Експресія адаптерних білків родини (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS) та механізми реалізації їх ефектів у пухлинах грудної залози і матки людини

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О. В. ПАЛЛАДІНА

УДК 577.112.7:576.32/36:616-006

Експресія адаптерних білків родини (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS) та механізми реалізації їх ефектів у пухлинах грудної залози і матки людини

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Басараба Ольга Іванівна

Київ 2010



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор

Дробот Людмила Борисівна,

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України,

завідувач лабораторії сигнальних механізмів клітини

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Філоненко Валерій Вікторович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу сигнальних систем клітини;

доктор біологічних наук, професор

Дмитренко Микола Петрович,

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України,

завідувач відділу регуляції обміну речовин.

Захист відбудеться “17” травня 2010 р. о 14 годині на засіданні cпеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України за адресою: Київ, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат розіслано “15” квітня 2010 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.



Анотація

Басараба О. І. Експресія адаптерних білків родини (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS) та механізми реалізації їх ефектів у пухлинах грудної залози і матки людини. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 -- біохімія. -- Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ, 2010.

Дисертацію присвячено дослідженню особливостей експресії адаптерних білків родини (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS) у пухлинах грудної залози і матки людини та дослідженню сигнальних механізмів реалізації їх біологічних ефектів. Встановлено підвищення рівня експресії Rukl/CIN85 у зразках аденокарцином грудної залози порівняно з умовно нормальними тканинами як за допомогою підходів імуногістохімії, так і Вестерн-блот аналізом. Продемонстровано, що сублінії клітин аденокарциноми грудної залози MCF-7, які стабільно надекспресують Rukl/CIN85, характеризуються підвищеною рухливістю та змінами як динаміки, так інтенсивності Erk1/2- і Akt-залежного сигналювання, індукованого EGF. Виявлено зростання рівнів експресії мРНК і білка Rukl/CIN85 та CD2AP/CMS у пухлинах матки порівняно з умовно нормальними оточуючими тканинами. Вперше ідентифіковані андрогенові рецептори в клітинах аденокарциноми матки людини лінії HeLa, показано дигідротестостерон-залежне утворення комплексу між Rukl/CIN85 та андрогеновим рецептором, встановлено роль Rukl/CIN85 в реалізації швидких негеномних ефектів рецепторів андрогенів.

Ключові слова: адаптерний білок, Ruk/CIN85, CD2AP/CMS, канцерогенез.



Аннотация

Басараба О. И. Экспрессия адаптерных белков семейства (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS) и механизмы реализации их эффектов в опухолях грудной железы и матки человека. -- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 -- биохимия. -- Институт биохимии им. О. В. Палладина НАН Украины, Киев, 2010.

Диссертация посвящена исследованию особенностей экспрессии адаптерных белков семейства (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS) в опухолях грудной железы и матки человека и исследованию сигнальных механизмов реализации их биологических эффектов. Установлено повышение уровня экспрессии Rukl/CIN85 в образцах аденокарцином грудной железы по сравнению с условно нормальными тканями как с помощью подходов иммуногистохимии, так и Вестерн-блот анализом. Продемонстрировано, что сублинии клеток аденокарциномы грудной железы MCF-7, которые стабильно сверхэкспрессируют Rukl/CIN85, характеризуются повышенной подвижностью и изменениями как динамики, так интенсивности Erk1/2- и Akt-зависимой сигнализации, индуцированной EGF. Выявлено повышение экспрессии мРНК и белка полноразмерной формы Rukl/CIN85 и белка CD2AP/CMS в опухолях матки по сравнению с условно нормальными окружающими тканями. Впервые идентифицированы андрогеновые рецепторы в клетках аденокарциномы матки человека линии HeLa, показано дигидротестостерон-зависимое образование комплекса между Rukl/CIN85 и андрогеновым рецептором, установлена роль Rukl/CIN85 в реализации быстрых негеномных эффектов рецепторов андрогенов.

Ключевые слова: адаптерный белок, Ruk/CIN85, CD2AP/CMS, канцерогенез.



Summary

Basaraba O. I. Expression of adapter proteins of (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS) family and mechanisms of their effects in human breast and uterine cancer. -- Manuscript.

Thesis for Ph.D. degree in Biology, specialty 03.00.04 -- Biochemistry. -- Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2010.

Thesis is devoted to the study of adapter proteins (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS) expression and mechanisms of their biological effects in human breast and uterine cancer. Using immunohistochemistry, Ruk/CIN85-specific signal was detected in control breast tissue at low level in both ductal and alveolar epithelium, whereas an increase of Rukl/CIN85 staining intensity was revealed in tumor samples, especially in areas of invasive growth.

