Біологічна активність кріоконсервованої сироватки кордової крові в експериментальній моделі постгістеректомічного синдрому

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини

УДК: 615.832.9:615.361.018.5.013.8:618.14-089.87

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Біологічна активність кріоконсервованої сироватки кордової крові в експериментальній моделі постгістеректомічного синдрому

14.01.35 -кріомедицина

Нардід Едуард Олегович

Харків - 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Науковий керівник: білковий біологічний сироватка

академік НАН України, доктор медичних наук, професор Грищенко Валентин Іванович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, директор, м. Харків.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Юрченко Тетяна Миколаївна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріоморфології, м. Харків.

доктор медичних наук, професор Карпенко Володимир Геннадійович, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, проректор з науково-педагогічної (міжнародної) роботи, м. Харків.

Захист відбудеться «21» грудня 2010 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків - 15, вул. Переяславська, 23).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).

Автореферат розіслано «12» листопада 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук, профессор Розанов Л. Ф.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Фундаментальні дослідження в галузі сучасної кріобіології і кріомедицини дозволили розробити науково обґрунтовані методи кріоконсервування біологічних об'єктів. Застосування кріобіологічних технологій дає можливість розробляти нові препарати з наступним збереженням їх властивостей протягом тривалого часу [Цуцаєва А. О. та ін., 2000; Грищенко В. И. и др., 2002; Ліпіна О. В. та ін., 2003; Прокопюк О. С. и др., 2008]. Таке довгострокове зберігання дозволяє значно збільшити інтервал часу між етапом заготівлі матеріалу і його клінічним застосуванням, що дає можливість провести відповідні дослідження для виключення інфікування препаратів та створити їх запаси у кріобанках. Перспективними є методики кріоконсервування й наступного зберігання препаратів при температурі близько _80°С безпосередньо в лікувальних установах. Одержання нових ефективних біологічних препаратів - один із пріоритетних напрямків сучасної кріобіології і кріомедицини.

Стимулююча дія кордової (плацентарної) крові (КК) давно привернула увагу клініцистів. В наш час підвищився інтерес до застосування в клінічній практиці компонентів КК, зокрема, сироватки кордової крові (СКК). Використання досягнень кріомедицини і кріобіології мало величезне значення для вирішення проблеми збереження складу й властивостей компонентів КК [Грищенко В. І. та ін., 2000; Цуцаєва А. О. та ін., 2000].

Різні біологічні об'єкти вимагають індивідуальної технології кріоконсервування, а її розробка є одним з пріоритетних завдань кріобіології і кріомедицини. Актуальною є розробка оптимальних методик низькотемпературного консервування СКК, які дозволять максимально зберегти її біоактивні сполуки в нативному стані без порушення їх вихідного фізіологічного співвідношення, а також, - зберігати кріоконсервовану СКК безпосередньо в клініці. Індивідуальність підходу до розробки технологій низькотемпературного консервування СКК обумовлена особливостями біології даного матеріалу, пов'язаними, насамперед, з його специфічною плацентарною природою [Грищенко В. І. та ін., 2000; Ліпіна О. В. та ін., 2003].

Сироватка кордової крові є унікальною біологічно активною субстанцією. У ній міститься більше 60 специфічних плацентарних білків, які виконують роль ферментів, адаптогенів, рецепторів, факторів росту, імунорегуляторних агентів; цілий ряд пептидів _ структурних аналогів нейропептидів головного мозку, гормонів, вітамінів, мікроелементів [Морозова Р. П. и др., 1999; Милованов А. П. и др., 1999]. Кріоконсервовані препарати, отримані з елементів плацентарного комплексу, у тому числі й СКК, використовуються при лікуванні захворювань жіночої полової сфери, таких як ендометріоз, безплідність, гінекологічні запальні захворювання, станів, пов'язаних з порушенням гормональної рівноваги [Грищенко В. І. та ін., 2000; Цуцаєва А. О. та ін., 2003; Берегова Ю. П., 2003; Мошко Ю. А., 2003; Прокопюк О. С. и др., 2008]. Поряд з цим існує проблема лікування постгістеректомічного синдрому (ПГС), який виникає у жінок, після видалення матки у фертильному віці. Останнім часом в Україні кількість таких пацієнток значно збільшилась. Більше 20% жінок у віці старше 18 років перенесли видалення матки, у тому числі 70% з них були прооперовані у віці від 30 до 40 років [Венцківський Б. М. та ін., 2000; Чайка В. К., 2001; Вихляева Е. М., 2004; Татарчук Т. Ф. та ін., 2005].

Відповідно до сучасних уявлень найважливішою ланкою патогенезу ПГС є гормональний дисбаланс внаслідок ішемії яєчників і порушення зворотних рецепторних зв'язків після видалення матки з наступними клінічними проявами естрогенної недостатності [Kaiser R. et al., 1989; Derksen J. G. et al., 1998; Краснопольский В. И. и др., 1998; Кулаков В. И. и др. 1999, Макаров О. В. и др., 2000; Краснова И. А. и др., 2001; Рубченко Т. И. и др., 2002; Доброхотова Ю. Э., 2003].

Отже, важливого значення в терапії ПГС набуває використання засобів, які володіють стимулюючою, гормонозамісною дією, до яких належать й біологічні препарати. Одним з таких препаратів може бути кріоконсервована СКК, застосування якої при даній патології дозволяє очікувати позитивного клінічного ефекту.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною наукових досліджень Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України й виконана за темами: «Проведення наукових досліджень, розробка та втілення інформаційних, організаційних та технічних заходів, необхідних для збереження й використання наукового об'єкта - низькотемпературного банку біологічних об'єктів» (№ держреєстрації 0104U006441); «Дослідження впливу низьких температур і складу середовища на деякі елементи фетоплацентарного комплексу людини (клітини й плазма кордової крові, тканини плаценти та їх екстракти)» (№ держреєстрації 0101U003482); «Дослідження впливу низькотемпературної обробки тканини плаценти на біологічну активність її водно-сольових екстрактів відносно клітин різного походження» (№ держреєстрації 0106U002167), в яких автор виконував окремі розділи.

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження - визначення впливу різних режимів кріоконсервування на збереження білкового складу СКК, структурно-функціональні властивості її білкових макромолекул, а також вивчення біологічної активності й ефективності СКК в експериментальній моделі постгістеректомічного синдрому.

