Вплив рентгенівського випромінювання на NO-залежні механізми регуляції морфо-функціонального стану імунокомпетентних клітин крові

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН НААН

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Вплив рентгенівського випромінювання на NO-залежні механізми регуляції морфо-функціонального стану імунокомпетентних клітин крові

ПЕРЕТЯТКО ЮЛІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 535-34: 546.172.6-31: 57.052: 581.17: 576.31

03.00.04 - біохімія

Львів - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор

Сибірна Наталія Олександрівна,

Львівський національний університет

імені Івана Франка,

завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Луцик Максим Дмитрович,

Інститут біології клітини НАН України,

провідний науковий співробітник відділу регуляції проліферації клітин та апоптозу

доктор біологічних наук, професор

Столяр Оксана Борисівна,

Тернопільський національний педагогічний

університет імені Володимира Гнатюка

завідувач науково-дослідної лабораторії

порівняльної біохімії та молекулярної біології

Захист відбудеться “21” грудня 2010 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин НААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біології тварин НААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

Автореферат розісланий “19” листопада 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

рентгенівський опромінення лейкоцит кров

Актуальність теми. Вплив іонізуючого випромінювання на імунну систему ссавців є актуальною проблемою сучасної біології та медицини (Moller А., 2006; Nasonova E., 2006; Vokurkova D., 2006; Gridley D., 2009; Колядa T., 2007; Демченко O., 2009) Із розвитком ядерної енергетики, збільшенням обсягів використання радіоактивних матеріалів, нагромадженням ядерних відходів атомних реакторів, а також внаслідок аварій на атомних електростанціях, невпинно зростає кількість людей, які щоденно піддаються впливові іонізуючого випромінювання (Prasad K., 2004; Коляда T., 2007; Schnarr K., 2007).

Особливої гостроти проблема дії малих доз радіації набула у зв'язку з необхідністю оцінки і прогнозування негативних наслідків Чорнобильської катастрофи на здоров'я населення (Демченко O., 2009). Недостатня кількість ґрунтовних робіт, присвячених вивченню біологічного ефекту малих доз випромінювання, зумовила неоднозначність його трактування та співіснування різних гіпотез щодо його механізму (Богданов И., 2005; Кострюкова Н., 2005; Anoopkumar-Dukie S., 2005; Ивановский Ю., 2006; Демченко О., 2009).

Кровотворна система - це найбільш радіочутлива тканина, кількісні та якісні показники якої певною мірою є маркерами для оцінки ступеня радіаційного ушкодження (Лыков А., Сахно Л., Козлов В., 1998; Лыков А., Сахно Л., Михеенко Л., 1998; Яблоков А., 2001; Devi Р., 2003; Шибкова Д., 2006; Ефимова Н., 2007; Кузьменко О., 2007). Згідно з даними літератури, захворювання крові та кровотворних органів в учасників ліквідації наслідків аварії на Чорнобильській атомній електростанції (ЧАЕС) спостерігаються у 3,6 раза частіше, ніж у решти населення (Зак К., 2000; Чаяло П., 2002).

При дії іонізуючого випромінювання низької інтенсивності особливого значення набувають процеси, пов'язані з утворенням активних метаболітів Оксигену (АМО) та Нітрогену, зокрема оксиду азоту (NO), оскільки вони при підвищених концентраціях можуть модифікувати біомолекули і призводити до деструктивних змін у клітині та до її загибелі (Реутов В., 1995; Ракша Н., 2006; Ohta S., 2007; Valerie К., 2007). NО, що утворюється в надмірних кількостях, за патологічних станів виявляє виражену цитотоксичну дію за рахунок утворення пероксинітриту, здатного викликати деструкцію практично всіх компонентів клітини (Radi R., 2004; Чеснокова Н., 2006; Куровська В., 2008).

Визначна роль у формуванні внутрішньоклітинного сигналу, індукованого радіацією, належить регуляторним каскадам, які опосередковуються про- і антиапоптичними білками р53 та Вcl-2, і вторинними месенджерами, що посилюють і передають його в ядро (Giaccia А., 1998; Embree-Ku М., 2002; Cook Т., 2004; Yang J., 2006; Valerie К., 2007).

У зв'язку з цим функціональна активність лейкоцитів периферичної крові заслуговує на особливе місце у вивченні дії іонізуючого випромінювання низької інтенсивності як універсальна мішень та індикатор різних порушень гомеостазу й гемокінезу.

Поряд із тим, окремі аспекти впливу низькоінтенсивного іонізуючого випромінювання на структурно-функціональні особливості і метаболічні процеси лейкоцитів вивчені ще недостатньо.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в науково-дослідній лабораторії радіаційної та молекулярної біології Львівського національного університету імені Івана Франка в рамках теми “Вплив рентгенівського випромінювання на NO-залежні механізми регуляції морфо-функціонального стану імунокомпетентних клітин крові” (№ державної реєстрації 0108U004128). Здобувач дослідила біохімічні ефекти L-аргініну та L-NAME у лейкоцитах периферичної крові щурів за умов хронічного рентгенівського опромінення.

Дослідження були підтримані грантом Західно-Українського біомедичного наукового центру (West-Ukrainian BioMedical Research Center), 2008-2009 рр.

Мета і завдання досліджень. Метою даної роботи було з'ясувати вплив тривалого рентгенівського опромінення на морфологічний і функціональний стан лейкоцитів периферичної крові лабораторних щурів та віднайти способи корекції виявлених порушень.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Дослідити вплив рентгенівського випромінювання у щодобовій дозі 1cГр (протягом 30-ти діб) на активність ферментів окисного та неокисного шляхів обміну аргініну (NO-синтази (NOS) і аргінази (ARGs)), вміст сечовини та стабільних метаболітів NO в лейкоцитах, а також концентрацію вільного L-аргініну в плазмі крові, у нормі і за умов рентгенівського опромінення, а також на фоні введення контрольним і опроміненим щурам per os субстрату досліджуваних ферментів - L-аргініну та неселективного інгібітора NOS - L-NAME.

2. Вивчити зміни вуглеводних детермінант глікопротеїнів мембран лейкоцитів під впливом низькоінтенсивного рентгенівського опромінення.

3. Дослідити вплив L-аргініну і L-NAME на процеси апоптозу в лейкоцитах крові у нормі та при тривалому рентгенівському опроміненні.

4. Дослідити проліферативну активність і апоптоз мононуклеарів периферичної крові людини за дії іонізуючого випромінювання у дозі 0,3 та 2 Гр, а також на фоні введення L-аргініну та L-NAME.

