Вивчення гепатопротекторної активності водного екстракту листків кукурудзи

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Національний фармацевтичний університет

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

14.03.05 - фармакологія

Вивчення гепатопротекторної активності водного екстракту листків кукурудзи

Кононенко Алевтина Геннадіївна

Харків - 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біології, фізіології та анатомії людини Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України, м. Харків

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Малоштан Людмила Миколаївна Національний фармацевтичний університет МОЗ України, м. Харків, завідувач кафедри біології, фізіології та анатомії людини

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Риженко Ірина Михайлівна Національний фармацевтичний університет МОЗ України, м. Харків, професор кафедри фармакології

кандидат фармацевтичних наук, доцент Сирова Ганна Олегівна Харківський національний медичний університет, МОЗ України, м. Харків, завідувач кафедри медичної та біоорганічної хімії

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор фармацевтичних наук, професор В.А. Георгіянц

Анотація

гепатопротектор екстракт листок кукурудза

Кононенко А.Г. Вичення гепатопротекторної активності водного екстракту листків кукурудзи - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Національний фармацевтичний університет, Харків, 2010.

Дисертація присвячена вивченню фармакологічних властивостей водного екстракту листків кукурудзи. Встановлено, що в дозі 50 мг/кг досліджуваний екстракт чинить виразну антиоксидантну, антицитолітичну, мембранопротекторну, протизапальну, жовчогінну та гіполіпідемічну дії.

Доведена виражена гепатопротекторна активність водного екстракту листків кукурудзи на моделях гострого тетрахлорметанового, субхронічного алкогольного та хронічного тетрахлорметанового гепатиту. Досліджуваний екстракт в дозі 50 мг/кг чинить виразний гепатозахисний ефект, що віддзеркалюється стабілізацією мембран гепатоцитів, відновленні функції антиоксидантної системи, зменшенні проявів цитолітичного синдрому, нормалізації білоксинтезуючої, детоксикуючої та зовнішньосекреторної функції печінки.

Результати з вивчення гострої токсичності водного екстракту листків кукурудзи дозволили віднести його до класу практично нешкідливих сполук. Встановлено, що досліджуваний екстракт в дозі 50 мг/кг не чинить ульцерогенной дії та не впливає на рухову активність шлунково-кишкового тракту.

Ключові слова: водний екстракт листків кукурудзи, поліфенольні сполуки, гепатопротекторна активність, антиоксидантні властивості, перекисне окиснення ліпідів, гепатит.

Аннотация

Кононенко А.Г. Изучение гепатопротекторной активности водного экстракта листьев кукурузы - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2010.

Исследование посвящено изучению гепатопротекторной активности водного экстракта листьев кукурузы (ВЭЛК) и экспериментальному обоснованию его применения в терапии заболеваний гепатобилиарной системы.

Показано, что ВЭЛК проявляет выраженные антиокислительные свойства в системе in vitro и in vivo. При изучении антиоксидантных и антицитолитических свойств исследуемого экстракта на модели острого тетрахлорметанового гепатита была определена ее условноэффективная доза - 50мг/кг. Установлено, что по уровню выраженности антиоксидантного и антицитолитического действия исследуемый экстракт превосходит препарат сравнения силибор.

Результаты исследования мембранопротекторных свойств ВЭЛК на модели спонтанного перекисного гемолиза мембран эритроцитов подтверждают его способность снижать продукты ПОЛ и гиперферментию АлАТ в условиях острого тетрахлорметанового гепатита.

Изучение противовоспалительной активности ВЭЛК на моделях острого асептического воспаления свидетельствует о наличии антиэкссудативных свойств у исследуемой субстанции. На моделях каррагенинового отека антиэкссудативный эффект составлял 35,93%, формалинового - 39,45%, зимозанового - 44,24%. Показано, что по степени выраженности противовоспалительной активности на модели острого зимозанового отека исследуемый экстракт превосходил препарат сравнения кверцетин в 1,8 раза и не уступал препарату сравнения диклофенаку натрию на модели формалинового отека. Противовоспалительный эффект ВЭЛК обусловлен наличием антиоксидантных, мембранопротекторных свойств, а также антилипооксигеназной активностью.

Результаты исследования влияния ВЭЛК на желчевыделительную функцию печени у интактных животных показали умеренное желчегонное действие последнего.

На модели экспериментальной гиперлипидемии показано гиполипидемическое действие исследуемого экстракта, что проявлялось положительными изменениями со стороны показателей, характеризующих липидный обмен (общие липиды, общий холестерин, триглицериды и липопротеиды низкой плотности) и оксидативный баланс.

В условиях экспериментальных патологий печени с острым, подострым и хроническим течением, вызванных введением тетрахлорметана и этанола, установлено, что исследуемый экстракт в дозе 50мг/кг оказывает выраженный гепатозащитный эффект, что проявляется стабилизацией мембран гепатоцитов, восстановлением функции антиоксидантной системы, уменшеннием проявлений цитолитического синдрома, нормализацией белоксинтезирующейї, детоксикующей и внешнесекреторной функции печени.

Установлено, что в условиях острого тетрахлорметанового, подострого алкогольного и хронического тетрахлорметанового гепатитов ВЭЛК по выраженности гепатопротекторного действия не уступает препарату сравнения силибору.

Полученные результаты подтверждены данными изучения морфофункционального состояния печени под действием ВЭЛК.

Результаты по изучению острой токсичности ВЭЛК при однократном внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении позволили отнести исследуемый экстракт к классу практически безвредных веществ. Установлено, также, что исследуемый экстракт не оказывает ульцерогенного действия и не влияет на двигательную активность желудочно-кишечного тракта.