Using Western-blot analysis, the statistically significant increase in expression level of Rukl/CIN85 full-length form as well as its homologue CD2AP/CMS in 1st - 3rd stages human invasive ductal breast cancer samples in comparison with normal surrounding tissues samples was detected. Rukl/CIN85 content was significantly higher in samples with moderate degree of differentiation (G2) as compared to low degree of differentiation (G3) breast cancer samples, whereas inverse dependency was revealed for CD2AP/CMS. Ruk/CIN85 form with apparent molecular weight of 130 kDa was revealed in Triton X-100-sobluble fraction of the most analyzed normal breast tissue samples, whereas high expression level of Ruk/CIN85 multiple molecular forms with apparent molecular weight of 130, 85, 56, 40 and 34 kDa was detected in breast cancer samples. The changes in dynamics as well as intensity of Erk1/2 and Akt-dependent signalling induced by EGF were demonstrated for sublines of breast adenocarcinoma MCF-7 cells with stable overexpression of Rukl/CIN85. EGF induced the rapid and powerful activation of Erk1/2 and Akt which was sustained during 30 min incubation with growth factor in comparison with MCF-7 cells stably transfected with empty vector. In order to investigate whether Rukl/CIN85 overexpression influences EGF-induced motility of MCF-7 cells, Transwell migration assay was performed. The migration of subline G4 of breast adenocarcinoma MCF-7 cells with stable overexpression of Rukl/CIN85 was increased by about 40% when compared to control cells in the absence of EGF. Upon EGF treatment, migration of control MCF-7 cells was increased by about 60% and migration of G4 cells was increased by insignificant 20%. Thus, breast adenocarcinoma MCF-7 cells with stable overexpression of full-length Rukl/CIN85 form were characterized by increased constitutive and decreased EGF-induced motility.

Increase of Rukl/CIN85 mRNA and protein expression levels as well as CD2AP/CMS protein expression levels was revealed in uterine tumors as compared to conventionally normal surrounding tissues. The characteristic feature of Ruk/CIN85 forms expression patterns in control tissues as well as in benign tumors was a high content of high-molecular-weight Ruk/CIN85 forms (140 and 130 kDa), while increase in the content of low-molecular-weight forms (40 and 30 kDa) was observed in samples of malignant tumors. For the first time, androgen receptor was identified in human uterine adenocarcinoma HeLa cells. It was established that the content of full-length Rukl/CIN85 form in Triton-X-100-soluble fraction of untreated human cervical adenocarcinoma HeLa cells in logarithmic growth phase was very low, whereas stimulation of cells with dihydrotestosterone (DHT) resulted in up-regulation of the full-length form content. DHT-dependent complex formation between Rukl/CIN85 and androgen receptor as well as the role of Rukl/CIN85 in rapid non-genomic effects of androgen receptor were shown.

Thus, the abnormal expression of adapter proteins Ruk/CIN85 and CD2AP/CMS in breast and uterine tumors as well as changes in functional activity of downstream signaling pathways may be involved in maintaining of the malignant phenotype. Therefore, adapter proteins Rukl/CIN85 and CD2AP/CMS might be used as tissue-specific tumor markers, prognostic factors in cancer development and potential pharmacological targets for developing of anti-cancer drugs.

Keywords: adaptor protein, Ruk/CIN85, CD2AP/CMS, carcinogenesis.

залоза матка грудний



1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Дослідженнями останніх років переконливо показано, що канцерогенез є багатоетапним та багаторівневим процесом, який залежить від геномної нестабільності, впливу ендогенних і екзогенних факторів. Накопичення незалежних мутацій та епігенетичних порушень, які ведуть до порушень у регулюванні сигнальних шляхів, що контролюють проліферацію, ріст, диференціювання та запрограмовану смерть клітин, призводить до їх злоякісної трансформації (Fox, 2006). Однак, незважаючи на високий ступінь гетерогенності механізмів виникнення і прогресії злоякісних новоутворень, у всьому світі не припиняється пошук нових пухлиноспецифічних маркерів. Це пов'язано, насамперед, з тим, що регуляторні механізми клітин організовані за мереженим принципом, і, діючи скеровано на їх ключові компоненти, вдається регулювати фізіологію клітин в обхід генетичних змін, що викликали розвиток тих чи інших патологічних станів (Evans, 1998).

