Лектинова гістохімія печінки та підшлункової залози в умовах експериментального цукрового діабету

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВЯ УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНИЙ ВИЩИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД

ІВАНО-ФРАНКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

14.03.09 - Гістологія, цитологія, ембріологія

Лектинова гістохімія печінки та підшлункової залози в умовах експериментального цукрового діабету

Балуш Леся Володимирівна

Івано-Франківськ 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Ященко Антоніна Михайлівна, Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, кафедра гістології, цитології та ембріології, професор кафедри.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Михайлюк Іван Олексійович, ДВНЗ “Івано - Франківський національний медичний університет” МОЗ України, кафедра патоморфології з секційним курсом, завідувач кафедри; доктор медичних наук, професор Грабовий Олександр Миколайович, Державна установа “Національний інститут раку” МОЗ України, завідувач відділу патологічної анатомії.

Захист відбудеться “9” червня 2010 року об 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 20.601.02 при ДВНЗ “Івано-Франківський національний медичний університет” МОЗ України (76018, м. Івано-Франківськ, вул. Галицька, 2).

Із дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці ДВНЗ “Івано-Франківський національний медичний університет” МОЗ України (76018, м. Івано-Франківськ, вул. Галицька, 7).

Автореферат розісланий “ 7 ” травня 2010 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 20.601.02 кандидат медичних наук, доцент О.Г. Попадинець

1. Загальна характеристика роботи

печінка цукровий діабет гістохімія

Актуальність теми. Цукровий діабет (ЦД) залишається одним з найпоширеніших тяжких захворювань у світі (Балаболкин М.И., 2000). У даний час проблема прогресуючого зростання кількості хворих на цукровий діабет набула особливої актуальності, оскільки, характерною рисою цієї патології є рання інвалідизація і висока смертність (Кураева Т.Л., 2003; Станєв О.І. та ін., 2006; Люта М.Я., 2008). За темпами росту захворюваності, інвалідизації і смертності діабет займає одне із провідних місць серед так званих “хвороб цилівізації” (Ященко А.М. та ін., 2008).

На порозі нового тисячоліття можна констатувати, що це захворювання є пандемією. Так, тільки у США щорічно діагностується до 600 тис. нових випадків (Карпов О.И., 2001). Не краща ситуація і в інших країнах. За літературними даними, щорічно число хворих в Україні збільшується на 5-7% (Сибірна Н.О., 2004; Кіхтяк О.П., Скрипник Н.В., 2004).

Упродовж останніх років інтенсивно вивчаються механізми інсулінової регуляції, етіологія і патогенез цукрового діабету, ведуться пошуки нових методів лікування, проте, головним завданням досліджень є перехід від діагностики діабету до його передбачення і від лікування до профілактики (Зилов А.В. та ін., 2005; Дорошенко О.М. та ін., 2006). На сьогоднішній день пускові фактори ініціації діабету до кінця не досліджені. Вивченню особливостей морфології печінки, підшлункової залози на тлі перебігу експериментального діабету присвячено ряд наукових праць (Медведь В.І., Грицай І.М., 2004; Полторак В.В. и др., 2004).

Аналіз наукової літератури показав, що питання ролі глікокон'югатів, які формують глікокод клітин, беруть участь у розпізнаванні, передачі інформації та переводять її у біологічні ефекти у структурних компонентах органів, зокрема, печінки (на її внутрішньоклітинних мембранах є асіалоглікопротеїновий рецептор людини (лектин печінки Н1), рецептор купферовських клітин печінки щура, асіалоглікопротеїновий рецептор R2/3 щура (лектин печінки 2/3)) та підшлункової залози (з її інсулоцитами асоційовані протеоглікани, в тому числі і ростовий фактор в-клітин та панкреатинасоційований білок 1 (РАР) (Волошин Н.А. та ін., 2005; Антонюк В.О., 2005) у процесах патогенезу цукрового діабету до цього часу не з'ясоване, тому запропоноване нами комплексне дослідження глікокон'югатів з використанням методів лектиногістохімії є актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проведена у рамках планових наукових тем кафедри гістології, цитології та ембріології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького “Лектинові маркери та цитоплазматичні сигнальні молекули у процесі клітинної диференціації і проліферації” (номер державної реєстрації 0700U00106), “Пошук нових препаратів лектинів із сировини Карпатського регіону та можливості їх застосування у біології та медицині” (номер державної реєстрації 0107U001048). Здобувач є виконавцем фрагментів зазначених науково-дослідних робіт.

Мета і завдання дослідження. Вивчити зміну глікокон'югатів та морфофункціональні особливості в структурних компонентах печінки і підшлункової залози в умовах норми, експериментального стрептозотоцин- індукованого (СЦ) цукрового діабету та діабету I типу в людини.

Задачі дослідження:

1. На тлі гіперглікемії, викликаної стрептозотоцином, дослідити гістологічні, гістохімічні та морфометричні параметри печінки.

2. Вивчити морфофункціональні особливості екзо- і ендокринної частин підшлункової залози за умов СЦ цукрового діабету.

3. Дослідити закономірності розподілу рецепторів лектинів у структурних компонентах печінки за умов експериментального СЦ цукрового діабету.

4. Вивчити особливості цитотопографії рецепторів лектинів у структурних компонентах підшлункової залози за умов СЦ цукрового діабету.

5. Дослідити особливості морфології та цитотопографію рецепторів лектинів у структурних компонентах печінки і підшлункової залози при діабеті I типу в людини.

6. Порівняти зміни цитотопографії рецепторів лектинів у досліджуваних органах за умов СЦ цукрового діабету і діабету I типу в людини.

Об'єкт дослідження: морфофізіологічні параметри та глікополімери структурних компонентів печінки і підшлункової залози.

