Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМЕНІ О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

14.03.04 - патологічна фізіологія

ЕКПРЕСІЯ ГЕНІВ ЕНДОГЕННОЇ КАРДІОПРОТЕКЦІЇ ПРИ ІШЕМІЇ-РЕПЕРФУЗІЇ СЕРЦЯ

Сурова Ольга Вікторівна

Київ - 2010

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

генетичний кардіоміоцит міокард гіпоксія

Актуальність проблеми. В Україні за період 1985 - 2003 рр. захворюваність ішемічною хворобою серця зросла на 108 % - більше ніж у 2 рази, а смертність від серцево-судинних захворювань стабільно тримається на рівні 60 % загальної смертності та має тенденцію до зростання: 1.5 - 2.0 % щорічно [Коваленко В. М. та ін., 2004]. Важливим та перспективним аспектом боротьби із захворюваннями серця, безумовно, є наукова розробка проблеми - встановлення патогенетичних механізмів розвитку гострого інфаркту міокарда та створення на основі результатів наукових досліджень загальної концепції патогенезу захворювання, яка могла б служити основою для розробки терапевтичних заходів у різні строки розвитку захворювання. На сьогоднішній день значну увагу набуває дослідження механізмів так званої ендогенної кардіопротекції. Тобто, це механізми, які закладені в самому організмі на клітинному та молекулярному рівнях і здатні попереджувати та значно зменшувати пошкоджуючу дію ішемії та реперфузії [Мойбенко О.О. та ін., 2008].

Не дивлячись на інтенсивні дослідження, етіологія гострого інфаркту міокарда та механізмів, ініціюючих компенсаторні процеси при ішемії-реперфузії, лишаються недостатньо вивченими. Одним з механізмів обмеження ішемічного пошкодження серця є зміна в експресії генів. З використанням сучасних молекулярно-біологічних методів було показано, що вже в перші 24 години в зоні інфаркту відбувається зміна в експресії більш ніж тисячі генів, продукти яких грають роль у транскрипції, запаленні, клітинній проліферації, білковому синтезі та ін. [LaFramboise W.A. et al., 2005]. В той же час питання функціонального значення цих змін в експресії багатьох генів залишається відкритим. Серед них велику увагу привертають гени стрес-білків, які одними з перших включаються у захист міокарда, гени білків-регуляторів різних типів загибелі клітин, протеасомного протеолізу, гени, що зумовлюють стійкість міокарда до гіпоксії та інших патогенних факторів. Спираючись на те, що однією з найважливіших ланок патологічного процесу ішемії-реперфузії в серці є загибель кардіоміоцитів, яка відбувається різними шляхами (запрограмованими - апоптоз, аутофагічна клітинна смерть; та незапрограмованим - некроз), перспективним є вивчення змін експресії тих генів, продукти яких є регуляторами різних видів клітинної смерті. Варто зазначити, що описані зміни у експресії цілого ряду генів при відтворенні другого вікна прекондиціонування [Dipak K. D. et al., 2006]. Власне саме з перебудовою генетичного апарату клітини і пов'язують розвиток позитивних ефектів цього явища і те, що вони з'являються не раніше, ніж через 24 години після короткочасної ішемії. Враховуючи те, що наявність феномену пізнього посткондиціонування є не вивченою, невідомим залишається і залучення змін експресії тих чи інших генів в розвиток цього явища. Отже, розуміння того, яким чином відбуваються зміни експресії генів та до яких наслідків вони ведуть за умов дії ішемії-реперфузії, а також яким чином вони задіяні у розвиток ендогенної кардіопротекції, являє собою важливу з клінічної та теоретичної точки зору проблему. З'ясування цього питання є критичним для створення та розвитку терапевтичних підходів, що дадуть змогу посилювати благоприємні генетичні зміни та пригнічувати потенційно шкідливі, та впровадження новітніх методів генної терапії ішемічної хвороби серця та інфаркту міокарда. Останнє, як вже зазначалося, є на сьогодні дуже актуальною проблемою.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках наукової тематики відділу загальної та молекулярної патофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: «Дослідження механізмів розвитку та попередження порушень діяльності серцево-судинної системи при ішемічно-реперфузійному синдромі; розробка методів їх корекції» (№ держреєстрації 0102U000827), «Дослідження ендогенних механізмів кардіопротекції при захворюваннях серця» (№ держреєстрації 0105U003233) та наукової програми НАН України «Дослідження молекулярних механізмів - проявів функціонування геному, що зумовлюють специфічність діяльності фізіологічних систем організму в нормі та патології» (№ держреєстрації 0102U002472).

Метою дослідження було визначення ролі генетичних факторів у розвитку патологічних процесів, що ведуть до загибелі кардіоміоцитів (шляхом некрозу, апоптозу та аутофагії), зумовлюють стійкість міокарда до гіпоксії та інших патогенних факторів, та ролі генів стрес-білків при ішемії-реперфузії міокарда та аноксії-реоксигенації неонатальних кардіоміоцитів в культурі, а також участі цих факторів в механізмах кардіопротекції в умовах пре- та посткондиціонування.

Завдання дослідження:

1. Дослідити цитопротективні ефекти пізнього ішемічного та фармакологічного прекондиціонування та пізнього ішемічного посткондиціонування за допомогою оцінки співвідношення живих та загиблих різними шляхами клітин в первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів;

2. Дослідити зміни експресії генів, продукти яких є регуляторами клітинної смерті: FRAP - регулятору аутофагії та гену антиапоптотичного фактору Bcl-2 при відтворенні аноксії-реоксигенації та ендогенної кардіопротекції в культурі ізольованих кардіоміоцитів;

3. Дослідити зміни експресії генів, продукти яких є ключовими факторами відповіді клітини на гіпоксичний стрес: HIF-3alpha - фактору, що індукується гіпоксією, та білків теплового шоку HSP70 та HSP90 при відтворенні аноксії-реоксигенації та ендогенної кардіопротекції в культурі ізольованих кардіоміоцитів та в тканині міокарду при моделюванні ішемії-реперфузії in vivo

4. Дослідити зміни експресії зазначених генів в тканині міокарда при моделюванні ішемії-реперфузії in vivo та провести кореляційний аналіз між виявленими змінами експресії цих генів та розміром зони некрозу міокарда.

Об'єкт дослідження - генетичні фактори реалізації ендогенної кардіопротекції у первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура при відтворенні аноксії-реоксигенації, а також в тканині серця при моделюванні ішемії-реперфузії in vivo, та іх функціональне значення.

Предмет дослідження - РНК, виділені з неонатальних кардіоміоцитів та тканин серця щурів, тканини сердець щурів, неонатальні кардіоміоцити щурів.