Для досягнення мети були поставлені наступні задачі:

1. Вивчити вплив швидкостей і кінцевих температур заморожування сироватки кордової крові, у тому числі і помірно низьких (_80єC), на розподіл білків за молекулярними масами.

2. Вивчити вплив заморожування-відігрівання на конформаційну динаміку білків сироватки кордової крові.

3. Дослідити методом НВЧ-діелектрометрії гідратацію біомакромолекул сироватки кордової крові та її зміну під впливом низьких температур.

4. Створити експериментальну модель постгістеректомічного синдрому.

5. Вивчити біологічну активність кріоконсервованої і нативної сироватки кордової крові при її використанні в експериментальній моделі постгістеректомічного синдрому.

Об'єкт дослідження. Сироватка кордової крові.

Предмет дослідження. Зміни білкових компонентів СКК під впливом низьких температур, біологічна активність СКК (в експериментальній моделі ПГС).

Методи дослідження: спектрофотометрії, гель-хроматографії, ЕПР спінових зондів, електрофорезу, НВЧ-діелектрометрії, диференціальної скануючої калориметрії, морфології, імуноферментного аналізу.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено дослідження впливу режимів і кінцевих температур заморожування на білковий спектр СКК. Комплексом методів (ЕПР спінових зондів, диференціальна скануюча калориметрія, НВЧ-діелектрометрія) встановлено, що після повільного заморожування й наступного відігрівання відбувається порушення конформації поверхневих поліпептидних ланцюгів білків СКК. Вперше показано, що повільне охолодження приводить до наступної агрегації білків сироватки, основну роль в якій відіграють сироватковий альбумін й імуноглобуліни.

Визначено оптимальні швидкості заморожування СКК й температури довгострокового зберігання. Вперше досліджена можливість використання СКК для корекції гормональних порушень в експериментальній моделі ПГС. Доведено, що після використання кріоконсервованої при _80єC СКК в експериментальній моделі ПГС нормалізується рівень фолікулостимулюючого гормону (ФСГ), лютеїнізуючого гормону (ЛГ) і естрадіолу. Вперше вивчена біологічна активність кріоконсервованої СКК в експериментальній моделі ПГС (у порівнянні з замісною гормональною терапією (ЗГТ)).

Практичне значення отриманих результатів. Проведене комплексне дослідження етапів низькотемпературного консервування СКК, яка є природною сумішшю білкових молекул, визначило підходи, що дозволяють узагальнено характеризувати стан білків у складі білкових сумішей і розробити практичні рекомендації для низькотемпературних банків щодо оптимальних режимів заморожування й кінцевих температур довгострокового зберігання білків й їхніх сумішей. Отримані результати дозволяють обґрунтувати економічно вигідне в порівнянні з температурою зрідженого азоту тривале зберігання препаратів СКК у морозильних камерах з температурою _80єC зі збереженням їх високої біологічної активності й клінічної ефективності.

Результати, отримані при використанні СКК в експериментальній моделі ПГС, дозволяють очікувати ефект від клінічного застосування препаратів, створених на основі СКК, при розвитку ПГС.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Автором роботи сформульована мета і визначені задачі, проведені і проаналізовані експерименти, статистично оброблені результати, сформульовані висновки, які засновані на експериментальних даних. В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

- у роботах [1, 5, 6, 8, 9, 11, 12] у дослідженні впливу режимів заморожування СКК на зміну спектрів ЕПР сироватки;

- у роботах [2, 7] у вивченні за даними гель-хроматографії та електрофорезу зразків СКК впливу швидкостей заморожування й температур зберігання СКК на розподіл білків за молекулярними масами;

- у роботах [3, 10] у аналізі впливу низької температури на діелектричну проникність зразків СКК;

- у роботах [4, 13, 14] у вивченні біологічної активності кріоконсервованої та нативної СКК в експериментальній моделі ПГС на підставі вмісту естрадіолу, ФСГ та ЛГ у периферичній крові до і після гістеректомії у самок щурів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації повідомлені й обговорені на IX Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), IV з'їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006), представлені на V Міжнародному симпозіумі «Актуальні проблеми біофізичної медицини» (Київ, 2007), конференціях «Нові кріотехнології для рішення фундаментальних і прикладних завдань медицини» (Харків, 2008), «Досягнення та перспективи експериментальної і клінічної ендокринології» (Харків, 2010), «Актуальные вопросы акушерства, гинекологии и пеританологии» (Судак 2010).

Публікації. За темою дисертаційного дослідження опубліковано 14 робіт, з них 6 _ у спеціалізованих наукових журналах, включених до переліку, затвердженого ВАК України.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу, присвяченого матеріалам і методам дослідження, двох розділів власних досліджень й висновків. Робота викладена на 135 сторінках, містить 4 таблиці й 22 ілюстрації (графіки, діаграми). Список використаних літературних джерел складається з 227 найменувань викладений на 23 сторінках.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Заготовлену за стандартною методикою кордову кров людини центрифугували у скляних флаконах при 2000-3000 об/хв протягом 30 хв, відокремлювали СКК, переносили її в стерильний скляний флакон. Отриману СКК розливали у стерильні одноразові поліетиленові контейнери об'ємом 1,0 мл.

З метою розробки оптимальних технологій низькотемпературного консервування СКК, що дозволяють максимально зберегти її склад і властивості, застосовували у дослідженнях наступні програми заморожування:

1 програма - до -196°С (швидкість охолодження близько 300-400°С/хв);

2 програма - до -80°С (швидкість охолодження близько 300-400°С/хв);

3 програма - до -80°С (швидкість охолодження близько 100°С/хв);

4 програма - до -80°С (швидкість охолодження близько 35°С/хв);

5 програма - до -80°С (швидкість охолодження близько 1-2°С/хв);

6 програма - до -20°С (швидкість охолодження близько 1-2°С/хв).

Розморожування СКК здійснювали при температурі 36±2°С.

Розподіл білків за молекулярними масами методом гель-хроматографії проводили на колонці 2х21см із сефадексом G-200. Концентрацію білка у фракціях визначали спектрофотометричним методом [Harris D. A., 1987]. Спектри поглинання записували на спектрофотометрі «Pye Uniсam SP 8000». Для електрофоретичнго аналізу компонентів СКК використовували апарат для горизонтального електрофорезу SE 2120 фірми «Solar» з програмним забезпеченням і блок електроживлення РЕ 2120. Розподіл зразків проводили на пластинах з агаровим покриттям 108см. Електрофорез ( при силі струму 40 мА й напрузі 200 В) проводили протягом 20 хв. Як барвник використовували бромфеноловий синій. Денситометричний аналіз електрофореграм виконували на скануючому денситометрі ДМ 2120.