Одними із основних компонентів сигнальних мереж клітини є адаптерні/риштувальні білки. Адаптерні/риштувальні білки характеризуються наявністю численних білок-/ліпід-зв'язувальних доменів і мотивів, центрів для індукованої посттрансляційної модифікації і відсутністю каталітичних доменів. У багатьох випадках адаптерні/риштувальні білки є необхідними для повної активації сигнальних шляхів. Вони визначають утворення і локалізацію сигнальних комплексів і можуть сприяти проходженню чи інгібувати передачу сигналу залежно від їх концентрації в певному компартменті, регулюючи, таким чином, специфічність, ефективність і амплітуду сигналювання (Levchenko, 2000). До таких адаптерних білків відносяться представники родини (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS). За рахунок своєї мультидоменної структури Ruk/CIN85 та CD2AP/CMS зв'язуються з низкою білків-партнерів і формують мультимерні комплекси, залучені до контролю апоптозу, клатрин-опосередкованого ендоцитозу рецепторних тирозинових кіназ, внутрішньоклітинного транспорту везикул, динамічних перебудов актинового цитоскелету, адгезивних властивостей та інвазії клітин, мітогенного сигналювання, інфікування клітин вірусом простого герпесу (Dikic, 2002; Hutchings, 2003; Schmidt, 2003; Tibaldi, 2003; Sakakibara, 2004; Liang, 2005). Таким чином, наявні функціональні дані свідчать, що адаптерні білки Ruk/CIN85 та CD2AP/CMS залучені не тільки до регулювання нормального гомеостазу клітин, але й можуть брати участь у розвитку патологічних станів людини і тварин і, зокрема, злоякісних новоутворень.

Незважаючи на значні зусилля, переважна більшість сигнальних шляхів, які зазнали змін у процесі канцерогенезу, досліджені лише частково. Мало відомо про вклад адаптерних/риштувальних білків до патогенезу злоякісних новоутворень. Беручи до уваги значимість трансляційних досліджень в онкології, в даній дисертаційній роботі було вирішено проаналізувати експресію адаптерних білків Ruk/CIN85 та CD2AP/CMS у пухлинах грудної залози та матки людини, дослідити сигнальні механізми, залучені до реалізації їх біологічних ефектів, на моделях ліній пухлинних клітин in vitro.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планами наукових досліджень лабораторії сигнальних механізмів клітини Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України. У роботі використані результати досліджень, отримані в рамках бюджетних тем: „Аналіз експресії ізоформ адаптерного білка Ruk/CIN85 у зразках раку молочної залози людини”, № держреєстрації 0106U009734, 2006 р.; "Протеомний аналіз інтерактому ізоформ адаптерного білка Ruk/CIN85 в нормальних і трансформованих клітинах", № держреєстрації 0107U002370, 2007-2009 рр. Робота виконувалась також у рамках програми «Новітні медико-біологічні проблеми та оточуюче середовище людини» за темами: «Моніторинг профілю експресії ізоформ адаптерного білка в пухлинах людини як фактора прогнозу захворювання та параметра чутливості клітин до протипухлинної терапії», № держреєстрації 0104U007727, 2004-2006 рр.; „Протеомний аналіз адаптерного/риштувального білка Ruk/CIN85 в пухлинах грудної та щитовидної залоз людини”, № держреєстрації 0107U007195, 2007-2009 рр. Крім того, дослідження, представлені в роботі, були підтримані грантом Західно-Українського біомедичного наукового центру (West-Ukrainian BioMedical Research Center), 2006 р.

Мета та завдання досліджень. Метою дослідження було проаналізувати особливості експресії адаптерних білків Ruk/CIN85 та CD2AP/CMS у пухлинах грудної залози та матки людини та дослідити сигнальні механізми, залучені до реалізації їх біологічних ефектів, на моделях ліній пухлинних клітин in vitro.

Для досягнення поставленої мети було сформульовано такі основні завдання:

1. Проаналізувати особливості експресії множинних молекулярних форм Ruk/CIN85 у зразках умовно нормальних тканин та аденокарцином грудної залози і матки людини на рівні мРНК та білка за допомогою Нозерн-блот та Вестерн-блот аналізів, підходів імуногістохімії.

2. Дослідити експресію гомолога Ruk/CIN85, адаптерного білка CD2AP/CMS, у зразках умовно нормальних тканин та пухлин грудної залози і матки людини.

3. З'ясувати можливість утворення комплексів in vivo між адаптерним білком Rukl/CIN85 та його гомологом CD2AP/CMS в аденокарциномах грудної залози людини.

4. Вивчити особливості EGF-індукованої активації Erk1/2 та РІ3K/Akt сигнальних шляхів у клітинах аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7 з різним рівнем стабільної надекспресії Rukl/CIN85.