Об'єкт дослiдження: структурний і функціональний стан лейкоцитів у контрольних та в опромінених тварин, а також опромінених in vitro імунокомпетентних клітин крові, отриманих від здорових донорів.

Предмет дослiдження: ферменти обміну L-аргініну (NO-синтаза, аргіназа), рівень продукції оксиду азоту, концентрація L-аргініну, вміст сечовини, агрегаційна здатність лейкоцитів, структура вуглеводних детермінант глікопротеїнів мембран лейкоцитів, апоптоз, проліферація за опромінення in vitro.

Методи дослiдження: біохімічні (cпектрофотометричні), молекулярно-біологічні (метод ДНК-комет), цитологічні (імуноцитохімічні, аналіз морфології клітин за допомогою світлового мікроскопа, метод бласттрансформації лімфоцитів), статистичні (метод варіаційної статистики із використанням критерію Стьюдента).

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше досліджено вплив хронічного рентгенівського опромінення у щодобовій дозі 1 сГр (потужність дози 0,042 мГр•с-1) на морфо-функціональний стан імунокомпетентних клітин (ІКК). Встановлено, що фракційне низькоінтенсивне опромінення призводить до змін функціонального стану лейкоцитів, структурних змін та кількісного перерозподілу вуглеводних детермінант глікопротеїнів, зростання активності NOS та інтенсифікації апоптичного процесу в імунокомпетентних клітинах крові. За показниками лектиніндукованої агрегації з використанням лектину акації амурської встановлено зростання вмісту сіалових кислот, зв'язаних б(2>3)-глікозидним зв'язком з галактозою на фоні зниження загального вмісту нейрамінової кислоти, зменшення N-ацетил-в,D-глюкозаміновмісних та в,Dгалактозовмісних глікокон'югатів у складі вуглеводних детермінант глікопротеїнів мембран лейкоцитів опромінених тварин.

Виявлено істотне зростання частоти морфологічних ознак апоптозу, рівня фрагментованої ДНК, числа комет класу С3/С4 та відсотка клітин із високим вмістом проапоптичного білка р53 за умов фракційного рентгенівського опромінення.

Вперше показано коригуючий вплив L-NAME (неселективного інгібітора NOS) на активність ферментів обміну L-аргініну, процеси апоптозу та морфо-функціональний стан рецепторного апарату імунокомпетентних клітин крові щурів за дії іонізуючої радіації.

Встановлені структурно-функціональні порушення клітин імунної системи розширюють існуючі уявлення про механізми впливу низькоінтенсивного іонізуючого випромінювання в діапазоні доз 10 - 30 сГр.

Практичне значення одержаних результатів. Оскільки введення L-NAME викликало зниження активності NOS та виявляло позитивний вплив на морфо-функціональний стан лейкоцитів крові на фоні хронічного рентгенівського опромінення, доцільно вести пошук і розробку нових фармакологічних препаратів на його основі, спрямованих на нормалізацію функціональної активності ІКК периферичної крові, з метою коригування ускладнень, що виникають за умов опромінення у малих дозах.

Вивчення функціонального стану лейкоцитів із використанням лектинів як молекулярних зондів із визначеною селективністю до вуглеводних детермінант є новим напрямом розробки діагностичних і прогностичних підходів у терапії даної патології.

Співпвдіння напрямленості та пропорційності змін вмісту фрагментованої ДНК, співвідношення класів комет, утворених лейкоцитами периферичної крові, відсотка клітин, що містять про- і антиапоптичні білки, може бути основою для рекомендації використання у клінічній лабораторній практиці аналізу морфологічних ознак апоптозу як достовірного, але водночас доступного та відносно дешевого.

Отримані результати досліджень розвивають сучасні уявлення про характер і закономірності ураження клітин імунної системи за тривалого впливу іонізуючих випромінювань у малих дозах як на клітинному, так і на молекулярному рівнях.

Результати дослідження структурно-функціональної організації плазматичних мембран лейкоцитів, активності ензимів обміну L-аргініну й апоптозу ІКК крові сприятимуть розробці кількісних і якісних критеріїв оцінки впливу малих доз радіації на імунну систему.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно зібрала та опрацювала літературу за темою дисертації, виконала експериментальну частину роботи, провела статистичний аналіз отриманих результатів досліджень. За участю співавторів публікацій проведено інтерпретацію та узагальнення результатів роботи. Основні положення, які виносяться на захист, і висновки по даній дисертаційній роботі були сформульовані спільно з науковим керівником - професором Н.О. Сибірною.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були представлені на V та VI міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології” (Львів, 2009, 2010); VII Парнасівській конференції “Фундаментальні та прикладні аспекти сучасної біохімії” (Ялта, 2009); Х Українському біохімічному з'їзді (Одеса, 2010).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 9 робіт, у тому числі 4 статті у фахових наукових журналах і 5 тез доповідей на міжнародних і вітчизняних наукових конференціях та з'їздах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 144 сторінках і містить такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень, аналіз і узагальнення результатів досліджень, висновки та список використаних джерел із 209 найменувань (з них 93 латинкою). Основна частина роботи викладена на 116 сторінках, містить 25 рисунків і 10 таблиць, які займають 21 сторінку.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено і проаналізовано сучасні дані стосовно впливу іонізуючого випромінювання на клітини імунної системи. Охарактеризовано морфо-функціональний стан і процес апоптозу лейкоцитів периферичної крові та біологічну систему L-аргінін/NO у нормі і за умов іонізуючого випромінювання.

Матеріали і методи досліджень. В експериментах використовували щурів-самців лінії Wistar масою 150-200 г. яких утримували у стандартних умовах віварію. Тварин піддавали тотальному рентгенівському опроміненню щодобовою дозою 1сГр на апараті РУМ-17 (шкірно-фокусна відстань 178 см, напруга 110 кВ, сила струму 4 мА, фільтри Cu 0,5 мм та Al 1,0 мм, потужність дози - 0,042 мГр·с-1, час опромінення за даних умов - 4 хвилини). Дозу опромінення контролювали клінічним дозиметром типу 27012 (Otto Shon, Німеччина). Сумарна доза на 10, 20, 30-ту добу опромінення становила відповідно 10, 20 і 30 сГ. Дослідним тваринам per os із питною водою вводили: L-аргінін (L-arg) (“Reanal”, Угорщина) у концентрації 1,25 г/л протягом 30 днів та NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) (“Sigma”, США) у концентрації 70 мг/л протягом 30 днів. Дослідження проводили у таких групах: 1. Контроль (К); 2. К+L-arg; 3. К+L-NAME; 4. Опромінення (О); 5. О+L-arg; 6. О+L-NAME. В експерименті було задіяно 384 тварини.