Для дослідження динамічної структури СКК застосовували метод ЕПР спінових зондів [Кузнецов А. И., 1976], використовуючи гідрофільний спіновий зонд ТЕМПОН, а також стеаринову кислоту, спін-мічену в 16 положенні уздовж гідрофобного ланцюга (16-ДС). Спін-мічені зразки сироватки містили по 100 мкМ зонда ТЕМПОН або зонда 16-ДС. Спектри ЕПР реєстрували на спектрометрі “Bruker” ER-100 (Німеччина) з температурною стабілізацією зразка. Були вивчені температурні залежності параметрів рухливості зондів у контрольних й розморожених зразках у діапазоні температур 0-40°С. Зі спектрів ЕПР зонда ТЕМПОН визначали інтенсивності центрального й бічного компонентів триплету й оцінювали параметр рухливості зонда. Як характеристики конформаційної динаміки сироваткових білків використовували значення параметра максимального розщеплення спектра ЕПР (2Амакс.), ширини центрального компонента спектра ЕПР зонда 16-ДС (ДН0).

Дійсну частину комплексної діелектричної проникності е? при 20°С в інтервалі температур 4-40°С вимірювали на НВЧ-діелектрометрі резонаторного типу на частоті 9,2 ГГц. Температуру вимірювали за допомогою термопари з точністю ±0,1°С. Відносна помилка вимірів діелектричної проникності е? становила 0,15%.

Термограми СКК реєстрували на прецизійному диференціальному адіабатичному скануючому мікрокалориметрі DASM-4 (СКББП АН Росии, Пущино). Швидкість сканування температури становила 1°C/хв, надлишковий тиск - 2,5 атм. Помилка у визначенні температури денатурації домінантних білків сироватки Тd і ширини температурного інтервалу денатурації на напіввисоті піка Тd не перевищувала 0,5 й 1,0°C відповідно.

Для постановки експерименту було використано 120 статевозрілих самок щурів лінії Wistar масою 180-200 г, які утримувалися в стандартних умовах віварію Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України при нормальному освітленні й харчуванні ad libidum. Експериментальну роботу виконували відповідно до положень «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985) , а також до «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах», схвалених Національним конгресом по біоетиці (2001).

Протягом 2 тижнів у щурів брали піхвові мазки для їх відбору. Відібрані тварини мали п'ятиденний естральний цикл і на момент початку експерименту перебували в стадії циклу dioestrous. При визначенні фаз естрального циклу у самок щурів використовували характерні морфологічні ознаки при мікроскопії піхвових мазків відповідно до опису [Киршенблата Я. Д., 1969].

Всі тварини були прооперовані на стадії циклу dioestrous. Гістеректомію в самок щурів виконували під наркозом. Черевну порожнину розкривали розрізом по середній лінії живота довжиною 4-5 см. Кожен ріг матки був виведений і покладений на вологу серветку. Маточно-яєчникова артерія й вена були перев'язані. Після цього кожен матковий ріг був відсічений. Після контролю гемостазу передня черевна стінка ушивалася наглухо вікрилом. Шов обробляли 5% спиртовим розчином йоду [Ozdamar S., 2005].

При розрахунку доз препаратів використовували константи біологічної активності [Рыболовлев Ю. Р., 1979] за формулою:

D1 = R1 * D2 / R2,

де D1 - доза для людини;

R1 - коефіцієнт видової витривалості для людини;

D2 - доза для тварини;

R2 - коефіцієнт видової витривалості для тварини.

Доза 17 в-естрадіолу для однієї тварини склала 0,02 мг, доза СКК _ 0,02 мл на добу. Естрадіол вводили внутрішньом'язово один раз на добу протягом 30 діб, СКК - внутрішньом'язово один раз на добу протягом 10 діб.

Тварини були розподілені на шість груп:

1 група (n=20) - без лікування після видалення матки (контрольна група);

2 група (n=20) - після гістеректомії проведення ЗГТ (17 в-естрадіол );

3 група (n=20) - введення нативної СКК;

4 група (n=20) - введення СКК після заморожування до -196єС зі швидкістю 300-400°С/хв;

5 група (n=20) - введення СКК після заморожування до -80єС зі швидкістю 300-400°С/хв;

6 група (n=20) - введення СКК після заморожування до -80єС зі швидкістю 300-400°С/хв і наступного зберігання при цій температурі протягом 3 місяців.

Кров для визначення рівня гормонів забирали із хвостової вени тварин. Вміст ФСГ, ЛГ й естрадіолу у сироватці крові визначали імуноферментним методом аналізу за допомогою аналізатора Stat Fax 303 Plus (США). Для визначення вмісту естрадіолу у сироватці крові використовували гормональні тест-набори для твердофазного імуноферментного аналізу in vitro (ООО «Хема-Медика», Москва, Россия), а ФСГ і ЛГ - гормональні тест-набори для твердофазного імуноферментного аналізу in vitro (ЗАО «Алкор- Био», Санкт-Петербург, Россия).

Статистичну обробку отриманих результатів проводили на персональному комп'ютері, використовуючи пакети програм Statistika v5.5 й Origin 6.0. Оцінка статистичної значимості показників і розходжень розглянутих вибірок проводилась з використанням параметричного критерію Стьюдента й непараметричного критерію Манна-Уітні, при рівні значимості не нижче p<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

У результаті проведених досліджень визначено, що використані режими заморожування й наступного відігрівання СКК приводять до зміни температурних залежностей параметрів конформаційної динаміки білків сироватки. На рис. 1 представлені результати досліджень методом ЕПР спінових зондів впливу різних режимів заморожування на конформаційну динаміку білків сироватки.

Представлені дані демонструють певні відмінності дії на СКК різних режимів заморожування, що проявляється як у максимальному розщепленні, так й у ширині центрального компонента спектра ЕПР. Так, повільне заморожування сироватки до -20°С приводить до більших змін максимального розщеплення й ширини центрального компонента спектра ЕПР зонда 16-ДС. Це свідчить про значну модифікацію динамічної структури білків, що має характер розпушення. Швидке заморожування зразків сироватки не викликає значних змін динаміки мікрооточення радикалів.

Таким чином, при такому режимі заморожування білки СКК залишаються в стані, близькому до нативного. Але й при заморожуванні СКК з високими швидкостями зміни параметрів спектрів ЕПР можуть бути обумовлені збільшенням доступності розчиннику більш глибоких порожнин білків.