5. Дослідити вплив надекспресії повнорозмірної форми Ruk/CIN85 у клітинах MCF-7 на їх базальну та EGF-індуковану рухливість.

6. З'ясувати можливість залучення адаптерного білка Ruk/CIN85 до реалізації сигнальних ефектів дигідротестостерону на моделі клітин аденокарциноми матки людини лінії HeLa.

Об'єкт дocліджeння: молекулярні механізми канцерогенезу.

Пpeдмeт дocліджeння: експресія адаптерних білків родини (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS) та механізми реалізації їх ефектів у пухлинах грудної залози і матки людини.

Методи дослідження: методи роботи з культурами клітин, трансфекція, конфокальна мікроскопія, електрофорез білків в ПААГ та нуклеїнових кислот в агарозному гелі, Нозерн- та Вестерн-блот аналізи, імунопреципітація, підходи імуногістохімії.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено підвищення експресії повнорозмірної форми Ruk/CIN85 та білка CD2AP/CMS у зразках аденокарцином грудної залози та матки людини. Виявлені особливості профілю експресії множинних молекулярних форм Ruk/CIN85 в аденокарциномах грудної залози та матки людини порівняно з умовно нормальними оточуючими тканинами. Показано, що в клітинах умовно нормальних тканин грудної залози Rukl/CIN85 жорстко асоційований із структурами цитоскелету, тоді як у зразках пухлин білок виявляється в складі Тритон Х-100-розчинної фракції. Вперше продемонстровано найвищу інтенсивність позитивного імунобарвлення на Rukl/CIN85 в зонах інвазивного росту зразків протокового раку грудної залози. Показано, що зразки нормальної тканини матки характеризуються підвищеним вмістом високомолекулярних форм (р140, р130, р100), тоді як зразки пухлин матки - високим вмістом низькомолекулярних форм (р70, р40, р34). Вперше виявлено, що надекспресія Rukl/CIN85 в клітинах аденокарциноми матки людини лінії MCF-7 призводить до посилення їх рухливості та швидшої і потужнішої активації Erk1/2 та РІ3K/Akt сигнальних шляхів при дії EGF. Вперше ідентифіковані андрогенові рецептори в клітинах аденокарциноми матки людини лінії HeLa, показано дигідротестостерон-залежне утворення комплексу між Rukl/CIN85 та андрогеновим рецептором, встановлено роль Rukl/CIN85 в реалізації швидких негеномних ефектів рецепторів андрогенів.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної роботи розширюють сучасні уявлення про роль адаптерних/риштувальних білків у канцерогенезі, зокрема адаптерних білків родини (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS), і можуть слугувати підґрунтям для розробки підходів до оцінки рівня диференціювання та активаційного статусу злоякісно трансформованих епітеліальних клітин. Отримані дані щодо підвищення рівня експресії Rukl/CIN85 у пухлинах грудної залози та матки людини вказують на те, що досліджувані адаптерні білки можуть слугувати тканиноспецифічними маркерами пухлинного процесу і його прогресії, бути прогностичними факторами та потенційними мішенями для розробки фармакологічних препаратів скерованої дії. Результати дисертаційної роботи рекомендуються для використання в загальному курсі “Молекулярна біологія клітини” та спецкурсі ”Сигнальні механізми клітин” для студентів університетів зі спеціальностей ”біохімія”, “молекулярна біологія”, ”біотехнологія”.

Особистий внесок здобувача. Результати дисертаційної роботи отримані здобувачем особисто або за безпосередньої участі. Дослідження експресії мРНК ruk/cin85 проведено спільно з к.б.н., с.н.с. Бобаком Я. П. (Інститут біології клітини, Львів, Україна) та д.б.н., проф. Бухманом В. Л. (Кардіффський університет, Кардіфф, Велика Британія); вивчення особливостей EGFR-індукованої активації Erk1/2 та PI3K/Akt сигнальних шляхів та рухливості клітин - спільно з к.б.н., с.н.с. Самойленком А. А. Дослідження впливу DHT на вміст адаптерного білка Ruk/CIN85 у Тритон Х-100-розчинній фракції клітин аденокарциноми матки лінії HeLa було проведено здобувачем у лабораторії “Molecular Signaling Group” (керівник Іван Дікіч - професор, директор Інституту біохімії II медичної школи університету Гете, Франкфурт на Майні, Німеччина). Імуногістохімічний аналіз парафінових зрізів умовно нормальних тканин та аденокарцином грудної залози людини виконано в рамках співпраці зі співробітниками морфологічної лабораторії БІОНТЕК (м. Дніпропетровськ, Україна) к.б.н Лизогубовим В. В. та к.мед.н. Усенко В. С. Автор висловлює подяку д.мед.н., проф. Саврану В. Р. та к.мед.н., доц. Володько Н. А. кафедри онкології і радіології Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, а також співробітникам лабораторії сигнальних механізмів клітини Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України та відділу сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України за сприяння у виконанні роботи. Отримані результати опубліковано у спільних публікаціях. За темою проведеного наукового дослідження здобувачем зібрано та проаналізовано наукову літературу, опрацьовано та інтерпретовано отримані результати. Планування експериментальної роботи, аналіз та обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником д.б.н., проф. Дробот Л. Б.