Предмет дослідження: наслідки впливу діабету I типу на морфофункціональні параметри і глікокон'югати структурних компонентів печінки та підшлункової залози за даними лектиногістохімії.

Методи дослідження: лектиногістохімічні, загальногістологічні, гістохімічні, електронномікроскопічний, морфометричні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше вивчена зміна глікокон'югатів на основі цитотопографії рецепторів 8 лектинів різної вуглеводної специфічності у комплексному дослідженні структурних компонентів печінки та підшлункової залози при експериментальному СЦ цукровому діабеті на 14-й день його перебігу та діабеті I типу в людини. Вперше проведено комплексне дослідження морфофункціональних параметрів структурних компонентів підшлункової залози і печінки щура у нормі та при СЦ цукровому діабеті. Поряд із гіперглікемією, показана токсична дія стрептозотоцину на структурні компоненти печінки та екзокринної частини підшлункової залози. Вперше показана якісна зміна цитоплазматичних глікокон'югатів клітин Купфера з підвищенням ступеня їх сіалювання в поєднанні з демаскуванням кінцевих моносахаридних залишків D-галактози і N-ацетил-D-галактозаміну (експресії рецепторів SNA, PNA, SBA). Ідентифіковано нерівномірність розподілу рецепторів лектинів ConA (DMan), LABA (бLFuc), WGA (NAcDGlс) у гепатоцитах із центральною та периферійною локалізацією у складі часточок, що може служити віддзеркаленням порушень синтетичних і секреторних процесів у гепатоцитах при цукровому діабеті.

У підшлунковій залозі встановлено перерозподіл рецепторів NАcDGlc специфічного лектину WGA серед інсулоцитів острівців та їх редукція у ендотелії гемокапілярів.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані нові знання про роль вуглеводних детермінант у процесі перебігу ЦД, індукованого стрептозотоцином, можуть бути підґрунтям для подальших наукових досліджень у вивченні його патогенетичних механізмів на молекулярному рівні. Показана можливість використання лектинів як селективних гістохімічних маркерів структурних компонентів печінки та підшлункової залози.

Впровадження результатів дослідження. Матеріали дисертації впроваджені і використовуються в навчальному процесі під час викладу лекційного матеріалу та на практичних заняттях на кафедрах гістології, цитології та ембріології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького та Вінницького національного медичного університету імені М.І.Пирогова.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, сформульовано мету і завдання дослідження, виконано експеримент. Дисертант провела забір гістологічного матеріалу в експериментальних тварин, його фіксацію, зневоднення, ущільнення та виготовила гістологічні препарати. Виконано загальногістологічні та лектиногістохімічні методи, проведено аналіз мікропрепаратів та морфометричні дослідження з наступною статистичною обробкою отриманих даних. Обговорення і узагальнення результатів та висновки - спільно з науковим керівником. Ультраструктурне дослідження виконано у лабораторії електронної мікроскопії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького із консультативною допомогою старшого наукового співробітника к.б.н. Ковалишина В.І.

Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати роботи були представлені на науково-практичних конференціях: “Досвід і проблеми застосування сучасних морфологічних методів досліджень органів і тканин у нормі та при діагностиці патологічних процесів” (Тернопіль, 2007), “Прикладні аспекти морфології експериментальних і клінічних досліджень” (Тернопіль, 2008), “5th International symposium on cell/tissue injury and сytoprotection/organoprotection” (Ялта, 2008), “Морфологічні основи компенсаторно - пристосувальних процесів і їх структурне забезпечення“ (Тернопіль, 2008), “Актуальні проблеми функціональної морфології та інтегративної антропології”,“Прикладні аспекти морфології” (Вінниця, 2009).

Публікації результатів дослідження: Результати дисертації опубліковані в 10 наукових працях: 5 статей у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 5 - у тезах матеріалів науково - практичних конференцій.

Об'єм і структура дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 120 сторінках основного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та додатків. Список джерел містить 247 праць, із них 128 - праці вчених країн СНД і 119 - праці іноземних авторів. Робота ілюстрована 63 рисунками і 5 таблицями.

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили на 110 статевозрілих щурах-самцях лінії Вістар, масою 110-120 г, які були розділені на дві групи. Контрольна група включала 20 тварин, дослідна - 90. Усі тварини утримувались у стандартних умовах віварію з дотриманням санітарно-гігієнічних норм та раціону харчування. Інсулінзалежну форму цукрового діабету I типу викликали одноразовим внутрішньочеревним введенням стрептозотоцину фірми “Sigma” (США), приготовленому на 0,1М цитратному буфері (рН 4,5) (Великий Н.Н. та ін., 1995) з розрахунку 7 мг на 100 г маси тіла тварин Розвиток діабету контролювали за рівнем глюкози, який визначали глюкооксидазним методом із використанням реактивів фірми “Lachema” (Чехія).

Досліджувані органи (печінку і підшлункову залозу) забирали у тварин контрольної та дослідної груп після евтаназії, яку викликали передозуванням ефірного наркозу та під час автопсії у людей, які прижиттєво хворіли цукровим діабетом (6 померлих) і тих, що не хворіли цукровим діабетом (3 померлих) віком 23-45 років. Гістологічний матеріал фіксували у 4% нейтральному формаліні впродовж 24 год, промивали у проточній воді, зневоднювали у спиртах зростаючої концентрації (70є - 96є), ущільнювали у парафіні та заливали у блоки. Виготовляли зрізи на санному мікротомі марки МС-2 ТУ-64-1-1629-78 товщиною 5-7 мкм. Оглядові препарати забарвлювали гематоксиліном і еозином. Морфометричні дослідження проводили з допомогою комп'ютерної програми UTHSCSA ”Image Tool for Windows. Version 2.00“ (USA).

