Особливості розвитку системної запальної відповіді при глюкокортикоїдному остеопорозі та обґрунтування її корекції теріпаратідом

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІнІстерство ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УкраЇнИ

ДонецЬкий нацІональнИй медиЧНий унІверситет

ім. М. Горького

УДК 616-007.234-037-092.4/.9

ОСОБЛИВОСТІ РОЗВИТКУ СИСТЕМНОЇ ЗАПАЛЬНОЇ ВІДПОВІДІ ПРИ ГЛЮКОКОРТИКОЇДНОМУ ОСТЕОПОРОЗІ ТА ОБҐРУНТУВАННЯ ЇЇ КОРЕКЦІЇ ТЕРІПАРАТІДОМ

14. 03. 04 - патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

АУССІ ГОЗАН САІД

Донецьк - 2010



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Донецькому національному медичному університеті ім. М. Горького МОЗ України

Науковий керівник доктор медичних наук, професор Крюк Юрій Якович, Донецький національний медичний університет ім. М. Горького, професор кафедри патологічної фізіології

Офіційні опоненти доктор медичних наук, професор Казімірко Ніла Казімірівна, Луганський державний медичний університет, завідувач кафедри патологічної фізіології

доктор медичних наук, професор Клименко Микола Олексійович, Харківський національний медичний університет, завідувач кафедри патологічної фізіології

Захист відбудеться «18» червня 2010 року о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 11.600.02 при Донецькому національному медичному університеті ім. М. Горького МОЗ України (83003, м. Донецьк, пр. Ілліча, 16).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Донецького національного медичного університету ім. М. Горького (83003, м. Донецьк, пр. Ілліча, 16).

Автореферат розісланий «17» травня 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, доцент М. В. Єрмолаєва



АНОТАЦІЯ

Ауссі Г.С. Особливості розвитку системної запальної відповіді при глюкокортикоїдному остеопорозі та обґрунтування її корекції теріпаратідом. - Рукопис. теріпаратід глюкокортикоїдний остеопороз нейроендокринний

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 - патологічна фізіологія. - Донецький національний медичний університет ім. М. Горького МОЗ України, Донецьк, 2010.

Дисертаційна робота присвячена виявленню основних закономірностей формування розладів нейроендокринної, цитокінової відповіді та гіперметаболізму при глюкокортикоїдному остеопорозі.

У роботі вдосконалено модель глюкокортикоїдного остеопорозу та розроблено в експерименті рентгенологічний спосіб оцінки виразності глюкокортикоїдного остеопорозу. Враховано роль КТ, ПТГ, ТТГ, Т₃ і Т₄, а також ІЛ-6 і ЧНП-б у механізмах підтримки рівня іонізованого кальцію в крові. Установлено обтяжуючий вплив системної запальної реакції з розвитком гіперметаболізму на патогенез глюкокортикоїдного остеопорозу.

Обґрунтовано використання для корекції глюкокортикоїдного остеопорозу фармакологічного аналога паратиреоїдного гормону - теріпаратіду.

Ключові слова: глюкокортикоїдний остеопороз, гіперметаболізм, обмін кальцію, теріпаратід.



АННОТАЦИЯ

Аусси Г.С. Особенности развития системного воспалительного ответа при глюкокортикоидном остеопорозе и обоснование его коррекции терипаратидом. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 - патологическая физиология. - Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького МЗ Украины, Донецк, 2010.

Диссертационная работа посвящена выявлению основных закономерностей формирования расстройств нейроэндокринного, цитокинового ответа и гиперметаболизма при глюкокортикоидном остеопорозе и обоснованию использования для его коррекции фармакологического аналога паратиреоидного гормона - терипаратида.

В основу диссертации положены результаты исследования, проведенные на 374 белых нелинейных половозрелых крысах обоего пола. У крыс основных серий моделировали глюкокортикоидный остеопороз путем внутримышечного введения им преднизолона в дозе 3 мг/кг/сут на протяжении 4-5 недель. Для разделения крыс по тяжести остеопороза на 3 группы применен рентгенологический метод и предложен критерий в виде значений показателя «К». В соответствии с величинами показателя «К» выделен легкий остеопороз, остеопороз средней тяжести и тяжелый остеопороз.

В работе уточнена роль кальцитонина, паратиреоидного, тиреотропного гормонов, тироксина и трийодтиронина, а также интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей-б в механизмах поддержания уровня ионизированного кальция в крови. Установлено отягчающее влияние системной воспалительной реакции на патогенез глюкокортикоидного остеопороза. При остеопорозе средней степени тяжести и при тяжелом остеопорозе развивается гиперметаболический синдром. Выраженность гиперметаболизма при остеопорозе может быть оценена биохимическими показателями крови, включающими креатинин, мочевину, мочевую кислоту, глюкозу, общий белок, уровень молекул средней массы, малоновый диальдегид, диеновые конъюгаты, билирубин. С помощью этих показателей определяют средний показатель гиперметаболизма «Т».

При разработке методики прогнозирования течения глюкокортикоидного остеопороза установлена информационная значимость для этого прогнозирования данных рентгенологического исследования, изученных гормонов и цитокинов, а также показателей, характеризующих гиперметаболизм. Предложены прогностические критерии тяжести состояния животных при глюкокортикоидном остеопорозе.

При гипокальциемии, развивающейся при глюкокортикоидном остеопорозе, для его лечения обосновано назначение фармакологического аналога паратиреоидного гормона - терипаратида. Проведена оценка эффективности терипаратида. Установлено увеличение продолжительности жизни крыс и снижение выраженности среднего показателя гиперметаболизма при глюкокортикоидном остеопорозе трех степеней тяжести.