Методи дослідження: виділення та культивування кардіоміоцитів; визначення різних видів клітинної смерті із застосуванням флуоресцентних барвників; моделювання аноксії-реоксигенації та пізнього ішемічного пре- та посткондиціонування, а також пізнього фармакологічного прекондиціонування на первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура; моделювання ішемії-реперфузії in vivo; визначення розміру зони інфаркту за допомогою флуоресцентної мікроскопії, виділення РНК з клітин та тканин серця, зворотна транскрипція та полімеразна ланцюгова реакція, полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на сучасному методичному рівні отримано інформацію про роль змін експресії генів FRAP, Bcl-2, HIF-3alpha, HSP70 та HSP90 в реалізації програм ендогенної кардіопротекції. Зокрема, вперше показано можливість відтворення саме пізнього фармакологічного прекондиціонування за допомогою низьких доз інгібітору протеасоми. Вперше розроблена та застосована методика відтворення пізнього посткондиціонування на первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура. При цьому нам вдалося показати, що позитивні ефекти цього явища відсутні, або виражені надто слабо у порівнянні з аналогічною дією прекондиціонування. Вперше продемонстровано зміни у співвідношенні живих та загиблих різними шляхами кардіоміоцитів в культурі при моделюванні пізнього прекондиціонування та посткондиціонування. Крім того, вперше проведено дослідження експресії генів білка-регулятора аутофагічної клітинної смерті FRAP та субодиниці фактора, що індукується гіпоксією - HIF-3alpha - при моделюванні пізнього ішемічного пре- та посткондиціонування в культурі кардіоміоцитів, і при відтворенні цих феноменів за допомогою малих доз протеасомного інгібітору, а також в тканині серця за умов ішемії-реперфузії. При моделюванні пізнього ішемічного посткондиціонування також вперше досліджено експресію гену білка-регулятора апоптоза Bcl2 та білків теплового шоку HSP70 та HSP90. Ці дані дозволяють робити висновки стосовно участі генетичного апарату клітини в реалізації другого вікна протекції та відкривають можливості для подальшого цілеспрямованого вивчення змін експресії генів.

Практичне значення одержаних результатів. В роботі вперше відтворене пізнє ішемічне посткондиціонування і встановлено, що на відміну від прекондиціонування воно не справляє вираженного цитопротективного ефекту. Розроблено метод відтворення пізнього прекондиціонування за допомогою малих доз протеасомного інгібітору на культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура. Отримані у даній роботі дані обумовлюють можливість використання інгібіторів протеасомного протеолізу у малих дозах як засобу для відтворення пізнього прекондиціонування, що відкриває широкі перспективи для лікування ішемічної хвороби серця. В роботі також було досліджено зміни експресії генів при моделюванні ішемії-реперфузії in vivo. Отримані дані дають змогу для розробки шляхів корекції патологічних процесів, що реалізуються в тканині серця за умов ішемічно-реперфузійного пошкодження, на генетичному рівні та впровадження нових методів генної терапії ішемічної хвороби серця.

Особистий внесок здобувача. Автором проведено аналіз літературних джерел, поставлено задачі дослідження, налагоджено та розроблено нові функціонально-генетичні методи, виконано необхідні експериментальні дослідження, статистично оброблено, проаналізовано та узагальнено отримані результати. Деякі експерименти були проведені разом із співробітниками Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, які є співавторами опублікованих робіт.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи було представлено на засіданні сектору вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця (Київ, 11 червня 2009 р.); XXVIII Європейській секції засідання Міжнародного товариства по вивченню серця (Афіни, 28 - 31 травня 2008 р.); 8^му Засіданні France - New EU Members 16^го JMRC Симпозіуму „New frontiers in cardiovascular research” (Краків, 5 - 7 червня 2008 р.); 16^й Європейській конференції по вивченню апоптозу та 5^му Швейцарському конгресі з питань вивчення апоптозу (Берн, 6 - 9 вересня 2008 р.); міжнародному науково-практичному конгресі студентів та молодих вчених “Актуальні проблеми сучасної медицини” та 5^му міжнародному з'їзді представників студентських наукових товариств ВМНЗ „Actual problems of modern medicine” (Київ, 5 - 7 листопада 2008 р.); XII Всеросійській медико-біологічній науковій конференції молодих дослідників "Фундаментальна наука та клінічна медицина" (Санкт-Петербуг, 18-19 квітня 2009 р.); V Міжнародній науковій конференції "Молодь та поступ біології" (Львів, 12-15 травня 2009 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 робіт, у тому числі 4 статті у наукових журналах.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень, аналізу й узагальнення результатів, висновків та списку використаних літературних джерел із 303 найменувань. Робота викладена на 138 сторінках, містить 1 таблицю та проілюстрована 31 рисунком.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Експериментальні дослідження виконано на 35 статевозрілих самках щурів лінії Вістар (маса - 300 - 340 г) віком від 4 до 6 місяців та кардіоміоцитах, виділених із шлуночків 50 щурів лінії Віcтар (маса - 51.0 4.4 г) віком від 2 до 3 діб. Тварин отримували із віварію Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, де вони утримувалися на стандартному харчовому раціоні та в цілому знаходилися у схожих умовах..

Методика виділення та культивування неонатальних кардіоміоцитів щура. Неонатальні кардіоміоцити отримували з міокарду шлуночків дводенних щурів шляхом ферментативного гідролізу за Reinecke H. et al. (1999) із модифікаціями. Шлуночки відокремлювалися від передсердь, механічно подрібнювалися ножицями, а отримані шматочки міокарда розміром 1-2 мм³ переносили у буферний сольовий розчин (рН 7.4) наступного складу: HEPES - 20 мM/л, KCl - 5.4 мM/л, NaCl - 116.4 мM/л, глюкоза - 5.5 мM/л, Na₂HPO₄ - 0.4 мM/л та K₂HPO₄ - 0.4 мM/л, що містив колагеназу ІІ типу (95 ОД/мл) та панкреатин (0.6 мг/мл). Розчин попередньо оксигенувався карбогеном. Очищені клітини ресуспендували у живільному середовищі (середовище Ігла в модифікації Дюльбекко (DMEM), середовище 199 (співвідношення DMEM/199 - 4: 1), теляча сироватка - 15%, Na₂СО₃ - 4.2 мМ/л, HEPES - 15 мМ/л та антибіотики (стрептоміцин - 100 мкг/мл, гентаміцин - 0.05 мг/мл, пеніцилін - 100 ОД/мл)). Кількість живих та загиблих клітин визначалася за допомогою фарбування клітин 0.2 % розчином трипанового синього і становила 85-95 % та 5-15 % відповідно. Клітини розміщували на скельця із щільністю 120 000 на 1 см². Культивування проводилося при 37С у газовому середовищі - 5% СО₂ та 95% атмосферного повітря протягом 1 - 2 діб.