Рахували кількість поліплоїдних ядер гепатоцитів у нормі та при СЦ ЦД, кількість двоядерних гепатоцитів, площі гепатоцитів, ацинусів підшлункової залози та ядер панкреатоцитів із врахуванням найбільшого та найменшого діаметрів ядер. Статистичну обробку морфометричних показників проводили з використанням комп'ютерної програми Microsoft Office Excel 2003 STATISTICA 6 (USA) (Гумецький Р.Я.та ін., 2004; Автандилов Г.Г., 1990) з визначенням “М“ та середньої похибки “м“. У роботі використовували два рівні достовірності: р < 0,01; р < 0,001. Глікоген виявляли за допомогою ШИК-реакції (Пирс Э., 1962). B-інсулоцити ідентифікували альдегід-фуксином за удосконаленим методом Гоморі (Григорова Н.В. та ін., 2006). Нуклеїнові кислоти виявляли за методом Ейнарсона (Горальський Л.П. та ін., 2005). Електронномікроскопічне дослідження проводили за загальноприйнятою методикою після фіксації у 2%-му розчині чотириокису осмію на 0,1М фосфатному буфері (рН 7,36) з цукрозою. Вивчення і фотографування матеріалу здійснювали з допомогою мікроскопа УЕМВ - 100К (Україна). Для виявлення глікокон'югатів використовували набір із 8-ми лектинів різної вуглеводної специфічності, мічених пероксидазою (табл.1). Лектини виготовлені д. фарм. н. Антонюком В.О. у лабораторії “Лектинотест” Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького із сировини Карпатського регіону. Лектиногістохімічні дослідження проводили після фіксації матеріалу у 4% нейтральному формаліні прямим лектиногістохімічним методом (Луцик А.Д. и др., 1989). Контроль реакції - шляхом виключення лектину з інкубаційного розчину.

Таблиця 1 Лектини, мічені пероксидазою та їх вуглеводнева специфічність

Візуалізацію рецепторів лектинів здійснювали з допомогою фотосистеми “Olympus” на базі мікроскопа ВХ 41.

Результати дослідження та їх обговорення. На основі загальногістологічних, морфометричних та електронномікроскопічного досліджень печінки встановлено, що на 14-й день після введення стрептозотоцину на тлі гіперглікемії (концентрація глюкози 10-18 мМоль/л) спостерігаються яскраво виражені зміни: розширення просвіту синусоїдних гемокапілярів і перисинусоїдного простору Діссе, інфільтрація лейкоцитами портальних трактів, внутрішньочасточкова інфільтрація лімфоцитами і плазмоцитами, зерниста та жирова дистрофія гепатоцитів, каріопікноз ядер у окремих гепатоцитах, місцями ділянки некрозів, утворення лімфоцитарних інфільтратів всередині печінкових часточок, розширення центральних вен, зменшення кількості глікогену у напрямку до периферії часточки, появляється глікоген у ядрах гепатоцитів, що можна розглядати як наслідок розвитку гепатопатії при цукровому діабеті. Морфометричні дослідження показали збільшення кількості двоядерних гепатоцитів від 3,46 + 0,20 (у контролі) до 4,46 + 0,20 (у досліді), р < 0,001; збільшення кількості поліплоїдних гепатоцитів у 1,43 рази, р < 0,001, що можна розглядати як компенсаторну реакцію на введення стрептозотоцину та пошкоджуючу дію гіперглікемії. Це було підтверджено електронномікроскопічно. Так, помітні зміни морфології синусоїдних гемокапілярів (неоднорідність структури базальної мембрани), ендотеліоцитів (розширення у них канальців ендоплазматичної сітки (ЕПС), гіпертрофія мітохондрій та дезорганізація їх крист), форми еритроцитів у просвіті гемокапілярів, що, очевидно, обумовлено глікозилюванням гемоглобіну. Люта М.Я. (2008) виявила, що чим інтенсивніший процес глікозилювання, тим більш різко виражена зміна форми еритроцитів. Нами констатовано також нерівномірність ширини простору Діссе, відсутність у окремих гепатоцитах включень глікогену, нагромадження у них ліпопротеїнових включень, зміни мембранних компонентів гепатоцитів. Такі прояви є типовими для токсичного пошкодження гепатоцитів (Кулинич Г.Б., 2009). Одночасно відмічено варіабельність структури і морфології мітохондрій, що опосередковано вказує на зміну мітохондріального потенціалу і є одним із механізмів запуску апоптозу гепатоцитів (Фільченков О.О., 2009).