Полученные данные служат экспериментальным обоснованием терапевтической эффективности водного экстракта листьев кукурузы при воспалительных заболеваниях печени, в частности гепатитов.

Ключевые слова: водный экстракт листьев кукурузы, полифенольные соединения, гепатопротекторная активность, антиоксидантные свойства, перекисное окисление липидов, гепатит.

Summary

Kononenko A.G. The study of hepatoprotective activity of the corn leaves aqueous extract - Manuscript.

Thesis for scientific degree of the candidate of pharmaceutical sciences in speciality 14.03.05 - pharmacology. - National university of pharmacy, Kharkiv, 2010.

Thesis deals with the pharmacological properties of aqueous extract of corn leaves. It has been determined that the investigated extract has a wide spectrum of pharmacologic activity in a dose of 50 mg/kg. It has been proved, that aqueous extract of corn leaves has maked antioxidantive, anticytolitic, membrane-stabiliging, anti-inflammatory, choleretic and hypoliposic actions.

Specific activity of aqueous extract of corn leaves has been studied on the acute, subchronic and chronic toxic hepatitises. It has been determined that aqueous extract of corn leaves in 50 mg/kg dose excert maked hepatoprotective properties. They stabilizer membranes of hepatocytes, normalize function of antioxidant system, proteins synthesis, detoxic function, inhibit the processes of lipids peroxide oxidation, decrease cytolyses process.

Studying the acute toxicity parameters of aqueous extract of corn leaves allowed to attribute the investigated substance to practically harmless substances class according to Sidorov K.K. classification. It has been determined, that investigated extract in 50 mg/kg dose hasn't any ulcerogenic action.

Key words: aqueous extract of corn leaves, polyphenolic compounds, hepatoprotective activity, antioxidative properties, lipids peroxide oxidation, hepatitis.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Згідно даних МОЗ України за останні 20 років у всьому світі простежується чітка тенденція до росту чисельності захворювань печінки, що обумовлюють високу смертність населення. Сьогодні у світі кількість хворих з різноманітною гепатобіліарною патологією перевищує 2 млрд. людей. Тільки в країнах СНД щорічно реєструється від 500 тис. до 1 млн. людей, що страждають тим чи іншим захворюванням печінки. В Україні за останні 10 років відзначається суттєве підвищення чисельності людей з захворюваннями гепатобіліарної системи (ГБС), серед яких на першому місці знаходяться інфекційні гепатити, а друге місце посідають токсичні ураження печінки (Ткач С.М., 2009).

Ріст захворюваності населення пов'язують з несприятливою екологічною ситуацією, неправильним харчуванням, а також токсичними, лікарськими та алергічними ураженнями органів травлення. Порушення функції ГБС можуть розвиватися під дією чинників інфекційної природи, токсичних речовин екзогенного та ендогенного походження, радіації, гіпоксії, при розладах системної та реґіонарної гемодинаміки (Подымова С.Д., 2005; Ивашкин В.Т., 2007; Байкова И.Е., 2009).

Незважаючи на значні успіхи у вивченні патогенезу гепатитів проблема їх лікування до тепер остаточно не вирішена.

На даний час для фармакотерапії та профілактики захворювань ГБС використовують різні групи лікарських препаратів: антиоксиданти, жовчогінні, вітамінні препарати, стероїдні та нестероїдні анаболічні засоби, імуномодулятори, протизапальні препарати стероїдної та нестероїдної природи, дезінтоксикаційні, індуктори ферментних систем, замісники живлення, препарати, які покращують обмін речовин, тощо (Харченко Н.В., 2001; Подымова С.Д., 2004).

Патогенетично обґрунтованим у фармакотерапії гепатитів є використання так званих гепатопротекторів, що підвищують резистентність гепатоцитів до патологічних впливів, посилюють їх детоксикуючу функцію та сприяють відновленню порушених функцій. Дія гепатопротекторів спрямована на відновлення гомеостазу в печінці, нормалізацію її функціональної активності та стимуляцію процесів регенерації (Бабак О.Я., 2008; Буеверов А.О., 2009; Звягинцева Т.Д., 2009).

В той же час лікарські препарати з групи гепатопротекторів не позбавлені побічної дії. Так, критичний аналіз з точки зору доказової медицини свідчить, що більшість уявлень відносно ефективності та безпеки відомих гепатопротекторів застарілі. Будь-якого ідеального гепатопротектора до теперішнього часу не існує (Ткач С.М., 2009).

Враховуючи тенденцію хвороб печінки до хронізації та труднощі у виборі препаратів при тяжких порушеннях функції органу, адекватну фармакологічну корекцію патологічного процесу можуть забезпечити лише препарати, які поряд з вираженим терапевтичним ефектом не виявляли б негативного впливу на печінку та організм в цілому при тривалому вживанні.

Усім цим вимогам відповідають фітопрепарати, важливими особливостями яких є широкий діапазон терапевтичних доз, здатність активно впливати на уражені мембранно-клітинні структури і метаболічні процеси, висока біодоступність, м'яка дія на організм і фізіологічна корекція порушених функцій, низькі токсичність та алергенність і у багатьох випадках - ціна. Враховуючи вищезазначене, актуальним є використання для створення вітчизняного гепатопротектора листків кукурудзи, які містять поліфенольні сполуки, амінокислоти та інші біологічно активні речовини (БАР), що забезпечують гепатопротекторну дію.

Зв'язок роботи з науковими роботами, планами, темами. Робота виконана у рамках науково-дослідної програми Національного фармацевтичного університету з проблеми МОЗ України “Фармакологічне дослідження біологічно активних речовин та лікарських засобів синтетичного та рослинного походження та їх застосування в медичній практиці” (№ державної реєстрації 0103U000478).

