Оцінка протипухлинної активності кріоконсервованих клітин фетальної печінки в експериментальній моделі раку молочної залози

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

УДК: 615.361.36.013.014.41:618.19-006.55-092.4

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Оцінка протипухлинної активності кріоконсервованих клітин фетальної печінки в експериментальній моделі раку молочної залози

03.00.19. - кріобіологія

Бондарович Микола Олександрович

Харків - 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, академік НАН України Гольцев Анатолій Миколайович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, головний науковий співробітник відділу кріопатофізіології і імунології, м. Харків.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Бондаренко Валерій Антонович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріофізіології клітини, м. Харків;

доктор медичних наук, професор Попов Микола Миколайович, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, завідувач кафедри загальної і клінічної імунології та алергології, м. Харків.

Захист дисертації відбудеться “23” 03 2010 р. о 13.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розіслано “ 23” 02 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, академік НАН України, доктор медичних наук Гольцев А.М.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Важливим компонентом клітинної і тканинної терапії є фетальний біоматеріал [Грищенко В.И. и др., 2003; Демин Ю.А. и др., 2007; П'ятикоп В.О. та ін., 2009]. Особливу значимість для клініцистів мають клітини фетальної печінки (КФП). Їхнє використання як лікувального матеріалу обґрунтовано насамперед наявністю клітин стовбурового компартменту, а так само медіаторів з гістогенетичним і імуномодулюючим потенціалом, які продукуються стовбуровими і більш диференційованими елементами [Гольцев А.Н. и др., 1994, 1998, 2000; Le Blanc K. et al., 2003]. Завдяки цьому використання КФП є однією з терапевтичних стратегій мінімізації розвитку багатьох патологічних станів. Прийнято вважати, що як і інші представники продуктів фетоплацентарного комплексу (ПФПК) КФП в організмі реципієнта відповідають “на запит ситуації”, виявляючи поліфункціональну відповідь у конкретних умовах розвитку тієї чи іншої патології [Гольцев А.Н. и др., 2000, 2006]. Як в експерименті, так і в клініці була доведена ефективність КФП при лікуванні захворювань аутоімунної природи, до яких відносять й онкопатологію [Храновська Н.М., 2001; Гольцев А.Н. и др., 2003, 2006]. Однак залишаються не вивченими конкретні механізми реалізації протипухлинної активності КФП. Зокрема, не з'ясовані характер впливу КФП на стан імунної системи (ІС) пухлиноносія, оптимальні терміни використання в залежності від стадії розвитку патології. Особлива увага в онкології приділяється вивченню превентивного лікування злоякісних новоутворень, що стало можливим завдяки освоєнню сучасних методів молекулярно-генетичної ідентифікації схильності до розвитку онкологічних захворювань [Neuhausen S.L. et al., 2009; Santarius T. et al., 2010]. При такому підході лікування виключається використання хіміо- і променевої терапії [Чехун В.Ф., 2008; Blaha P. et al., 2009], що визначає необхідність апробації препаратів природного походження, до яких можна віднести КФП. Не меншу значимість при цьому має атестація у пухлиноносія стану стовбурових ракових клітин (СРК) як найголовнішого фактора індукції і підтримки розвитку злоякісного росту [Al-Hajj M. et al., 2004; Pece S. et al., 2010].

Найважливішим компонентом аплікації клітинної і тканинної терапії в медичній практиці є кріобіологічні технології [Бездетко П.А. и др., 2000; Грищенко В.И. и др., 2003]. Проте дотепер продовжується робота з оцінки впливу кріоконсервування на структурно-функціональні характеристики ПФПК і зокрема КФП [Гольцев А.Н. и др., 2009; Петренко А.Ю. и др., 2009; Natan D. et al., 2009]. Отримано переконливі докази модифікуючого впливу кріоконсервування на стан біооб'єкта, його терапевтичний потенціал [Fuller B.J. et al., 2003; Гольцев А.Н. и др., 2006]. У зв'язку з цим необхідно провести доклінічну порівняльну оцінку впливу КФП на системи протипухлинного захисту до і після кріоконсервування. Зручною експериментальною моделлю вивчення патогенезу й оцінки ефективності превентивної протипухлинної терапії можуть бути миші лінії С3Н з генетично детермінованим розвитком раку молочної залози (РМЗ) на визначених етапах онтогенетичного розвитку.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках тематичного плану Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за темами №2.2.6.6 “Визначення характеру і впливу нативних та кріоконсервованих продуктів ембріофетоплацентарного комплексу різних строків гестації на структурно-функціональний стан лімфогемопоетичного комплексу молодих та старих тварин в умовах розвитку аутоімунних захворювань” (№ держреєстрації 0102U002023), №2.2.6.35 “Оцінка стану пула стовбурових клітин з метою оптимізації лікування аутоімунних захворювань кріоконсервованими продуктами ембріофетоплацентарного комплексу” (№ держреєстрації 0107U000535).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - експериментально обґрунтувати можливість превентивного використання кріоконсервованих КФП для лікування РМЗ у мишей з генетично детермінованою формою його розвитку.

Відповідно до поставленої мети передбачалося:

1. Оцінити особливості впливу різних режимів кріоконсервування на характеристики клітинних популяцій, які визначають імуномодулюючий і терапевтичний потенціал фетальної печінки (ФП).

2. Провести комплексну оцінку у мишей лінії С3Н стану основних ланок ІС, вмісту СРК у тканинах пухлини молочної залози (МЗ) і поза пухлиною.