Лейкоцити виділяли у градієнті густини фікол-тріомбрасту (Ficoll - “Sigma”, CША) згідно з методом, описаним Л. Лаповець зі співавт., 2004. Морфологічні дослідження імунокомпетентних клітин периферичної крові виконувалися згідно з методом, описаним Н. Сибірною зі співавт., 1997. Визначення вмісту сіалових кислот мембран лейкоцитів проводили за реакцією з тіобарбітуровою кислотою (цит. за: М. Прохорова, 1982). Лектиніндуковану агрегацію лейкоцитів проводили в суспензії відмитих клітин на автоматичному аналізаторі “Биола” (Росія) згідно з методом И. Воскобой с соавт., 2002. Лізис лейкоцитів проводили шляхом заморожування в рідкому азоті та відтаювання на водяній бані при 370С. Клітини ресуспендували в ЗФР з інгібіторами протеаз: PMSF (5 мкг/мл, Sigma), апротонін (5 мкг/мл, Sigma), хімостатин (5 мкг/мл, Sigma), пепстатин (5 мкг/мл, Sigma). Дослідження активності ферментів проводили в супернатанті. Концентрацію білка вимірювали згідно з методом описаним G. Peterson, 1977. Активність NO-синтази визначали згідно з методами В. Сагача зі співавт., 2005, Н. Cибірної зі співавт., 2006, або опосередковано контролювали за вмістом кінцевих продуктів метаболізму NO: нітритів за методом Гріса (Green L. et al., 1982), нітратів - за методом Н. Cибірної зі співавт., 2006. Вміст сечовини визначали за допомогою реакції з діацетилмонооксимом (цит. за: Е. Меньшиков, 1987). Визначення вмісту вільного L-аргініну в плазмі крові проводили згідно з методом, описаним К. Времеенко и соавт, 1988. Апоптоз ІКК крові досліджували за вмістом фрагментованої ДНК методом Е. Орловой с соавт., 2001; методом „ДНК-комет”, як описано В. Троновим с соавт., 1998. Імуноцитохімічне дослідження вмісту білків р53 та Bcl-2 здійснювали непрямим імунопероксидазним методом (цит. за: І. Кайдашев, 2003). Статистичну обробку отриманих результатів проводили на персональному комп'ютері за ліцензованою програмою MS Excel 2003. Оцінку вірогідності різниці середніх величин здійснювали з використанням критерію Стьюдента (t). Вірогідною вважали різницю при р<0,05 - 0,001, порівняно з контрольною групою тварин, а в окремих дослідах з вихідними даними.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Окисний і неокисний шляхи обміну L-аргініну в лейкоцитах периферичної крові щурів у нормі та на фоні хронічного радіаційного впливу. У зв'язку з тим, що L-аргінін є субстратом для NOS і аргінази, важливо було дослідити зміну співвідношення окисного та неокисного шляхів метаболізму даної амінокислоти за умов хронічного рентгенівського опромінення. За цих умов спостерігається достовірне зростання концентрації вільного L-аргініну в плазмі крові, зростання активності NOS протягом усього експерименту й вірогідне підвищення кількості стабільних продуктів окиснення NO - нітритів (у 2 рази) і нітратів (у 1,6 раза) на 30-ту добу, порівняно з контролем (табл. 1).

На фоні достовірного зниження активності аргінази спостерігається вірогідне зниження вмісту сечовини на 20-ту і 30-ту доби експерименту в 1,3 та 1,6 раза відповідно, порівняно з контрольними значеннями (табл. 1).

Оскільки клітинна продукція NO у лейкоцитах повністю залежить від наявності аргініну (Sonoki T. et al., 1997; Mori M. et al., 2000), то, очевидно, зростання активності NOS при опроміненні пов'язане зі збільшенням концентрації субстрату даного ферменту.

Таблиця 1

Активність аргінази, NO-синтази, вміст стабільних метаболітів NO та рівень сечовини у лейкоцитах крові контрольних і опромінених тварин та на фоні введення L-аргініну й L-NAME (М ± m, n = 6)

Показники Групи	Активність NOS, нмоль NADPH за хв на 1 мг білка	Вміст NO2-, нмоль/мг білка	Вміст NO3-, нмоль/мг білка	Активність ARGs, нмоль сечовини за хв на 1 мг білка	Вміст сечовини, нмоль/мг білка
Контроль	0,10±0,010	1,21±0,20	42,50±5,3	100,0±2,2	275,0±7,6
К+L-Arg 10 доба	0,08±0,002*	2,58±0,40*	81,40±5,3*	93,2±3,8	254,7±7,9
К+L-Arg 20 доба	0,05±0,007*	4,24±0,50*	89,30±15,4*	90,3±4,1	241,7±11,7
К+L-Arg 30 доба	0,04±0,008*	1,08±0,10	66,30±3,0*	86,6±6,5*	238,4±17,2
К+L-NAME 10 доба	0,05±0,008*	0,65±0,06	19,30±3,5	90,2±2,3	219,6±6,3*
К+L-NAME 20 доба	0,04±0,008*	0,28±0,02	11,50±3,9	80,8±2,4*	252,0±5,0
К+L-NAME 30 доба	0,04±0,008*	0,47±0,04	21,30±3,6	74,2±1,2*	212,0±8,0*
Опромінення 10 доба	0,19±0,006*	1,64±0,25	32,30±5,9	82,8±4,6*	251,0±26,2
Опромінення 20 доба	0,28±0,010*	1,49±0,27	58,10±8,2	78,0±1,4*	213,0±4,3*
Опромінення 30 доба	0,47±0,020*	2,69±0,81*	66,60±9,4*	63,4±3,0*	176,3±7,7*
О+L-Arg 10 доба	0,16±0,030	2,60±0,80**	95,00±9,2**	80,0±3,1	206,4±13,4
О+L-Arg 20 доба	0,13±0,010**	2,82±0,10**	105,80±5,8**	70,8±2,1	193,4±6,0
О+L-Arg 30 доба	0,13±0,100**	2,24±0,40	60,30±5,4	65,8±3,3	178,6±9,1
О+L-NAME 10 доба	0,14±0,001**	0,28±0,07**	16,20±1,4**	67,4±2,0**	182,0±5,4**
О+L-NAME 20 доба	0,11±0,001**	0,66±0,04**	14,90±2,3**	58,4±1,9**	158,8±4,9**
O+L-NAME 30 доба	0,10±0,001**	0,84±0,07	49,60±3,0	41,2±0,5**	110,0±1,4**

Примітка. Тут і далі: * - різниця вірогідна, порівняно з контролем,

р ? 0,05;

** - різниця вірогідна, порівняно з опроміненням, р ? 0,05.

Введення екзогенного L-аргініну за умов опромінення призводить до підвищення концентрації цієї амінокислоти у плазмі крові, зниження активності NOS на всі доби експерименту та підвищення вмісту NO2- і NO3- у лейкоцитах периферичної крові на 10-ту і 20-ту доби порівняно з контрольними показниками (табл. 1). Активність аргінази та вміст сечовини залишалися в межах показників тварин, що зазнали тільки опромінення (табл. 1).