Мета та завдання дослідження. Метою даного дослідження стало експериментальне обґрунтування можливості застосування водного екстракту листків кукурудзи як гепатопротектора при токсичних ураженнях печінки.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1. Вивчити антиоксидантні властивості водного екстракту листків кукурудзи в системах in vitro та in vivo.

2. Дослідити мембранопротекторні властивості водного екстракту листків кукурудзи.

3. Вивчити протизапальні властивості водного екстракту листків кукурудзи на моделях гострого ексудативного запалення, викликаного різними флогогенами: карагеніном, формаліном та зимозаном.

4. Вивчити жовчогінну та гіполіпідемічну дію водного екстракту листків кукурудзи.

5. З'ясувати ефективність водного екстракту листків кукурудзи на експериментальних моделях ураження печінки: гострого тетрахлорметанового, субхронічного етанолового та хронічного тетрахлорметанового гепатитів.

6. Вивчити гостру токсичність, можливу ульцерогенну дію та вплив на моторику шлунково-кишкового тракту водного екстракту листків кукурудзи.

Об'єкт дослідження - фармакологічна активність водного екстракту листків кукурудзи (ВЕЛК).

Предмет дослідження - гепатопротекторна активність ВЕЛК при ураженнях печінки.

Методи дослідження. В ході виконання дисертаційної роботи були використані фармакологічні, біохімічні, токсикологічні, гістологічні та статистичні методи дослідження.

Наукова новизна. Вперше проведений комплекс фармакологічних досліджень ВЕЛК, за результатами яких встановлено наявність у нього вираженої антиоксидантної, мембраностабілізуючої, протизапальної, жовчогінної, гіполіпідемічної, гепатопротекторної активності.

Показано, що в умовах експериментального ураження печінки з різним характером перебігу (гострим, субхронічним, хронічним) ВЕЛК виявляє виразну гепатозахисну дію, що характеризується пригніченням процесів вільнорадикального окиснення, обмеженням цитолізу, поліпшенням функціонального стану печінки та перевищує за цими показниками препарат порівняння силібор. Фармакологічні дослідження підтверджені гістологічними даними, щодо впливу досліджуваного екстракту на стан печінки.

Встановлено, що ВЕЛК відноситься до класу практично нешкідливих речовин і не чинить негативного впливу на функцію шлунково-кишкового тракту.

Наукова новизна роботи підтверджена патентом на винахід №86502 від 27.04.2009р «Спосіб одержання комплексу біологічно активних речовин з антиоксидантною та протизапальною дією».

Практичне значення роботи. Отримані дані дозволяють пропонувати ВЕЛК в якості потенційного гепатопротекторного засобу та можуть бути використані при експериментальному обґрунтуванні ефективності застосування препаратів на його основі для лікування та профілактики захворювань ГБС з холестатичними ускладненнями.

За результатами експериментальних досліджень виданий інформаційний лист «Використання субстанції рослинного походження водного екстракту листків кукурудзи для розробки лікарського засобу гепатопротекторної дії» № 252 - 2009.

Матеріали досліджень впроваджені в навчальний процес у вищих навчальних закладах України III та IV рівня акредитації: Луганському державному медичному університеті на кафедрі фармакології, Буковинському державному медичному університеті на кафедрі фармакології та використовуються у науково-дослідній роботі в Інституті проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України в лабораторії експериментальної фармакології та токсикології.

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником визначені мета та завдання роботи, розроблені методичні підходи до вивчення гепатопротекторної дії ВЕЛК. Здобувачем особисто проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз даних літератури, експериментальні дослідження, статистична обробка, аналіз та систематизація отриманих результатів, сформульовані висновки дисертаційної роботи, оформлені таблиці та рисунки, підготовлені до друку наукові праці.

Апробація роботи. Матеріали роботи викладалися та обговорювалися на: ІІ Міжнародній науковій конференції молодих вчених-медиків (Росія, м. Курськ, 2008), Всеукраїнському конгресі «Сьогодення та майбутнє фармації» (м. Харків, 2008), VIII Всеукраїнській науково-практичній конференції за участю міжнародних спеціалістів «Клінічна фармація в Україні» (м. Харків, 2008), XXVI науково-практичній конференції з міжнародною участю «Ліки - людині. Сучасні проблеми створення, дослідження та апробації лікарських засобів» (м. Харків, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових праць: 4 статті у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 6 тез доповідей, 1 інформаційний лист, отримано 1 патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 3-х розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення експериментальних даних, загальних висновків та переліку використаної літератури. Робота викладена на 149 сторінках друкованого тексту, має 15 рисунків, 23 таблиці. В роботі використано 278 джерел літератури, з них 188 - кирилицею та 90 - латиницею.

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Об'єктом експериментальних досліджень став висушений ВЕЛК, отриманий на кафедрі фармакогнозії під керівництвом професора Ковальова В.М. До складу екстракту входить комплекс біологічно активних речовин, представлений, головним чином, поліфенолами, а також моно- та полісахаридами, амінокислотами, білками, сапонінами та органічними кислотами.

У дослідах використано 360 стандартизованих тварин: 297 нелінійних білих щурів, 64 нелінійних білих мишей, які вирощувались у віварії ЦНДЛ НФаУ та утримувались в однакових умовах на збалансованому харчуванні згідно з санітарно-гігієнічними нормами та вимогами GLP. Всі експериментальні дослідження виконували у повній відповідності з «Загальними етичними принципами експериментів на тваринах» (Україна, 2001), що узгоджуються з положеннями «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985).

Експериментальне вивчення ВЕЛК як гепатопротекторного засобу було проведено згідно з методичними рекомендаціями Державного фармакологічного центру МОЗ України (2001) та включало три етапи досліджень:

- вивчення фармакологічної активності ВЕЛК (антиоксидантної, мембраностабілізуючої, протизапальної, жовчогінної, гіполіпідемічної);

- вивчення гепатопротекторної дії ВЕЛК на моделях токсичних гепатитів з гострим, субхронічним та хронічним перебігом;

- вивчення токсикологічних властивостей ВЕЛК.