Ключевые слова: глюкокортикоидный остеопороз, гиперметаболизм, обмен кальция, терипаратид.



ANNOTATION

Aussi G.S. The features of development of systemic inflammatory response at glucocorticoid osteoporosis and grounding its teriparatid correction. - Manuscript.

A dissertation for the degree of candidate of the medical sciences by specialty 14.03.04 - pathological physiology. - M. Gorky Donetsk National Medical University Ministry of Public Health, Ukraine, Donetsk, 2010.

A dissertation work is devoted to revealing the main regularities of the shaping disorders of neuroendocrine system, cytokines response and hypermetabolism at glucocorticoid osteoporosis.

In work the model of glucocorticoid osteoporosis is improved and developed the roentgenologic method of estimation of expressiveness of glucocorticoid osteoporosis in the experiment. It is the calcitonin, parathyreoid hormone, thyreotropic hormone, thyroxin and threeiodthyronine role taken account, and also interleukin-6 and tumor necrosis factor-б in the mechanisms of the maintenance level ionized calcium in blood. Established aggravating influence of system inflammatory response with development of hypermetabolism on pathogenesis of glucocorticoid osteoporosis.

It is motivated to use the pharmacological analogue of parathyreoid hormone - teriparatid for correcting of glucocorticoid osteoporosis.

Keywords: glucocorticoid osteoporosis, hypermetabolism, calcium metabolism, teriparatid.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність. Остеопороз - одне з найбільш поширених системних метаболічних захворювань скелету. Згідно з даними Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я, проблеми остеопорозу, як причини інвалідизації і смертності хворих від переломів кісток (особливо проксимальних відділів стегнових кісток), займають четверте місце серед неінфекційних захворювань (Поворознюк В.В. и соавт., 2007). Вони поступаються лише хворобам серцево-судинної системи, онкологічній патології і цукровому діабету (Казимирко Н.К. и соавт., 2008; Беневоленская Л.И., 2005; Leonard M.B. et al., 2007). Частота остеопорозу підвищується з віком (Гайко Г.В. и соавт., 2007; Климовицкий В.Г. и соавт., 2008).

У структурі остеопорозу глюкокортикоїдний остеопороз займає друге місце після постменопаузального і сенільного (Риггз Б.Л. и соавт., 2008; Казимирко В.К. и соавт., 2005). Це обумовлено широким вживанням глюкокортикоїдів у всьому світі. За деякими оцінками їх приймають 0,5-1,0% населення земної кулі (Синяченко О.В. и соавт., 2006; Kearney D.M. et al., 2006). Більше половини з них страждає на запальні ревматичні захворювання (Дзяк Г.В., 2007; Клименко Н.А. и соавт., 2006).

Механізми глюкокортикоїдного остеопорозу, як вважають дослідники, обумовлені біологічною активністю самих глюкокортикостероїдів і опосередковуються глюкокортикоїдними рецепторами, які експресуються в остеокластах і остеобластах (Ходжсон С.,2007; Буфистова А.В. и соавт., 2006).

Між тим, дію глюкокортикоїдів на кісткову резорбцію і їх взаємодію з гормонами щитовидної і паращитовидної залоз при глюкокортикоїдному остеопорозі остаточно не розкрито. Не ясний механізм системної запальної відповіді при глюкокортикоїдному остеопорозі. Не розкрито патогенетичне значення гіперметаболізму і недостатньо розроблені методи прогнозування його перебігу. Лікувальна ефективність фармакологічного аналога паратиреоїдного гормону теріпаратіду і його вплив на гіперметаболізм також вивчені недостатньо.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи кафедри патологічної фізіології сумісно з Центральною науково-дослідною лабораторією Донецького національного медичного університету за планом МОЗ України “Дисфункція гуморальної регуляції в патогенезі травматичної хвороби” (№ держ. реєстрації 0105U008712, шифр теми МК 06.01.05). Дисертант є співвиконавцем теми.

Мета дослідження: виявити основні закономірності формування розладів нейроендокринної, цитокінової відповіді і гіперметаболізму при глюкокортикоїдному остеопорозі в експерименті і обґрунтувати використання для його корекції фармакологічного аналога паратиреоїдного гомону теріпаратіду.

Завдання дослідження:

1. Розробити експериментальну модель глюкокортикоїдного остеопорозу і рентгенологічні критерії його тяжкості у щурів.

2. Вивчити зміну найбільш важливих параметрів нейроендокринного статусу, у тому числі гормонів кальцитоніну (КТ), паратиреоїдного (ПТГ), тиреотропного (ТТГ) гормонів, тироксину (Т₄) і трийодтироніну (Т₃), цитокінової відповіді (інтерлейкін-6 (ІЛ-6), чинник некрозу пухлин-б (ЧНП-б)) при глюкокортикоїдному остеопорозі різного ступеня тяжкості.

3. Вивчити мікробний склад і виразність бактеріємії та гіперметаболізму при глюкокортикоїдному остеопорозі різного ступеня тяжкості.

4. Вивчити взаємозв'язок між виразністю змін нейроендокринної, цитокінової відповідей, гіперметаболізму і тяжкістю остеопорозу. Розробити критерії прогнозу і методику прогнозування його перебігу.

5. Обґрунтувати вживання при тяжкому глюкокортикоїдному остеопорозі теріпаратіду і оцінити його лікувальну ефективність.

Об'єкт дослідження - механізми розвитку системної запальної відповіді та їх корекція теріпаратідом при глюкокортикоїдному остеопорозі.