3. Оцінити особливості клінічної маніфестації розвитку РМЗ у мишей лінії С3Н на різних етапах онтогенетичного розвитку.

4. Оцінити ефект превентивного використання кріоконсервованих КФП на стан ІС і вміст СРК у мишей лінії С3Н.

5. Охарактеризувати терапевтичний ефект кріоконсервованих КФП на маніфестацію пухлинного процесу і виживаність мишей.

Об'єкт дослідження - стан структурно-функціональних характеристик лімфогемопоетичного комплексу (ЛГПК) і СРК у мишей лінії С3Н до і після використання КФП.

Предмет дослідження - кріоконсервовані КФП мишей.

Методи дослідження - кріобіологічні, імунологічні, морфологічні і гематологічні, а також методи статистичної обробки отриманих результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше для аналізу протипухлинної активності кріоконсервованих КФП обрана експериментальна модель з генетично детермінованим розвитком РМЗ. Показано виражені порушення стану ІС, які по-різному проявляються на етапах розвитку РМЗ. Проведено якісний і кількісний аналізи вмісту СРК в органотканьових субстратах МЗ на різних етапах розвитку патології та встановлено факт присутності СРК не тільки в пухлині, але й поза осередком злоякісного росту.

Проведено порівняльний аналіз і обрані ті режими кріоконсервування, які максимально забезпечують схоронність клітинного складу КФП, із яким пов'язана їх потенційна протипухлинна активність.

Уперше продемонстрована здатність кріоконсервованих по обраному режиму КФП корегувати стан Т-ланки імунітету, субпопуляції Т-регуляторних клітин (T-reg (CD4⁺25⁺), функції клітин моноцитарно-фагоцитарної системи (МФС), клітин натуральних кілерів (НК) і вміст циркулюючих імунних комплексів (ЦІК). Установлено дозозалежний характер такого роду активності кріоконсервованих КФП.

Вперше отримано дані, які демонструють здатність кріоконсервованих КФП супресувати експансію СРК у тканинах МЗ, що в сукупності з імунокоригуючим ефектом позитивно відбивалося на клінічній маніфестації патології.

Практичне значення отриманих результатів. Експериментально встановлений факт ефективності превентивної терапії кріоконсервованими КФП при розвитку РМЗ є обґрунтуванням можливості їхнього використання в клінічній практиці для осіб з обтяженою спадковістю за даним захворюванням. Здатність кріоконсервованих у визначеному режимі КФП виявляти протипухлинний ефект надає можливість варіювати режимами кріоконсервування КФП для оптимізації їхнього протипухлинного захисту, включаючи схеми і дози матеріалу, що вводиться. Установлені факти кількісних і топографічних особливостей експансії СРК у залежності від стадії і виразності розвитку РМЗ вносять істотний вклад у модернізацію підходів діагностики й оцінки ефективності його лікування в клініці.

Особистий внесок здобувача. Разом з керівником Гольцевим А.М. обґрунтовані вибір теми, план і ідеологія виконання роботи. Автором самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз літератури. Самостійно виконані дослідження, що стосуються вивчення характеру впливу кріоконсервованих КФП на частоту розвитку пухлини і модифікацію стану ІС при розвитку РМЗ.

В опублікованих у співавторстві роботах особистий внесок здобувача полягає:

у роботах [1,2,12,17,19] - в оцінці впливу кріоконсервованих КФП на стан ІС тварин з онкопатологією;

у роботах [3, 21, 22] - в атестації різних режимів заморожування на морфофункціональні характеристики КФП;

у роботах [4, 20] - у вивченні кількісних і топографічних особливостей експансії СРК у мишей із РМЗ до і після лікування;

у роботах [5,6,7,9,11] - у дослідженні впливу кріоконсервованих КФП на структурно-функціональні характеристики ЛГПК в умовах розвитку онкопатології;

у роботах [8,16,18] - у визначенні ефективності використання кріоконсервованих КФП як превентивного методу лікування РМЗ;

у роботах [10,13,14,15] - у проведенні і практичній розробці методів вивчення стану ЛГПК при розвитку РМЗ.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи повідомлені й обговорені на наступних наукових форумах: на конференції молодих учених “Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології” (Київ, 2003, 2006, 2008 рр.); IV Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю “Фундаментальні аспекти сучасної медицини” (Чернівці, 2004 р.); конференції молодих учених “Актуальні проблеми геронтології і геріатрії” (Київ, 2006 р.); Всеукраїнській конференції молодих учених “Сучасні аспекти медицини і фармації - 2009” (Запоріжжя, 2009 р.); щорічній конференції молодих учених “Холод у біології і медицині” (Харків, 2006, 2009 рр.); науковій конференції “Application of cryopreservation from human tissue engineering to plant genebank integration” (Гановер, 2009 р.); науковій конференції “Нове в діагностиці і профілактиці імуно- та алергопатології” (Львів, 2009 р.).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 22 наукові праці, з яких 5 статей у провідних фахових виданнях, 17 тез доповідей на конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали і методи дослідження”, 5-ти розділів з описом результатів дослідження та їх обговоренням, підсумку, висновків, списку використаної літератури, що включає 233 джерела на 27 сторінках. Робота містить 8 таблиць і 49 рисунків. Загальний обсяг роботи складає 165 сторінок, з яких 138 сторінок основного змісту.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи досліджень