Моделювання аноксії-реоксигенації, пізнього пре- та посткондиціонування в культурі неонатальних кардіоміоцитів щура. Аноксія-реоксигенація моделювалася шляхом подачі до клітин безкисневї газової суміші (5% СО₂ та 95% Ar) протягом 30 хвилин із наступною заміною живильного середовища та культивуванням клітин за вихідних умов (5% СО₂ та 95% атмосферного повітря) протягом 24 год (Р1) чи 60 хв (Р2). Ішемічне посткондиціонування відтворювалося наступним чином: послідовно проводили три короткі цикли реоксигенації тривалістю по 1 хв після 30 хв аноксії. Між періодами реоксигенації відбувалися періоди аноксії відповідної тривалості. Після цих циклів проводилася реоксигенація тривалістю 24 год. Прекондиціонування відтворювалося шляхом проведення трьох коротких періодов аноксії тривалістю 3 хв (5% СО₂ та 95% Ar), що були розмежовані трьома відповідними періодами реоксигенації [Нагібін В. С. та ін., 2006]. Після цього відтворювалася аноксія-реоксигенація за зазначеною вище методикою.

Для моделюванні пізнього прекондиціонування фармакологічним шляхом використовували специфічний інгібітор протеасоми класто-лактацистін в-лактон. Клітини інкубувалися у присутності інгібітору у концентрації 100 нМ, який розчиняли у ДМСО та додавали до поживного середовища за 24 год до моделювання аноксії-реоксигенації протягом 30 хв та 60 хв відповідно. Контрольні клітини отримували відповідну кількість розчинника.

Визначення різних видів клітинної смерті кардіоміоцитів при моделюванні аноксії-реоксигенації та ендогенної кардіопротекції. Кількість живих, некротичних та апоптотичних клітин оцінювали цитологічно за допомогою забарвлення кардіоміоцитів біс-бензимідом (Hoeсhst 33342) та пропідіум йодидом в однаковій концентрації 8.75 мкМ/л. Перший з них проникає через непошкоджену мембрану клітин і забарвлює ядерний хроматин, візуалізуючи таким чином, живі та апоптотичні клітини (останні мають фрагментовані та пікнотичні ядра). Пропідіум йодид не здатен проникати через плазматичну мембрану і забарвлює лише ядра клітин з пошкодженою плазмолемою, тобто некротичних. Для виявлення аутофагічних вакуолей застосовували специфічний барвник - монодансилкадаверин. Далі проводилося цитологічне дослідження із застосуванням флуоресцентної мікроскопії.

Виділення РНК з ізольованих клітин і тканин серця. Виділення РНК із кардіоміоцитів та тканин сердець щурів проводили із використанням набору Trizol RNA-prep (Isogen, Росія) для виділення тотальної РНК. Метод базується на використанні Trizol реагенту, що містить гуанідинізотіоціонат, який призначений для лізису клітин, солюбілізації клітинного дебрісу, денатурації клітинних рибонуклеаз, а також білків. Після цього РНК екстрагується в розчин фенол-хлороформу при центрифугуванні, відмивається від білків та переноситься у стерильні вільні від ДНК та РНК мікропробірки. Вихід чистої РНК з 1 000 000 клітин становить 8 - 15 мкг. В процесі виділення РНК ми дотримувалися рекомендацій, наведених у комерційному наборі.

Оцінка експресії генів білків теплового шоку HSP70 та HSP90 із використанням зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. Зворотну транскрипцію проводили із використанням First Strand cDNA Synthesis Kit («Fermentas», Литва), застосовуючи 2 - 2.5 мкг загальної РНК та гексамерний праймер. Отриману одноланцюгову ДНК використовували для полімеразної ланцюгової реакції із застосуванням наступних пар праймерів: HSP70-F 5`-ATG CGC TCG AGT CCT ACG CCT T-3`, HSP70-R 5`-GCT GAT CTT GCC CTT GAG ACC CTC-3`, HSP90-F 5`-TCC AAT AGG CTT GTG TCT TCC CCC-3`, HSP90-R 5`-AAT CCG TTC CAT GTT GGC TGT CC-3` Ампліфікаційна суміш містила 2.5 мкл 10х РСR-буфера, 2.5 мМ сульфату магнію, 2 мМ суміші нуклеотидтрифосфатів, по 30 пМ кожного з праймерів та 0.5 ОД Taq-ДНК-полімерази («Fermentas», Литва), об'єм доводили до 25 мкл деіонізованою водою. Ампліфікація генів обох HSPs складалася з 35 циклів: денатурація - 94С, 30 с, приєднання праймерів - 60С, 40 с і елонгація - 72С, 1 хв. Для контролю за якістю виділення РНК та порівняння інтенсивності експресії генів HSPs паралельно ампліфікували за вищезазначеною програмою фрагмент гену 18S (рибосомна субодиниця 18) - один із house-keeping генів, послідовність нуклеотидів у специфічних праймерах була наступною: 18S- F5`-CTT AGA GGG ACA AGT GGC G-3` та 18S -R5`-GGA CAT CTA AGG GCA TCA CA-3`. Отримані ампліфікати генів HSP70 та HSP90 розділяли в 2,5% агарозному гелі, що містив 10 мкг/мл бромистого етидію. Візуалізація ДНК після горизонтального електрофорезу (160 V протягом 40 хв) проводилася за допомогою трансілюмінатору (“Біоком”, Росія) та відеосистеми ViTran (Росія). Після цього ДНК отриманих ампліфікатів вилучали із агарозного гелю та очищали за допомогою DNA Extraction Kit («Fermentas», Литва). Концентрацію отриманої з геля ДНК визначали із використанням спектрофотометру NanoDrop ND1000 («NanoDrop Technologies Inc», США) та перераховували в кількість молекул в 1 мкл. Після цього готували серії послідовних розведень очищеної ДНК генів HSP від 10^-4 до 10^-8 молекул в мкл та застосовували для побудови колібрувального графіку для кількісної оцінкі експресії білків теплового шоку у полімеразній ланцюговій реакції в реальному часі.

Кількісну оцінку експресії генів білків теплового шоку проводили використовуючи метод полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі із застосуванням отриманих після зворотньої транскрипції одноланцюгових ДНК, праймерів зазначеної вище послідовності, та стандартизували відносно експресії гену 18S, як ендогенного контролю. ПЛР-ампліфікація HSP70 та HSP90 генів проводилась у 20 мкл SYBR Green PCR Master Mix, що містив 30 пМ кожного праймеру. Програма ампліфікації починалася із попередньої активації AmpliTaq Gold® ДНК-полімерази протягом 10 хв при 95 °C та складалася з 45 циклів: денатурація - 95 °C, 15 с, приєднання праймерів та елонгація - 59 °C, 1 хв. Для контролю за специфічністю флуоресценції продуктів реакції проводили стадію дисоціації - послідовне підвищення температури від 60 до 94С із реєстрацією падіння інтенсивності флуоресценції комплексів дволанцюгових ДНК з SYBR Green. Аналіз отриманих данних проводився за допомогою 7500 Fast Real-time PCR Software.