Предмет дослідження - рентгенологічні, біохімічні, бактеріологічні, імунологічні зміни показників, які характеризують стан ремоделювання кісткової системи, нейроендокринна, цитокінова відповідь організму, сепсис і гіперметаболізм при глюкокортикоїдному остеопорозі.

Методи дослідження. У роботі використані патофізіологічні (моделювання глюкокортикоїдного остеопорозу), рентгенологічні (рентгенографія кісток скелету щурів), біохімічні (визначення в крові концентрації іонізованого кальцію, КТ, ПТГ, Т₄ і Т₃, загального білка і його фракцій, показників ліпідного обміну (холестерину, тригліцеридів, малонового діальдегіду (МДА), дієнових кон'югатів (ДК), а також концентрації глюкози, сечовини, сечової кислоти, креатиніну, активності лужної фосфатази (ЛФ); імуноферментні (визначення в крові концентрації ІЛ-6 і ЧНП-б), бактеріологічні (посів мікроорганізмів на звичайні і селективні середовища, забарвлення за Романовським, Грамом, біохімічні тести для ідентифікації збудників). Для побудови прогностичних рівнянь використаний кореляційно-регресійний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів полягає в удосконаленні методики експериментального моделювання і у встановленні невідомих раніше сторін патогенезу глюкокортикоїдного остеопорозу. Зокрема:

- в уточненні механізмів порушення кісткового ремоделювання при глюкокортикоїдному остеопорозі і участі у них гормонів КТ, ПТГ, ТТГ, Т₄ і Т₃, а також ІЛ-6 і ЧНП-б;

- у встановленні компенсаторного характеру ендокринних реакцій, у тому числі ролі ПТГ у підтримці рівня іонізованого кальцію в крові;

- у виявленні умов зміни характеру компенсаторних реакцій ендокринної системи і обтяження патогенезу глюкокортикоїдного остеопорозу системною запальною реакцією з розвитком гіперметаболізму, інфекційних ускладнень і сепсису; у етіології сепсису показана роль не патогенних бактерій, а умовно-патогенної мікрофлори, в основному тієї, що транслокується з кишечника;

- у визначенні виразності і патогенетичного значення гіперметаболізму при експериментальному глюкокортикоїдному остеопорозі.

Практичне значення отриманих результатів роботи полягає в розробці рентгенологічних і лабораторних критеріїв тяжкості експериментального глюкокортикоїдного остеопорозу, методів прогнозування і критеріїв прогностичної оцінки його тяжкості в експерименті. Воно також визначається удосконаленням методики експериментального моделювання остеопорозу.

При розробці методики прогнозування перебігу глюкокортикоїдного остеопорозу встановлена інформаційна значущість для цього прогнозування даних рентгенологічного дослідження, гормонів (ПТГ, ТТГ, КТ, Т₃ і Т₄), цитокінів (ІЛ-6 і ЧНП-б) і біохімічних показників, що характеризують гіперметаболізм.

Обґрунтовано вибір і проведено оцінку лікувальної ефективності теріпаратіду при глюкокортикоїдному остеопорозі.

Матеріали дисертації упроваджені у практику відділень Донецької обласної травматологічної лікарні, клінік інституту травматології і ортопедії Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, Інституту невідкладної і відновної хірургії ім. В.К. Гусака НАМН України, а також в педагогічний процес Донецького і Луганського медичних університетів.

Особистий внесок здобувача. Внесок здобувача в отримані результати є основним і полягає в проведенні патентно-інформаційного пошуку, в аналізі літературних даних, у виконанні всіх досліджень на тваринах. Автор самостійно моделював остеопороз і визначав біохімічні, бактеріологічні і імунологічні показники. Дисертант також самостійно виконав кореляційно-регресійний аналіз. Ним запропоновано критерії тяжкості глюкокортикоїдного остеопорозу і отримані прогностичні рівняння. Дисертантом написано самостійно всі глави дисертації і автореферат, підготовлено до друку статті і тези. Пошукувачем в даному дослідженні не були використані результати і ідеї співавторів публікацій.

Апробація результатів дисертації. Дисертаційна робота апробована на спільному засіданні кафедр патологічної фізіології, нормальної фізіології, травматології, ортопедії та військово-польової хірургії і Центральної науково-дослідної лабораторії Донецького національного медичного університету ім. М. Горького (березень 2010). Основні положення дисертації доповідалися на науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні аспекти неспецифічних запальних захворювань суглобів» (Хмельницький, 2007), на конференції, присвяченій 75-річчю з дня народження, 50-річчю науково-практичної діяльності заслуженого діяча науки і техніки України, професора М.І. Хвісюка (Харків, 2009). Матеріали дисертації також були обговорені і доповідались на V конгресі патофізіологів України (2008), на ХII конгресі Світової федерації українських лікарських товариств (Івано-Франківськ, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 9 наукових робіт, з яких 5 - у фахових виданнях ВАК України, 4 - у матеріалах наукових форумів.

Структура і об'єм дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, двох розділів власних досліджень і обговорення результатів, аналізу і узагальнення отриманих результатів, висновків, списку використаної літератури (250 найменувань: 134 кирилицею, 116 латиницею). Текстова частина роботи викладена на 143 сторінках, дисертація містить 6 таблиць і ілюстрована 13 рисунками.

ОСНОВНІЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. Дане дослідження проведене на 374 білих безпородних щурах обох статей, віком 6-7 місяців і масою 190-220 г, які перебували на стандартному раціоні і вільному доступі до їжі і води в умовах віварію Донецького національного медичного університету ім. М. Горького. Досліди проводили з дотриманням загальних вимог і положень Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для дослідницьких і інших наукових цілей (Страсбург, 1986). Всього виконано 5 експериментальних серій. Загальна кількість тварин у всіх серіях склала 398. З цього числа як контроль використано 100 щурів. Необхідність контрольних досліджень була пов'язана із стандартизацією результатів кількісних досліджень і порівнянням отриманих даних з наведеними в літературі. У серії 1 використано 62 дослідних і 30 контрольних щурів. У цій серії проведене відпрацювання методик моделювання остеопорозу, оцінка ступеня його тяжкості шляхом рентгенографії кісток скелету і визначення тривалості життя щурів. Контроль використаний для отримання рентгенологічних знімків інтактних кісток скелету. У серії 2 вивчали біохімічний статус, бактеріологічний спектр і концентрацію інтерлейкінів у 102 дослідних тварин і у 26 контрольних. При вивченні біохімічного статусу всі дослідні тварини були розділені на 3 групи по 28 щурів залежно від ступеня тяжкості остеопорозу. Біохімічний статус вивчали в серіях по 20 щурів, концентрацію інтерлейкінів - по 8 щурів. Надалі, для знаходження сили кореляційного зв'язку і форми залежності між остеопоретичним коефіцієнтом «К» і біохімічними показниками, що вивчаються, проведений кореляційно-регресійний аналіз. Бактеріологічні показники вивчали в 3 дослідних групах і 1 контрольній - по 6 щурів в кожній. У серії 3 і 4 вивчали показники, що характеризують гіперметаболізм у тварин з остеопорозом 1-3 ступеня тяжкості (n=30). Вивчали також тривалість життя щурів (n=50). У цих серіях обчислювали коефіцієнти кореляції і знаходили форми залежності між біохімічними показниками. Проведені дослідження потрібні були для розробки біохімічних критеріїв тяжкості і прогнозування остеопорозу. У 5 серії (n=54) вивчали ефективність теріпаратіду для пригнічення системної запальної реакції і гіперметаболізму при тяжкому глюкокортикоїдному остеопорозі.

Остеопороз у тварин моделювали шляхом внутрішньом'язового введення метілпреднізолону (фірма «Pfizer», США) в дозі 3 мг/кг впродовж 4-5 тижнів. Наприклад, для щура масою 200 г добова доза препарату, що вводився, складала 0,6 мг (0,02 мл офіцинального розчину).

Розроблений нами метод оцінки виразності остеопорозу у експериментальних тварин належить до променевих методів діагностики остеопорозу. Він заснований на фіксації різниці довжини фрагменту хребетного стовпа на рентгенограмах тварин в контролі і при остеопорозі. Для кращої стандартизації значень змінних величин, що реєструються, згідно розробленої нами методики, застосовували показник «К». Його знаходили за формулою:

(1),

де: К - показник остеопорозу; T_k - середня довжина одного хребця і міжхребцевого диску на рентгенограмі в контролі, мм; То - середня довжина одного хребця і міжхребцевого диску на рентгенограмі в динаміці експерименту, що моделював остеопороз, мм; Дd - зміна на рентгенівських знімках величини еталону довжини, мм. При однакових масштабах порівнюваних знімків Дd = 0.

Враховуючи, що в експериментальних серіях досліду (у яких моделювали остеопороз), величина показника «К» змінювалася від 0 до 3, нами, за величиною цього показника, була запропонована триступенева класифікація остеопорозу. При I ступені остеопорозу показник «К» дорівнював 1 (0,91±0,09; n=20), при II ступені - 2 (1,78±0,11; n=20), при III ступені - 3 (2,84±0,16; n=20). У запропонованій класифікації нижнє значення показника «К», що дорівнює 1, обмежувалося достовірністю відмінностей ДТ від даних контрольної серії, верхнє значення, що дорівнює 3, - тривалістю життя щурів.

У групах тварин 3 серії проводили вивчення біохімічних параметрів крові (кальцію, гормонів - КТ, ПТГ, ТТГ, Т₄, Т₃, активності ферменту ЛФ). Визначення вмісту гормонів проводили радіоімунологічним (мітка радіоактивним ізотопом ¹²⁵I) і імуноферментним методами з використанням стандартних комерційних наборів реактивів для визначення досліджуваних речовин в зразках плазми крові щурів. Вміст кальцію в сироватці крові визначали фотометричним методом (з о-крезолфталеїнкомплексом). Активність ЛФ в сироватці крові визначали спектрофотометричним методом за допомогою набору реактивів «La Chema» (Чеська Республіка).

З сукупності параметрів біохімічного статусу для оцінки гіперметаболізму нами вибрані 11 найбільш інформативних і простих показників. Ці показники, на наш погляд, з різних сторін характеризували явище гіперметаболізму. Такими показниками були: концентрація в сироватці крові загального білка, креатиніну, сечовини, сечової кислоти, глюкози, холестерину, тригліцеридів, МДА, ДК, білірубіну і рівень молекул середньої маси (МСМ). Всі біохімічні показники визначали за допомогою наборів рідких реагентів, готових до вживання. Вміст речовин вимірювали за допомогою біохімічного аналізатора «Kone Progress Plus» (Фінляндія). Рівень маркера ендогенної інтоксикації МСМ визначали скринінговим методом.

Для оцінки виразності запальної відповіді організму вивчали в сироватці крові концентрацію прозапальних цитокінів: ІЛ-6 і ЧНП-б. Вказані цитокіни виявляли методом твердофазового імуно-ферментного аналізу з вживанням в якості індукторного ферменту пероксидази хрону. У методиці використані реактиви виробництва ТОВ «Протеиновый контур» (Росія, С.-Петербург). Дослідження виконували відповідно до інструкції, що додається до набору реактивів.