На етапі скринінгових досліджень проведено вивчення антиокислювальних властивостей ВЕЛК в системі in vitro в концентраціях 0,5мг/г, 1мг/г та 2мг/г тканини печінки на моделі спонтанного перекисного окиснення ліпідів ( Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972).

З метою визначення умовноефективної дози ВЕЛК проведені скринінгові дослідження антиоксидантної та антицитолітичної активності екстракту в системі in vivo в дозах 25мг/кг, 50мг/кг та 100мг/кг на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту у щурів (Стефанов О.В., 2001).

Для підтвердження мембранопротекторної дії досліджуваного екстракту вивчали його вплив на процес спонтанної перекисної деструкції мембран еритроцитів за методом F.C. Jager (Вороніна Л.М. зі співавт., 1996) в порівнянні з силібором в дозі 25 мг/кг (ЕД₃₀).

Протизапальну активність ВЕЛК досліджували на моделях гострого карагенінового та зимозанового набряків у щурів, а також на моделі гострого формалінового набряку у мишей. В якості референс-препаратів використовували диклофенак натрію в дозі 8мг/кг та кверцетин в дозі 50мг/кг (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001).

Жовчогінну дію ВЕЛК вивчали на інтактних щурах за методикою Н.П. Скакуна та А.М. Олійник (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001) в порівнянні з жовчогінним засобом рослинного походження фламіном в дозі 500 мг/кг за наступними показниками: швидкість секреції жовчі (ШСЖ), вмістом жовчних кислот (ЖК) та холестеролу, значенням холато-холестеринового коефіцієнту (ХХК).

На моделі експериментальної гіперліпідемії у щурів визначили наявність гіполіпідемічної дії у ВЕЛК (Хабриев Р.У., 2005). В якості референс-препаратів використовували силібор в дозі 25 мг/кг та б-токоферол в дозі 50 мг/кг.

Гепатопротекторну активність ВЕЛК в дозі 50мг/кг вивчали на моделях гострого та хронічного гепатитів, викликаних тетрахлорметаном та на моделі субхронічного гепатиту, викликаного етанолом (Стефанов О.В., 2001). Препаратом порівняння був обраний силібор в дозі 25мг/кг.

В умовах уражень печінки, індукованих токсичними агентами, визначали масовий коефіцієнт печінки (МКП), оцінювали інтенсивність вільнорадикального окиснення за рівнем ТБК-реактантів, дієнових кон'югатів (ДК) (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977); стан антиоксидантної системи (АОС) за вмістом відновленого глутатіону (GSH) (Beutler E.D. еt al., 1963) та активністю каталази у гомогенатах печінки (Королюк М.А., 1988). Активність метаболічних процесів у печінці визначали за рівнем глікогену за методом Прохорової С.А. (1995). У сироватці крові визначали показники функціонального стану печінки: активність аланінамінотрансферази (АлАТ), лужної фосфатази (ЛФ), гама-глутамілтрансферази (г-ГТП), вміст загального білка, сечовини, рівень загальних ліпідів, вміст холестеролу за допомогою діагностичних наборів виробництва «Lachema» (Чехія). Зовнішньосекреторну функцію печінки оцінювали за ШСЖ (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001) та вмістом холатів і холестеролу в жовчі експериментальних тварин (В.П. Мірошниченко зі співавт., 1978).

Гістологічне вивчення зразків тканини печінки на моделі хронічного тетрахлорметанового гепатиту у щурів виконане за загальноприйнятими методиками світлової мікроскопії (Г.А. Меркулов, 1969, В.В. Соколовский, 1971).

Вивчення гострої токсичності з розрахунком середньосмертельних доз (ЛД₅₀) при внутрішньошлунковому та внутрішньоочеревинному введенні проводили за методом Пастушенко Т.В. зі співавт. (1978) на мишах та щурах. Клас токсичності визначали за класифікацією Сидорова К.К. (1973).

Вплив ВЕЛК на стан слизової оболонки шлунка вивчали за методом Андрєєвої Н.І. та Шарової С.Д. (1978). Вплив досліджуваного екстракту на рухову активність шлунково-кишкового тракту вивчали методом Sticknay I.S. et al. (1951).

Статистичну обробку результатів проводили методами параметричної та непараметричної статистики (Іванов Ю.И., Погорелюк Р.Н., 1990; Лапач С.М. зі співавт., 2001) за допомогою стандартного пакету програм «Statistica 6.0».

Результати досліджень та їх обговорення. Першим етапом вивчення ВЕЛК було скринінгове дослідження його антиоксидантних та антицитолітичних властивостей в умовах in vitro та in vivo з метою визначення умовноефективної дози та його впливу на перебіг процесів перекисного окиснення. В результаті дослідження було встановлено, що в усіх досліджуваних концентраціях (0,5мг/г, 1мг/г та 2мг/г) він виявляє антиокиснювальні властивості та чинить виразний гальмівний вплив на перебіг процесів ПОЛ в системі in vitro. Показано, що у співставлюваних концентраціях досліджуваний екстракт перевищує антиокисний ефект класичного фенольного антиоксиданту - б-токоферолу (рис. 1).