Оцінка експресії генів антиапоптотичного білку Bcl2, регулятору аутофагічної клітинної смерті FRAP (mTOR) та субодиниці фактору, що індукується гіпоксією, HIF-3alpha із використанням зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. Зворотну транскрипцію проводили із використанням First Strand cDNA Synthesis Kit («Fermentas», Литва), застосовуючи 2 - 2.5 мкг загальної РНК та гексамерний праймер. Отримані одноланцюгові ДНК використовували для кількісної оцінки експресії генів Bcl2, FRAP та HIF-3alpha із використанням полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі із застосуванням TaqMan Gene Expression Assay 7500 Fast Real-time PCR System Custom № 443137. TaqMan-проби для відповідних генів було розроблено на основі послідовностей мРНК щура компанією «Applied Biosystems» (США). Експресія генів була нормалізована відносно гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази (GAPDH) як ендогенного контролю, використовуючи TaqMan Rodent GADPH Control Reagent (VIC^TMProbe). ПЦР-ампліфікація для генів Bcl2 та FRAPскладалася з 45 наступних циклів: начальна денатурація при 95°C впродовж 20 с, з послідуючою обробкою при 95°C протягом 3 с, приєдання праймерів та елонгація - 60 °C, 30 с. Аналіз отриманих данних проводився за допомогою 7500 Fast Real-time PCR Software. ПЦР-ампліфікація для HIF-3alpha складалася з 55 аналогічних циклів. Аналіз отриманих данних проводився за допомогою 7500 Fast Real-time PCR Software.

Моделювання ішемії-реперфузії in vivo. Дорослим самкам щура лінії Вістар масою 300 - 340 г інтраперитонеально вводили розчин уретану з розрахунку 150 мг сухого уретану на 100 г тварини. Після того, як тварина засинала, її надійно фіксували на операційному столі і проводили операцію трахеотомії - в надрізану трахею вводили поліетиленову трубку, під'єднану до апарату штучної вентиляції легень; трубку надійно фіксували. Далі надрізали шкіру і розташовані під нею шари м'язів в нижній зоні лівої сторони грудної клітки для того, щоб дістатися до ребер; при появі кровотеч користувалися коагулятором. За допомогою спеціального розширювача фіксували отвір між ребрами. Потім знімали перикард і перев'язували передню нисхідну коронарну артерію лігатурою, підкладаючи під вузол шматок товстої нитки для уникнення пошкодження серця. Розширювач знімали, рану закривали ватою змоченою фізрозчином. Ішемію підтверджували регістрацією змін показників ЕКГ (елевація ST сегмента). Кожні 15 хвилин після перев'язки записували дані ЕКГ. Через годину обережно розрізали вузол на коронарній артерії і після цього протягом 3х годин реперфузії реєстрували дані ЕКГ з інтервалом у 20 хв. По закінченню реперфузії серце вирізали, невеликий шматочок верхівки міокарду видаляли для подальшого виділення з цього матеріалу РНК, а серце заморожували для подальших досліджень. Контрольні тварини проходили всю описану вище процедуру окрім зав'язування вузла на коронарній артерії. Для визначення в подальшому площі зони некрозу міокарда всім тваринам за 20 хв до закінчення реперфузії вводили внутрішньовенно 0,05% розчин пропідіум-йодиду.

Визначення площі зони некрозу міокарду. Після завершення реперфузії, серця вирізали і розрізали перпендикулярно повздовжної осі на 4 трансверсивні долі приблизно однакової товщини. З кожної долі за допомогою мікротому отримували зрізи товщиною 10 - 12 мкм. Пропідіум-йодид-позитивні зони зрізів фотографували за допомогою мікроскопу Nikon Eclipse E200 (фільтр D/PI, довжина хвилі збудженння 510-560 нм). Сумарна площа некротичних зон визначалася планиметрично за допомогою програмного забезпечення ImageJ 1.37V.

Методи статистичної обробки матеріалу. Отримані дані обробляли статистично з використанням програми Excel 2000 та Оrigin 8.0. При цьому вірогідність різниці середніх величин (Р<0.05) визначали за критерієм t Ст'юдента. Значення Р < 0.05 вважали вірогідним.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Співвідношення живих, некротичних, апоптотичних та аутофагічних кардіоміоцитів та експресія генів в контрольних умовах. За допомогою методу подвійного фарбування клітин флуоресцентними барвниками Hoeсhst та пропідіум іодид встановлено, що співвідношення живих, некротичних та апоптотичних клітин у контролі становить 87.31 ± 2.72 %, 5.98 ± 0.66 % та 2.59 ± 0.61 % відповідно (n = 10) (Рис. 1). Кількість клітин з ознаками аутофагії в культурі становила 6.45 ± 1.47 % (n = 10) по відношенню до загальної кількості клітин. При цьому відносний рівень мРНК HSP70 та HSP90 становив (1.32 ± 0.11) · 10^-7 та (0.051 ± 0.005) · 10^-6 молекул/мкл відповідно. Рівень мРНК гену Bcl2 складав 34.41 ± 4.65 у. о., а гену FRAP - 14.83 ± 1.33 у. о.

Вплив аноксії-реоксигенації на клітинну смерть та експресію генів в культурі кардіоміоцитів. При відтворенні аноксії-реоксигенації протягом 30 хв та 24 год відповідно (А-Р1) кількість живих клітин зменшувалася на 8.5 % від 87.3 ± 2.72 до 78.9 ± 2.44 % (P < 0.005, n = 10). Популяція некротичних та апоптотичних клітин при цьому зростала у 2 (5.98 ± 0.66 - 11.88 ± 1.99 %) та 3 рази (2.59 ± 0.61 - 7.85 ± 1.97 %) відповідно у порівнянні з контролем (P < 0.05, n = 10) (Рис. 1). Кількість клітин із ознаками аутофагії збільшувалася за цих умов у 2.6 рази порівняно з контролем і становила 16.67 ± 1.66 % (P < 0.005, n = 10). При цьому нами було встановлено, що 30-хвилинна аноксія із наступною реоксигенацією впродовж 24 год (А-Р1) призводила до значної індукції експресії білків теплового шоку з молекулярною масою 70 та 90 кДа. Так, рівень мРНК HSP70 зростав у 4.4 рази від (1.32 ± 0.11) · 10^-7 до (5.81 ± 0.47) · 10^-7 (молекул на мкл) порівяно з контролем (P < 0.05, n = 10), а рівень мРНК HSP90 - у 38 разів від (0.051±0.005) · 10^-6до (1.95±0.2) · 10^-6 (молекул на мкл) (P < 0.05, n = 10) (Рис. 2). Аноксія-реоксигенація практично не впливала на експресію гену антиапоптотичного білку Bcl2 в культурі. Відносний рівень мРНК гену в контролі та в групі А-Р1 становив 34.41 ± 4.65 та 33.94 ± 2.64 у.о. відповідно. За цих умов відносний рівень мРНК гену FRAP також майже не змінювався із незначною тенденцією до зростання від 14.83 ± 1.33 до 17.877 ± 3.96 у. о. Нами вперше було показано вплив аноксії-реоксигенації на експресію субодиниці фактору, що індукується гіпоксією, HIF-3alpha, в культурі ізольованих кардіоміоцитів щура. Ми спостерігали значну депресію експресії гену HIF-3alpha за умов відтворення аноксії-реоксигенації в культурі кардіоміоцитів. При цьому відносний рівень мРНК гену знижувався на 70 % у порівнянні з контролем (Рис. 2).