Посів крові виконували на тіогліколеве середовище (для виявлення мікробів) і середовище Сабуро (для виявлення грибів) над полум'ям спиртівки. У 5 мл кожного середовища вносили по 1,0 мл крові. Потім здійснювали термостатування проб при температурі 37⁰ С. Висівання на кров'яний агар і на середовище Сабуро виконували на 3, 5 і 7 добу після первинного посіву. За наявності зростання на цих середовищах колонії бактерій перевивали на скошений м'ясопептонний агар в пробірках або аналогічно приготоване середовище Сабуро. Через добу проводили фарбування мазків мікроорганізмів за Грамом і ставили біохімічні тести для ідентифікації збудників.

Препарат «теріпаратід» вводили щурам підшкірно в область стегна, в ділянку, заздалегідь звільнену від шерсті. Доза препарату склала 5 мкг/кг (0,1 мл розбавленого офіцинального розчину). Доза 5 мкг/кг, що вводилась щурам, за лікувальним ефектом відповідала дозі 0,45 мкг/кг, що вводиться людині. Ці дані підтверджуються літературним джерелом (Finkelstoin J.S. et al., 1999). Використовувана нами в лікуванні остеопорозу доза теріпаратіду називалася середньою терапевтичною дозою (Shao J.S. et al., 2003). Для вивчення ефективності теріпаратіду препарат вводили 1 раз на добу три дні.

Щурів для забору крові під гексеналовим наркозом декапітували гільйотинуванням.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили на персональному комп'ютері під керуванням ОС Windows XP із застосуванням ліцензійних пакетів Statistica 5.5 (Stat Soft Rus) і Stadia 6.1.

Результати власних досліджень і їх обговорення. У тварин в процесі розвитку остеопорозу, що індукувався глюкокортикоїдним гормоном метілпреднізолоном, спостерігалися зміни, як в структурі кісток хребта, підтверджувані рентгенологічно, так і в концентрації біохімічних показників крові, що вивчалися (таблиця 1).

Зміна концентрації кальцію в сироватці крові носила фазний характер. На початковому етапі остеопорозу спостерігалося деяке підвищення концентрації кальцію на 40,2% (p<0,05), а потім зниження, відповідно на 14,3% і 37,3% (при II і III ступені тяжкості, p<0,05).

Концентрація в плазмі крові КТ в динаміці остеопорозу поступово підвищувалася. Проте це підвищення мало максимальну величину при остеопорозі II ступеня (у 2,7 раз було вище, ніж в контролі, p<0,05). У плазмі крові рівень ПТГ в динаміці остеопорозу також підвищувався: при I ступені він в 2,7 раз перевищував значення контрольних величин, а при II і III ступені відповідно в 2,5 раз і на 54,9% (p<0,05). Концентрація ТТГ в плазмі крові при остеопорозі I ступеня була на 86,6% вище, ніж в контролі (p<0,05). При II ступені вона залишалася на такому ж високому рівні. При III ступені остеопорозу спостерігалося зниження в плазмі крові концентрації ТТГ практично до вихідного рівня. Концентрація в плазмі крові гормонів щитовидної залози - Т₄ і Т₃ змінювалася при розвитку патологічного процесу фазно: концентрація Т₄ підвищувалася до рівня, що в 2,5 рази перевищувала контроль (p<0,05), і на такому рівні знаходилася на всьому протязі моделювання остеопорозу; Т₃, навпаки, знижувалася на 57,8%, а потім збільшувалася, але все одно залишалася на низькому рівні (достовірно нижче за вихідний рівень на 31,6%, p<0,05). Активність ЛФ в сироватці крові впродовж всього періоду розвитку остеопорозу постійно знижувалася відносно вихідного рівня. Концентрація ІЛ-6 в сироватці крові при остеопорозі I ступеня мала лише тенденцію до зниження.

При остеопорозі II ступеня рівень ІЛ-6 відновлювався до вихідних величин. При остеопорозі III ступеня спостерігалося значне підвищення цього прозапального цитокіну: його значення в 3,2 рази перевищували показники інтактних тварин (p<0,05). Концентрація ЧНП-б у сироватці крові при остеопорозі I ступеня підвищувалася в 2,2 рази (p<0,05), при остеопорозі II ступеня - в 4,7 рази (p<0,05) і при остеопорозі III ступеня - в 18 разів (p<0,05).

Нами проведений кореляційно-регресійний аналіз. У цьому аналізі була здійснена спроба знайти силу кореляційного зв'язку і форму залежності між величиною остеопоретичного коефіцієнту «К» і всіма вивченими біохімічними і імунологічними показниками. Найбільший кореляційний зв'язок виявлений між значеннями остеопоретичного коефіцієнту «К» і кальцієм (r1 = - 0,65) (p<0,05), а також між цим показником і ТТГ (r4 = - 0,65) (p<0,05), ЧНП-б (r9 = 0,65) (p<0,05) і ЛФ (r7 = - 0,62) (p<0,05). Рівень кореляційного зв'язку в згаданих випадках розцінювався як виражений. У інших випадках він був помітним.

Всі вивчені нами біохімічні і імунологічні показники відображали не лише порушення кісткового ремоделювання в динаміці стероїдного остеопорозу. Підвищення концентрації гормонів при остеопорозі мало компенсаторний характер, направлений на підтримку гомеостазу і, зокрема, рівня іонізованого кальцію. При остеопорозі середньої тяжкості і тяжкому остеопорозі його патогенез обтяжувався розвитком системної запальної реакції. При тяжкому остеопорозі відбувався зрив компенсаторних реакцій ендокринної системи.