Підтвердженням порушення конформації білкових молекул сироватки при повільному заморожуванні є дані, отримані методом калориметрії.

а б

Рис. 1. Температурні залежності параметрів спектрів ЕПР (максимального розщеплення (а), ширини центрального компонента (б)) зонда 16-ДС, пов'язаного з білками СКК (n=6): 1 - нативна СКК; 2 - СКК після заморожування до -20°С; 3 - СКК після заморожування до -196°С.

На рис. 2 наведені криві теплопоглинання СКК після різних режимів заморожування в порівнянні з нативним зразком. Процес теплопоглинання (рис. 2) відбувається в температурному інтервалі 40-100°C. Крива теплопоглинання нативного зразка характеризується різким й інтенсивним піком (Тd=62,50,5°C), а також слабко вираженим піком при температурі 840,5°C. Враховуючи дані літератури [Хачидзе Д. Г] пік (Тd=62,50,5°C) можна приписати денатурації знежиреного альбуміну, плечі на кривій теплопоглинання - денатурації трансферину (Тd 66°C) та імуноглобуліну G (Тd 72°C), а пік (Тd=840,5°C) - денатурації незнежиреного альбуміну. Виходячи з термограм представлених на рис. 2, можна стверджувати, що альбумін у складі СКК, у тому числі і після її заморожування, перебуває в основному в знежиреному стані, тобто його центри зв'язування в значній мірі вільні від лігандів і можуть відігравати важливу роль in vivo.

Заморожування СКК з високими швидкостями не викликає істотної зміни кривої теплопоглинання (рис. 2). У той же час після заморожування сироватки з низькою швидкістю спостерігається зміщення піка денатурації знежиреного альбуміну в зону низьких температур. Таке зниження температури денатурації альбуміну вказує на зміну конформації, імовірно, поверхневих поліпептидних ланцюгів макромолекул, це приводить до більш раннього процесу теплової денатурації при нагріванні СКК.

Відомо, що агрегація білків при заморожуванні-відігріванні відноситься до поверхнево-індукованих процесів і відбувається внаслідок розгортання білків на поверхнях розділу лід-вода й вода-повітря [Foster P. R., Williams R. O.].



Рис. 2. Калориметричні записи теплопоглинання СКК (n=6): 1 - нативна СКК; 2 - СКК після заморожування до -20єС зі швидкістю 1-2 град/хв; 3 - СКК після заморожування до -196єС зі швидкістю 300-400 град/хв.

Розпушення білків може сприяти їх розгортанню на поверхнях розділу й стимулювати агрегацію. Враховуючи отримані методом ЕПР і калориметрії дані про те, що при заморожуванні СКК з повільними швидкостями відбувається розпушення поверхневих поліпептидних ланцюгів білкових молекул сироватки, доцільно було дослідити виникнення агрегації в цих умовах.

Методом гель-хроматографії вивчено вплив різних режимів заморожування на білковий спектр СКК (рис. 3). Дослідження складу білків СКК замороженої за програмою 6 показали, що максимуми на гель-хроматограмі зміщені в зону більших молекулярних мас, це може свідчити про агрегацію біомакромолекул сироватки при такому режимі заморожування. З рис. 3 видно, що відбувається зменшення вмісту білків з молекулярною масою ~65 кДа одночасно зі збільшенням вмісту білків з молекулярними масами ~120 та 300 кДа. Зменшення вмісту білків в низькомолекулярних фракціях свідчить про те, що, імовірно, і вони можуть частково приймати участь у процесі агрегації. Заморожування СКК за програмою 5 ще більше змінює розподіл білків за молекулярними масами і супроводжується появою більших агрегатів (збільшення вмісту білків з молекулярною масою ~700 кДа й вище).

Рис. 3. Гель-хроматограми СКК нативної і після заморожування-відігрівання (n=6):

Размещено на http://www.allbest.ru/

нативна СКК; СКК після заморожування до -80°C зі швидкістю 300-400°C;

Размещено на http://www.allbest.ru/

СКК після заморожування до -80°C зі швидкістю 100°C;

Размещено на http://www.allbest.ru/

СКК після заморожування до -80°C зі швидкістю 35°C;

Размещено на http://www.allbest.ru/

СКК після заморожування до -80°C зі швидкістю 1-2°C;

Размещено на http://www.allbest.ru/

СКК після заморожування до -20°C.

Хроматограма сироватки, замороженої за програмою 4, практично не відрізняється від хроматограми сироватки, замороженої зі швидкістю 1-2°C/хв до цієї ж температури. Після заморожування СКК за програмою 3 характер її гель-хроматограми наближається до нативної СКК, а відмінності свідчать про участь в агрегації в основному низькомолекулярних білків. Агрегування, очевидно, у цьому випадку практично відсутнє. Принаймні, основні за кількістю білки сироватки (альбумін й імуноглобуліни), в агрегації не беруть участі. Виявлено аналогічні відмінності в гель-хроматограмах нативної сироватки й сироватки, попередньо замороженої за програмами 1 і 2.

Наведені вище результати щодо впливу режимів заморожування на агрегацію білків сироватки добре узгоджуються з результатами, отриманими методом гель-електрофорезу. На рис. 4 приведені електрофореграма СКК та гістограма вмісту білків у фракціях залежно від режимів заморожування.

Рис.4. Електрофореграма СКК і діаграма зміни фракцій СКК при дії різних режимів заморожування (n=6):

Размещено на http://www.allbest.ru/

- електрофореграма нативної СКК;

Размещено на http://www.allbest.ru/

- нативна СКК;

Размещено на http://www.allbest.ru/

- СКК заморожена до -196°C зі швидкістю 300-400°C/хв; - СКК заморожена до -80°C зі швидкістю 300-400°C/хв;

Размещено на http://www.allbest.ru/

- СКК заморожена до -80°C зі швидкістю 100°C/хв; - СКК заморожена до -80°C зі швидкістю 35°C/хв; - СКК заморожена до -80°C зі швидкістю 1-2°C/хв; - СКК заморожена до -20°C зі швидкістю 1-2°C/хв.

Примітка. * _ відмінність вірогідна відносно нативної СКК, p<0,05.