Лектиногістохімічні дослідження виявили специфіку зв'язування лектинів із структурними компонентами печінки як контрольних, так і дослідних тварин. При експериментальному СЦ ЦД спостерігалася редукція рецепторів DMan - специфічного лектину СonA у цитоплазмі центролобулярних гепатоцитів з одночасною експресією реактивності ядерних та цитоплазматичних глікокон'югатів ендотеліоцитів центральних вен і ядер прилеглих до них гепатоцитів, а також у складі цитоплазми гепатоцитів периферії часточок та ендотеліоцитів судин портальних трактів. Це є гістохімічною ознакою накопичення глікогену в ядрах гепатоцитів, ядрах і цитоплазмі судинного ендотелію та співпадає з попередньо отриманими результатами з використанням інших методів дослідження (Шерлок Ш. та ін., 1999). Слід врахувати, що СonA має певну афінність до елементів гладкої та гранулярної ендоплазматичної сітки, гетерохроматину та ядерцевого апарату гепатоцитів (Roth J., 1983). Характер зв'язування лектину LABA зі структурними компонентами печінки як у нормі, так і при ЦД якісно нагадував зв'язування СonA, хоча дещо відрізнявся інтенсивністю реакції. Подібність реактивності обох лектинів обумовлена тим фактором, що певну направляючу роль у зв'язуванні лектину LABA, окрім фукози, відіграють манозильні детермінанти глікополімерів (Антонюк В.О., 2005). Лектин PNA в нормі виявляв помірну спорідненість до цитоплазматичних глікокон'югатів гепатоцитів та волокнистих структур строми печінки. При ЦД рецептори цього лектину додатково з'являлися в цитоплазмі клітин Купфера. Лектин RCA, вуглеводна специфічність якого подібна до лектину PNA, продемонстрував істотні відмінності у зв'язуванні зі структурними компонентами печінки. Так, у печінці тварин контрольної групи висока експресія рецепторів цього лектину була в ендотелії синусоїдних капілярів, центральних вен та судин портальних трактів. Відмінності між гістохімічною реактивністю PNA і RCA обумовлені присутністю залишків сіалової кислоти, які окрім D-галактози визначають зв'язування лектину RCA з глікокон'югатами (Антонюк В.О., 2005). При ЦД рецептори цього лектину у вищезгаданих структурах були редуковані, спостерігалася поступова редукція в гепатоцитах інших лектинів, таких як SBA, у напрямку від центральних вен до периферії часточок із одночасною їх експресією в цитоплазмі клітин Купфера. Спорідненість до NАcDGal- специфічного лектину SBA проявляли епітеліоцити холангіол і жовчних проток. Посилювалась експресія рецепторів лектину HPA, який має подібну вуглеводну специфічність до лектину SBA в ендотеліоцитах судин портальних трактів, тоді як у контролі висока експресія рецепторів цього лектину була в цитоплазмі гепатоцитів, ретикулярних волокнах перисинусоїдного простору Діссе, ендотеліоцитах внутрішньої оболонки центральних вен. Відрізнялась і експресія рецепторів NAcDGlc-специфічного лектину WGA при ЦД від контрольної групи тварин. Простежувалася його редукція у напрямку від центральних вен до периферії часточок (найвищу реактивність до цього лектину виявляли гепатоцити навколо центральної вени та ендотеліоцити синусоїдних гемо капілярів). Лектин WGA може зв'язуватись із рецепторами інсуліну у складі плазмолеми гепатоцитів. (Антонюк В.О., 2005). Нерівномірна реактивність структур печінки з цим лектином при ЦД свідчить про зменшення числа рецепторів до інсуліну в гепатоцитах периферії часточок і нагромадження глікополімерів із детермінантами DGlcNAc центролобулярно. Сіалоглікани в основному виявлялися в печінці інтактних тварин у цитоплазмі гепатоцитів, тоді як при ЦД виявлена інтенсивна експресія SNA-реактивних глікокон'югатів у цитоплазмі клітин Купфера, що, ймовірно, пов'язано з їх сіалізацією. За даними Cordield (1992) (цитовано за Антонюк В.О., 2005), сіалові кислоти відіграють стрижневу роль для вірусів, пептидних гормонів і токсинів. Високий вміст сіалогліканів виявлений на поверхні макрофагів інших органів (ЯщенкоА.М.та ін., 2007).

Запалення будь-якої тканини починається з лейкоцитарної інфільтрації, що здійснюється в результаті взаємодії селектинів судинного ендотелію з глікопротеїном PSG-I лейкоцитів за механізмом упізнавання залишків сіалових кислот у його складі, а також внаслідок взаємодії з комплексом сульфатованих тирозинів лейкоцитарних мембран (Волошин Н.А. та ін., 2005; Хижняк О.М. та ін., 2007).

Деструктивні зміни гепатоцитів, наявність внутрішньочасточкових вогнищ запального характеру можуть бути причиною активації, а, можливо, і збільшення числа макрофагів при діабеті; сіалювання їх поверхні супроводжується посиленням їх адгезивних властивостей щодо елементів тканинного детриту. Слід зазначити, що при ЦД активовані клітини Купфера, кількість яких збільшувалася, проявляли афінність до лектинів PNA та SBA, що може бути свідченням того, що поряд із сіалізацією синтезованих цими клітинами глікополімерів мало місце демаскування в їх складі залишків D - галактози та N- ацетил - D- галактозаміну.

Отже, при ЦД усі використані нами лектини зв'язувалися з ендотелієм судин портальних трактів, синусоїдних гемокапілярів або центральних вен часточок печінки, тоді як у тварин контрольної групи афінність до ендотелію проявляли лектини RCA, HPA та WGA.

У підшлунковій залозі при ЦД констатовані деструктивні зміни як у екзокринній, так і у ендокринній її частинах, збільшення числа лімфатичних вузликів довкола підшлункової залози. Спостерігалася лейкоцитарна інфільтрація острівців Лангерганса, а велика кількість лімфоцитів посилює пошкодження В-клітин (Щербак А.В., 1989). Помітне зменшення кількості острівців, зміна та втрата їх чітких контурів і форми, зниження в них кількості клітин з альдегідфуксинофільним компонентом. У екзокринній частині виявлені ділянки некрозів. Подібні зміни спостерігали при алоксановому діабеті (Долатказіна К.Б., 1984).

Збільшення кількості лімфатичних вузликів біля підшлункової залози, інфільтрація острівців лімфоцитами, що мало місце у нашому випадку, може також приводити до втрати В - інсулоцитів, що і підтверджується зменшенням кількості клітин з альдегідфуксинофільним компонентом.

При ЦД відмітили зменшення ШИК-позитивного матеріалу у інсулоцитах, їх ядрах та у панкреатоцитах; збільшення площі ацинусів - 1117,38 ± 21,42 мкм2 (у контролі - 888,68 ±15,41 мкм2) (р ‹ 0,001), збільшення площі ядер від 125,35 ± 2,39 мкм2 до 165,00 ± 3,66 мкм2 (р ‹ 0,001).