Таким чином, у проведених дослідах було підтверджено той факт, що аноксія-реоксигенація суттєво впливає на співвідношення живих, некротичних, апоптотичних та аутофагічних клітин. Було також втановлено, що за умов аноксії-реоксигенації відбувається потужна активація експресії білків теплового шоку; вперше було досліджено вплив аноксії-реоксигенації на експресію HIF-3alpha у кардіоміоцитах та втановлено пригнічення експресії цього фактору за даних умов.

Співвідношення живих, некротичних, апоптотичних та аутофагічних кардіоміоцитів та зміни експресії генів в умовах моделювання пізнього ішемічного прекондиціонування. Встановлено, що при відтворенні прекондиціонування зменшувалася популяція апоптотичних клітин у 1.4 рази порівняно з групою А-Р1 від 7.85 ± 1.9 % до 5.83 ± 1.5 % (P₁ > 0.05, n = 10). Прекондиціонування на 6 % зменшувало кількість кардіоміоцитів, що гинули шляхом некрозу, при повторному епізоді аноксії-реоксигенації А-Р2, від 24.56 ± 1.77 % до 18.75 ± 3.27 % (Р₂ > 0.05, n = 10) (Рис. 1). При відтворенні пізнього прекондиціонування спостерігалося зростання у 1.4 рази кількості клітин із ознаками аутофагії зростала від 16.67 ± 1.66 % до 23.9 ± 4.60 % порівняно з А-Р1 (P < 0.05, n = 10). При повторному епізоді аноксії-реоксигенаціі прекондиціонування призводило до зменшення на 5 % кількості клітин з ознаками аутофагії від 26.77 ± 6.50 % до 21.35 ± 6.20 % (Р₂ > 0.05). Отже, встановлений нами цитопротективний ефект пізнього прекондиціонування реалізується за рахунок попередження апоптотичної загибелі кардіоміоцитів в культурі за умов дії першого епізоду аноксії-реоксигенації, а при другому її епізоді - за рахунок зменшення популяції некротичних клітин.

К - контроль, А-Р1- аноксія 30 хв - реоксигенація 24 год, Пре - прекондиціонування, А-Р2 - аноксія 30 хв - реоксигенація 60 хв, 2А-Р - А-Р1 + А-Р2. ^*P < 0.05 - у порівнянні з контролем, ^**P₁ < 0.05 - порівняно з А-Р1, ^#Р₂ > 0.05 - порівняно з А-Р1 + А-Р2.

При відтворенні пізнього ішемічного прекондиціонування зменшувалась експресія генів молекуляних шаперонів HSP70 та HSP90 у 14 (від (5.87 ± 0.59) · 10 ^-7 до (4.31 ± 0.48) · 10 ^-8 молекул мРНК/мкл) та 7 (від (1.95 ± 0.2) · 10 ^-6 до (2.68 ± 0.99) · 10 ^-7 молекул мРНК/мкл) разів відповідно у порівнянні із А-Р1 (P₁ < 0.05, n = 10) (Рис. 2). При цьому рівень мРНК Bcl2 знижувався у 4.5 рази від 33.9 ± 2.6 до 7.5 ± 0.86 у.о. у порівнянні з А-Р1 (P₁ < 0.05, n = 10). Експресія гену FRAP пригнічувалась за умов відтворення прекондиціонування у 4.3 рази від 17.9 ± 3.96 до 4.2 ± 2.88 у..о. у порівнянні з аноксією-реоксигенацією (P₁ < 0.05, n = 10). Рівень мРНК гену HIF-3alpha за цих умов зростав у 9 разів (0.001 ± 0.0002 - 0.009 ± 0.003 у. о.) у порівнянні з А-Р1 (P₁ < 0.05).

Отже, аналіз отриманих даних дозволив підтвердити наявність вираженого цитопротективного ефекту пізнього прекондиціонування, який реалізувався за рахунок попередження апоптотичної загибелі кардіоміоцитів в культурі за умов дії першого епізоду аноксії-реоксигенації, а при другому її епізоді - за рахунок зменшення популяції некротичних клітин.

Прекондиціонування у віддаленому періоді відміняло індукуючий ефект аноксії-реоксигенації на експресію обох HSP`s, при чому найбільш вираженим цей вплив був по відношенню до HSP70. Отже, прекондиціонування нівелює надмірну експресію білків теплового шоку, яка може призводити до індукції каскаду реакцій, що спричинюють некротичну загибель клітин та можуть блокувати апоптотичну програму при повторній аноксії-реоксигенації. Ці дані дають змогу припустити протективний характер змін експресії стрес-білків, індукованих прекондиціонуванням у наших дослідах. Це також дає змогу в певній мірі пояснити зменшення кількості апоптотичних клітин, індуковане прекондиціонуванням, не зважаючи на його потужний інгібуючий ефект по відношенню до експресії гену антиапоптотичного білку Bcl2. З цими змінами, вірогідніше за все, може бути пов'язане зростання кількості апоптотичних клітин за умов дії повторного епізоду аноксії-реоксигенації на фоні відтворення прекондиціонування. Експресія гену FRAP пригнічувалась при відтворення прекондиціонування, що корелює із зростанням кількості клітин з ознаками аутофагії. Виходячи із результатів, отриманих у попередніх наших дослідженнях, щодо кардіопротективної ролі аутофагії [Досенко В.Є. та ін., 2006] встановлені в нашому експерименті зміни експресії гену FRAP слід розглядати з точки зору протективного механізму прекондиціонування.

Клітинна смерть та експресія генів в при моделюванні пізнього фармакологічного прекондиціонування за допомогою інгібітору протеасомного протеолізу. Виходячи з отриманих даних щодо цитопротективної дії пізнього ішемічного прекондиціонування, а також попередніх даних, отриманих у роботі Досенко В.Є. та ін., 2006 р., щодо можливості відтворення цитопротективних ефектів раннього пре- та посткондиціонування за допомогою інгібіторів протеасомального протеолізу, нами було досліджено можливість відтворення фармакологічним шляхом пізнього прекондиціонування. В ході проведених досліджень нами було виявилено, що класто-лактацистін в-лактон у низькій дозі зумовлює помірне пошкодження кардіоміоцитів в культурі (Таблиця 1).