Після електрофорезу білки СКК були розподілені на шість піків, що відповідають основним білковим фракціям сироватки. Аналіз площ білкових піків показав, що після повільного заморожування сироватки до -20 і -80°C відбувається збільшення високомолекулярних білкових фракцій (пік 6 і частково 5). Цей же режим охолодження приводить до зменшення фракцій, що містять білки з молекулярною масою 60-80 кДа (1 і частково 2 піки). Заморожування ж СКК з високою швидкістю не приводить до зміни виду електрофореграми у порівнянні з електрофореграмою нативної сироватки.

На відміну від ЕПР і калориметрії, що дозволяють робити висновки про компактність макромолекул, а також від хроматографії й електрофорезу, результати яких свідчать про агрегацію білків сироватки, інтерпретувати результати досліджень, проведених методом діелектрометрії більш складно. Цей метод відображає рівень гідратації білкових молекул, яка змінюється як при агрегації білків сироватки, так і при їх розпушенні. При цьому розпушення макромолекул приводить до збільшення зв'язаної води, а їхня агрегація - до зменшення. Але навіть з урахуванням цих особливостей метод НВЧ-діелектрометрії проявляє наявність порушень конформації білкових молекул після заморожування СКК з низькими швидкостями. Зменшення величини дійсної частини комплексної діелектричної проникності сироватки кордової крові після повільного заморожування свідчить про збільшення кількості зв'язаної білками сироватки води. При цьому зв'язування додаткової кількості молекул води в результаті розпушення білкових молекул частково компенсується звільненням зв'язаної води при агрегації білків.

Таким чином, результати проведених досліджень свідчать про те, що повільне охолодження СКК зі швидкістю 1-2°C/хв до температур -20 і -80°C значно змінює фракційний склад білків і супроводжується зміщенням в бік більших молекулярних мас, що можна пояснити агрегацією компонентів сироватки. Збільшення швидкості охолодження до 35°C/хв не запобігає агрегації білків сироватки. При збільшенні швидкості охолодження СКК до 100°C/хв зміни відбуваються тільки у низькомолекулярній частині білкового спектра.

Для вивчення біологічної активності СКК було обрано постгістеректомічний синдром, в основі клінічних проявів якого лежить гормональний дисбаланс, викликаний порушенням зворотних рецепторних зв'язків у репродуктивній системі та ішемією яєчників після операції [Макаров О.В., 2000; Краснова И.А., 2001]. Для діагностики порушення яєчникового стероїдогенезу після гістеректомії керувались визначенням рівня естрадіолу, ФСГ і ЛГ у крові експериментальних тварин. Рівень естрадіолу, ФСГ і ЛГ у крові визначали на 5-ту добу після операції з метою мінімізації впливу на їхній рівень наркозу й післяопераційного стресу.

Після видалення матки у самок щурів визначали зниження рівня естрадіолу до 0,141± 0,033 нМ/л, що в 1,6 рази менше рівня до операції 0,221± 0,069 нМ/л (рис. 5).

При порівнянні вмісту естрадіолу в крові експериментальних тварин, яких не лікували після видалення матки, з доопераційними показниками, визначено зниження рівня як на 30-ту, так і на 90-ту добу після операції (рис. 5). Не було відзначено вірогідно значимого зниження рівня естрадіолу в периферичній крові тварин, які одержували ЗГТ, відносно доопераційного рівня після закінчення введення 17в-естрадіолу. Тенденція до зниження рівня естрадіолу в крові тварин цієї групи наприкінці експерименту може бути пов'язана із пригніченням власного стероїдоґенезу яєчників при проведенні замісної гормональної терапії естрогенами [Рубченко Т.И., 2002].

Рівень ФСГ залишався підвищеним у самок контрольної групи в порівнянні з доопераційними показниками протягом усього спостереження (р<0,05). Вміст ФСГ у крові тварин, які одержували ЗГТ і нативну СКК, залишався на доопераційному рівні (рис. 6).

Вміст ЛГ у крові тварин, яких не лікували після видалення матки, залишався підвищеним у порівнянні з доопераційним рівнем до кінця експерименту. У крові щурів, які одержували замісну гормональну терапію і нативну СКК, не спостерігалося вірогідно значимої зміни рівня ЛГ у порівнянні з доопераційними показниками (р<0,05) (рис. 7).

Рис. 5. Динаміка рівня естрадіолу в плазмі крові самок щурів до й після гістеректомії: - до видалення матки;

Размещено на http://www.allbest.ru/

- 5-а доба після видалення матки;

Размещено на http://www.allbest.ru/

- 30-а доба після видалення матки;

Размещено на http://www.allbest.ru/

- 90-а доба після видалення матки.

Примітка. * _ відмінність вірогідна відносно контрольної групи на відповідну добу після операції, p<0,05.

Враховуючи отримані дані про вплив різних швидкостей охолодження на конформаційні зміни білків СКК, вивчали біологічну активність кріоконсервованої сироватки кордової крові в експериментальній моделі ПГС. Для порівняння були обрані СКК: заморожена до -80°С зі швидкістю охолодження близько 300-400°С/хв; заморожена до -196°С зі швидкістю охолодження близько 300-400°С/хв; заморожена до -80°С зі швидкістю охолодження - близько 300-400°С/хв після зберігання протягом 3-х місяців в умовах морозильної камери при температурі -80°С. Такі режими були обрані тому, що при їх використанні мінімізується агрегація білків СКК.

Результати дослідження вмісту ФСГ, ЛГ й естрадіолу в крові щурів, які одержували після видалення матки СКК, заморожену до -196°С (швидкість охолодження близько 300-400°С/хв), СКК, заморожену до -80°С (швидкість охолодження близько 300-400°С/хв) і СКК, заморожену до -80°С (швидкість охолодження близько 300-400°С/хв), з наступним зберіганням при цій температурі протягом 3-х місяців в порівнянні з рівнем цих гормонів у крові тварин до операції й з групою тварин, які одержували після операції нативну СКК та ЗГТ наведені на рис.5-7.

При порівнянні вмісту естрадіолу в крові тварин, які одержували після видалення матки кріоконсервовану СКК, з вмістом цього гормону в крові щурів, які отримували після операції нативну СКК, не було виявлено вірогідно значимого розходження, ні на 30-ту, ні на 90-ту добу післяопераційного періоду. Так само не було виявлено вірогідно значимих розходжень у вмісту Е в крові цих тварин у порівнянні з доопераційним рівнем (р<0,05) (рис. 5).

Розходжень вмісту ФСГ у крові тварин, які одержували після гістеректомії кріоконсервовану СКК, в порівнянні з доопераційними показниками виявлено не було (рис. 6).