Експерименти проведені на мишах-самках лінії С3Н/HeLac, C57BL/6J, СВА/H, що утримувались в стандартних умовах віварію ІПКіК НАН України. Мишам С3Н дослідних груп у 6 місяців, тобто за 6-7 місяців до маніфестації клінічних ознак РМЗ, внутрішньовенно у 0,2 мл середовища вводили кріоконсервовані або нативні КФП (кКФП, нКФП): 1-й групі - кКФП у дозі 1х10⁶ клітин/мишу (n=17); 2-й групі - нКФП у дозі 1х10⁶ клітин/мишу (n=16); 3-й групі - кКФП у дозі 5х10⁶ клітин/мишу (n=17); 4-й групі - нКФП у дозі 5х10⁶ клітин/мишу (n=16). До груп порівняння увійшли миші лінії С3Н, яким замість КФП були введені клітини дорослої печінки (КДП) у дозі 1х10⁶ клітин/мишу (5 група, n = 15) та дозі 5х10⁶ клітин/мишу (6 група, n = 14). Характер розвитку патології вивчали на мишах лінії С3Н (n = 18), яких не лікували. Контроль - здорові миші лінії СВА (n =12).

Усі маніпуляції з мишами проводили відповідно до положень “Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, які використовувались для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985). кріоконсервування імуномодулюючий фетальний

Приготування суспензії КФП здійснювали згідно з методичними рекомендаціями у стерильних умовах [Грищенко В.И. и др., 1991] у деякій модифікації для експериментального матеріалу [Гольцев А.Н. и др., 2000]. Кількість клітин у суспензії підраховували в камері Горяєва [Меньшиков В.В., 1987]. У роботі були використані КФП 14-ї доби гестації, які отримували у мишей лінії C57BL/6J (n=11).

Заморожування КФП здійснювали за різними програмами під захистом 7,5; 10 і 12,5%-го кріопротектора диметилсульфоксиду (ДМСО) за такими програмами:

Швидкість охолодження 1 °С/хв до -25°С з наступним зануренням у рідкий азот [Цуцаева А.А., 1983];

Швидкість охолодження 1 °С/хв до -40°С, далі 7 °С/хв до -100°С з наступним зануренням у рідкий азот [Шерешков С.И., 1984];

Швидкість охолодження 1 °С/хв, 10-хвилинна експозиція при -25°С, 10 °С/хв до -40°С, занурення в рідкий азот [Вотякова И.А., 1987].

Клітини розморожували на водяній бані (41°С) протягом 1-3 хвилин до зникнення твердої фази. Кріопротектор видаляли шляхом розведення суспензії середовищем 199 при наступному центрифугуванні клітин.

До і після кріоконсервування оцінювали наступні показники КФП: життєздатність по пропідій йодиду (PI) [Nebe-von-Carona G. et al., 2000]; якісний склад ядровмісних клітин на мазках, пофарбованих азур-II-еозином в світовом мікроскопі ЛОМО-2; вміст стовбурових кровотворних клітин (СКК) і мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) методом цитофлуоріметрії на проточному цитофлуориметрі FACS Calibur, з використанням моноклональних антитіл (МАТ) до CD34 і CD38, CD44 і CD73 (BD, США). Вміст кровотворних попередників, які формують колонії в селезінці летально опромінених мишей (КУОс), визначали методом [Till J.E. et al, 1961] на 8-у добу - КУОс-8 і 14-у добу - КУОс-14.

Аналіз крові, що була отримана при декапітуванні тварин, проводили за загальноприйнятим методом [Меньшиков В.В., 1987]. Лейкограми крові і цитограми органів ЛГПК (кістковий мозок (КМ), тимус, селезінка, лімфатичні вузли (ЛВ)) аналізували на мазках забарвлених азур-II-еозином. Гістологічне дослідження органів ЛГПК, МЗ і легень виконували загальноприйнятими методами [Лилли Р., 1969]. У ІС визначали показники клітинної, гуморальної ланок і МФС. Досліджували фенотипію клітин селезінки з використанням МАТ (Сaltac, США) до CD3, CD4, CD8, Ia, CD25 антигенів (АГ). Цитотоксичну активність НК клітин селезінки оцінювали за методом [Мельников О.Ф., 1999]. Вміст ЦІК визначали в периферичній крові за методом [Меньшиков В.В., 1987]. В МФС оцінювали здатність клітин перитоніальній порожнини (ПП) до адгезії [Меньшиков В.В., 1987] та їх фагоцитарну активність [Александров М.Г., 1988]. Вміст СРК у МЗ визначали методом цитофлуориметрії з використанням МАТ до СD44, CD24, CD133 АГ. У мишей лінії С3Н віком 13 і 16 місяців оцінювали частоту розвитку пухлини, а саме - кількість тварин з пухлиною, кількість пухлинних осередків, розмір і структуру пухлини, виживаність тварин.

Статистичну обробку результатів проводили за методом Стьюдента-Фішера за допомогою програми Statistika 7.0, адаптованої до поставленої задачі з урахуванням специфіки даних.