Рис. 1. Антиокислювальна активність ВЕЛК

Примітки:

* - розбіжність достовірна відносно контролю (p?0,05);

** - розбіжність достовірна відносно препарату порівняння (p?0,05).

На моделі гострого тетрахлорметанового ураження печінки були підтверджені антиоксидантні властивості ВЕЛК. Досліджуваний екстракт у дозах 50 та 100 мг/кг пригнічував процеси ПОЛ у мембранах гепатоцитів та знижував прояви цитолітичного синдрому. Аналіз отриманих даних дозволив визначити умовноефективну дозу ВЕЛК за антиоксидантною та антицитолітичною активністю, яка становила 50 мг/кг (антиоксидантна активність - 84,14%, антицитолітична - 72,04%). Подальше збільшення дози не призводило до посилення ефекту. Досліджуваний екстракт у дозі 50 мг/кг в умовах гострого тетрахлорметанового гепатиту за антиоксидантною активністю перевищує референс-препарат - силібор у дозі 25 мг/кг на 37 % і за антицитолітичною активністю - на 15%.

Від ступеню ураження мембранного апарату клітин залежить виразність деструктивно-запальних змін у печінці. На моделі спонтанного гемолізу еритроцитів були підтверджені виражені мембраностабілізуючіі властивості ВЕЛК. Встановлено, що за виразністю мембраностабілізуючої дії досліджуваний екстракт дещо перевищує ефект препарату порівняння - силібору в дозі 25 мг/кг.

В патогенезі захворювань печінки важливе місце належить запальному процесу. За даними літератури відомо, що рослинним поліфенольним сполукам притаманна здатність усувати такі ознаки запалення, як ексудацію. Це пов'язано з їх антиоксидантними та мембраностабілізуючими властивостями, а також впливом на медіатори запалення.

Рис. 2. Протизапальна активність ВЕЛК на моделях гострого ексудативного запалення, викликаного різними флогогенами

Примітки:

* - розбіжність достовірна відносно контролю (p?0,05);

** - розбіжність достовірна відносно препарату порівняння (p?0,05).

Тому нами вивчалась протизапальна активність ВЕЛК на моделях гострого асептичного запалення, викликаного дією різних флогогенів: карагеніну, зимозану, формаліну (рис. 2). На моделі гострого карагенінового запалення стопи у щурів досліджуваний екстракт в дозі 50 мг/кг виявляв помірний антиексудативний ефект, зменшуючи через 3 години (пік запалення) ступінь набряку, викликаного введенням карагеніну, на 35,93%. За виразністю антиексудативного ефекту він поступався препарату порівняння - «золотому стандарту» НПЗП - диклофенаку натрію в дозі 8мг/кг на 20,39%.

На моделі формалінового набряку стопи у мишей ВЕЛК виявляв виразну протизапальну дію, зменшуючи об'єм ураженої кінцівки на 39,45%, та не поступався за антиексудативним ефектом препарату порівняння диклофенаку натрію в дозі 8 мг/кг (37,16%).

В умовах гострого зимозанового запалення досліджуваний екстракт чинив виразну протизапальну дію, яка складала 44,24%, що була в 1,8 рази вище за препарат порівняння кверцетин в дозі 50мг/кг (рис. 2).

Таким чином, отримані результати дослідження свідчать, що антиексудативний ефект ВЕЛК обумовлений впливом на медіатори запалення, що у свою чергу, ймовірно, пояснюється переважно поліфенольним складом екстракту та його антиоксидантними властивостями.

Відомо, що гепатопротекторний ефект є багатокомпонентним та складається з комплексу різнонаправлених активностей, серед яких і жовчогінна дія.

Дослідження впливу ВЕЛК на жовчовидільну функцію печінки у інтактних тварин показало, що його застосування призвело до посилення продукції та секреції жовчі гепатоцитами на 13% в порівнянні з контрольною групою. Проте вміст ЖК, холестеролу та значення ХХК під дією ВЕЛК залишалися в межах показників контрольної групи. За виразністю жовчогінної дії досліджуваний екстракт поступався препарату порівняння фламіну, який підсилював секрецію жовчі на 35%, але в дозі 500 мг/кг. Таким чином, отримані дані свідчать про помірну жовчогінну активність ВЕЛК в дозі 50 мг/кг.

Печінка відіграє виключну роль в обміні ліпідів, порушення якого має негативний вплив на стан серцево-судинної системи. Дані літератури свідчать про важливу роль рослинних поліфенолів у забезпеченні антиоксидантного захисту транспортних ліпопротеїдів від аномального ліпопереокиснення.

Проведені дослідження по вивченню гіполіпідемічної дії ВЕЛК показали, що введення щурам з експериментальною гіперліпідемією досліджуваного екстракту в дозі 50 мг/кг призвело до позитивних змін з боку показників, що характеризують ліпідний обмін та оксидативний баланс. Так, рівень загального холестерину (ЗХ) та загальних ліпідів (ЗЛ) у сироватці крові зменшувався порівняно з групою контрольної патології на 42 % та 41%, відповідно. Відмічалась нормалізація вмісту тригліцеридів та ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ), значення яких наближались до інтактного контролю. В той же час гіполіпідемічна дія силібору в дозі 25 мг/кг та б-токоферолу в дозі 50 мг/кг була менш виразною за такими показниками ліпідного обміну, як вміст ЗЛ, ЗХ та ЛПНЩ. Також, відзначалося достовірне зменшення вмісту ТБК-реактантів в 1,3 рази, повна нормалізація вмісту GSH та зниження до рівня інтактного контролю активності каталази. Отримані дані свідчать про виразнішу, ніж у силібору та б-токоферолу, корегуючу дію ВЕЛК на обмін ліпідів та процеси ПОЛ.

Вивченя гепатопротекторної активності ВЕЛК на моделі гострого тетрахлорметанового ураження печінки показало, що його застосування призвело до регресивних змін у розвитку патології. Останнє підтверджується відповідними змінами з боку функціонально-біохімічних показників. Так, активність АлАТ у сироватці крові знижувалась на 50,52%. За впливом на виразність цитолітичного синдрому досліджуваний екстракт не поступався препарату порівняння силібору, застосування якого позначилося зменшенням активності АлАТ на 42,27% (рис. 3).