Електронномікроскопічне дослідження показало деструктивні зміни В- та А- інсулоцитів, їх гранули втрачали мембрани і біля них з'являлись автофаголізосоми, помітні гіпертрофовані мітохондрії та розширені цистерни апарату Гольджі (АГ), дезорганізація мембран ЕПС. Змін зазнавали і А-інсулоцити з периваскулярною локалізацією. У просвіті гемокапілярів острівців спостерігалась адгезія еритроцитів з люменальною поверхнею ендотеліоцитів. У екзокринній частині відмічені морфологічні зміни в компонентах мікроциркуляторного русла: потовщення базальної мембрани, збільшення розміру ядер ендотеліоцитів, гіпертрофія їх ядерець.

У панкреатоцитах є розширення канальців ЕПС і збіднення їх на рибосоми, що вказує на зниження у них синтетичних процесів. Відмічена також гіпертрофія АГ. Для центроацинозних клітин характерна наявність вакуолей, що є ознакою їх дегенерації. Отже, на тлі збільшення площі ацинусів у цитоплазмі панкреатоцитів спостерігаються зміни структури їх органел.

Лектиногістохімічні дослідження підшлункової залози показали, що більшість лектинів зв'язувались із базальною мембраною ацинусів (ConA, SNA, PNA, SBA), гомогенною чи зимогенною зоною панкреатоцитів, що вказує на зміну хімічного складу секрету в процесі секреторного циклу. При ЦД відмітили фукозилювання зимогенних гранул з перевагою у їх складі рецепторів бLFuc. У міжчасточкових протоках на апікальній поверхні епітеліоцитів констатували вуглеводні детермінанти у вигляді NАcDGal та бLFuc. В ендокринній частині залози контрольних тварин високу спорідненість до інсулоцитів мав лектин WGA, інші лектини, такі як HPA, SNA, ConA, виявляли гомогенність зв'язування з інсулоцитами. На 14-й день на тлі гіперглікемії відмічений перерозподіл рецепторів лектину WGA серед інсулоцитів. Вуглеводні детермінанти DMan, вDGal локалізувались у базальній мембрані ацинусів, у гомогенній зоні панкреатоцитів з наступним глікозилюванням на мембранах АГ із залученням вуглеводневих детермінант NАcDGIс, NАcDGal та Neu5Ac(б2-Gal/DGalNAc) до формування гранул зимогену, що вказує на участь останніх у процесах їх дозрівання. Нагромадження секреторних гранул на апікальній поверхні панкреатоцитів з високим ступенем експресії рецепторів лектинів SNA,WGA та HPA у тварин контрольної групи та незначна їх редукція у складі зимогенних гранул і часткове маскування їх бLFuc при ЦД, засвідчує зміну характеру хімічного складу секрету, що може негативно впливати на процеси травлення вже на 14-й день розвитку ЦД.

Нерівномірність нагромадження на апікальній поверхні панкреатоцитів у зимогенних гранулах глікополімерів NAcDGal, сіалової кислоти, NAcDGlс та очевидне сповільнення екструзії супроводжується гіпертрофією ацинусів, що свідчить про збільшення їх площі і достовірне збільшення площі їх ядер. Процеси транспорту секрету по міжчасточкових протоках супроводжуються його подальшим фукозилюванням при ЦД.

Дослідження автопсійного матеріалу печінки і підшлункової залози людини при ЦД I-го типу задекларували дещо подібну картину, як при СЦ ЦД. Так, у печінці також констатовано перипортальну лейкоцитарну інфільтрацію поліморфоядерними лейкоцитами, розширення синусоїдних гемокапілярів, жирову дистрофію гепатоцитів, а також збільшення площі гепатоцитів від 206,58 ± 36,93 мкм2 - у контролі до 385,47 ± 54,59 мкм2 - при ЦД, р ‹ 0,01.

У підшлункові залозі при ЦД I типу констатували зміни деструктивного характеру в екзокринній частині залози. На тлі ацинусів, що зберігали свою типову будову, частина їх повністю втрачала характерну для них організацію і залишалася тільки базальна мембрана. Поряд із означеним, діагностували збільшення площі ацинусів від 992,95 ± 31,0 мкм2 - в осіб, що не хворіли ЦД до 2037,82 ± 49,77 мкм2 - у тих, що хворіли ЦД, р ‹ 0,01. В острівцях Лангерганса спостерігалася часткова або повна втрата інсулоцитів, інфільтрація лейкоцитами навколо острівця. Характерно, що при СЦ ЦД частина острівців зберігала свою типову будову.

На фоні СЦ ЦД окремі клітини острівців, що зберігали морфологію, виявляли високу афінність до лектину WGA. Клітинний детрит острівців був позбавлений рецепторів цього лектину. Відмітили експонування комплементарних до лектину WGA-глікокон'югатів у внутрішній еластичній мембрані судин.

Для підшлункової залози людини при ЦД I типу з терміном перебігу від 3 до 5 років характерний більш високий ступінь ураження екзокринної частини залози з ознаками жирової трансформації та надмірне фукозилювання окремих груп клітин ацинусів із локалізацією їх біля адипоцитів.

У печінці тварин з експериментальним цукровим діабетом і діабетом I типу виявляли перепрограмування глікокон'югатів структурних компонентів печінки з одночасним збільшенням кількості клітин Купфера та частковою втратою ними сіалогліканів при діабеті I типу в людини, що, можливо, обумовлено терміном перебігу захворювання або видовою специфічністю. Отже, при діабеті I типу людини та СЦ ЦД на 14-ту добу його перебігу в печінці та підшлунковій залозі спостерігається специфічна модифікація глікокон'югатів структурних компонентів, що може бути причиною патогенетичних механізмів морфофункціональних змін. Проведені дослідження показали перспективність використання лектинів у дослідженнях глікополімерів структурних компонентів печінки і підшлункової залози на тлі СЦ ЦД і діабету I типу в людини.