Таблиця 1. Кількість живих, некротичних та апоптотичних клітин в контролі та при застосуванні протеасомного інгібітору в культурі ізольованих кардіоміоцитів.

Відтворення аноксії-реоксигенації (А-Р) протягом 30 хв та 60 хв відповідно на фоні застосування інгібітору супроводжувалося зменшенням кількості апоптотичних клітин у 1.5 рази від 7.7 ± 1.11 % до 4.98 ± 1.80 % порівнянно із групою клітин, що зазнавали дії лише аноксії-реоксигенації (30хв - 60 хв) (P₁ < 0.05). Популяція клітин, що гинули шляхом некрозу, за даних умов виявляла тенденцію до зменшення, кількість некротичних клітин при цьому зменшувалася на 2% від 12.0 ± 1.04 % до 10.14 ± 1.86 % у порівнянні з групою А-Р (P₁ < 0.05). Класто-лакстоцистін у поєднанні з наступною дією А-Р призводив збільшував кількість клітин із ознаками аутофагії на 5 % - у порівнняні із дією А-Р (від 16.6 ± 1.66 % до 21.5±3.22 %, P₁ < 0.05). Таким чином, протеасомний інгібітор не попереджав аутофагічну загибель кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації, але попереджав їх загибель шляхом апоптозу та некрозу, відтворюючи тим самим явища ендогенної кардіопротекції

В наших дослідженнях класто-лактацистин в-лактон у застосованій концентрації 100 нМ збільшував експресію білку теплового шоку HSP70 у 2 рази від (1.32 ± 0.11) · 10^-7 до (2.47 ± 0.09) · 10^-7 молекул/мкл порівяно з контролем (P < 0.05, n = 10). При цьому рівень мРНК HSP90 практично не змінювався при застосуванні інгібітору, із незначною тенденцією до зниження від 5.12 ± 0.5 · 10^-8 до 4.27 ± 0.2 · 10^-8 молекул/мкл (P > 0.05, n = 10). Спостерігалася тенденція до пригнічення експресії гену FRAP - рівень мРНК гену несуттєво зменшувався від 3.64 ± 0.49 до 2.29 ± 0.31 у. о. (P > 0.05, n = 7). Інгібітор не вливав на експресію генів Bcl2 та HIF-3alpha.

Протеасомні інгібітори спричинюють комлексні ефекти на реалізацію різних типів програмованої клітинної смерті, а їх застосування уявляє собою новий підхід до лікування запальних, гіперпроліферативних та інших захворювань, включаючи ішемічно-реперфузійні пошкодження [Meiners S. et al., 2002; Elliott P.J. et al., 2003; Voorhees P.M. et al., 2006]. Наш аналіз дозволив виявити, що інгібування протеасомного протеолізу за допомогою низької дози інгібітору індукує стрес у клітинах серця та супроводжується значними змінами експресії генів, що в свою чергу призводить до активації протективних механізмів захисту проти дії аноксії-реоксигенації. Згідно наших даних, інгібітор протеасоми класто-лактоцистін-b-лактон збільшує експресію гену HIF-3alpha, що може сприяти більш ефективній роботі цієї транскрипційної системи. Серед приблизно сотні генів-мішеней HIF є деякі, що беспосередньо пов'язані із стійкістю кардіоміоцитів до ішемічного пошкодження (гени гліколізу, антиоксидантних систем, судинного тиску, регуляції рН, клітинної пролиферації та виживання, тощо) [Hu C.J. et al., 2003; Semenza G.L. et al., 2004]. Показані у наших дослідженнях зміни експресії білків теплового шоку (в основному HSP70) також можуть пояснити попередження апоптотичної клітинної смерті кардіоміоцитів при застосуванні інгібітору протеасоми та моделюванні аноксії-реоксигенації. Згідно літературним даним, деякі HSPs мають антиапоптотичні властивості та беспосередньо інгібують активацію каспаз [Beere H.M. et al., 2000; Bruey JM. et al. 2000; Garrido C. et al., 2001].

Вплив пізнього ішемічного посткондиціонування на клітинну смерть та експресію генів у культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів. Проблема наявності віддалених цитопротективних ефектів, а також існування самого феномену пізнього посткондиціонування є досі відкритою. У наших дослідженнях було вперше відтворено модель віддаленого ішемічного посткондиціонування на культурі неонатальних кардіоміоцитів щура, а також встановлено зміни експресії, індуковані посткондиціонуванням у віддаленому періоді. При цьому кількість кардіоміоцитів, ща гинули шляхом некрозу, зростала у 1.6 рази від 11.88 ± 1.99 % до 19.88 ± 3.01 % у порівнянні з А-Р1 (P₁ < 0.05, n = 10). У віддаленому періоді посткондиціонування зменшувало апоптоз у 3.3 рази порівняно з групою А-Р1 від 7.85 ± 1.9 % до 2.4 ± 1.20 % (P < 0.05). Тобто, посткондиціонування нівелювало індукуючу по відношенню до апоптозу дію аноксії-реоксигенації. Повторна аноксія-реоксигенація А-Р2, відтворена на фоні посткондиціонування, супроводжувалася збільшенням кількості некротичних клітин на 2 % (від 20.7 ± 3.50 % до 22.5 ± 2.48 % (Р₂ > 0.05) у порівнянні з групою клітин, що зазнали дії двох аноксій-реоксигенацій без посткондиціонування. Посткондиціонування невірогідно збільшувало на 5 % популяцію клітин з ознаками аутофагії порівняно із аноксією-реоксигенацією, при цьому кількість аутофагічних клітин зростала з 16.67 ± 1.66 % до 21.3 ± 4.15 % (P₁ > 0.05, n = 10).

А - аноксія, Р1 - реоксигенація 24 год, Пост - посткондиціонування (1хв Ч 3), Р2 - реоксигенація 60 хв. ^*P < 0.05 -порівняно з контролем, ^**P₁ < 0.05 - порівняно з А-Р1, ^#Р₂ > 0.05 - порівняно з А-Р1 + А-Р2.

Посткондиціонування у віддаленому періоді нівелює індукуючий ефект аноксії-реоксигенації на експресію обох HSP's. При цьому рівень мРНК HSP70 зменшувався у 5 разів з (5.81±0.47)·10^-7 до (1.07±0.10)·10^-7 молекул мРНК/мкл (P₁ < 0.05, n = 10), рівень мРНК HSP90 зменшувався у 34 рази з (1.95±0.2)·10^-6 до (0.0057±0.0006)·10^-6 молекул на/мкл (P₁ < 0.05, n = 10). Посткондиціонування на 4 % збільшувало рівень мРНК гену Bcl2 від 33.94 ± 2.64 до 37.8 ± 2.5 у. о. у порівнянні з А-Р1 (Рис. 4). Показане підвищення експресії цього антиапоптотичного білку корелює із пригніченням апоптотичної клітинної смерті, яке спостерігалося в культурі кардіоміоцитів при моделюванні пізнього посткондиціонування. Відносний рівень мРНК гену FRAP зростав у 1.3 рази від 14.83 ± 1.33 до 18.62 ± 1.30 у.о. порівняно із контролем, проте це підвищення майже не відрізнялося від дії самої аноксії-реоксигенації. Посткондиціонування у віддаленому періоді призводило до пригнічення експресії гену HIF-3alpha у 1.4 рази порівняно із дією аноксії-реоксигенації (від 0.3 ± 0.029 до 0.21 ± 0.019 у. о., Р₁ > 0.05).