Результати власних досліджень

Вплив умов заморожування-відігрівання на схоронність і морфофункціональні характеристики КФП. Можливість використання КФП як препарату клітинної та тканинної терапії в онкологічній практиці обґрунтована присутністю серед них клітинних популяцій і синтезованих ними біоактивних субстанцій, які потенційно мають антибластомну активність [Gibbs P. et al., 1998; Tower AM et al., 2009]. Здатність пригнічувати проліферативну активність пухлинних клітин виявляють онкостатин, фетуїн, б-фетопротеїн, 7-кетохолестерол та інші [Zhang Q.L. et al., 1997; Brounais B. et al., 2009; Tower AM et al., 2009]. Кожний з перерахованих медіаторів виробляється широким спектром КФП, у тому числі МСК, бластними клітинами (овальні клітини (ОК), гепатобласти). Особливе значення мають кровотворні стовбурові елементи ФП [Lepus C.M, et al., 2009]. Проведені морфологічні і цитометричні дослідження інтактної суспензії ФП мишей лінії С57BL продемонстрували високу гетерогенність її клітинного складу з наявністю клітин еритроїдного ряду (75,42±5,87%), недиференційованих бластів (8,71±1,25%), гепатоцитів (7,21±0,53%), моноцитів (2,31±0,42%), лімфоцитів (1,21±0,01%), зрілих і незрілих гранулоцитів (8,71±1,98%), а так само кровотворних CD34⁺38^- (0,04±0,003%) і мезенхімальних CD44⁺73⁺ (5,25±0,36%) стовбурових клітин.

Після кріоконсервування більш чутливими к факторам кріоконсервування були зрілі гранулоцити, моноцити, гепатоцити. При цьому оцінка морфофункціональних властивостей КФП при варіюванні швидкостями охолодження і концентрацією кріопротектора показала нерівнозначні зміни складу і стану КФП. У табл. 1 представлені результати інтегральної оцінки такого роду відхилень, виражених у вигляді сумарного ступеня відхилення (ССВ) показників від контролю (нативні КФП) [Гольцев А.Н. и др., 2003].

Таблиця 1 ССВ показників стану КФП 14-ї доби гестації після кріоконсервування за різними режимами

Показник ССВ	Режим 1	Режим 2	Режим 3
	Концентрація ДМСО, %
	7,5	10	12,5	7,5	10	12,5	7,5	10	12,5
Клітинний склад*	1,35	1,23	1,66	1,34	1,24	1,33	1,62	1,31	1,23
Кількість ядерних клітин	0,50	0,10	0,28	0,24	0,21	0,51	0,44	0,20	0,20
Схоронність клітин	0,24	0,13	0,27	0,15	0,23	0,30	0,27	0,14	0,19
Клітини CD34+38-	0,10	0,16	0,36	0,15	0,15	0,38	0,07	0,39	0,32
Клітини CD44+73+	0,85	0,42	0,86	0,56	0,70	0,70	0,67	0,58	0,56
КУОс 8	0,43	0,31	0,57	0,56	0,54	0,61	0,42	0,61	0,58
КУОс 14	0,38	0,31	0,60	0,48	0,44	0,68	0,36	0,48	0,45
УССВ	3,85±0,29	2,66±0,23	4,60±0,24	3,48±0,37	3,51±0,30	4,51±0,36	3,85±0,30	3,71±0,31	3,53±0,25

Примітки: кожна величина виражає ступінь відхилення від контрольного показника в умовних одиницях; *- відсотковий вміст кожної з оцінених популяцій клітин ФП;

Як показано, мінімальний ступінь відхилення від контролю, тобто кращий з показників ССВ, був отриманий при кріоконсервуванні КФП зі швидкістю 1 °С/хв до -25°С при концентрації ДМСО 10%. Саме цей режим був обраний для атестації протипухлинного потенціалу КФП.

Оцінка стану ЛГПК мишей лінії С3Н. Отримані результати показали, що розвиток РМЗ супроводжується багатопрофільними змінами якісних і кількісних характеристик ЛГПК. Так, у мишей лінії С3Н, яких не лікували, віком 13 місяців на тлі лейкоцитозу ((5,05±0,43)х10⁶ кл/мл при (2,84±0,15)х10⁶кл/мл у контролі, р<0,05) відзначалося підвищення в порівнянні з контролем ШОЕ (2,94±0,27 і 2,00±0,17 мм/годину відповідно, р<0,05). До 16-го місяця у мишей С3Н відзначалася тенденція до збільшення в порівнянні з 13-м місяцем виразності цих показників: кількість лейкоцитів - (6,04±0,54) х10⁶ кл/мл; ШОЕ - 3,27±0,28 мм/годину. Оцінка стану ІС у 13 і 16 місяців виявила істотні зміни показників клітинної і гуморальної ланки, МФС з перевагою ознак імуносупресії.

При гістологічному дослідженні структури органів ЛГПК мишей лінії С3Н в 13 місяців було виявлено гіпоплазію тимусу, мієлоїдну гіперплазію КМ, інфільтрацію пухлинними клітинами селезінки і ЛВ. У легенях спостерігали осередки метастазування, а в МЗ - внутрішньопротоковий кріброзний рак. В 16 місяців у мишей що вижили спостерігали ознаки бластомної та плазмоцитарної реакцій цих органів. В селезінці, крім того, було відзначено появу колоній медулярного крововиливу.

Оцінка коригуючого ефекту превентивно введених КФП на стан ЛГПК мишей С3Н. Превентивна терапія РМЗ, так само як і в роботах [Vaage J. et al. 1995, Lala P.K. et al., 1997] проводилась у 6 місяців, коли починають виявлятися СРК (СD44^hi - 0,01±0,001%, CD44⁺24^- - 0,35±0,024%, а СD133⁺ - 15,41±1,39%). Отримані дані показали, що превентивне введення КФП мишам лінії С3Н незалежно від віку сприяло поліпшенню багатьох показників стану ЛГПК. Для КФП була характерна здатність в обидва терміни дослідження знижувати лейкоцитоз, ШОЕ, підвищувати кількість еритроцитів і гемоглобіну. Була відзначена явна динаміка відновлення структури органів ЛГПК: у тимусі - часточкова будова з чітко позначеною корковою та мозковою зонами, у КМ - зниження мієлоїдної гіперплазії. У ЛВ виявлялися фолікули коркової зони, спостерігалося відновлення паракортикальної зони; у селезінці відновлювалися структури білої пульпи, у легенях не відмічалось крововиливів, а також були відсутні ознаки розростання пухлинних клітин.