За умов комбінованого впливу опромінення та L-NAME концентрація вільного L-аргініну в плазмі крові залишається в межах показів опромінених тварин, активність NOS знижується в 1,4; 2,5 і 4,7 раза на всі досліджувані терміни відповідно, порівняно з показниками тварин, що зазнали тільки опромінення (табл. 1). На 10-ту і 20-ту доби сукупного впливу обох факторів виявлено вірогідне зниження вмісту стабільних метаболітів NO. Однак зниження активності NOS на 30-ту добу експерименту не приводить до вірогідних змін вмісту NO2О та NO3- в імунокомпетентних клітинах крові (табл. 1).

Підвищення вмісту нітритів і нітратів до рівня контрольних показників на тлі зниження активності NOS, можливо, зумовлене посиленням процесів вивільнення NO з депо оксиду азоту, які були сформовані у результаті S-нітрозилювання білків, з подальшим його окисненням до NO2О та NO3О.

Достовірне зниження активності аргінази в 1,2, 1,3 та 1,5 раза на 10-ту, 20-ту і 30-ту доби експерименту, відповідно, порівняно з показниками тварин, які зазнали тільки опромінення, корелює з вірогідним зниженням вмісту сечовини (табл. 1).

Таким чином, встановлено, що пероральне введення L-NAME призводить до стійкого зниження активності NOS у лейкоцитах периферичної крові щурів упродовж тривалого впливу фракційного рентгенівського випромінювання у щодобовій дозі 1 сГр та зниження вмісту нітритів і нітратів на ранніх стадіях експерименту, забезпечуючи цитопротекторний ефект шляхом зниження продукції оксиду азоту і тим самим запобігаючи розвиткові оксидативно-нітрозативного стресу.

Вплив рентгенівського випромінювання на агрегаційну здатність лейкоцитів периферичної крові щурів. Різноманітність рецепторів лейкоцитів визначає їхню чутливість до численних подразників, будучи при цьому важливим показником потенційної реактивності (Воскобой И. и соавт., 2002). Про рівень експонування на поверхні клітин відповідних глікокон'югатів можна робити висновки за ступенем агрегаційної здатності, використовуючи лектини, які зв'язують різні вуглеводні детермінанти (Тимошенко А. и соавт., 1991, Хомерики С. и соавт., 1993).

При використанні як індуктора агрегації, лектину акації амурської (МАА) спостерігається достовірне зростання ступеня лектиніндукованої агрегації лейкоцитів на 30-ту добу радіаційного впливу (у 3 рази) порівняно з показником контрольних тварин (табл. 2).

Такі дані свідчать про те, що у структурі глікопротеїнових рецепторів мембран лейкоцитів зростає кількість сіалових кислот, зв'язаних б(2>3)-глікозидним зв'язком з субтермінальним залишком галактози. Комбінований вплив L-аргініну та L-NAME з низькоінтенсивним випромінюванням призводив до вірогідного зниження ступеня агрегації у 2,6 раза на 30-ту добу для L-аргініну та у 2,6, 2 та 1,7 раза на 10-ту, 20-ту та 30-ту доби експерименту для L-NAME, порівняно з показником тварин, що зазнали тільки опромінення (табл. 2).

Зниження кількості рецепторів, тропних до МАА, при опроміненні з паралельним введенням L-NAME вказує на радіопротекторний вплив досліджуваного інгібітора на морфо-функціональний стан рецепторного апарату плазматичної мембрани ІКК крові.

Сильна агрегація лейкоцитів при використанні як індуктора лектину рицини звичайної (RCA) свідчить про підвищену спорідненість глікопротеїнових рецепторів мембрани лейкоцитів контрольних щурів до цього чинника (табл. 2). Рентгенівське опромінення протягом 10-ти і 20-ти діб не супроводжується достовірними змінами досліджуваного показника. Проте низькоінтенсивне випромінювання протягом 30-ти діб призвело до зниження ступеня агрегації у 2,5 раза порівняно з показником контрольної групи тварин (табл. 2). Як відомо, в,D-галактозовмісні рецептори характерні для клітин низького рівня диференціації у гранулоцитарному ростку. Таким чином, отримані дані можуть опосередковано вказувати на пришвидшення диференціації і/або старіння лейкоцитів за умов хронічного рентгенівського опромінення. Вірогідне зростання ступеня агрегації у 1,3 раза на 30-ту добу при введенні L-аргініну у 2,2 раза при введенні L-NAME вказує на підвищення кількості клітин, які експресують на своїй поверхні комплементарні цьому лектинові глікокон'югати.

Таблиця 2

Показники лектиніндукованої агрегації лейкоцитів контрольних і опромінених тварин на фоні введення L-аргініну та L-NAME (М ± m; n = 6)

Показники Групи	МАА	WGA	RCA
	Ступінь агрегації лейкоцитів, у.о.
Контроль	66,3 ± 2,5	40,5 ± 2,6	75,0 ± 2,0
К + L-Arg 10 доба	64,0 ± 6,0	36,0 ± 2,6	67,0 ± 2,8
К + L-Arg 20 доба	71,0 ± 3,8	38,4 ± 3,1	67,5 ± 4,7
К + L-Arg 30 доба	57,7 ± 5,6	33,8 ± 2,5	71,7 ± 3,0
К + L-NAME 10 доба	73,2 ± 7,0	35,6 ± 2,5	70,0 ± 2,5
К + L-NAME 20 доба	58,3 ± 4,9	43,7 ± 3,2	57,0 ± 3,1*
К + L-NAME 30 доба	51,0 ± 4,0*	40,8 ± 4,0	50,0 ± 3,2*
Опромінення 10 доба	70,0 ± 6,1	17,0 ± 1,0*	75,8 ± 5,6
Опромінення 20 доба	75,3 ± 2,5	34,5 ± 3,4	83,0 ± 4,0
Опромінення 30 доба	202,0 ± 9,0*	27,3 ± 2,2*	30,5 ± 1,5*
О + L-Arg 10 доба	75,3 ± 2,4	22,8 ± 2,1	86,0 ± 3,0
О + L-Arg 20 доба	71,2 ± 1,7	24,0 ± 1,5	86,0 ± 6,5
О + L-Arg30 доба	76,3 ± 7,0**	17,6 ± 1,2**	39,0 ± 1,2**
О + L-NAME 10 доба	30,0 ± 2,4**	17,2 ± 1,6	71,3 ± 3,4
О + L-NAME 20 доба	37,7 ± 3,0**	51,0 ± 3,5**	84,1 ± 6,1
О + L-NAME 30 доба	118,0 ±10,0**	25,0 ± 1,8	68,0 ± 5,0**