Про зменшення патологічних проявів свідчило також достовірне зниження масового коефіцієнту печінки (МКП) під дією досліджуваних засобів.

Рис. 3. Вплив ВЕЛК на деякі функціонально-біохімічні показники печінки при гострому тетрахлорметановому гепатиті у щурів

Примітки:

* - розбіжність вірогідна щодо інтактного контролю (P?0,05);

** - розбіжність вірогідна щодо контрольної патології (P?0,05);

*** - розбіжність вірогідна щодо референс-препарату (P?0,05).

Зниження виразності некротичних та дистрофічних змін у печінковій паренхімі на тлі застосування досліджуваних засобів було обумовлене суттєвим пригніченням перекисних деструктивних процесів. Під впливом ВЕЛК відбувалося достовірне зменшення вмісту продуктів ПОЛ у тканині печінки піддослідних тварин. Так, рівень ДК знижувався на 17,5%, а ТБК- реактантів - на 48,4%.

Пригнічення процесів ліпопероксидації при застосуванні ВЕЛК відбувалося на тлі відновлення функціональної потужності АОС. При його застосуванні рівень GSH зростав у 2,5 рази, активність каталази у гомогенаті печінки щурів зменшувалась у 1,2 рази порівняно з групою контрольної патології.

Введення силібору також супроводжувалося зменшенням проявів синдрому пероксидації та нормалізацією стану АОС. Зміни з боку АОС, при застосуванні силібору, виявилися нормалізацією активності каталази та відновленням внутрішньоклітинного фонду GSH.

Зменшення проявів оксидативного дисбалансу і виразності синдрому цитолізу при застосуванні ВЕЛК та силібору супроводжувалося поліпшенням функціонального стану печінки.

Під дією ВЕЛК та силібору відбувалася нормалізація білоксинтетичної функції печінки. Так, рівень загального білка у сироватці крові щурів зростав на 19,75% та на 18,48%, відповідно. При використанні досліджуваного екстракту рівень сечовини при цьому знижувався в 1,5 рази, що свідчить про його спроможність позитивно впливати на детоксикуючу функцію печінки, на відміну від силі бору, який не чинив суттєвого впливу на сечовиноутворення.

Встановлено, що застосування ВЕЛК та препарату порівняння призвело до зростання ШСЖ: у 2,1 та 1,8 рази, відповідно. Одночасно відбувалася практично повна нормалізація вмісту у жовчі холатів та ХХК. В той же час, на тлі застосування досліджуваного екстракту та препарату порівняння не спостерігалося зменшення гіперферментемії г-ГТП та ЛФ, зміни активності яких є непрямим критерієм порушення жовчосекреторної функції.

Таким чином, в умовах гострого тетрахлорметанового гепатиту ВЕЛК в дозі 50 мг/кг виявляє виражені гепатопротекторні властивості та за дією не поступається препарату порівняння силібору. Терапевтичний ефект досліджуваного екстракту характеризується зменшенням виразності синдрому гіперліпопероксидації та цитолізу, а також позитивним впливом на більшість функціональних показників, що вивчалися.

Метою подальших досліджень специфічної активності ВЕЛК стало вивчення його гепатозахисної дії в умовах хронізації патологічного процесу.

Субхронічне токсичне ураження печінки у щурів викликали шляхом щоденного введення 40% етанолу протягом семи діб.

Застосування на тлі підгострого алкогольного ураження печінки ВЕЛК в дозі 50 мг/кг та силібору в дозі 25 мг/кг запобігало надмірній активації процесів ПОЛ, на що вказує достовірне зниження рівня ТБК-реактантів в 1,9 та 1,5 рази, відповідно в тканині печінки дослідних тварин (рис. 4). Це супроводжувалось зменшенням витрат ендогенних антиоксидантів та призводило до стимуляції АОС: рівень GSH підвищувався до значень, вищих, ніж у інтактних тварин, а активність ферменту АОС - каталази була в 1,86 разів нища, ніж у нелікованих, в той час як при застосуванні силібору вона зменшувалась лише в 1,29 рази.

Під впливом ВЕЛК та силібору відбувалося зменшення виразності цитолітичного синдрому, про що свідчить зниження активності АлАТ у сироватці крові дослідних тварин на 26,17% та 29,91%, відповідно.

Рис. 4. Вплив ВЕЛК на деякі біохімічні показники при субхронічному алкогольному гепатиті у щурів

Примітки:

* - розбіжність вірогідна щодо інтактного контролю (P?0,05);

** - розбіжність вірогідна щодо контрольної патології (P?0,05);

*** - розбіжність вірогідна щодо референс-препарату (P?0,05).

Введення ВЕЛК та силібору сприяло нормалізації вмісту загального білку та сечовини у сироватці крові.

Нами також було зафіксоване зменшення проявів холестатичного синдрому, про що свідчить зниження активності ЛФ та г-ГТП.

Таким чином, встановлено, що ВЕЛК виявляє виражену гепатопротекторну дію на тлі алкогольного субхронічного ураження печінки та не поступається за виразністю дії препарату порівняння силібору. Досліджуваний екстракт сприяв стабілізації мембран гепатоцитів, відновленню функції АОС, покращував білоксинтетичну, детоксикуючу та зовнішньосекреторну функцію печінки.

На моделі хронічного токсичного ураження печінки тетрахлорметаном введення ВЕЛК та силібору призводило до зменшення ступеня ураження гепатоцитів та попереджало загибель дослідних тварин.

