION

Syrotenko L.A. The influence of administering the phosphodiesterase activity inhibitors during the prenatal period on the reproductive system in the male rats (experimental study). - Manuscript.

The present thesis is submitted for a MS degree in biology, speciality 14.01.14. - Endocrinology. - The Publish establishment “The Institute of Problems Endocrine Pathology named after V.Ya.Danilevsky. AMS. Ukraine, Kharkiv, 2010.

The present thesis is devoted to the investigation into aftereffects of the experimental inhibitors influence of different phosphodiesterase types during the prenatal period on parameters of the somatic sexual development and the reproductive system in male rats. As a result of the present work it has been found that dipyridamol and vinpocetin administered prenatally give rise to cAMP amounts both in testicles and hypophysis, which results in the increased gonadotropic activity and sexual hormones concentration in neonatal animals. The prenatal administration of euphyllin contributes to an increase of cAMP in testicles alone. It does not change the gonadotropic hypophysis activity and the testosterone level but it caused a decrease in the relative androgenization of neonatal males. The following disturbance of the somatic and sexual development has been noted in experimental animals. It can be put down to the lowered testosterone level production in puberty. The hypogonadal state is accompanied by the reduced gonadotropic hypophysis activity due to dipyridamol and euphyllin administered in males during the prenatal period. At the mature age the puberty processes retardation is retained as a consequence of hypoandrogenia resulting from gonadotropins hyporealization in relation to the testicules. The exogenic testosterone was found to reduce the sensitivity of the prostate and spermatocysts receptor apparatus. The examination of the morphofunctional spermatozoa status allowed to reveal disturbed spermatozoa motility and a decrease of spermatozoa concentration afte dipyridamol and vinpocetin injections. These changes were fixed against the background of the lowered concentration of the energy-supplying ejaculate factor - fructose. No changes in the amount of spermatozoa can testify to the fact heat pathological processes take place at the stage of spermatic maturation due to existent androgendeficiency. The results of the present work make it possible to the broaden the knowledge of the factors in causing disturbances of the somatic-sexual development and perinatally determinated forms of the hypogonadal states in males.