Спостерігалося також відновлення фагоцитарної активності клітин МФС. Особливо важливим можна вважати установлений факт зниження вмісту T-reg (CD4⁺25⁺), а так само істотне підвищення кількості Т-лімфоцитів (CD3⁺), що корелювало зі зниженням атрофії тимуса і зниженням вмісту ЦІК.

При цьому слід підкреслити, що імунокоригуючий ефект КФП як у 13, так і 16 місяців визначався видом і дозою введенного матеріалу: більш виражену коригуючу дію мали кріоконсервовані КФП у дозі 5х10⁶ клітин/мишу і нативні КФП у дозі 1х10⁶ клітин/мишу. Необхідно відзначити коригуючий ефект КФП у відношенні Ia⁺ клітин, вміст яких у 13 місяців після використання кріоконсервованих КФП у дозі 5х10⁶ клітин/мишу вірогідно не відрізнявся від контрольних значень (12,74±1,18%, при 12,51±1,14% в контролі, p>0,05).

Імунокоригуючий ефект введених у дозі 5х10⁶ клітин/мишу кріоконсервованих і у дозі 1х10⁶ клітин/мишу нативних КФП утримувався до 16-го місяця, що свідчить про збереження функціональної активності трансплантованих клітин після кріоконсервування. Особливу значимість має коригуюча активність КФП відносно цитотоксичної активності НК клітин.

Вплив превентивного використання кріоконсервованих КФП на кількісні і якісні характеристики СРК при розвитку РМЗ. Встановлено, що у них, навіть без клінічної маніфестації пухлини, вірогідно в порівнянні з контролем підвищувався вміст CD44^hi, CD44⁺24^- і CD133⁺ клітин в МЗ. Поряд з цим встановлена чітка залежність експансії СРК у мишей лінії С3Н від поширеності пухлинного процесу. Оцінка ефективності проведеного лікування виявила виражений ефект на вміст СРК при використанні КФП незалежно від виду і дози. Проте найбільш близьке до контрольних значень вмісту особливо інвазивних СРК із маркерами СD44^hi і CD44⁺24^- клітин було досягнуто при використанні кріоконсервованих КФП у дозі 5х10⁶ клітин/мишу і нативних - у дозі 1х10⁶ клітин/мишу. При цьому різний характер зміни вмісту інших субпопуляцій клітин (CD133⁺, CD44⁺24⁺, CD44^-24⁺) у залежності від дози і виду біоматеріалу може вказувати на різний механізм впливу на СРК, що виявляють КФП у кожному конкретному випадку. Доказом специфічного ефекту КФП є той факт, що введення КДП не викликало подібних змін. Слід відзначити, що дослідження вмісту СРК у хворих на РМЗ тварин у динаміці може бути використане в загальній оцінці ефективності терапії і прогнозуванні перебігу захворювання.

Вплив превентивного введення кріоконсервованих КФП на характер клінічної маніфестації РМЗ. Закономірності зміни вмісту СРК під дією введених КФП корелювали зі зниженням частоти розвитку пухлини і виживаностю мишей лінії С3Н (табл.2).

Таблиця 2 Частота розвитку РМЗ і виживаність мишей лінії С3Н

Група мишей	Період спостереження, місяці
	13	16
	Частота розвитку РМЗ, %	Виживаність тварин, %	Частота розвитку РМЗ, %	Виживаність тварин, %
С3Н	73,42±5,37	83,35±5,69	75,31±2,54	31,47±4,73
С3Н+кКФП 1х106	50,62±4,271,2,3	90,04±2,49	-	57,54±3,971,2,3
С3Н+нКФП 1х106	36,48±2,431,3	100	-	70,46±2,001,3
С3Н+кКФП 5х106	43,65±2,491,2	100	-	81,65±3,381,2
С3Н+нКФП 5х106	58,57±3,841	87,53±3,62	-	67,53±1,761
С3Н+КДП 1х106	69,52±6,83	58,35±2,43	75,31±2,54	45,07±1,11
С3Н+КДП 5х106	65,20±5,59	66,72±5,73	66,74±3,34	37,51±3,12

Примітки: ступінь вірогідності розходження (р<0,05) у порівнянні: з 1 - мишами, яких не лікували; 2 - кріоконсервованого матеріалу з нативним відповідною дозою; 3 - матеріалу в дозі 1х106 клітин/мишу з матеріалом у дозі 5х106 клітин/мишу в кожній групі препаратів (нативні і кріоконсервовані).

Максимальне зниження частоти розвитку пухлини в 13 місяців, так само як і максимальна виживаність тварин у 16 місяців спостерігалися при використанні нативних КФП у меншій дозі 1х10⁶ клітин/мишу, тоді як кріоконсервованих КФП - у дозі 5х10⁶клітин/мишу.

Висновки

Експериментальне обґрунтування можливості використання кріоконсервованих препаратів фетального походження при лікуванні патологій неопластичного генезу є однією з важливих задач сучасної медицини. Враховуючи вищесказане, у даній роботі проведена оцінка ефективності превентивного використання кріоконсервованих КФП на стан ІС, вміст СРК і клінічну маніфестацію пухлинного процесу у мишей лінії С3Н з генетично детермінованим розвитком РМЗ.