Отже, отримані дані вказують на те, що посткондиціонування у віддаленому періоді через 24 години після його відтворення не виявляє суттєвого цитопротективного ефекту, про що свідчить підвищення кількості некротичних клітин. Аналіз показаних нами змін експресїї генів при моделюванні посткондиціонвання не дозволяє дійти остаточного висновку щодо ролі змін експресії зазначених генів у відсутності цитопротективного ефекту. Посткондиціонування пригнічує надекспресію генів білків теплового шоку, індуковану аноксією-реоксигенацію, тобто діє однонаправлено із прекондиціонванням, проте ми не спростерігали при цьому формування резистентності кардіоміоцитів до оксидативного стресу. Можливо, цей факт можна пояснити різницею у потужності та селективності інгібуючого ефекту пре- та посткондиціонування. Так, посткондиціонування майже в 3 рази менше пригнічувало експресію HSP70 у порівнняні з прекондиціонуванням та супроводжувалося надзвичайно потужним пригнічення експресії HSP90. Це наводить на думку, що індукована аноксією-реоксигенацією надекспресія саме HSP70 робить головний внесок у пошкодження клітин та запуск некрозу, та посткондиціонування у віддаленому періоді не здатне нівелювати цей ефект у достатній мірі. При моделюванні посткондиціонування спостерігалася тенденція до зростання експресії Bcl2, що супроводжувалося зменшенням апоптотичної популяції клітин в культурі, проте кількість некротичних клітин при цьому не зменшувалася. Показане нами зростання експресії гену FRAP при моделюванні посткондиціонування хоча і не приводило до зменшення кількості клітин із ознаками аутофагії, проте також не супроводжувалося зменшенням популяції некротичних клітин. Ми також не спостерігали значних протективних ефектів посткондиціонування на фоні зниження експресії гену HIF3-aplha. Отже, індуковані в застосованій моделі пізнього ішемічного посткондиціонвання зміни експресї генів лише частково забеспечували формування резистентного фенотипу кардіоміоцитів та не мали вираженого цитопротективного ефекту.

Клітинна смерть та експресія генів в тканині серця при моделюванні ішемії-реперфузії in vivo. При використанні методу фарбування тканини серця щурів флуоресцентним барвником пропідіум іодидом було встановлено, що розмір некротичної (пропідіум іодид позитивної) зони у вдавано-оперованих тварин та при моделюванні ішемії-реперфузії становив 2.92 ± 1.0 % та 14.3 ± 2.7 % відповідно. Отже, ішемія-реперфузія збільшувала зону інфаркту у 5 разів (Р < 0.05, n = 6).

Ішемія впродовж 1 год із наступною 3 год реоксигенацією призводила до потужної індукції експресії генів молекулярних шаперонів HSP70 та HSP90 в тканині міокарда. При цьому рівень мРНК HSP70 та HSP90 зростав у 9 (від (0.179 ± 0.008) · 10^-7 до (1.58 ± 0.07) · 10^-7 молекул/мкл) та 1.6 рази від (5.59 ± 0.27) · 10^-6 до (9.18 ± 0.45) 10^-6 молекул/мкл) відповідно у порівнянні з контролем (Р < 0.05, n = 6). Ми спостерігали індукуючий ефект ішемії-реперфузії на експресію генів Bcl2 та HIF-3alpha в тканині міокарда. Рівень мРНК генів зростав у 4.4 (від 6.94 ± 1.32 до 30.42 ± 2.54 у. о.) та у 2.5 рази (від 0.057 ± 0.007 до 0.14 ± 0.009 у. о.) для Bcl2 та HIF-3alpha відповідно (Р < 0.05) (Рис. 6). За даних умов експресія гену FRAP практично не змінювалась, рівень мРНК гену становив 4.98 ± 1.5 та 5.76 ± 1.7 у. о. в контролі та після ішемії-реперфузії відповідно.

Проведення кореляційного аналізу взаємозв'язку між експресією генів та розміром некротичної ділянки міокарда при ішемії-реперфузії in vivo показало, що існує негативна кореляція між експресією мРНК HSP70 та об'ємом некротизованого міокарда (r = - 0.75, P < 0.05). Аналогічні дані отримано і при аналізі кореляційного зв'язку із експресією мРНК HSP90, проте ці дані не були вірогідними (r = - 0.45, P > 0.05). Це свідчить про те, що чим більше є рівень експресії вказаних білків теплового шоку, тим менша кількість кардіоміоцитів гине шляхом некрозу протягом ішемії-реперфузії, та, навпаки, чим менший рівень експресії, тим більша некротична зона.

Досить суттєвий позитивний кореляційний зв'язок спостерігається при аналізі експресії мРНК HIF-3alpha та розміру некротичної ділянки - r = 0.70 (P > 0.05). Це свідчить про те, що встановлені зміни експресії HIF-3alpha не впливають на резистентність клітин серця до ішемічно-реперфузійного ушкодження, навіть, навпаки, підвищення експресії цього гену може впливати на збільшення некротичної ділянки серця. Контроверсійний по відношенню до інших членів родини білків HIF ефект HIF-3alpha [Shuntaro H. et al., 2001] добре узгоджується з отримними нами даними для клітин серця. Позитивний кореляційний зв'язок також спостерігається при аналізі взаємовідношення між експресією мРНК FRAP та об'ємом некротизованого міокарда при ішемії-реперфузії (r = 0.60, P > 0.05). Здатність білкового продукту вказаного гену пригнічувати аутофагію в кардіоміоцитах [Yan L. et al., 2005] дозволяє припустити, що пригнічення аутофагічних процесів збільшує вразливість міокарда до ішемічного ушкодження та підтверджує отримані раніше дані про протективне значення аутофагії при моделюванні аноксії-реоксигенації та ішемії-реперфузії [Dosenko V. E. et al., 2006; Gustafsson B. et al., 2008].

ВИСНОВКИ

Сучасними роботами в галузі патофізіології та молекулярної біології доведено, що генетичні фактори можуть грати значну роль в патогенезі ішемічного пошкодження серця. У дисертації наведені теоретичне узагальнення та нові дані про зміни експресії генів, що приймають участь в регуляції запрограмованих типів клітинної смерті (апоптозі, аутофагії), а також значення цих генетичних факторів в механізмах кардіопротекції.