Застосування ВЕЛК супроводжувалось зменшенням показника МКП на 21,83%, зниженням інтенсивності вільнорадикальних процесів (ТБК-реактантів у тканині печінки на 47%), підвищенням антиоксидантного захисту (GSH зростав на 49%), нормалізацією активності каталази (рис. 5).

Подібні зміни відбувалися і в організмі тварин, лікованих силібором, за винятком того, що рівень GSH підвищувався не так виразно (на 39,3%), а активність каталази суттєво не зменшувалась.

Деструкція мембранних ліпідів у щурів контрольної патології супроводжувалась цитолізом - підвищенням активності АлАТ. Ефективне зниження під впливом ВЕЛК і силібору гіперліпопероксидації корелює з усуненням ними цитолітичного синдрому на 46,53% і 40,59%, відповідно.



Рис. 5. Вплив ВЕЛК на деякі функціонально-біохімічні показники при хронічному тетрахлорметановому гепатиті у щурів

Примітки:

* - розбіжність вірогідна щодо інтактного контролю (P?0,05);

** - розбіжність вірогідна щодо контрольної патології (P?0,05);

*** - розбіжність вірогідна щодо референс-препарату (P?0,05).

Результатом такого впливу екстракту стало покращення білоксинтезуючої та глікогенутворюючої функцій печінки в порівнянні з контрольною патологією, про що свідчить підвищення рівня загального білка у сироватці крові та збільшення вмісту глікогену у тканині печінки. Зниження розпаду тканинних білків супроводжувалось зменшенням вмісту сечовини.

Вплив силібору на динаміку зазначених показників був співставлюваним за виразністю з показниками ВЕЛК.

Застосування ВЕЛК та силібору супроводжувалося зменшенням проявів холестатичного синдрому. Так, активність ЛФ під впливом досліджуваного екстракту зменшувалась на 29,97%, -ГТП - на 40,59%; під дією силібору - на 16,9% та 34,37% відповідно (рис. 5).

Нормалізація зовнішньосекреторної функції печінки під впливом ВЕЛК спостерігалася і за показниками ШСЖ та холатоутворення. За впливом на жовчосекреторну функцію ВЕЛК виявляв перевагу перед препаратом порівняння: ШСЖ під впливом досліджуваного екстракту зростала в 3,9 рази по відношенню до контрольної патології та в 1,5 рази по відношенню до тварин, лікованих силібором (рис. 5).

Таким чином, було встановлено, що в умовах хронічного тетрахлорметанового гепатиту, ВЕЛК в дозі 50 мг/кг чинить виразну гепатозахисну активність, що виявляється усуненням оксидативного дисбалансу та пригніченням процесів ліпопероксидації, зменшенням проявів цитолітичного синдрому, підвищенням антиоксидантного захисту організму щурів, а також нормалізацією білоксинтезуючої, глікогенутворюючої та жовчосекреторної функції печінки.

Результати гістологічних досліджень показали, що застосування ВЕЛК прискорювало етапи організації некрозу, зменшувало виразність жирової та білкової дистрофії, судинних розладів. Спостерігався виражений поліморфізм клітин та ядер, збільшення процесів мітозу, що відбувалось на тлі появи молодих клітин, які заміщали загиблі гепатоцити у проблемних зонах печінки. Препарат порівняння силібор за ефектом позитивного впливу на морфоструктуру органу-мішені поступався ВЕЛК.

Проведені дослідження по вивченню гострої токсичності ВЕЛК показали, що він відноситься до класу практично нешкідливих сполук за класифікацією К.К. Сидорова (ЛД₅₀ при внутрішньошлунковому введенні перевищує 20000мг/кг та при внутрішньоочеревинному - 5000 мг/кг).

Встановлено, що ВЕЛК не чинить ульцерогенної дії та не впливає на рухову активність шлунково-кишкового тракту.

Висновки

1. Показано, що ВЕЛК чинить виражену антиокислювальну дію в системі in vіtro і перевищує антиокислювальну активність Ь-токоферолу у концентрації 1мг/г.

2. В умовах in vivo ВЕЛК виявляє виразні антиоксидантні та антицитолітичні властивості. Встановлено умовноефективну дозу досліджуваного екстракту за антиоксидантною та антицитолітичною діями, що становить 50 мг/кг.

3. ВЕЛК в дозі 50 мг/кг чинить мембраностабілізуючу дію, яка за виразністю аналогічного ефекту перевищує препарат порівняння силібор.

4. Встановлено помірну протизапальну дію ВЕЛК в умовах гострого ексудативного запалення, викликаного карагеніном, і виразну протизапальну активність - на моделі формалінового та зимозанового набряків. Отримані дані свідчать, що протизапальний ефект досліджуваного екстракту обумовлений впливом на медіатори запалення та його антиоксидантними властивостями.

5. Встановлені помірна жовчогінна активність ВЕЛК на інтактних щурах та виражена гіполіпідемічна дія на моделі експериментальної гіперліпідемії у щурів.

6. Виражені гепатопротекторні властивості ВЕЛК в дозі 50 мг/кг обумовлені гальмуючим впливом на процеси ПОЛ, зменшенням виразності цитолітичних процесів та поліпшенням функціональної активності гепатоцитів в умовах гострого, субхронічного та хронічного гепатитів у щурів. За виразністю гепатозахисної дії досліджуваний екстракт перевищував препарат порівняння силібор.

7. За результатами гістологічного дослідження впливу ВЕЛК в дозі 50 мг/кг на архітектоніку тканини печінки в умовах хронічного тетрахлорметанового гепатиту встановлено виразний гепатопротекторний ефект, що проявилось в антинекротичній, антидистрофічній дії та прискоренні процесів фізіологічної регенерації гепатоцитів за виразністю яких досліджуваний екстракт перевищував силібор.