WGA-індукована агрегація лейкоцитів периферичної крові щурів за умов хронічного рентгенівського опромінення характеризується зниженням ступеня цього процесу у 2,4 та 1,5 раза на 10-ту та 30-ту доби опромінення, відповідно. Модифікація сіалових кислот, яка може траплятися на слизових оболонках ссавців (наприклад, 9-О-ацетилювання), попереджує взаємодію з деякими лектинами патогенів. Тому можна припустити, що така модифікація у місцях локалізації сіалогліканів відіграє специфічну захисну роль. Отримані результати свідчать про важливе значення рецепторів, чутливих до WGA, у забезпеченні певного рівня функціонального стану лейкоцитів за умов хронічного радіаційного впливу. При сукупному впливі опромінення та введення L-аргініну достовірні зміни ступеня зв'язування WGA з тропними до нього рецепторами відзначено на 30-ту добу експерименту. Ступінь агрегації знижується в 1,6 раза порівняно з показником тварин, що зазнали тільки опромінення (табл. 2).

Щодобове рентгенівське опромінення на фоні введення L-NAME призводить до посилення ступеня зв'язування лектину зародків пшениці з N-ацетил-в,D-глюкозаміновими та N-ацетилнейраміновими детермінантами на 20-ту добу есперименту в 1,5 раза, відповідно, порівняно з показником опромінення. Ці дані опосередковано вказують на зростання кількості рецепторів, комплементарних до WGA, та відновлення нормального функціонального стану лейкоцитів.

Дослідження вмісту фрагментованої ДНК в лейкоцитах периферичної крові щурів. Ушкодження та відновлення кровотворення є критичними процесами у механізмі формування радіологічного ефекту і його наслідків на рівні організму ссавців. За умов радіаційного впливу у першу чергу руйнуються ушкоджені та функціонально нестабільні клітини, забезпечуючи збереження лише повноцінних кровотворних клітин-попередників і зрілих клітин крові. Дослідження вмісту фрагментованої ДНК в імунокомпетентних клітинах крові, які зазнали променевого ураження, виявляє достовірне зростання цього показника у лейкоцитах периферичної крові щурів на 10-ту, 20-ту і 30-ту добу опромінення в 1,4, 2 та 2,8 раза відповідно (рис. 1).



Размещено на http://www.allbest.ru/

За умов опромінення на фоні прийому L-аргініну не відзначаються достовірні відмінності вмісту фрагментованої ДНК порівняно з аналогічними показниками тварин, що зазнали тільки опромінення.

У клітинах лейкоцитарного ряду опромінених тварин на фоні введення L-NAME ступінь ушкодження ДНК за своєю інтенсивністю знижується в 1,4 та 1,5 раза на 20-ту і 30-ту добу відповідно, порівняно з показниками щурів, що зазнали тільки опромінення (рис. 1).

Таким чином, встановлено, що як L-аргінін, так і L-NAME мають позитивний коригуючий вплив на зниження рівня фрагментованої ДНК у лейкоцитах периферичної крові щурів за умов хронічного рентгенівського опромінення.

Дослідження відсотка лейкоцитів, що містять білок р53 у нормі та за умов опромінення. Достовірні зміни відсотка клітин, що містять проапоптичний білок р53, спостерігається на 20-ту і 30-ту доби експерименту. Відсоток клітин із різко позитивною реакцією на білок р53 зростає у 2,4 раза на 20-ту і у 4 рази на 30-ту доби експеременту.

На фоні зростання відсотка клітин із найінтенсивнішим забарвленням спостерігається зниження відсотка клітин зі слабопозитивною реакцією на досліджуваний білок у 2,3 та 1,5 раза на 20-ту і 30-ту доби експерименту, відповідно. Як відомо, р53 - ядерний білок, онкосупресор, рівень якого значно зростає у клітинах, де ступінь ушкодження генома досягає такого рівня, коли звичайні механізми репарації нездатні їх виправити і забезпечити подальше нормальне функціонування клітини (Клименко М. зі співавт., 2007). Посилення експресії гена р53, яке ми оцінювали за відсотком клітин, що містять білок р53, свідчить про пошкоджуючий вплив радіації на структуру ДНК клітин імунної системи.

Сукупний вплив низькоінтенсивного рентгенівського опромінення та введення L-аргініну призводить до достовірного зниження відсотка клітин із різкопозитивною реакцією на досліджуваний білок лише на 30-ту добу експерименту на 27 % порівняно з показниками тварин, що зазнали тільки опромінення.

Введення L-NAME опроміненим тваринам виявляло позитивний коригуючий ефект у плані зниження відсотка клітин з позитивною реакцією на білок р53. На 20-ту добу комбінованого впливу обидвох факторів встановлено зниження відсотка клітин з позитивною реакцією у 2 рази. Сумарна дія L-NAME та фракційного рентгенівського опромінення протягом 30-ти діб призводить до достовірного підвищення відсотка клітин з негативною реакцією в 1,3 раза на фоні зниження відсотка клітин з позитивною та різкопозитивною реакцією у 2,7 та 2 рази відповідно, порівняно з показниками тварин, яких лише опромінювали.

Дослідження апоптозу лейкоцитів крові методом ДНК-комет. За умов хронічного рентгенівського опромінення в інтервалі доз 10 - 30 сГр спостерігаються зміни в перерозподілі основних класів комет.

Хронічне рентгенівське опромінення призводить до зростання кількості комет класів С2 - С3/С4 впродовж експерименту (табл. 3).