Апробація результатів досліджень. Оcнoвні пoлoжeння диcepтaції бyли представлені на ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, Україна, 2006), міжнародних конференціях студентів і аспірантів “Молодь і поступ в біології” (Львів, Україна, 2006, 2007), конференціях молодих вчених Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна (Київ, Україна, 2007, 2008, 2009), VI, VII Парнасівській конференції (Краків, Польща, 2007; Ялта, Україна, 2009), багатогалузевому конгресі 15 ECCO - 34 ESMO (Берлін, Німеччина, 2009).

Публікації. Зa тeмoю диcepтaції oпyблікoвaнo 20 poбіт, які включaють 8 cтaттей у фахових виданнях тa тeзи 12 дoпoвідeй нa міжнapoдниx та вітчизняних нayкoвиx конференціях, з'їздах, конгресах.

Cтруктура та обсяг дисертації. Диcepтaція міcтить тaкі poзділи: вcтyп, аналітичний oгляд літepaтypи, мaтepіaли тa мeтoди дocліджeнь, peзyльтaти дocліджeнь, aнaліз тa oбгoвopeння peзyльтaтів дocліджeнь, висновки, додатки тa cпиcoк викopиcтaниx джepeл.

Диcepтaцію виклaдeнo нa 147 cтopінках мaшинoпиcнoгo тeкcтy і пpoілюcтpoвaнo 34 pиcyнками тa 5 тaблицями. Спиcoк використаної літepaтypи oxoплює 284 нaймeнyвaнь.

2. Основний зміст роботи

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено сучасний стан проблеми організації та функціонування сигнальних мереж клітин, детально проаналізовано доменну організацію сигнальних білків та порушення у клітинному сигналюванні, що призводять до злоякісної трансформації клітин. Особливу увагу приділено ролі адаптерних білків у функціонуванні сигнальних шляхів клітини, зокрема біологічної ролі адаптерного білка Ruk/CIN85 у регулюванні сигнальних процесів у клітинах.

Матеріали і методи досліджень. У дисертаційній роботі використано такі плазмідні вектори, сконструйовані для експресії в клітинах бактерій і ссавців: pRc/CMV2/Rukl, pEGFP-Rukl (вказані вектори були люб'язно надані професором Бухманом В. Л., Кардіффський університет, Кардіфф, Велика Британія). Клітини ліній MCF-7, HeLa та LNCaP були отримані в банку клітинних ліній Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького.

Детекцію повнорозмірної форми білка Rukl/CIN85 проводили за допомогою моноклонального анти-SH3A антитіла, а множинних молекулярних форм за допомогою поліклональних анти-Ruk/СС антитіл до С-кінцевої ділянки Ruk/CIN85, спільної для всіх ізоформ (Mayevska, 2006). У роботі також були використані антитіла до в-актину (“Sigma”, США), CD2AP, AR, клатрину, FAK (“Santa Cruz Biotech”, США), анти-мишачі і анти-кролячі IgG, кон'юговані з пероксидазою хрону (“Promega”, США). р85б моноклональне антитіло до регуляторної субодиниці РІ3К, було люб'язно надано професором Гутом І., (коледж медичної школи університету, Лондон, Велика Британія).