Рис. 6. Динаміка рівня ФСГ в плазмі крові самок щурів до й після гістеректомії: - до видалення матки;

Размещено на http://www.allbest.ru/

- 5-а доба після видалення матки;

Размещено на http://www.allbest.ru/

- 30-а доба після видалення матки;

Размещено на http://www.allbest.ru/

- 90-а доба після видалення матки.

Примітка. * _ відмінність вірогідна відносно доопераційних показників, p<0,05.

У крові щурів, які отримували після гістеректомії СКК, заморожену до -196°С зі швидкістю охолодження близько 300-400°С/хв, не спостерігалося вірогідно значимої зміни рівня ЛГ у порівнянні з доопераційним рівнем. Так само не виявлено змін рівня ЛГ у порівнянні з доопераційними показниками тварин, які одержували після операції СКК, заморожену до -80°С зі швидкістю охолодження близько 300-400°С/хв, та у тварин, які одержували після операції СКК заморожену до -80°С (зі швидкістю охолодження близько 300-400°С/хв), після зберігання при -80°С впродовж 3 місяців (рис. 7).

Рис. 7. Динаміка рівня ЛГ в плазмі крові самок щурів до й після гістеректомії: - до видалення матки;

Размещено на http://www.allbest.ru/

- 5-а доба після видалення матки;

Размещено на http://www.allbest.ru/

- 30-а доба після видалення матки;

Размещено на http://www.allbest.ru/

- 90-а доба після видалення матки.

Примітка. * _ відмінність вірогідна відносно доопераційних показників, p<0,05.

Таким чином, результати проведених досліджень свідчать про те, що після гістеректомії у самок щурів розвивається стан яєчникової недостатності, який характеризується зниженням вмісту в крові естрадіолу поряд з підвищенням рівнів ФСГ і ЛГ. При відсутності лікування гормональний дисбаланс зберігався протягом усього експерименту. У групі тварин, які одержували в якості ЗГТ 17в-естрадіол, рівень ФСГ, ЛГ й естрадіолу на 30-ту добу після операції перебував на рівні доопераційних показників, при цьому на 90-ту добу спостерігалося незначне зниження вмісту естрадіолу в крові відносно доопераційного рівня. У тварин, які одержували після гістеректомії нативну сироватку кордової крові, вміст ФСГ, ЛГ і естрадіолу не відрізнявся від доопераційних показників. На відміну від щурів, які одержували як лікування 17в-естрадіол, у групі тварин, які одержували нативну СКК, після закінчення лікування не відзначалося зниження рівня естрадіолу в крові.

Враховуючи результати порівняльного аналізу рівнів естрадіолу, ФСГ й ЛГ у сироватці крові самок щурів, які одержували нативну й кріоконсервовану СКК після видалення матки, можна зробити висновок, що швидке заморожування сироватки кордової крові (зі швидкістю охолодження близько 300-400°С/хв) до -80 та -196°С не приводить до достовірного зниження її біологічної активності при застосуванні в експериментальній моделі ПГС. Так само не визначається зниження біологічної активності СКК, замороженої до -80°С (зі швидкістю охолодження близько 300-400°С/хв), після зберігання протягом трьох місяців при температурі -80°С.

Таким чином, результати проведених досліджень свідчать про те, що швидке заморожування СКК (зі швидкістю 300-400°С/хв до -80°С) не впливає на її біологічну активність. Сироватка кордової крові, кріоконсервована за такою програмою, може бути використана в клінічних цілях, враховуючи практично повну збереженість її біологічної активності в процесі низькотемпературного консервування й зберігання. Сироватка кордової крові, заморожена до -196°С (зі швидкістю 300-400°С/хв), так само зберігає свою біологічну активність, однак ми вважаємо швидке заморожування СКК до -80°С з наступним її зберіганням при цій температурі кращим. Це пов'язано з тим, що в клінічних умовах зберігання СКК при температурі -80°С є більш доступним й економічно вигідним.

Висновки

У дисертаційній роботі наведено теоретичне та експериментальне узагальнення наукової задачі щодо визначення впливу режимів кріоконсервування на збереження структурно-функціональних властивостей білкових макромолекул СКК, а також вивчення біологічної активності й ефективності кріоконсервованої СКК в експериментальній моделі постгістеректомічного синдрому. У роботі показано, що швидке заморожування до температури як -196°С, так і -80°С дозволяє запобігти можливій агрегації біомакромолекул і зберегти їх нативну конформацію. Використання в експериментальній частині роботи кріоконсервованої на протязі 3 місяців сироватки кордової крові при постгістеректомічному синдромі в статевозрілих щурів у порівнянні з замісною гормональною терапією показало високу ефективність СКК. Обґрунтовано використання при цій патології кріоконсервованої СКК з урахуванням ефективних швидкостей заморожування й зберігання її при низьких температурах.

Встановлено зменшення максимального розщеплення й ширини центрального компонента спектра ЕПР спінового зонда 16-ДС у СКК після її заморожування зі швидкістю 1-2C /хв до -20C, що свідчить про збільшення рухливості спінового зонда й, отже, зміни конформації білків сироватки, яка має характер розпушення. Це підтверджує зниження температури основної стадії процесу термоденатурації сироватки кордової крові, яке виявлено методом диференціальної скануючої калориметрії після таких швидкостей заморожування.

Отримані результати свідчать, що використання заморожування зі швидкістю 300-400C/хв запобігає пошкодженню білків сироватки кордової крові. Температура термоденатурації сироваткового альбуміну СКК при цьому не відрізняється від температури термоденатурації альбуміну нативної СКК, хоча навіть у цьому випадку зміни параметрів спектрів ЕПР свідчать про деяке збільшення доступності молекулам води гідрофобних порожнин білків.

Після заморожування СКК до кінцевих температур -20 або -80C з повільними швидкостями охолодження (1-2C/хв) у сироватці збільшується вміст білків з високими молекулярними масами на тлі зменшення білків з низькими молекулярними масами, що можна пояснити агрегацією після такого впливу білків сироватки, в основному, імовірно сироваткового альбуміну й імуноглобулінів. Швидке заморожування зі швидкостями 300-400C/хв до кінцевої температури _196C не змінює результати гель-хроматографії й вид електрофореграм нативної сироватки. Заморожування сироватки до -80C зі швидкістю 35C/хв приводить до зниження рівня агрегації білків у порівнянні з більше повільним охолодженням, а охолодження вже зі швидкістю 100C/хв практично повністю запобігає змінам в електрофореграмах й гель-хроматограмах.