Зростання чисельності комет класів С3/С4 на фоні підвищення кількості комет класу С2 вказує на стимулювання процесу апоптозу в лейкоцитах периферичної крові щурів за умов хронічного рентгенівського опромінення, тобто на скорочення тривалості життя та зміну їхнього функціонального стану.

Таблиця 3

Вміст окремих класів ДНК-комет, які утворюють лейкоцити, у контрольних тварин і за умов хронічного рентгенівського опромінення, а також на фоні введення L-аргініну та L-NAME (%, М ± m, n = 6)

Класи Групи	C0/C1	C2	C3/C4
Контроль	98,2 ± 1,1	1,5 ± 0,1	0,3 ± 0,02
К + L-Arg 10 доба	96,9 ± 0,7	2,8 ± 0,5	0,3 ± 0,02
К + L-Arg 20 доба	97,4 ± 0,6	2,3 ± 0,2	0,3 ± 0,02
К + L-Arg 30 доба	97,0 ± 0,9	2,7 ± 0,3	0,3 ± 0,02
К + L-NAME 10 доба	97,8 ± 0,6	1,7 ± 0,3	0,5 ± 0,03
К + L-NAME 20 доба	97,7 ± 0,7	2,0 ± 0,2	0,3 ± 0,02
К+ L-NAME 30 доба	98,0 ± 0,5	1,8 ± 0,2	0,2 ± 0,02
Опромінення 10 доба	89,2 ± 3,5	8,0 ± 0,6*	2,8 ± 0,1*
Опромінення 20 доба	88,1 ± 3,5*	8,2 ± 0,5*	3,7 ± 0,3*
Опромінення 30 доба	85,3 ± 2,6*	10,2 ± 0,3*	4,5 ± 0,4*
О + L-Arg 10 доба	90,7 ± 1,5	7,0 ± 0,4	2,3 ± 0,2
О + L-Arg 20 доба	88,2 ± 1,7	9,0 ± 0,9	2,8 ± 0,3
О + L-Arg 30 доба	87,8 ± 2,3	8,5 ± 0,6**	3,7 ± 0,3
О + L-NAME 10 доба	90,7 ± 1,2	7,5 ± 0,4	1,8 ± 0,2
О + L-NAME 20 доба	91,1 ± 1,6	7,2 ± 0,6	1,7 ± 0,1**
О + L-NAME 30 доба	92,3 ± 1,4	6,0 ± 0,4**	1,7 ± 0,1**

Введення основного субстрату NOS тваринам, яких піддавали опроміненню, призводить до достовірного зниження вмісту комет класу С2 на 30-ту добу експерименту у 1,2 раза порівняно до показників тварин, що зазнали лише опромінення (табл. 3).

Неселективний інгібітор NO-синтази зумовлює позитивні зміни в опромінених лейкоцитах. Відсоток клітин, що перебувають на стадії передапоптозу знижується у 1,7 раза на 30-ту добу введення, а клітин, що вступили в заключну фазу загибелі вірогідно знижується на 20-ту та 30-ту добу експерименту, у 2,2 та 2,6 раза відповідно (табл. 3).

Таким чином, введення L-аргініну та L-NAME опроміненим тваринам має позитивний коригуючий вплив у плані пригнічення процесів апоптозу в лейкоцитах периферичної крові. Конкурентний неселективний інгібітор NO-синтази, блокуючи активність NOS і таким чином обмежуючи надсинтез цитотоксичного NO, здійснює протекторний вплив на генетичний апарат ІКК крові щурів за умов хронічного рентгенівського впливу.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив оксиду азоту на проліферативну активність мононуклеарів периферичної крові людини за дії іонізуючої радіації. NO як посередник для передачі внутрішньоклітинних і міжклітинних сигналів може стимулювати або пригнічувати ріст клітин (Ярилин А., 2000), безпосередньо впливаючи на процеси, пов'язані з експресією генів, необхідних для проліферації (Кондакова И., 2005). У контрольних дослідах преінкубація лімфоцитів з L-аргініном підвищує їхню проліферативну активність на 10 % (рис. 2). Вплив іонізуючого випромінювання в дозі 0,3 Гр з преінкубацією лімфоцитів людини або з L-аргініном, або з L-NAME призводить до посилення проліферативної активності у всіх варіантах досліду (рис. 2). Відомо, що зростання концентрації супероксид-радикалу, пероксиду водню, ліпідних гідроперекисів, активних сполук азоту в фізіологічних межах стимулює проліферативні процеси в клітині (Губский Ю., 2008), а за дії низьких доз іонізуючого випромінювання, як вважають деякі автори, є причиною посилення радіорезистентності організму (Пелевина И., 2007).

Преінкубація досліджуваних клітин з L-аргініном при опроміненні дозою 0,3 Гр викликає активацію проліферативних процесів. Внесок NO у стимуляцію бластоутворення за даних умов становить 8,6 %, порівняно з цим показником для клітин, які опромінювались без преінкубації. За дії окремо рентгенівського опромінення в дозі 2 Гр та за преінкубації клітин за умов дії радіаційного чинника або з L-аргініном або з L-NAME спостерігається пригнічення бластної трансформації лімфоцитів у всіх варіантах досліду. За дози опромінення 2 Гр ефект преінкубації лімфоцитів з субстратом NO-синтази - L-аргініном, як і у вище проаналізованих результах, проявляється у збільшенні на 8,3 % кількості проліферуючих клітин у культурі порівняно з показниками лише опроміненої культури. Очевидно, зростання кількості проліферуючих лімфоцитів пов'язане із здатністю NO у певних концентраціях запобігати цитотоксичним ефектам, які спостерігаються при розвитку оксидативного стресу, спричиненого впливом іонізуючого випромінювання.

ВИСНОВКИ

Отримані результати з'ясовують біохімічні механізми участі системи L-аргінін/NO у детермінації морфо-функціонального стану лейкоцитів за умов хронічного рентгенівського опромінення й обгрунтовують можливі способи корекції метаболічних порушень у цих клітинах. Зміни у функціонуванні окисного та неокисного шляхів обміну L-аргініну, перебудова у структурі або зміна кількості вуглеводних детермінант глікопротеїнів мембран лейкоцитів, порушення співвідношення про- й антиапоптичних білків є провідними факторами механізму пошкодження морфо-функціонального стану клітин імунної системи на фоні хронічного рентгенівського опромінення.

1. За умов дії низькоінтенсивного рентгенівського випромінювання в імунокомпетентних клітинах крові спостерігається зміна інтенсивності перебігу окисного та неокисного шляхів обміну L-аргініну. Зростання NO-синтазної активності на фоні інгібування аргінази зумовлює підвищене утворення оксиду азоту і веде до перетворення фізіологічної регуляторної функції NO на цитотоксичну дію.