Далі ми зробили спробу встановити склад субпопуляції транслокуючих мікроорганізмів і їх патогенетичне значення в динаміці тяжкого глюкокортикоїдного остеопорозу в експерименті. Дослідження показали, що у тварин в процесі розвитку остеопорозу, що індукується глюкокортикоїдним гормоном метілпреднізолоном, спостерігалися зміни як в частоті виявлення, так і у складі мікроорганізмів, що виявлялися в крові щурів. Було встановлено, що при глюкокортикоїдному остеопорозі має місце транслокація в основному грамнегативної аутофлори. З грамнегативних паличок переважають E. coli і E. faecalis. Частота їх виявлення знаходиться в прямо пропорційній залежності від ступеня тяжкості остеопорозу. Грампозитивні коки і гриби роду Candidae в основному з'являються в крові при остеопорозі 3-го ступеня тяжкості. Ці мікроорганізми, ймовірно, і грають етіологічну роль в розвитку гнійно-запальних ускладнень і сепсису у фіналі хвороби.

З метою розробки інформативних і простих біохімічних критеріїв гіперметаболізму, а також для оцінки їх прогностичної значущості при тяжкому, середньої тяжкості і легкому глюкокортикоїдному остеопорозі ми продовжили дослідження.

Результати дослідження свідчили, що у тварин при остеопорозі показники креатиніну, білірубіну, МСМ в сироватці крові змінювалися більшою мірою, ніж показники загального білка, сечовини, сечової кислоти, тригліцеридів, глюкози і МДА. При тяжкому остеопорозі ці величини мали максимальне значення, при легкому остеопорозі - мінімальне. Найбільших значень при тяжкому остеопорозі досягали показники білірубіну, МСМ, сечовини і ДК. Вони, відповідно, в 3,8, 2,4, 2,3 і 2,2 рази перевищували рівень контролю (p<0,05).

Для розробки прогностичних критеріїв тяжкості гіперметаболізму у тварин з різною виразністю остеопорозу нами всі 11 біохімічних показників було приведено до єдиної шкали значень відносно рівня контролю. Для такої уніфікації ми використовували формулу, що розраховує величину кожного біохімічного показника, як відносного коефіцієнту «Т_i»:

, (2)

де: - середнє арифметичне значення величини одного з одинадцяти згаданих біохімічних показників при остеопорозі; - середнє значення однойменного біохімічного показника, визначуваного в контрольній групі тварин. У чисельнику представлена різниця значень біохімічних показників, узята за абсолютною величиною.

З урахуванням того, що величини відносних коефіцієнтів «Т_i» відображали ступінь виразності гіперметаболізму, ці коефіцієнти ми назвали «гіперметаболічними». Найбільшими гіперметаболічними показниками були показники білірубіну, МСМ, ДК, сечовини; найменшими - загального білка, МДА, глюкози.

Для розробки біохімічних критеріїв тяжкості остеопорозу ми збільшили період спостереження за піддослідними щурами до 21 доби. При цьому ми отримали дані, що всі щури в цьому періоді гинули. 100%-а летальність щурів в дослідженні дала нам можливість в параметрі «тривалість життя» побачити «об'єкт прогнозу». Використовуючи середні дані показника «К» і вивчених біохімічних величин як аргументи, а середню тривалість життя щурів усередині груп I-III ступеня тяжкості в якості функції, нами, після проведення кореляційно-регресійного аналізу, були отримані наступні прогностичні рівняння:

У₁ = 35,9 * 0,39Х₁ - 0,45 (r = 0,65);

У₂ = - 3,89 * Х₁ - 3,22 / Х₂ - 0,17 * Х₃ + 468,1 / Х₄ + 21,68 (R = 0,79);

У₃ = 8,1 * Х₂ - 0,054 * Х₃ - 1,31 (R = 0,68);

У₄ = 85,54 * Х₅ - 2,05 * Х₆ + 112,3 (R = 0,72);

У₅ = 18,17 - 0,362 * Х₇ - 0,01 * Х₈ (R = 0,81);

У₆ = 18,1 - 0,16 * Х₉ (r = 0,69),

де: У₁ - У₆ - тривалість життя щурів в добі;

Х₁ - величина остеопоретичного коефіцієнту «К»;

Х₂ - концентрація в сироватці крові іонів кальцію, мкмоль/л;

Х₃ - концентрація в сироватці крові КТ, мг/мл;

Х₄ - концентрація в сироватці крові ПТГ, пг/мл;

Х₅ - концентрація в сироватці крові ТТГ, МЕ/л;

Х₆ - концентрація в сироватці крові Т₄, нмоль/л;

Х₇ - концентрація в сироватці крові ІЛ-6, пг/мл;

Х₈ - концентрація в сироватці крові ЧНП-б, пг/мл;

Х₉ - середній показник гіперметаболізму %;

r, R - коефіцієнти кореляції (парної і множинної).

З отриманих результатів дослідження виходило, що прогностичні величини У₁-У₆ могли виступати як тимчасові критерії тяжкості модельованого патологічного процесу.

Першим етапом наших досліджень, направленим на вивчення лікувальної ефективності теріпаратіду, з'явилося визначення тривалості життя щурів при різних ступенях тяжкості остеопорозу після введення препарату.

Без лікування щури з тяжким остеопорозом жили 3,2±0,8 діб, при остеопорозі середньої тяжкості - 8,9±1,2 діб, при остеопорозі легкого ступеня - 16,3±1,5 діб. Введення теріпаратіду протягом 3-х діб призводило до збільшення тривалості життя щурів до 10,2±1,3 діб при тяжкому остеопорозі, до 18,3±2,4 діб - при остеопорозі середньої тяжкості і до 29,4±3,1 діб при легкому остеопорозі. Слід також відзначити, що в останній підгрупі 5 щурів за період спостереження не загинули (тобто була виживаність).