1. При порівняльній оцінці впливу різних режимів кріоконсервування на структурно-функціональні характеристики КФП визначені ті умови, які максимально забезпечували схоронність у гетерогенній популяції клітин з потенціалом протипухлинної активності.

2. Комплексна оцінка стану ІС мишей лінії С3Н продемонструвала істотні зміни показників клітинної і гуморальної ланок імунітету та МФС, що збільшувалися в міру розвитку РМЗ. Порушення стану ІС супроводжувалися змінами структури органів ЛГПК, які характеризуються гіпоплазією лімфоїдної тканини та гіперплазією ретикулярних елементів.

3. Показано, що при генетично детермінованому розвитку РМЗ вже на ранніх етапах онтогенезу в ній виявляються клітини з ознаками СРК, що експресують маркер CD44^hi. В міру розвитку патології вміст СРК істотно підвищувався та виявлявся не тільки в самій пухлині, але й у тканинах МЗ поза осередку злоякісного росту.

4. Доведено можливість превентивного лікування генетично детермінованого РМЗ кріоконсервованими КФП. Встановлена здатність введених кріоконсервованих, так само як і нативних КФП коригувати ІС мишей лінії С3Н, в першу чергу вміст Т-регуляторних (T-reg) клітин, цитотоксичну активність селезінки, вміст ЦІК і функції клітин МФС.

5. Встановлена залежність прояву лікувального ефекту від дози і виду КФП, які вводили. Корекція ІС мишей у 13 місяців була більш властива нативним КФП у дозі 1х10⁶ клітин/мишу, тоді як у віці 16 місяців - кріоконсервованим КФП, введеним у дозі 5х10⁶клітин/мишу.

6. Використання КФП знижувало кількість найбільш інвазивних СРК із фенотипом CD44^hi і CD44⁺24^-, що корелювало зі ступенем активації клітин із протипухлинною активністю (НК клітин): максимально виражений ефект виявляли кріоконсервовані КФП в дозі 5х10⁶ клітин/мишу і нативні в дозі 1х10⁶ клітин/мишу.

7. Мінімальна частота розвитку РМЗ і максимальна виживаність мишей лінії С3Н, яких превентивно лікували введенням КФП, корелювала зі ступенем інгібіції експансії СРК і, в першу чергу, CD44^hi клітин.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Бондарович Н.А. Состояние иммунной системы мышей с генетически детерминированным развитием рака молочной железы после применения криоконсервированных клеток фетальной печени / Н.А. Бондарович, М.В. Останков, М.А. Сироус, Л.В. Останкова, А.Н. Гольцев // Вестник ХНУ, серия: Биология. - 2006. - Т.4, №748. - С.110 -120.

2. Бондарович Н.А. Использование клеток фетальной печени для коррекции иммунной системы мышей линии С3Н / Н.А. Бондарович, Л.В. Останкова, М.А. Сироус, К.А. Гольцев, М.В. Останков, А.Н. Гольцев // Світ медицини та біології. - 2007. - №1. - С.40 - 46.

3. Останков М.В. Характер изменения структурно-функциональных характеристик клеток фетальной печени после криоконсервирования в зависимости от их сроков гестации / М.В. Останков, Н.А. Бондарович, И.В.Рассоха, А.Н. Гольцев // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т.18, №3. - С. 302-305.

4. Бондарович Н.А. Определение содержания CD44⁺CD24^- клеток как дополнительный критерий оценки эффективности превентивной терапии онкопатологии в эксперименте / Н.А. Бондарович, К.А. Гольцев // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т.18, №1. - С. 5-9.

5. Бондарович Н.А. Применение клеток фетальной печени для коррекции иммунной системы при развитии рака молочной железы / Н.А. Бондарович, О.В. Сафранчук, М.В. Останков, М.А. Сироус // Зб. наукових статей „Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики”. - 2009. - Т. 2. - Вип. XXII. - C. 23 - 26.

6. Бондарович Н.А. Модулирующее влияние клеток эмбриональной печени на показатели иммунной системы мышей с онкопатологией в разные возрастные периоды их индивидуального развития / Н.А. Бондарович, О.В. Якимович, М.В. Останков, М.А. Сироус // Сучасні проблеми експериментальної онкології: VI конференція молодих онкологів України, 4-5 груд. 2003р.: тези допов. - Київ, 2003. - С.9.

7. Гольцев А.М. Вплив клітин ембріональної печінки на стан лімфогемопоетичної системи при онкопатології / А.М. Гольцев, М.О. Бондарович, М.В. Останков, О.Д. Луценко, К.А. Гольцев // Клінічна та експериментальна патологія. - 2004. - Т.3, №2, Ч.2. - С. 366-368.

8. Бондарович М.О. Трансплантація КЕП як метод імунотерапії при раку молочної залози / М.О. Бондарович, А.М. Гольцев, О.М. Шатнєва // Молодь і поступ біології: I міжнар. наук. конф. студентів і аспірантів, 11-14 квіт. 2005р.: тези допов. - Львів, 2005. - С.142.

9. Бондарович Н.А. Возможные пути коррекции возрастных нарушений структуры и функции лимфогемопоэтического комплекса у мышей линии С3Н / Н.А. Бондарович, Л.В. Останкова, М.В. Останков, М.А. Сироус, А.Н. Гольцев // Проблемы старения и долголетия: IV Національний конгрес геронтологів і геріатрів України, 11-13 жовт. 2005р.: тези допов. - Київ, 2005. - С.11 - 12.