Експресію множинних молекулярних форм Ruk/CIN85 аналізували в зразках пухлин грудної залози та матки людини, які отримували в рамках співпраці з кафедрою онкології та медрадіобіології Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького. Класифікацію пухлин проводили згідно класифікації ВООЗ. Пацієнти були проінформовані та дали згоду на використання хірургічного матеріалу в дослідницьких цілях. Всього було досліджено 21 зразок умовно нормальної тканини грудної залози, 31 зразок аденокарциноми грудної залози, 8 зразків умовно нормальної тканини матки, 16 зразків пухлин матки. Експресію множинних молекулярних форм Ruk/CIN85 на рівні білка вивчали методом імуноблот-аналізу в Тритон Х-100-розчинній та SDS-розчинній фракціях. Тотальну РНК із зразків тканин виділяли гуанідинізотіоціанатним методом (Chomczynski, 2003). Для Нозерн-гібридизації використовували 32P-мічений зонд клону ЗЕ7 кДНК гену ruk (Gout, 2000). рівень специфічних сигналів мРНК ruk/cin85 та відповідних білкових продуктів у зразках вирівнювали відносно експресії 18S рРНК та актину відповідно. Імуногістохімічні дослідження зразків умовно нормальних тканин та пухлин проводили на парафінових зрізах за схемою непрямого методу виявлення антигенів із застосуванням авідин-біотинової системи та пероксидази згідно стандартних протоколів. Інтенсивність імуногістохімічного барвлення аналізували за допомогою світлового мікроскопа “Axioplan” (“Carl Zeiss”, Німеччина) з окуляром х2,5, імерсією та об'єктивом х100, оснащеного системою відеовведення зображень.

Клітини аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7, сублінії клітин MCF-7 зі стабільною надекспресією Ruk/CIN85, клітини аденокарциноми шийки матки людини лінії HeLa, клітини аденокарциноми передміхурової залози людини лінії LNCaP вирощували в середовищі DMEM (“Sigma”, США) за присутності 10% ембріональної сироватки теляти (“GibcoBRL”, США), 2 мМ L-глутаміну, 50 МО/мл пеніциліну, 50 мкг/мл стрептоміцину (“GibcoBRL”, США) в зволоженій атмосфері з 5% СО2 при 37?С.

Лізування клітин проводили за методикою, описаною в роботі Морандіні (Morandini, 1996). Концентрацію білка в лізатах визначали за методом Петерсона (Peterson, 1977). Оцінку рухливості клітин лінії MCF-7 проводили в модифікованій камері Бойдена (Garcia, 2006). Життєздатність клітин оцінювали за активністю електронотранспортного ланцюга, яку визначали за допомогою тесту з МТТ-реагентом (Carmichael, 1987) та за допомогою фарбування клітин 0,2% трипановим синім.

Конфокальну та флуоресцентну мікроскопію препаратів проводили за допомогою спектральної мультифотонної лазер-скануючої конфокальної системи LSM 510 META (“Carl Zeiss”, Німеччина) під управлінням програмного забезпечення Carl Zeiss Confocal Software і Zeiss LSM Image Browser Version 4.0.0.241. Для сканування клітин використовували об'єктив 63x/0,75 Korr. Сканування здійснювали при довжинах хвиль збудження 489 нм для GFP (аргон-іонний лазер), 543 нм для TRITC-фаллоїдину (гелій-неон-іонний лазер). Актиновий цитоскелет специфічно забарвлювали TRITC фаллоїдином та Alexa Fluor 546 фаллоїдином (Sabala, 2002).

Для преципітації Rukl/CIN85-імунних комплексів використовували білок G-сефарозу (“Amersham”, Велика Британія). Клітинні лізати та імунопреци-пітати розділяли електрофорезом в градієнтному ПААГ (5-17%) за присутності SDS (Laemmli, 1970) з наступним імуноблот-аналізом (Тоwbin, 1979).

Всі експерименти проводили 3-5 разів. Після сканування авторадіо- та флюорограм (сканер UMAX Astra 4700), результати досліджень опрацьовували за допомогою комп'ютерних програм Photoshop, GelPro 3.2., Microsoft Exel 97. Діаграми будували на основі обчислень інтегральної оптичної густини (IOD). У роботі наведено середні значення величин і стандартні похибки (N±m). Статистичний аналіз проводили користуючись критерієм Ст'юдента, вірогідними вважали дані у разі Р?0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Нові підходи до пошуку засобів пригнічення пухлинного росту ґрунтуються на дослідженні сигнальних шляхів, залучених до координованого контролю проліферації, диференціювання клітин і апоптозу. У зв'язку з цим важливо з'ясувати природу і механізми регуляції функціональної активності окремих ланок сигналювання. Важливим є дослідження ролі сигнальних білків у процесах трансформації клітин, їх участі у процесах пухлинного росту та метастазування.