8. У дослідах з вивчення токсикологічних властивостей, проведених на щурах та мишах, встановлено, що ВЕЛК відноситься до класу практично нешкідливих сполук, не чинить подразнюючої дії на слизову оболонку шлунку, не впливає на перистальтику ШКТ.

9. Листки кукурудзи є перспективним та доступним джерелом БАР, що виявляють широкий спектр фармакологічної активності, та можуть бути використані для створення гепатопротекторного засобу комплексної дії.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Процеси перекисного окиснення ліпідів у експериментальних тварин при отруєнні та дії природних антиоксидантів / Л.М. Малоштан, Н.П. Субота, П.П. Пашинський, А.Г. Кононенко // Вісник фармації. - 2007. - № 1(49). - С. 73-75. (Особистий внесок: проведення експерименту, аналіз отриманих даних, підготовка статті).

2. Кононенко А.Г. Вплив сумарного водного екстракту листя кукурудзи на ексудативне запалення / А.Г. Кононенко, Л.М. Малоштан // Фармацевтичний часопис. - 2007. - № 3(3). - С. 61-65. (Особистий внесок: проведення експерименту, аналіз отриманих даних, підготовка статті).

3. Вивчення флавоноїдного складу листків кукурудзи ендоспермального мутанту sugary-1 / М.Ф. Ткаченко, В.М. Ковальов, А.Г. Кононенко, Л.М. Малоштан // Збірник наукових праць співробітників НМАПО імені П.Л. Шуліка. м. Київ, - 2009. - Вип. 18. - Книга 3. - С. 497-502. (Особистий внесок: аналіз даних літератури, участь у проведені експерименту, аналізі отриманих даних, підготовці статті).

4. Вивчення гепатопротекторної активності екстракту листків кукурудзи в умовах гострого тетрахлорметанового гепатиту / А.Г. Кононенко, Л.М. Малоштан, М.Ф. Ткаченко, В.М. Ковальов // Запорізький медичний журнал. - 2009. - Т. 11, №5. - С. 115-117. (Особистий внесок: проведення експерименту, аналіз отриманих даних, підготовка статті).

5. Кононенко А.Г. Изучение антиоксидантних свойств суммарного водного экстракта листьев кукурузы на модели острого гепатита // А.Г. Кононенко, Л.М. Малоштан // Сборник трудов ІІ-й Международной научной конференции молодых ученых-медиков. В 3-х томах. - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2008. - Т.1. - С. 57-58.

6. Кононенко А.Г. Вивчення протизапальної активності сумарного водного екстракту листя кукурудзи на моделі формалінового набряку стопи у мишей / А.Г. Кононенко, Л.М. Малоштан // Сьогодення та майбутнє фармації: Тези доповідей Всеукраїнського конгресу «Сьогодення та майбутнє фармації», 16-19 квітня 2008 р. - м. Харків. - Х.: Вид-во НФаУ, 2008. - С. 399.

7. Кононенко А.Г. Вивчення мембранопротекторних властивостей сумарного водного екстракту листя кукурудзи / А.Г. Кононенко, Л.М. Малоштан // Клінічна фармація в Україні: Матеріали VIII Всеукраїнської науково-практичної конференції за участю міжнародних спеціалістів, 6-7 листопада 2008р. - м. Харків. - Х.: Вид-во НФаУ, 2008. - С. 33.

8. Кононенко А.Г. Вивчення гострої токсичності сумарного водного екстракту листя кукурудзи / А.Г. Кононенко, Л.М. Малоштан // Ліки - людині. Сучасні проблеми створення, дослідження та апробації лікарських засобів: Матеріали XXVI науково-практичної конференції з міжнародною участю, 12 березня 2009р. - м. Харків. - Х.: Вид-во НФаУ, 2009. - С. 50-51.

9. Кононенко А.Г. Вивчення впливу сумарного водного екстракту листя кукурудзи на шлунково-кишковий тракт / А.Г. Кононенко, Л.М. Малоштан, М.Ф. Ткаченко // Актуальні питання створення нових лікарських засобів: тези доповідей всеукраїнської науково-практичної конференції студентів та молодих вчених, 23-24 квітня 2009 р. - м. Харків. - Х.: Вид-во НФаУ, 2009. - С. 230.

10. Кононенко А.Г. Вивчення сумарної антиокислювальної активності водного екстракту листків кукурудзи на моделі спонтанного перекисного окиснення ліпідів / А.Г. Кононенко, Л.М. Малоштан // Ліки - людині. Сучасні проблеми створення, вивчення та апробації лікарських засобів: Матеріали XXVIІ науково-практичної конференції з міжнародною участю, 4 лютого 2010р. - м. Харків. - Х.: Вид-во НФаУ, 2010. - С. 64-65.

11. Пат. № 86502 Україна, МПК А61К 36/899, А61К 127/00. Спосіб одержання комплексу біологічно активних речовин з антиоксидантною та протизапальною дією / В.М. Ковальов, Л.М. Малоштан, Н.П. Субота, А.Г. Кононенко, М.Ф. Ткаченко (Україна). - № а 2007 08446; Заявл. 23.07.2007; Опубл. 27.04.2009, Бюл. № 8 - 5 с. (Особистий внесок: приймав участь у патентному пошуку, в підготовці опису до патенту).

12. Інформаційний лист № 252-2009 «Використання субстанції рослинного походження водного екстракту листків кукурудзи для розробки лікарського засобу гепатопротекторної дії» / Л.М. Малоштан, А.Г. Кононенко, В.М. Ковальов, М.Ф. Ткаченко. - м. Київ, 2009. - 3 с. (Особистий внесок: частина експериментальних досліджень, підготовка інформаційного листа до друку).

Размещено на Allbest.ru

...