1. Визначені зміни експресії генів, які беруть участь в загибелі кардіоміоцитів шляхом некрозу, апоптозу та аутофагії при аноксії-реоксигенації неонатальних кардіоміоцитів в культурі, а також при розвитку явищ пре- та посткондиціонування. Одночасно досліджені механізми загибелі неонатальних клітин серця в культурі.

2. Доведено, що експресія генів HSP70, HSP90, Bcl2, FRAP та HIF-3alpha в культурі неонатальних кардіоміоцитів через 30 хв аноксії та 24 год реоксигенації змінюється різноспрямовано: спостерігається виражена індукція генів білків теплового шоку (рівень мРНК HSP70 зростає у 4.4. рази, а HSP90 - у 38 разів), в той час як експресія HIF-3alpha значно знижується, а рівень мРНК Bcl2 та FRAP залишається незмінним.

3. Встановлено, що відтворення ішемії-реперфузії в дослідах in vivo також спричинювало вірогідне збільшення експресії генів теплового шоку (мРНК HSP70 зростав у 9 разів, мРНК HSP90 - в 1.6 рази), експресія генів HIF-3alpha та Bcl2 також збільшувалася у 2.5 рази та в 4.4 рази відповідно, тоді як експресія гену FRAP, так само як і в культурі кардіоміоцитів, не змінювалась.

4. Вперше розроблено методику пізнього ішемічного та фармакологічного пре- та посткондиціонування неонатальних кардіоміоцитів в культурі. Цитопротективний ефект віддаленого фармакологічного прекондиціонування із застосуванням інгібітору протеасоми реалізується за рахунок попередження загибелі клітин шляхом апоптозу та некрозу (зменшення кількості апоптотичних та некротичних клітин у 1.5 рази та на 2 % відповідно), що супроводжується збільшенням експресії білку теплового шоку HSP70 у 2 рази.

5. Вперше показані суттєві відмінності в механізмах кардіопротекції при пізньому пре- та посткондиціонуванні. Цитопротективний ефект пізнього ішемічного прекондиціонування реалізується за рахунок попередження апоптотичної загибелі кардіоміоцитів (зменшення апоптотичної популяції у 1.4 рази) в культурі при першому епізоді аноксії-реоксигенації і при повторному епізоді за рахунок зменшення кількості некротичних клітин (на 6 %). В той же час ішемічне посткондиціонування у віддаленому періоді (через 24 години) не виявляє цитопротективної дії, тобто не захищає культуру кардіоміоцитів від повторної дії аноксії-реоксигенації.

6. Встановлено, що на відміну від ішемічного прекондиціонування, при посткондиціонуванні, яке не спричинювало захисного ефекту, спостерігається відміна індукованої аноксією-реоксигенацією гіперекспресії білків теплового шоку та підвищення експресії гену Bcl2.

7. Показано зворотний кореляційний зв'язок між інтенсивністю експресії гену HSP70 та розміром некротичної ділянки при ішемії-реперфузії міокарда in vivo у щурів: чим більша була експресія гену HSP70, тим меньшим був розмір некротичної ділянки (r = -0.74, P < 0.05). Аналогічний, але менш виражений негативний зв'язок спостерігався між експресією гену HSP90 та розміром ішемічного ураження міокарду.

8. Отримані дані розширюють уявлення про генетичні механізми ішемічного ушкодження міокарда та адаптаційні зміни експресії генів (в першу чергу, білків теплового шоку) та створюють підгрунтя для розробки нових методів кардіопротекції, зокрема із застосуванням інгібіторів протеасоми.

ЛІТЕРАТУРА

1. Повторна аноксія-реоксигенація культивованих неонатальних кардіоміоцитів не спричинює апоптотичну клітинну смерть / О.В. Сурова, В.Є. Досенко, В.С. Нагібін, Л.В. Тумановська, О.О. Мойбенко // Фізіологічний журнал. - 2009. - № 1. - С. 19 - 26 (Дисертант самостійно провів експериментальні дослідження та статистичну обробку отриманих результатів дослідження).

2. Effects of late postconditioning on gene expression and cell death in neonatal rat cardiomyocyte cultures / O. V. Surovaya, V. E. Dosenko, V. S. Nagibin, L. Tumanovskaya, A. Moibenko // Pathophysiology. - 2009. - Vol. 16, № 1 - P. 47 - 52 (Дисертант самостійно зробив огляд літератури, експериментальні дослідження та підбір методик).

3. Effect of low dose of proteasome inhibitor on cell death and gene expression in neonatal rat cardiomyocyte cultures exposed to anoxia-reoxygenation / Olga V. Surova, Vasyl S. Nagibin, Lesya V. Tumanovskaya, Victor E Dosenko, Alexey A Moibenko // Experimental and Clinical Cardiology. - 2009. - Vol. 14, № 2 - P. 57 - 61 (Дисертант самостійно провів експериментальні дослідження та здійснив статистичну обробку отриманих даних).

4. Заглушення гена ALOX5 із застосуванням малих інтерферуючих РНК запобігає некротичній загибелі неонатальних кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації/ О.О. Лісовий, В.С. Нагібін, О.В. Сурова, Л.В. Тумановська, В.Є. Досенко, О.О. Мойбенко // Фізіологічний журнал. - 2009. - № 3. - С. 37 - 44 (Дисертант самостійно зробив підбір методик та статистичну обробку отриманих даних).

5. O. Surova, V. Dosenko, A. Moybenko. Investigation of cardioprotective genes expression in cardiac cells under anoxia-reoxygenation and late postconditioning: Abstracts of XXVIII European Section Meeting of the International Society for Heart Research, 28 - 31 May 2008, Athens. - 2008. - P. 739.

6. L. Tumanovska, V. Nagibin, V. Dosenko, O. Surova, O. Moibenko. Changes of isolated cardiomyocytes ultrastructure at modeling of endoplasmic reticulum stress: Abstracts of 8^th Meeting of France - New EU Members 16^th JMRC Symposium „New frontieries in cardiovascular research”, 5 - 7 June 2008, Krakow. - 2008. - P. 69.

7. D. Pashevin, V. Dosenko, Y. Byts, O. Surovaya, A. Moibenko. Changes of proteasomal activity in heart tissue, aorta and leukocytes of blood in cholesterol-induced atherosclerosis modelling: Abstracts of Russian-Norwegian scientific symposium “Defence of myocardium: molecular, pathological and clinical aspects”, 12 - 13 May 2008, Saint-Petersburg. - 2008. - P. 24 - 25.

8. O. Surovaya, Viktor. Dosenko, V. Nagibin, A. Moybenko. Effect of proteasomal inhibitor low dose on cell death and genes expression in isolated neonatal cardiomyocytes culture: Abstracts of 16th Euroconference on Apoptosis - 5th Swiss Conference on Apoptosis, 6 -9 September 2008, Bern. - 2008. - P.158.