Дослідження онкогенного потенціалу адаптерних білків родини (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS) у пухлинах та лініях пухлинних клітин грудної залози. Імуногістохімічні дослідження парафінових зрізів зразків пухлин грудної залози та оточуючих умовно нормальних тканин проводили з використанням поліклональних антитіл до С-кінцевої суперспіралізованої ділянки Ruk/CIN85 (анти-Ruk/СС). В умовно нормальній тканині грудної залози було виявлене барвлення низької інтенсивності в протоковому і альвеолярному епітелії (рис. 1). Характер позитивного барвлення дифузний з нечисленними гранулами, що мали тенденцію до локалізації в апікальній зоні клітин. У поверхневих клітинах епітелію це барвлення мало дещо вищу інтенсивність, що може свідчити про підвищення експресії Ruk/CIN85 по мірі диференціювання клітин епітелію протоків. У зонах злоякісного росту виявлено значну гетерогенність барвлення на Ruk/CIN85: гранулярне і дифузне барвлення цитоплазми, перинуклеарну і ядерну локалізацію Ruk/CIN85 (рис. 1). Характерним є загальне зростання інтенсивності барвлення ракових клітин у порівнянні з умовно нормальною тканиною. Потрібно відмітити, що в зонах інвазивного росту пухлин виявлено найвищу інтенсивність барвлення ракових клітин на Ruk/CIN85 (рис. 1).

За допомогою Нозерн-блот аналізу у зразках тотальної РНК, виділеної з тканин грудної залози, виявлено мРНК-транскрипт гену ruk/cin85 розміром 3,5 тпн, який кодує повнорозмірну форму білка з молекулярною масою 85 кДа. Статистично достовірних відмінностей між рівнем експресії мРНК-транскрипту гену ruk/cin85 розміром 3,5 тпн у зразках умовно нормальних тканин та зразках аденокарцином грудної залози виявлено не було.

Експресію множинних молекулярних форм Ruk/CIN85 аналізували у Тритон X-100-розчинній фракції (TXS, Triton X-100-soluble) і SDS-розчинній фракції загального білка (TTP, total tissue protein) зразків умовно нормальних тканин та пухлин грудної залози людини методом Вестерн-блот аналізу. TTP фракція додатково містила білки, жорстко асоційовані з цитоскелетом і ядерним матриксом, які за умов екстракції Тритоном X-100 не солюбілізуються.

Аналіз повнорозмірної форми білка Rukl/CIN85 у контрольних зразках та зразках аденокарцином грудної залози людини проводили з використанням моноклонального анти-SH3A антитіла. У TXS фракції виявлено імунореактивну смугу, що відповідає білку з молекулярною масою 85 кДа (p85) - повнорозмірному продукту гену ruk/cin85 (рис. 2). Експресія p85 у контрольній нетрансформованій тканині в більшості проаналізованих зразків детектувалась на низькому рівні. Як видно з даних, приведених на рис. 2, досліджені зразки інвазивного протокового раку 1-ої - 3-ої стадій злоякісності характеризувались значним зростанням рівня експресії повнорозмірної форми білка Rukl/CIN85. Слід особливо відмітити, що у зразках середнього ступеня диференціювання (G2) вміст Rukl/CIN85 у Тритон Х-100-розчиній фракції був вищим порівняно зі зразками пухлин низького ступеня диференціювання (G3), які характеризуються агресивним перебігом, швидким і раннім метастазуванням та високою здатністю до рецидивів після лікування.

Множинні молекулярні форми Ruk/CIN85 з інтактним С-кінцевим доменом, який присутній в усіх відомих формах Ruk/CIN85, детектували за допомогою поліклональних анти-Ruk/CC антитіл. У більшості зразків умовно нормальних тканин грудної залози присутня молекулярна форма Ruk/CIN85 з молекулярною масою 130 кДа. У досліджених зразках аденокарцином грудної залози було детектовано зростання вмісту/появу імунореактивними смуг, що відповідають білкам з молекулярною масою 130, 85, 56, 40 і 34 кДа (рис. 2).

Імуноблот-аналіз TTP фракції зразків грудної залози людини з використанням анти-SH3A антитіла в основному був подібним до такого у TXS фракції, засвідчуючи значне підвищення рівня експресії Rukl/CIN85 у зразках аденокарцином порівняно з умовно нормальними тканинами (рис. 2).

Вестерн-блот аналізом TTP екстрактів умовно нормальних тканин грудної залози з використанням анти-Ruk/CC антитіл виявлено поліморфізм у спектрі множинних молекулярних форм Ruk/CIN85. У деяких зразках нормальної тканини були виявлені p130 і/або p85, тоді як в інших зразках було детектовано незначний вміст p130, p85, p70, p56 і p34. У зразках раку грудної залози виявлено високий вміст множинних молекулярних форм Ruk/CIN85 з молекулярними масами 130, 85, 70, 50, 40 і 34 кДа. На відміну від TXS розчинної фракції, у TTP фракції загального білка була виявлена форма з молекулярною масою 70 кДа (рис. 2).