На другому етапі було поставлено завдання оцінки зміни гіперметаболізму теріпаратідом при системній запальній реакції, що розвивається при остеопорозі.

При вивченні показників гіперметаболізму нами встановлено, що всі вони при порівнянні між собою в підгрупах, що розрізняються за тяжкістю остеопорозу, після лікування змінювалися у бік відновлення (p<0,05), або мали тенденцію до відновлення своїх первинних значень. При тяжкому остеопорозі теріпаратід в 2,3 рази знижував підвищений рівень білірубіну (p<0,05), на 58% зменшував гіперглікемію, на 50% зменшував концентрацію сечової кислоти (p<0,05), на 40% - концентрацію ДК (p<0,05), а також в декілька меншій мірі, на 17% і 13%, знижував показники МДА (p<0,05) і триглицеридів (p<0,05). У контрольній групі 2 щури загинули до дослідження крові. При остеопорозі середнього ступеня тяжкості теріпаратід зменшував на 50% виразність білірубінємії (p<0,05), на 37% зменшував показники сечової кислоти (p<0,05), на 35% - МДА (p<0,05) і на 8% - триглицеридів (p<0,05). При остеопорозі легкого ступеня теріпаратід знижував на 37% величину ДК (p<0,05), на 31% - рівень МСМ (p<0,05), на 29% - білірубіну (p<0,05), на 14% - сечової кислоти (p<0,05).

При вивченні зміни середнього показника гіперметаболізму в двох групах щурів (що лікувались ПТГ і без лікування) встановлено, що теріпаратід при тяжкому остеопорозі зменшував виразність гіперметаболізму в 1,6 раз, при остеопорозі середньої тяжкості - в 1.1 раза. При легкому остеопорозі теріпаратід повністю ліквідовував його прояви.



ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і розв'язання актуальної наукової задачі - на підставі вивчення показників нейроендокринних (гормонів щитовидної і паращитовидної залоз, а також тиреотропного гормону і паратиреоїдного гормону), обмінних порушень (вуглеводів, білків і ліпідів), мікробіологічних показників і цитокінів інтерлейкіна-6 і чинника некрозу пухлин-б у тварин з глюкокортикоїдним остеопорозом встановлені нові механізми розладів нейроендокринної, цитокінової відповіді, гіперметаболізму і структури бактерійного сепсису, які уточнюють діагностику, прогноз і оцінку тяжкості глюкокортикоїдного остеопорозу. Отримані дані також дозволяють обґрунтувати вживання при цьому виді остеопорозу фармакологічного аналога паратиреоїдного гормону теріпаратіду.

1. Вдосконалена модель глюкокортикоїдного остеопорозу, що полягає у внутрішньом'язовому введенні 3 мг/кг метілпреднізолону на добу впродовж 4-5 тижнів під безпосереднім щотижневим рентгенологічним контролем довжини попереково-грудного фрагмента хребта щура і обчислення за рентгенологічними даними відносного показника «К», що враховує зміну середньої довжини одного хребця цього фрагмента. При К < 1,5 (К=0,91±0,09) визначають легкий за тяжкістю остеопороз; при 2,5 > К > 1,5 (К=1,78± 0,11) визначають остеопороз середнього ступеня тяжкості; при К > 2,5 (К=2,84±0,16) визначають тяжкий остеопороз.

2. Біохімічні показники концентрації кальцію, кальцитоніну, паратиреоїдного гормону, тиреотропного гормону, тироксину і трийодтироніну в плазмі крові, активності лужної фосфатази в сироватці крові, а також імунологічні показники - концентрація інтерлейкіна-6 і чинника некрозу пухлин-б відображають порушення кісткового ремоделювання в динаміці стероїдного остеопорозу. Підвищення концентрації гормонів при остеопорозі носить компенсаторний характер, направлений на підтримку гомеостазу і, зокрема, рівня іонізованого кальцію. При остеопорозі середньої тяжкості і тяжкому остеопорозі його патогенез обтяжується системною запальною відповіддю. При тяжкому остеопорозі відбувається зрив компенсаторних реакцій нейроендокринної системи.

3. Мікробний склад і виразність бактеріємії при глюкокортикоїдному остеопорозі визначаються бактерійною і кандидозною транслокацією умовно-патогенної мікрофлори, яка колонізує відкриті біоценози. При тяжкому остеопорозі розвивається мікробний сепсис. У його етіології беруть участь як грампозитивні, так і грамнегативні коки і палички. Основну етіологічну роль при сепсисі відіграють грамнегативні палички E. coli і E. faecalis.

4. Показники концентрації в сироватці крові креатиніну, сечовини, сечової кислоти, глюкози, загального білка, молекули середньої молекулярної маси, холестерину, тригліцеридів, малонового діальдегіду, дієнових кон'югатів, білірубіну відображають стан гіперметаболізму. Для оцінки виразності гіперметаболізму за цими параметрами доцільно використовувати відносний показник «Т_i». Він показує середні відхилення вказаних параметрів при остеопорозі в порівнянні з їх вихідними значеннями в %. При Т_i = 21,9±2,0% реєструється остеопороз легкого ступеня, при Т_i = 46,4±3,9% - остеопороз середнього ступеня, при Т_i = 54,4±4,7% - тяжкий остеопороз.