10. Бондарович Н.А. Морфофункциональная характеристика лимфогемопоэтической ткани мышей линии С3Н до и после применения криоконсервированных продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса / Н.А. Бондарович, Л.В. Останкова, М.В. Останков, М.А. Сироус, А.Н. Гольцев // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, №4. - С.725.

11. Бондарович Н.А. Изменение лимфогемопоэтического комплекса у мышей с ускоренным старением и возможные пути его коррекции / Н.А Бондарович, М.В. Останков, К.А. Гольцев, М.А. Сироус, О.М. Шатнева // Актуальні проблеми геронтології та геріатрії: наукова конференція молодих вчених з міжнародною участю, 27 січ. 2006 р.: тези допов. - Київ, 2006. - С.24 - 25.

12. Бондарович Н.А. Оценка иммунокорригирующего эффекта криоконсервированных клеток фетальной печени у мышей линии С3Н / Н.А. Бондарович, М.А. Сироус, Е.Е. Ямпольская, К.А. Гольцев, М.В. Останков // Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології: VII міжнародна конференція молодих онкологів, 2-3 лют. 2006 р.: тези допов.-Київ, 2006.- С.15.

13. Бондарович Н.А. Изменение состояния лимфогемопоэтической системы при развитии рака молочной железы и возможные пути ее коррекции / Н.А. Бондарович, Л.В. Останкова, М.В. Останков, М.А. Сироус, К.А. Гольцев // Медицина третього тисячоліття: міжвузівська конференція молодих вчених, 17-18 січ. 2006 р.: тези допов. - Харків, 2006. - С. 5- 6.

14. Бондарович Н.А. Состояние лимфогемопоэтического комплекса у мышей линии С3Н/HELAC и возможные пути его коррекции / Н.А. Бондарович, М.В. Останков, М.А. Сироус, К.А. Гольцев // Хист. - 2006. - Вип. 8. - С.34.

15. Гольцев А.М. Стан лімфогемопоетичної системи тварин на різних етапах онкопроцесу / А.М. Гольцев, М.О. Бондарович, Л.В. Останкова, Т.Г. Дубрава, Ю.О. Козлова // Другий з'ізд Українського товариства клітинної біології, 23-26 жовт. 2007р.: тези допов. - Київ, 2007. - С.212.

16. Гольцев А.Н. Экспериментальное обоснование целесообразности использования криоконсервированных клеток фетальной печени для коррекции иммунной системы при развитии рака молочной железы / А.Н. Гольцев, Н.А. Бондарович, М.В. Останков, О.В. Сафранчук, М.А.Сироус // Імунологія та алергологія.- 2007. - №3. - С.96.

17. Бондарович М. Вплив клітин фетальної печінки на стан імунного статусу мишей лінії С3Н / М. Бондарович, К. Гольцев, О. Сафранчук, Є. Порожан // Молодь та поступ біології: III Міжнародна наукова конференція студентів і аспірантів, 23-27 квіт. 2007 р. - Львів, 2007. - С. 336.

18. Бондарович Н.А. Обоснование применения клеток фетальной печени в лечении рака молочной железы / Н.А. Бондарович, Е.А. Порожан, К.А. Гольцев, М.В. Останков, А.Н. Гольцев // Лекарственные средства и биологически активные соединения: Международная научная конференция, 11-12 окт. 2007 р.: тези. допов. - Гродно, 2007. - С.15 - 16.

19. Бондарович Н.А. Особенности возрастных характеристик иммунного статуса при развитии РМЖ и возможные пути его коррекции / Н.А. Бондарович // Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології: IX Міжнародна конференція молодих онкологів, 23-24 квіт. 2008 р.: тези допов. - Київ, 2008. - С.28.

20. Бондарович Н.А. Исследование содержания стволовых раковых клеток как дополнительный критерий оценки эффективности превентивной терапии онкопатологии криоконсервированными клетками фетальной печени / Н.А. Бондарович, О.В. Сафранчук, М.А. Сироус // Холод в биологии и медицине: Ежегодная конференция молодых ученых, 28-29 мая 2009 р.: тези допов. - Харків, 2009. - С.20.

21. Goltsev A.N. Modifying effect of cryopreservation on anti-tumor activity of FLCs / A.N. Goltsev, N.A. Bondarovich, O.V. Safranchuk, M.V. Ostankov // Application of cryopreservation from human tissue Engineering to plant genebank integration: conference of cryobyology, 7-9 sept. 2009 y.: abstracts of reports.- Hanover, 2009.- P.39.

22. Гольцев А.Н. Модифицирующий эффект криоконсервирования на противоопухолевую и иммуномодулирующую активность КФП / А.Н. Гольцев, Н.А. Бондарович, О.В. Сафранчук, М.В. Останков // Імунологія та алергологія. - 2009. - №2-3. - С.146.

Анотація

Бондарович М.О. Оцінка протипухлинної активності кріоконсервованих клітин фетальної печінки в експериментальній моделі раку молочної залози - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19. - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2010.

Дисертація присвячена вивченню протипухлинної активності кріоконсервованих клітин фетальної печінки (КФП) при їх введенні мишам лінії С3Н з генетично детермінованим розвитком раку молочної залози до клінічної маніфестації патологічного процесу. У роботі отримано експериментальне обгрунтування можливості превентивного використання кріоконсервованих КФП з метою корекції стану імунної системи, мінімізації клінічної маніфестації патології, підвищення виживанності тварин-пухлиноносіїв. Варіювання умовами кріоконсервування дозволило вибрати ті з апробованих режимів, які забезпечували максимальну схоронність складових компонентів КФП, з якими асоційована їх протипухлинна дія.