Висновки

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової задачі - встановлення модифікації глікокон'югатів структурних компонентів печінки і підшлункової залози за умов стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету в експерименті та діабету I типу в людини з використанням 8 лектинів різної вуглеводної специфічності і комплексу загальногістологічних, гістохімічних, морфометричних та електронномікроскопічного досліджень, що доповнює існуючі уявлення про патогенетичні механізми проявів цукрового діабету в досліджуваних органах і показує можливість застосування лектинів для вивчення вуглеводних детермінант при патологічних процесах.

1. На 14-ту добу після внутрішньочеревного введення стрептозотоцину на тлі гіперглікемії (10-18 мМоль/л) спостерігається гепатопатія, що супроводжується інфільтрацією лейкоцитами портальних трактів, внутрішньочасточковою інфільтрацією лімфоцитами, жировою дистрофією гепатоцитів, розширенням центральних вен, просторів Діссе та синусоїдних гемокапілярів. У відповідь на перечислені зміни відбувається збільшення кількості поліплоїдних гепатоцитів на стандартній площі зрізу від 2,91 ±0,14 - у контролі до 4,25 ±0,18 - при ЦД, р ‹ 0,01; збільшення кількості двоядерних гепатоцитів від 3,46 ±0,20 - у контролі до 4,46±0,20 - при ЦД, р ‹ 0,001; зниження інтенсивності ШИК-реакції в гепатоцитах із периферійною локалізацією з одночасним збільшенням кількості клітин Купфера.

2. Електронномікроскопічне дослідження показало, що при ЦД у просвіті синусоїдних гемокапілярів печінки наявні гіперагрегати еритроцитів; дезорганізація мітохондріальних крист, ліпопротеїнові включення, дезорганізовані пероксисоми, гіпертрофія АГ та розширення канальців ЕПС - у гепатоцитах. Звуження просвіту жовчних капілярів, відсутність або зменшення на окремих територіях гепатоцитів включень глікогену вказують на порушення синтетичних та метаболічних процесів у гепатоцитах.

3. У підшлунковій залозі на тлі СЦ ЦД відбувається збільшення числа лімфатичних вузликів у капсулі органа, лейкоцитарна інфільтрація острівців Лангерганса, зменшення кількості острівців із одночасним зменшенням у них клітин з альдегідфуксифільним компонентом, що відповідають В- інсулоцитам; збільшення площі ацинусів від 888,8 ±15,41 мкм2 - у контролі до 1117,38 ± 21,42 мкм2 - у досліді, р ‹ 0,001; збільшення площі ядер панкреатоцитів від 125,35 ±2,39 мкм2 - у контролі до 165± 3,66 мкм2 , р ‹ 0,001.

4. При електронній мікроскопії встановлено розширення канальців ЕПС, гіпертрофію АГ у панкреатоцитах, дегенеративні зміни центроацинозних клітин.

5. Для В-інсулоцитів характерна зміна морфології гранул або повна їх відсутність, гіпертрофія мітохондрій, розширення цистерн АГ, дезорганізація мембран ЕПС. А-інсулоцити відзначилися деструкцією крист мітохондрій, вакуолізацією їх матриксу.

6. За даними лектиногістохімії на тлі СЦ ЦД діагностовано модифікацію вуглеводних детермінант ендотелію синусоїдних гемокапілярів, центральних вен і судин портальних трактів печінки, що, ймовірно, лежить в основі молекулярних механізмів зміни адгезивних властивостей ендотелію та збільшення проникності судинної стінки. Констатовано якісну зміну цитоплазматичних глікокон'югатів клітин Купфера з підвищенням ступеня їх сіалювання в поєднанні з демаскуванням кінцевих моносахаридних залишків D-галактози і N-ацетил-D-галактозаміну (експресії рецепторів SNA, PNA, SBA).

7. Ідентифіковано нерівномірність розподілу рецепторів лектинів ConA (DMan), LABA (бLFuc), WGA (NAcDGl) у гепатоцитах із центральною та периферійною локалізацією у складі часточок, що може служити віддзеркаленням порушень синтетичних і секреторних процесів у гепатоцитах при ЦД.

8. У підшлунковій залозі на тлі СЦ ЦД відмічено перерозподіл рецепторів NАcDGlc специфічного лектину WGA серед інсулоцитів острівців та їх редукція в ендотелії гемокапілярів. Встановлено участь вуглеводних детермінант DMan, вDGal у формуванні базальної мембрани ацинусів та синтезі секрету в гомогенній зоні на мембранах ЕПС із наступним глікозилюванням на мембранах АГ із залученням вуглеводних детермінант NАcDGlc, NАcDGal та Neu5Ac(б2- Gal/D GalNAc) до формування зимогенних гранул.

9. При діабеті I типу в людини встановлена часткова редукція рецепторів лектинів HPA, SNA, WGA у складі зимогенних гранул та експресія у них рецепторів бLFuc, що змінює хімічний склад секрету екзокринної частини підшлункової залози і може мати негативний вплив специфічного лектину LABA на процеси травлення.

10. При експериментальному СЦ ЦД на 14-й день його перебігу та діабеті I типу в людини встановлені подібні зміни як у печінці, так і підшлунковій залозі, однак, при діабеті I типу в людини виявлені більш виражені морфологічні зміни у печінці (жирова дистрофія гепатоцитів, перерозподіл глікокон'югатів судинної стінки, помітне зниження експресії SNA - реактивних глікокон'югатів у клітинах Купфера) та підшлунковій залозі (посилення інтенсивності експресії рецепторів лектину LABA (бLFuc) у складі секрету ацинусів, зменшення числа острівців Лангерганса та повне руйнування у них інсулоцитів), що, очевидно, обумовлене терміном перебігу та ступенем важкості захворювання.