5. При глюкокортикоїдному остеопорозі тривалість життя експериментальних тварин залежить від концентрації прозапальних цитокінів (інтерлейкіна-6 і чинника некрозу пухлин-б) (r=0,81, p<0,05), рівня іонізованого кальцію, кальцитоніну і паратиреоїдного гормону (r=0,79, p<0,05), від виразності середнього показника гіперметаболізму (r=0,69, p<0,05) і остеопоретичного показника «К» (r=0,65, p<0,05). Тривалість життя щурів, взята за об'єкт прогнозу до складу регресійних рівнянь, що описують форму залежності з перерахованими показниками, може бути використана як критерій в прогнозуванні результату і оцінки тяжкості стану експериментальних тварин при остеопорозі.

6. Лікувальне вживання паратиреоїдного гормону при глюкокортикоїдному остеопорозі обґрунтовується гіпокальціємією. Теріпаратід (лікарська форма паратиреоїдного гормону) в лікувальних дозах збільшує тривалість життя щурів з тяжким остеопорозом в 3,2 рази, з остеопорозом середньої тяжкості - в 2,1 рази, при легкому остеопорозі - в 1,8 рази. При глюкокортикоїдному остеопорозі теріпаратід зменшує також виразність середнього показника гіперметаболізму в 1,6 рази при тяжкому остеопорозі, в 1,1 рази - при остеопорозі середньої тяжкості і повністю його нівелює при легкому остеопорозі.



ПЕРЕЛІК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Патогенетичне значення інфекційного чинника в розвитку глюкокортикоїдного остеопорозу в експерименті / С. Є. Золотухін, Г. С. Ауссі, В. Т. Шевченко, М. М. Шпаченко. - Науковий вісник Ужгородського університету, серія «Медицина». - 2007. - Вип. 32. - С. 86-88. (Особисто здобувачем отримані експериментальні результати моделювання остеопорозу, проведено їх аналіз і узагальнення).

2. С. Е. Золотухин Гиперметаболизм при различных типах течения тяжелой механической травмы в эксперименте / С. Е. Золотухин, А. Ю. Крюк, Г. С. Аусси. - Літопис травматології та ортопедії. - 2008. - № 1-2. - С. 102-105. (Особисто здобувачем проведений аналіз результатів дослідження гіперметаболізму у розвитку травми, обґрунтовано запропонований метод оцінки гіперметаболізму).

3. Роль гормонов щитовидной и паращитовидной желез в патогенезе глюкокортикоидного остеопороза и заболеваний пародонта (экспериментальное исследование) / С. Е. Золотухин, Г. С. Аусси, Н. Н. Шпаченко, В. П. Коробов, Е. С. Буфистова. - Український морфологічний альманах. - 2008. - Т.6, № 2. - С. 110-113. (Особисто здобувачем отримані експерименти, проведено їх аналіз, виконано написання статі).

4. Оценка эффективности терипаратида при глюкокортикоидном остеопорозе в эксперименте / С. Е. Золотухин, Ю. Я. Крюк, Г. С. Аусси, Н. Н. Шпаченко. - Український медичний альманах. - 2008. - Т.11, № 3. - С. 76-79. (Особисто здобувачем отримані експерименти, проведено їх аналіз, виконано написання статі).

5. Влияние паратиреоидного гормона на метаболические процессы при тяжелом глюкокортикоидном остеопорозе / С. Е. Золотухин, Г. С. Аусси, Н. Н. Шпаченко, Ю. Я. Крюк, Д. В. Пырко - Ортопедия, травматология и протезирование. - 2009. - № 1. - С. 45-48. (Особисто здобувачем отримані експерименти, виконано написання статті).

6. Способ экспериментального моделирования глюкокортикоидного остеопороза / Д. В. Пырко, Г. С. Аусси, А. С. Корнейчук, С. В. Попов. - Патологія (матеріали V національного Конгресу патофізіологів України). - 2008. - Т. 5, № 2. - С. 64. (Особисто здобувачем надані дані про зміни рентгенологічних показників при остеопорозі, проведено статистичній аналіз і узагальнення даних, написані тези).

7. Буфистова А. В. Способ моделирования и оценка тяжести глюкокортикоидного остеопороза в эксперименте / А. В. Буфистова, Н. Н. Шпаченко, Г. С. Аусси // Актуальні аспекти неспецифічних запальних захворювань суглобів: науково-практична конференція з міжнародною участю, 13-14 вересня 2007 р. : тези доповідей. - Хмельницький, 2007. - С. 26-28. (Особисто здобувачем надані дані про зміни рентгенологічних показників при остеопорозі, проведено статистичній аналіз і узагальнення даних, написані тези).

8. Особливості патогенезу і критерії тяжкості глюкокортикоїдного остеопорозу в експерименті / С. Є. Золотухін, Г. С. Ауссі, М. М. Шпаченко, Д. В. Пирко // ХII конгрес світової федерації лікарських товариств, 25-28 вересня 2008 р. : тези доповідей. - Івано-Франківськ - Київ - Чикаго, 2008. - С. 376. (Особисто здобувачем отримані експерименти, розроблені критерії тяжкості глюкокортикоїдного остеопорозу).

9. Особенности нарушения гормональной регуляции кальциевого обмена при глюкокортикоидном остеопорозе разной степени тяжести и его прогнозирование в эксперименте / Н. Н. Шпаченко, Г. С. Аусси, А. С. Корнейчук, А. А. Баешко // Ортопедія і травматологія: проблеми якості : науково-практична конференція, присвячена 75-річчю з дня народження, 50-річчю науково-практичної діяльності заслуженого діяча науки і техніки України, професора М. І. Хвисюка, 22-23 січня 2009 року : тези доповідей. - Харків, 2009. - С. 230-232. (Особисто здобувачем отримані експерименти, проведено їх аналіз, виконано написання тез).

Размещено на Allbest.ru

...