Ключові слова: кріоконсервовані клітини фетальної печінки, рак молочної залози, імунна система, лімфогемопоетичний комплекс, стовбурові ракові клітини.

Аннотация

Бондарович Н.А. Оценка противоопухолевой активности криоконсервированных клеток фетальной печени в экспериментальной модели рака молочной железы - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19. - криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2010.

Диссертация посвящена изучению противоопухолевой активности криоконсервированных клеток фетальной печени (КФП) при их превентивном введении мышам линии С3Н с генетически детерминированным развитием рака молочной железы (РМЖ), т.е. до клинической манифестации патологического процесса. В задачи исследования входило: оценить особенности влияния разных режимов криоконсервирования на характеристики клеточных популяций, которые определяют иммуномодулирующий и терапевтический потенциал фетальной печени (ФП); провести комплексную оценку у мышей линии С3Н состояния основных звеньев иммунной системы (ИС), содержания стволовых раковых клеток (СРК) в ткани опухоли молочной железы (МЖ) и вне опухоли; оценить особенности клинической манифестации развития РМЖ у мышей линии С3Н на разных этапах онтогенетического развития; оценить эффект превентивного применения криоконсервированных КФП на состояние ИС и содержание СРК у мышей линии С3Н; охарактеризовать терапевтический эффект криоконсервированных КФП на манифестацию опухолевого процесса и выживаемость мышей.

Показано, что замораживание КФП со скоростью охлаждения 1 °С/мин до -25°С с последующим погружением в жидкий азот максимально обеспечивало сохранность в гетерогенной популяции клеток с потенциалом противоопухолевой активности.

При оценке состояния ИС мышей линии С3Н установлены существенные изменения показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета, МФС, а также органов ЛГПК, которые усугублялись по мере развития РМЖ.

Показано, что при генетически детерминированном развитии РМЖ уже на ранних этапах онтогенеза в МЖ обнаруживаются клетки с признаками СРК экспрессирющие маркер CD44^hi. По мере развития патологии содержание СРК в тканях МЖ существенно повышается и выявляется не только в самой опухоли, но и в тканях МЖ вне очага злокачественного роста.

Доказана состоятельность превентивного лечения генетически детерминированного РМЖ криоконсервированными КФП. Установлена способность введенных криоконсервированных так же, как и нативных КФП, корригировать ИС мышей линии С3Н, в первую очередь содержание Т-регуляторных (T-reg) клеток, цитотоксическую активность селезенки, содержание ЦИК и функции клеток МФС.

Установлена зависимость степени корригирующего эффекта от дозы и вида вводимых КФП. Коррекция состояния ИС мышей в 13 месяцев была больше свойственна нативным КФП в дозе 1х10⁶ клеток/мышь, тогда как в возрасте 16 месяцев - криоконсервированным в дозе 5х10⁶клеток/мышь.

Введенные КФП снижали количество наиболее инвазивных СРК с фенотипом CD44^hi и CD44⁺24^-, что коррелировало со степенью активации клеток с противоопухолевой активностью (ЕК клеток): максимально выраженный эффект проявляли криоконсервированные КФП в дозе 5х10⁶ клеток/мышь и нативные в дозе 1х10⁶ клеток/мышь.

Минимальная частота развития РМЖ и максимальная выживаемость мышей линии С3Н, которых превентивно лечили введением КФП, коррелировала со степенью ингибиции экспансии СРК.

Экспериментально установленный факт эффективности превентивной терапии при развитии РМЖ криоконсервированными КФП может служить обоснованием возможности их применения в клинической практике у лиц с отягощенной наследственностью по данным заболеваниям.

Способность криоконсервированных в определенном режиме КФП проявлять противоопухолевый эффект как таковой открывает перспективу возможности варьирования режимами криоконсервирования КФП как подхода оптимизации их противоопухолевой защиты.

Установленные факты количественных и топографических особенностей экспансии СРК в зависимости от стадии и выраженности развития РМЖ вносят существенный вклад в модернизацию подходов диагностики и оценки эффективности ее лечения в клинике.

Ключевые слова: криоконсервированные клетки фетальной печени, рак молочной железы, иммунная система, лимфогемопоэтический комплекс, стволовые раковые клетки.

Annotation

Bondarovich N.A. Assessment of anti-tumor activity of fetal liver cryopreserved cells in experimental model of breast cancer - Manuscript.

The dissertation for the candidate of biological sciences degree (PhD equivalent) in specialty 03.00.19 - cryobiology. - Institute for Problems of Cryobiology & Cryomedicine of the national Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2010.

Dissertation is dedicated to studying of anti-tumor activity of cryopreserved fetal liver cells (FLCs) during their injection to C3H mice with genetically determined breast cancer development up to clinical manifestation of pathological process. In the research there was experimentally substantiated the possibility of preventive use of cryopreserved FLCs to correct the immune system state, minimize clinical manifestation of pathology, increase the survival of the tumor-bearing mice. The varying of cryopreservation conditions enable to select those tested protocols provided the maximum preservation of FLCs components with which their anti-tumor effect was associated.

Key words: cryopreserved fetal liver cells, breast cancer, immune system, lymphohematopoietic complex, cancer stem cells.

Размещено на Allbest.ru

...