Практичні рекомендації

1. Одержані нові знання про роль вуглеводних детермінант у процесі виникнення цукрового діабету, індукованого стрептозотоцином, можуть бути підґрунтям для подальших наукових досліджень у вивченні патогенетичних механізмів цієї патології на молекулярному рівні.

2. Результати дослідження можна рекомендувати до використання у навчальному процесі на кафедрах гістології, терапії, ендокринології.

3. Активно застосовувати лектиногістохімічні методики при дослідженні патологічних процесів у різних органах та системах.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Балуш Л.В. Морфофункціональні особливості печінки щурів після введення стрептозотоцину / Л.В. Балуш, В.І. Ковалишин, А.М. Ященко // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія . - 2008. - №1 (41). - С. 35-41. Здобувач виконала експеримент, забір матеріалу, узагальнення та формулювання висновків.

2. Балуш Л.В. Вплив стрептозотоцину на морфофункціональні особливості і вуглеводні детермінанти структурних компонентів підшлункової залози / Л.В. Балуш, А.М. Ященко // Світ медицини і біології. - 2008. - №4. - С.6-12. Здобувач виконала експеримент, забір матеріалу, виготовила гістологічні препарати, описала матеріал та сформулювала висновки.

3. Балуш Л.В. Гістохімічні та електронномікроскопічні дослідження підшлункової залози на тлі експериментального цукрового діабету / А.М. Ященко, Л.В. Балуш, О.Д. Луцик // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. - 2009. - №1. - С.37-43. Дисертант опрацювала робочу схему експерименту, провела аналіз літературних даних і власних результатів.

4. Балуш Л.В. Порівняльний аналіз впливу стрептозотоцину і діабету I-го типу на морфофункціональні аспекти та глікокон'югати печінки і підшлункової залози / Л.В. Балуш, А.М. Ященко // Світ медицини і біології. - 2009. - №4. - С.17 -23. Здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, виготовленні гістологічних препаратів, описанні матеріалу і формулюванні висновків.

5. Ященко А.М. Лектинова гістохімія печінки щура при стрептозотоцин-індукованому цукровому діабеті / А.М. Ященко, Л.В. Балуш, О.Д. Луцик // Вісник морфології. - 2008. - №1. - С.239-245. Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь у написанні та оформленні статті.

6. Балуш Л.В. Рецептори лектинів у структурних компонентах печінки при цукровому діабеті / Л.В. Балуш, А.М. Ященко, О.Д. Луцик // Досвід і проблеми застосування сучасних морфологічних методів досліджень органів і тканин у нормі та при діагностиці патологічних процесів: мат. наук.-практ. конф. - Тернопіль, 2007. - С.7-9. Здобувач провела дослідження, опрацювала та проаналізувала експериментальні дані, оформила тези.

7. Балуш Л.В. Глікополімери печінки щура при стрептозотоцин-індукованому діабеті: гістохімічне дослідження з використанням лектинів / Л.В. Балуш, А.М. Ященко // Прикладні аспекти морфології експериментальних і клінічних досліджень: мат.наук.-практ. конф. - Тернопіль, 2008. - С.9-10. Здобувачем проведено дослідження матеріалу, опис експериментальних даних.

8. Балуш Л.В. Цитотопографія глікогену та рецепторів конканаваліну А у структурних компонентах печінки щура при стрептозотоцин - індукованому діабеті / Л.В. Балуш, А.М. Ященко // Актуальні проблеми функціональної морфології та інтегративної антропології, прикладні аспекти морфології: мат. наук.-практ. конф. - Вінниця, 2009. - C.25-26. Особисто здобувачем проведені морфометричний і статистичний аналіз, узагальнення даних.

9. Ященко А.М. Роль вуглеводних детермінант у процесах формування секрету підшлункової залози щурів у нормі та експериментальному цукровому діабеті / А.М. Ященко, Л.В. Балуш // Морфологічні основи компенсаторно- пристосувальних процесів і їх структурне забезпечення: мат. наук.-практ. конф. - Тернопіль, 2008. - С. 71-72. Особисто здобувачем проведено забір матеріалу для дослідження, виготовлення зрізів та узагальнення отриманих даних.

10. Balush L.V. Cytotopography of lectin receptors in the liver of rat in streptozotocin-induced diabetes mellitus / L.V. Balush, А.М. Yashchenko // 5th International symposium on cell/tissue injury and сytoprotection/organoprotection: мат. симпозіуму. - Ялта, 2008. - С.9. Дисертант виконала дослідження і оформила тези.

Анотація

Балуш Л.В. Лектинова гістохімія печінки та підшлункової залози в умовах експериментального цукрового діабету. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.09.- гістологія, цитологія, ембріологія. ДВНЗ “Івано-Франківський національний медичний університет”, Івано-Франківськ, 2010.

Із використанням 8 лектинів різної вуглеводної специфічності, загальногістологічних та морфометричних методів проведено комплексне вивчення глікокон'югатів та морфофункціональних особливостей печінки і підшлункової залози при цукровому діабеті. Встановлена зміна цитоплазматичних глікокон'югатів клітин Купфера, яка проявлялася підвищенням ступеня їх сіалювання у поєднанні з демаскуванням кінцевих моносахаридних залишків D-галактози і NAcDGal. Відмічено нерівномірність розподілу рецепторів лектинів ConA, LABA,WGA у гепатоцитах. Встановлена участь вуглеводних детермінант DMan, DGal у формуванні базальної мембрани ацинусів та синтезі секрету у гомогенній зоні із залученням їх до формування гранул зимогену. Показана доцільність використання лектинів у якості селективних гістохімічних маркерів структурних компонентів печінки та підшлункової залози.