Зменшення величини дійсної частини комплексної діелектричної проникності сироватки кордової крові за даними НВЧ-діелектрометрії після повільного заморожування зі швидкістю 1-2C/хв до кінцевих температур -20 або -80C свідчить про збільшення кількості зв'язаної білками сироватки води. При цьому зв'язування додаткової кількості молекул води в результаті розпушення білкових молекул частково компенсується звільненням зв'язаної води при агрегації білків.

Видалення матки зі збереженням яєчників у статевозрілих самок щурів лінії Wistar приводить до виникнення естрогендефіцитного стану, що супроводжується різким зниженням вмісту естрадіолу в крові й підвищенням вмісту фолікулостимулюючого й лютеїнізуючого гормонів. Застосування сироватки кордової при ПГС відновлює гормональну рівновагу, не приводячи, на відміну від замісної гормональної терапії, до наступного пригнічення яєчникового стероїдоґенезу.

Результати порівняльного дослідження рівнів естрадіолу, ФСГ й ЛГ у сироватці крові самок щурів, які одержували нативну й кріоконсервовану СКК після видалення матки, свідчать про те, що швидке заморожування сироватки кордової крові (зі швидкістю охолодження 300-400°С/хв) як до -196°С, так і до -80°С не приводить до вірогідного зниження її біологічної активності при застосуванні в експериментальній моделі ПГС. Таким чином, результати проведених досліджень демонструють, що швидке заморожування сироватки кордової крові до -80°С дозволяє запобігти можливій агрегації біомакромолекул і зберегти їх нативну конформацію, що обумовлює збереженість біологічної активності СКК при застосуванні в експериментальній моделі ПГС.

Встановлено, що зберігання сироватки кордової крові при температурі -80°С протягом 3 місяців зберігає її здатність нормалізувати гормональну рівновагу при ПГС без наступного пригнічення яєчникового стероїдоґенезу. Це дозволяє проведення клінічних випробувань щодо застосування кріоконсервованої СКК при лікуванні стану яєчникової недостатності після гістеректомії зі збереженням яєчників. Використання запропонованої температури (_80°С) дозволяє зберігати і використовувати кріоконсервовану СКК в лікувальних установах, які не мають можливості утримувати низькотемпературні банки біологічних об'єктів на основі зрідженого азоту.

Перелік опублікованих робіт

1. Грищенко В. И. Исследование влияния замораживания-отогрева на структурно-динамическое состояние компонентов сыворотки кордовой крови человека / В. И. Грищенко, Э. О. Нардид, Л. В. Цымбал, О. А. Нардид // Експериментальна і клінічна медицина. - 2006. - № 4. - С. 12-17.

2. Нардид Э. О. Влияние режимов замораживания на агрегацию белков сыворотки кордовой крови человека / Э. О. Нардид, Е. И. Науменко, С. Л. Розанова, О. А. Нардид // Проблемы криобиологии. - 2006. - Т 16, № 3. - С. 311-315.

3. Горобченко О. А. Влияние низких температур на сыворотку кордовой крови человека / О. А. Горобченко, Н. Т. Маркова, Э. О. Нардид, А. В. Зинченко, О. А. Нардид, О. Т. Николов // Вісник проблем біології і медицини. _ 2007.- Вип. 3.- С. 52-57.

4. Горобченко О. А. Влияние замораживания и гамма-облучения на сыворотку кордовой крови по данным СВЧ-диэлектрометрии / О. А. Горобченко, Н. Т. Маркова, О. Т. Адельянов, О. Т. Николов, Э. О. Нардид, С. В. Гаташ, О. А. Нардид // Біофізичний вісник. _ 2008. _ Вип. 20(1). _ С. 103-106.

5. Нардид Э. О. Состояние белков сыворотки кордовой крови после замораживания / Э. О. Нардид, Е. Д. Розанова, Л. В. Цымбал, А. В. Зинченко, О. А. Нардид, В. И. Грищенко // Биофизика. - 2009. - Т. 16. _ Вып. 20. - С. 881-886.

6. Грищенко В. И. Исследование эффективности применения нативной и криоконсервированной сыворотки кордовой крови в экспериментальной модели постгистерэктомического синдрома / В. И. Грищенко, Э. О. Нардид, В. Ю. Прокопюк // Вісник проблем біології і медицини. - 2010.- Вип. 2.- С. 68-73.

7. Нардид Э. О. Влияние режимов замораживания на динамику водно-белковой системы сыворотки кордовой крови человека / Э. О. Нардид, Л. В. Цымбал, О. А. Нардид // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, № 3. - С. 544-545.

8. Nardid O. A. Method of EPR spin probes in study of freezing effect on dynamics of aqueous-protein system of blood serum / O. A. Nardid, L. V. Tsymbal, E. O. Nardid, V. I. Grischenko // Електроніка та прикладна фізика: II міжнар. конф., 11-14 жовт. 2006 р.- Київ, 2006. - С. 94-95.

9. Нардид Э. О. Изменение белкового спектра сыворотки кордовой крови под действием низких температур / Э. О. Нардид, О. А. Нардид, Е. И. Науменко, С. Л. Розанова // IX Український біохімічний з'їзд 24-27 жовт. 2006 р.: матеріали з'їзду. - Харків, 2006. - Т. 1. - С. 56.

10. Нардид О. А. Структурные изменения в сыворотке кордовой крови под влиянием замораживания / О. А. Нардид, Е. Д. Розанова, Л. В. Цымбал, Э. О. Нардид, С. Л. Розанова // IV зїзд Українського біофізичного товариства: тези доповід. - Донецьк, 2006. - С. 313-314.

11. Нардид Э. О. Биофизические подходы в исследовании лечебных препаратов на основе сыворотки кордовой крови / Э. О. Нардид, Л. В. Цымбал, Е. Д. Розанова, А. В. Зинченко, О. А. Нардид, Е. И. Науменко // Актуальные проблемы биофизической медицины: V междунар. симпозиум, 17-19 мая 2007 г.: материалы симпоз.- Киев, 2007. - С. 121-122.

12. Нардид Э. О. Исследование влияния режимов замораживания и конечных температур хранения на белки сыворотки кордовой крови / Э. О. Нардид, Е. Д. Розанова, А. В. Зинченко, Л. В. Цымбал, О. А. Нардид, Е. И. Науменко // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т. 18, № 2. - С. 229.