2. Хронічне рентгенівське опромінення у дозах 10-30 сГр викликає інтенсифікацію програмованої загибелі імунокомпетентних клтин крові щурів.

3. Проапоптична дія NO за умов хронічного рентгенівського опромінення доведена імуноцитохімічно (підвищується відсоток клітин, які містять білок р53 на фоні зниження відсотка Bcl-2+ клітин), методом ДНК-комет (підвищується відсоток комет класів С2-С3/С4), а також вмістом фрагментованої ДНК (досліджуваний показник зростає протягом усього процесу опромінення) в лейкоцитах крові.

4. Вплив низькоінтенсивного випромінювання на клітини імунної системи супроводжується змінами вуглеводних детермінант мембранних глікопротеїнів лейкоцитів периферичної крові щурів, що проявляється зниженням кількості N-ацетил-в,D-глюкозамінових та в,D-галактозовмісних глікокон'югатів, проте зростанням кількості N-ацетилнейрамінової кислоти, зв'язаної б(2>3)-глікозидним зв'язком з субтермінальним залишком галактози.

5. Раннім проявом апоптозу у відповідь на дію рентгенівського випромінювання є специфічна перебудова вуглеводних компонентів мембран з втратою сіалових кислот, зв'язаних б(2>6)-глікозидним зв'язком, що зумовлює зниженням негативного заряду на поверхні клітини.

6. За умов рентгенівського опромінення у дозах 0,3 та 2,0 Гр відзначено стимулюючий вплив NO на проліферативну активність мононуклеарів периферичної крові людини. За дії іонізуючого випромінювання у дозі 2 Гр преінкубація лімфоцитів з L-аргініном проявляє цитопротекторний ефект на проліферативні процеси.

7. Для послаблення токсичної та проапоптичної дії оксиду азоту на лейкоцити крові за умов радіаційного опромінення доцільним є використання L-NAME як інгібітора NO-синтази, а також чинника, який здатний пригнічувати розвиток програмованої загибелі імунокомпетентних клітин крові.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Перетятко Ю.В. Особливості аргіназного та NO-синтазного шляхів метаболізму L-аргініну у лейкоцитах периферичної крові щурів за умов хронічного рентгенівського опромінення / Ю.В. Перетятко., Н.О. Сибірна // Український біохімічний журнал. -- 2009. -- Т. 81. -- №2. -- С. 40-48.

(Здобувач визначила активність ферментів синтезу оксиду азоту та концентрацію вільного L-аргініну в плазмі крові).

2. Дацюк Л. Активність NO-синтази та вміст стабільних метаболітів оксиду азоту у лейкоцитах периферичної крові щурів при введенні L-аргініну за умов хронічного рентгенівського опромінення / Л. Дацюк, Ю. Перетятко, У. Старанко, Н. Сибірна // Вісник Львівського університету. Серія біологічна. -- 2009. -- Вип. 51. -- С. 37-42.

(Здобувач опрацювала робочу схему експерименту, проаналізувала літературні й експериментальні дані, Здобувач визначала вміст нітрит- і нітрат-аніонів у лейкоцитах периферичної крові щурів та взяла участь написанні і оформленні статті).

3. Дацюк Л. Ефект введення неселективного інгібітора NO-синтази за умов низькоінтенсивного рентгенівського опромінення / Л. Дацюк, Ю. Перетятко, У. Старанко, Н. Сибірна // Біологічні студії. -- 2009. -- Т. 3. -- №3. -- С. 51-58.

(Дисертант визначила вміст нітрит- і нітрат-аніонів у лейкоцитах периферичної крові щурів).

4. Перетятко Ю.В. Роль апоптоз-регуляторних білків у розвитку генетично запрограмованої смерті клітин імунної системи за дії рентгенівського випромінювання / Ю.В. Перетятко, Л.О. Дацюк, У.В. Старанко, Н.О. Сибірна // Експериментільна і клінічна фізіологія та біохімія. -- 2010. -- №2. -- С. 11-17.

(Здобувач опрацювала робочу схему експерименту, проаналізувала літературні й експериментальні дані, взяла участь в отриманні матеріалу та написанні й оформленні статті. Здобувач визначала вміст білків р53 та Bcl-2, а також кількість класів ДНК-комет).

5. Перетятко Ю. Особливості метаболізму L-аргініну в лейкоцитах периферичної крові щурів за умов хронічного рентгенівського опромінення / Ю. Перетятко, М. Чупа, Н. Сибірна // V Міжнародна конференція студентів та аспірантів [“Молодь і поступ біології”], (Львів, 12-15 травня 2009 р.), Т. 2. : збірник тез. -- Львів, 2009. -- С. 65-66.

6. Peretiatko Yu. The effects of the nitrogen oxide system on the activation of apoptosis in immunocompetent cells under chronic X-rays / Yu. Peretiatko, L. Datsiuk, U. Staranko, N. Sybirna // 7th Parnas Conference on Biochemistry and Molecular Biology, (October 3-7, 2009): book of abstracts. -- Yalta, 2009. -- P. 307.

7. Перетятко Ю.В. Протекторний вплив L-аргініну та інгібітора NO-синтази на радіаційноіндуковану фрагментацію ДНК лейкоцитів щурів / Ю.В. Перетятко, Н.О. Сибірна // Х Український біохімічний з'їзд, (13-17 вересня 2010 р.), додаток 2.: матеріали з'їзду. -- Одеса, 2010. -- С 293-294.

8. Старанко У.В. Проліферативна активність та апоптоз мононуклеарів периферичної крові людини за сукупної дії іонізуючої радіації та L-аргініну / У.В. Старанко, М.Я. Люта, Ю.В. Перетятко, Л.О. Дацюк, Н.О. Сибірна // Х Український біохімічний з'їзд, (13-17 вересня 2010 р.), додаток 1.: матеріали з'їзду. -- Одеса, 2010. -- С. 238.

9. Мирон О. Лектиніндукована агрегація лейкоцитів периферичної крові щурів за умов хронічного рентгенівського опромінення / О. Мирон, Ю. Перетятко, Н. Климишин, Н. Сибірна // VI міжнародна конференція студентів та аспірантів [Молодь і поступ біології], (Львів, 21-24 вересня 2010 р.): збірник тез. -- Львів, 2010. -- С. 37-38.

АНОТАЦІЇ

Перетятко Ю.В. Вплив рентгенівського випромінювання на NO-залежні механізми регуляції морфо-функціонального стану імунокомпетентних клітин крові. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біології тварин НААН, Львів, 2010.