Ключові слова: печінка, підшлункова залоза, стрептозотоцин, лектинова гістохімія, діабет I типу.

Аннотация

Балуш Л.В. Лектиновая гистохимия печени и поджелудочной железы в условиях экспериментального сахарного диабета. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.09. гистология, цитология, эмбриология. Ивано-Франковский национальный медицинский университет, Ивано-Франковск, 2010.

Диссертация посвящена изучению цитотопографии гликоконьюгатов структурных компонентов печени и поджелудочной железы в условиях сахарного диабета.

Применены общегистологические, гистохимические, электронномикроскопический и лектиногистохимические методы с использованием 8 лектинов разной углеводной специфичности, меченых пероксидазой, полученных из сырья Карпатского региона в лаборатории “Лектинотест” Львовского национального медицинского университета имени Данила Галицкого. Набор лектинов включал: конканавалин А (ConA), специфичный к бDMan; лектин зародышей пшеницы (WGA), специфичный к NАcDGlc; лектин бабовника анагиролистого (LABA), специфичный к бL-Fuc; лектин арахиса (PNA), специфичный к вDGal; лектин бузины чёрной (SNA), специфичный к Neu5Ас/2>6Gal; лектин сои (SBA), специфичный к NАcDGal; лектин виноградной улитки (HPA), специфичный к NАcDGal; лектин клещевины (RCA), специфичный к вDGal>вDGal>NАс. Проведено комплексное исследование морфофункциональных особенностей, гликоконьюгатов печени и поджелудочной железы в норме и при стептозотоцин-индуцированном (СЦ) сахарном диабете (СД). Показано, что на 14-ый день СЦ СД происходят морфологические изменения мембранных органелл гепатоцитов, стенки синусоидных гемокапилляров, расширение пространства Диссе, изменяется цитотопография гликогена, наблюдается гликоген в ядрах гепатоцитов, увеличивается количество полиплоидных и двухядерных гепатоцитов, лейкоцитарная инфильтрация портальных трактов, внутридольковая лейкоцитарная инфильтрация, увеличение количества клеток Купфера. В поджелудочной железе - увеличение площади ядер панкреатоцитов с последующей гипертрофией ацинусов, уменьшение числа В-инсулоцитов с альдегидфуксинофильным компонентом или полное их отсутствие, морфологические изменения гранул В- и А-инсулоцитов. Методом лектин - пероксидазной техники на 14-ый день СЦ СД констатированы изменения цитоплазматических гликоконьюгатов клеток Купфера, что сопровождается повышением степени их сиалирования с одновременным демаскированием концевых моносахаридных остатков D-галактозы и NАcDGlc. Идентифицировано неравномерность распределения рецепторов лектинов ConA, LABA, WGA в гепатоцитах с центролобулярной и периферической локализацией. Установлена модификация углеводных детерминант эндотелия синусоидных гемокапилляров, центральных вен и сосудов портальных трактов с преобладанием в них рецепторов WGA.

В поджелудочной железе на фоне диабета установлено перераспределение рецепторов лектина WGA (NАcDGlc) среди инсулоцитов островков в зависимости от их локализации. Установлено участие углеводных детерминант к DMan, вDGal в формировании базальной мембраны ацинусов и синтезе секрета в гомогенной зоне на мембранах эндоплазматической сети с последующим гликозилированием на мембранах аппарата Гольджи с комплементированием углеводных детерминант NАcDGlc, NАcDGa и Neu 5Ас(б2-6Gal/DGaINAc) к формированию зимогенных гранул.

На фоне диабета I типа у человека установлена частичная редукция рецепторов лектинов HPA, SNA, WGA в составе зимогенных гранул и экспрессия в них бL-Fuc-специфического лектина LABA, что изменяет химический состав секрета экзокринной части поджелудочной железы с последующим отрицательным влиянием на процессы пищеварения. При сравнительном исследовании печени и поджелудочной железы в условиях СЦ СД и диабета I типа у человека установлены более выраженные морфологические изменения в исследуемых органах, снижение интенсивности сиализации клеток Купфера, более интенсивное фукозилирование секрета ацинусов поджелудочной железы, уменьшение количества островков Лангерганса, полное розрушение инсулоцитов, что, вероятно, обусловлено степенью тяжести заболевания.

Показана перспективность использования лектинов в качестве селективных гистохимических маркеров структурных компонентов печени и поджелудочной железы.

Ключевые слова: печень, поджелудочная железа, стрептозотоцин, лектиновая гистохимия, диабет I типа.

Annotation

Balush L.V. Lectin histochemistry of the liver and pancreas under conditions of experimental diabetes mellitus. - Manuscript.

Dissertation for conferment of the scientific degree of candidate of medical sciences in the speciality 14.03.09 - histology, cytology, embryology. Ivano-Frankivsk National Medical University, Ivano-Frankivsk, 2010.

With the utilization of 8 lectins of different carbohydrate specificity, general histological methods and morphometry have been carried out complex investigation of the morphofunctional peculiarities and glycoconjugates of the liver and pancreas in diabetes mellitus. In diabetes mellitus there have been established changes of cytoplasmic glycoconjugates of Kupffer's cells manifested by greater degree of their sialization concomitant with unmasking the final monosaccharide residues of D-galactose and NAcDGal. There have been established participation of carbohydrate determinants DMan and DGal in the formation of basal membrane of the acini and in the synthesis of secretion in the homogenic zone with the involvement of carbohydrate determinants in the formation of zymogenic granules. It has been shown the expedience of usage of lectins as selective histochemical markers of structural components of the liver and pancreas.

Key words: liver, pancreas, streptozotocin, lectin histochemistry, type I diabetes mellitus.

Размещено на Allbest.ru