13. Нардид Э. О. Применение сыворотки кордовой крови в экспериментальной модели постгистерэктомического синдрома / Э. О. Нардид // Досягнення та перспективи експериментальної і клінічної ендокринології: наук.-практ. конф. з міжнар. участю, 2-3 берез. 2010 р.: тези доповід. - Харків, 2010. - С. 89-90.

14. Нардид Э. О. Сравнение эффективности применения нативной и криоконсервированной сыворотки кордовой крови у крыс с экспериментальным постгистерэктомическим синдромом / Э. О. Нардид, В. Ю. Прокопюк // Таврический медико-биологический вестник. - 2010.- Т. 13, №4(52).- С. 275-276.

Анотації

Нардід Е.О. Біологічна активність кріоконсервованої сироватки кордової крові в експериментальній моделі постгістеректомічного синдрому.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 - кріомедицина. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2010.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню впливу режимів заморожування й кінцевих температур зберігання сироватки кордової крові (СКК) на конформаційні та агрегаційні властивості її білків. Вивченна біологічна активність кріоконсервованої СКК у порівнянні з нативною СКК і замісною гормональною терапією в експериментальній моделі постгістеректомічного синдрому (ПГС).

Обґрунтовано використання для лікування цієї патології кріоконсервованої СКК при ефективних швидкостях заморожування й її зберігання при помірно низьких температурі. Отримані результати свідчать, що швидке заморожування СКК до -80°С дозволяє запобігти можливій агрегації біомакромолекул і зберегти їх нативну конформацію, що в остаточному підсумку визначає збереження біологічної активності СКК при її застосуванні в експериментальній моделі ПГС.

Показано, що зберігання СКК при температурі -80°С протягом 3 місяців зберігає її здатність нормалізувати гормональну рівновагу при ПГС. Використання запропонованої температури (_80°С) дозволяє зберігати і використовувати кріоконсервовану СКК в лікувальних установах, які не мають можливості утримувати низькотемпературні банки біологічних об'єктів на основі зрідженого азоту.

Ключові слова: сироватка кордової крові, кріоконсервування, гістеректомія, постгістеректомічний синдром, гонадотропні гормони, естрадіол.

Нардид Э.О. Биологическая активность криоконсервированной сыворотки кордовой крови в экспериментальной модели постгистерэктомического синдрома.- Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.35 - криомедицина. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2010.

Диссертационная работа посвящена изучению влияния режимов замораживания и конечных температур хранения сыворотки кордовой крови (СКК) на конформационные и агрегационные свойства ее белков. Изучена биологическая активность криоконсервированной СКК в сравнении с нативной СКК и ЗГТ в экспериментальной модели постгистерэктомического синдрома (ПГС). Обосновано использование при этой патологии криоконсервированной СКК с учетом эффективных скоростей её замораживания и хранения при умеренно низких температурах.

Установлено уменьшение максимального расщепления и ширины центрального компонента спектра ЭПР спинового зонда 16-ДС в сыворотке кордовой крови после её замораживания со скоростью 1-2C/мин до -20C, что свидетельствует об изменении конформации белков сыворотки, имеющем характер разрыхления. Это подтверждает и понижение температуры основной стадии процесса термоденатурации СКК, выявленное методом дифференциальной сканирующей калориметрии после таких скоростей замораживания.

Показано, что быстрое замораживание со скоростью 300-400C/мин до конечной температуры _196C оказывает более щадящее влияние на сывороточные белки, хотя даже в этом случае изменения параметров спектров ЭПР свидетельствуют о некотором увеличении доступности молекулам воды гидрофобных полостей белков.

После медленного замораживания (скорость 1-2C/мин) сыворотки кордовой крови до конечных температур -20 или -80C в СКК увеличивается содержания белков с высокими молекулярными массами на фоне уменьшения белков с низкими молекулярными массами. Это можно объяснить агрегацией ряда белков сыворотки, в основном, сывороточного альбумина и иммуноглобулинов. Быстрое замораживание со скоростью 300-400C/мин до конечной температуры -196C не изменяет результаты гель-хроматографии и вид электрофореграмм нативной сыворотки. Замораживание сыворотки до -80C со скоростью 35C/мин приводит к снижению уровня агрегации белков по сравнению с более медленным охлаждением, а охлаждение уже со скоростью 100C/мин практически полностью предотвращает изменения в электрофореграммах и гель-хроматограммах.

Методом СВЧ-диэлектрометрии определено уменьшение величины действительной части комплексной диэлектрической проницаемости СКК после медленного замораживания (со скоростью 1-2C/мин) до конечных температур -20 или -80C, что свидетельствует об увеличении количества связанной белками сыворотки воды. При этом связывание дополнительного количества молекул воды в результате разрыхления белковых молекул частично компенсируется освобождением связанной воды при агрегации белков.

Создана экспериментальная модель постгистерэктомического синдрома у половозрелых самок крыс линии Wistar, сопровождающегося резким снижением содержания эстрадиола в перифирической крови и повышением содержания фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов. Применение сыворотки кордовой крови при ПГС восстанавливает гормональное равновесие, и не приводит, в отличие от заместительной гормональной терапии, к последующему угнетению яичникового стероидогенеза. Результаты сравнительного исследования уровней эстрадиола, фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов в сыворотке крови самок крыс, получавших нативную и криоконсервированную СКК после удаления матки, свидетельствуют о том, что быстрое замораживание сыворотки кордовой крови (со скоростью охлаждения 300-400°С/мин) как до -196, так и до -80°С не приводит к достоверному снижению её биологической активности при применении в экспериментальной модели ПГС.

Полученные результаты свидетельствуют, что быстрое замораживание СКК до -80°С позволяет предотвратить возможную агрегацию биомакромолекул и сохранить их нативную конформацию, что в конечном итоге определяет сохранность биологической активности СКК при её применении в экспериментальной модели ПГС.

Показано, что хранение СКК при температуре -80°С в течение 3 месяцев сохраняет ее способность нормализовывать гормональное равновесие при ПГС. Это делает возможным проведение клинических испытаний по применению криоконсервированной СКК при лечении состояния яичниковой недостаточности, наступившем после гистерэктомии с сохранением яичников. Использование предложенной температуры хранения СКК (_80єС) дает возможность значительно расширить сеть таких хранилищ СКК, в том числе лечебных учреждений, не имеющих возможности организовать и содержать низкотемпературные банки биологических объектов на основе сжиженного азота.

...