Дисертацію присвячено дослідженню біохімічних механізмів, які опосередковують зміни морфологічного та функціонального стану імуно-компетентних клітин периферичної крові щурів, і способам корекції процесів, які призводять до виникнення та розвитку ускладнень за умов хронічного рентгенівського впливу.

Показано, що в основі біохімічних порушень, які зумовлюють зміни структурно-функціонального стану лейкоцитів за умов хронічного рентгенівського опромінення, лежить значне зростання продукції оксиду азоту (NO), викликане зміною співвідношення інтенсивності окисного та неокисного шляхів обміну L-аргініну за рахунок зростання активності NO-синтази на фоні інгібування аргінази. Активація апоптозу в імунокомпетентних клітинах крові за умов опромінення пов'язана з гіперпродукцією NO. Зміни у структурі та кількості вуглеводних детермінант глікопротеїнів, експонованих на мембранах лейкоцитів на фоні впливу радіаційного чинника, є провідними механізмами, що зумовлюють зміни морфо-функціонального стану цих клітин. Виявлено, що L-NAME як неселективний інгібітор NOS є чинником, що має здатність запобігати генетично запрограмованій загибелі клітин імунної системи через інгібування токсичної та проапоптичної дії оксиду азоту за умов рентгенівського опромінення. Запропоновано на основі L-NAME проводити пошук та розробку препаратів, які запобігатимуть розвиткові або коригуватимуть ускладнення, що опосередковуються лейкоцитами периферичної крові за умов тривалого рентгенівського опромінення.

Ключові слова: рентгенівське опромінення, імунокомпетентні клітини крові, NO-синтаза, апоптоз, L-NAME, білок р53, білок Bcl-2.

Перетятко Ю.В. Влияние рентгеновского излучения на NO-зависимые механизмы регуляции морфо-функционального состояния иммуно-компетентных клеток крови. -- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биологии животных НААН, Львов, 2010.

Диссертация посвящена исследованию биохимических механизмов, которые опосредуют изменения морфологического и функционального состояния иммунокомпетентных клеток периферической крови крыс и способам коррекции процессов, приводящих к возникновению и развитию осложнений в условиях хронического рентгеновского облучения.

Показано, что в основе биохимических нарушений, которые обуславливают изменения структурно-функционального состояния лейкоцитов в условиях хронического рентгеновского облучения, лежит значительное повышение продукции оксида азота (NO), вызванное изменением соотношения интенсивности окислительного и неокислительного путей обмена L-аргинина за счет повышения активности NO-синтазы на фоне ингибирования аргиназы. Образование избыточных количеств NO может приводить к усилению свободнорадикальных процессов в исследуемых клетках. Токсический пероксинитрит, продукт радикал-радикального взаимодействия NO и О2-, проявляет мощное деструктивное воздействие практически на все компоненты клетки. Кроме того, повышение активности NOS, и соответственно уровня оксида азота, может приводить к ингибированию адгезии и миграции лейкоцитов. При сопоставлении данных, полученных при исследовании агрегационной способности лейкоцитов, индуцированой лектином акации амурской, и содержания сиаловых кислот, наблюдаются однонаправленные изменения исследуемых показатетей. Как индуктор агрегации МАА вызывал наибольшую амплитуду ответа при исследовании функционального состояния ИКК крови крыс. Исходя из этого можна предположить, что основной вклад в изменение агрегационной способности ИКК крови вносят сиаловые кислоты, присоединенные б(2>3)-гликозидной связью к субтерминальному остатку галактозы. И, соответственно, ведущим структурным изменением, которое вызывает нарушение морфо-функионального состояния ИКК крови крыс, является изменение процессов сиалирования по типу образования б(2>3)-гликозидной связи.

Увеличение количества белка р53, индуцированное ионизирующим облучением низкой интенсивности, дает мощный апоптогенный сигнал в лейкоцитах периферической крови крыс. Обнаружено, что L-NAME способный предупреждать генетически запрограммированную гибель клеток иммунной системы путем ингибирования токсического и проапоптческого влияния оксида азота в условиях рентгеновского облучения. Таким образом угнетение активности NOS конкурентным неселективным ингибитором NOS приводит к снижению продукции оксида азота, и, как следствие, к снижению содержания белка р53. Повышение содержания антиапоптического белка Bcl-2 указывает на угнетение генетически запрограммированой гибели ИКК крови в условиях низкоинтенсивного излучения на фоне введения исследуемого ингибитора.

Предложено на основе L-NAME проводить поиск и разработку препаратов, которые будут предотвращать развитие или корригировать осложнения, которые опосредуются лейкоцитами периферической крови в условиях длительного рентгеновского облучения.

Ключевые слова: рентгеновское облучение, иммунокомпетентные клетки крови, NO-синтаза, апоптоз, L-NAME, белок р53, белок Bcl-2.

Peretyatko Y.V. The influence of the X-ray irradiation on the NO-dependent regulatory mechanisms regulation of the morpho-functional state of immunocompetent blood cells. -- Manuscript.

The dissertation is dedicated to investigation of biochemical mechanisms that mediate changes in morphological and functional state of the immunocompetent cells of the rats' peripheral blood and approaches to correction of processes which cause the manifestation and development complications caused by prolonged X-ray irradiation.

It has been shown that the basis of the biochemical impairments which cause changes in structural and functional state of immunocompetent blood cells under chronic X-ray irradiation is formed due to significant increase in nitric oxide (NO) production induced by the change in oxidative - non-oxidative pathways of L-arginine metabolic intensity ratio at the expence of the increase of NO-synthase activity against the background of arginase inhibition. The activation of the apoptosis in the immunocompetent blood cells treated with irradiation is induced by nitric oxide hyperproduction. The changes in the carbohydrate determinants structure and count of glycoproteins exposed on the leucocytes membranes caused by X-ray irradiation are the leading mechanisms determining the changes of morpho-functional state of these cells. L-NAME as non-selective inhibitor of NOS proved to be the factor capable to prevent the programmed cell death of immune system cells by means of inhibition of toxic and proapoptic effects of nitric oxide under X-ray irradiation. It has been proposed to continue research on the basis of L-NAME for development of preparations which may prevent or correct the impairments that appear in the leukocytes of peripheral blood due to prolonged X-ray irradiation.

Key words: X-ray irradiation, immunocompetent blood cells, NO-synthase, apoptosis, L-NAME, protein p53, protein Bcl-2.

Размещено на Allbest.ru

...