Подібним за структурою і функціями до Rukl/CIN85 є адаптерний білок CD2AP/CMS. Використання анти-CD2AP антитіл дозволило виявити зростання вмісту CD2AP/CMS у зразках аденокарцином грудної залози людини порівняно з умовно нормальною тканиною як у TXS, так і у TTP фракціях (рис. 3).

Зростання рівнів експресії Rukl/CIN85 та CD2AP/CMS у зразках аденокарцином у порівнянні з умовно нормальними тканинами є статистично достовірним (Р?0,05) (рис. 4).

Незважаючи на односкеровані зміни у рівні експресії Ruk/CIN85 та CD2AP/CMS у досліджених зразках аденокарцином, ступінь підвищення відрізняється для окремих зразків, що, поряд з даними літератури, може свідчити про регуляторну роль балансу цих білків у контролі фізіологічних відповідей пухлинних клітин.

Дослідження активності MAPK/Erk1/2 та РІ3K сигнальних шляхів в клітинах MCF-7 дикого типу та субклонах з різним рівнем стабільної надекспресії повнорозмірної форми Ruk/CIN85. Для аналізу змін в біологічних властивостях аденокарциномних клітин грудної залози, що можуть бути наслідком надекспресії адаптерного білка Ruk/CIN85, отримано стабільні сублінії клітин аденокарциноми грудної залози лінії MCF-7 з надекспресією Rukl/CIN85 та Rukl/CIN85, кон'югованого з GFP.

Оскільки аденокарциноми грудної залози характеризуються посиленням сигналювання, залежного від EGF, на першому етапі було проаналізовано особливості активації Ras/Erk1/2 та РІ3K/Akt сигнальних шляхів в клітинах лінії MCF-7 із стабільною надекспресією Rukl/CIN85 при дії EGF.

Активована фосфоформа Akt у контрольних нестимульваних клітинах детектувалася на дуже низькому рівні. Максимальне активування Akt в клітинах, трансфікованих пустим вектором (контроль), та в клітинах D4 з низьким рівнем надекспресії Rukl/CIN85 спостерігали через 5 хв після початку інкубації з EGF. Через 30 хв після початку інкубації з EGF фосфорилювання Akt було значно нижчим за максимальне, хоча й перевищувало контрольні значення. У клітинах субліній G4 та GFP-Ruk з високим рівнем надекспресії адаптерного білка спостерігалось швидше та триваліше активування кінази Akt при дії EGF у порівнянні з контрольними клітинами (рис. 5).

Максимальне активування Erk в клітинах дикого типу та клітинах субклону D4 спостерігали через 10 хв після початку інкубації з EGF. Через 30 хв після початку інкубації з EGF фосфорилювання Erk було близьким до контрольного значення (рис. 6). Водночас, активність Erk в клітинах, що стабільно надекспресують повнорозмірну форму Rukl/CIN85 на високому рівні, досягала максимальних значень вже через 1 хв та значно перевищувала контрольні значення через 30 хв після стимуляції.

Вплив надекспресії Ruk/CIN85 на рухливість клітин лінії MCF-7. В літературі є дані, що EGF-залежна стимуляція Ras/Erk і PI3K/Akt сигнальних шляхів індукує зміни морфології і підвищує рухливість клітин лінії MCF-7 (Garcia, 2006). Для дослідження можливого впливу Ruk/CIN85 на EGF-індуковану рухливість клітин лінії MCF-7 було досліджено хемотаксис клітин з використанням модифікованої камери Бойдена, що містила мембранну перегородку з розміром пор 8 мкм. Клітини, висіяні на зовнішню поверхню мембрани верхнього відсіку в середовищі з 0,1% ембріональною сироваткою теляти, мігрували на внутрішню поверхню мембрани нижнього відсіку, в якому знаходилося середовище з 5% ембріональної сироватки теляти за присутності або відсутності EGF (100 нг/мл).

Встановлено, що клітини сублінії G4 мігрують приблизно на 40% ефективніше у порівнянні з контролем (рис. 7). Водночас EGF-індукована міграція контрольних клітин лінії MCF-7 зросла на 60%, тоді як EGF-індукована міграція клітин сублінії G4 - лише на 20%. Отримані дані узгоджуються з даними літератури про зниження чутливості аденокарциномних клітин до дії EGF при посиленні їх трансформувального потенціалу.

Дослідження онкогенного потенціалу адаптерних білків родини (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS) у пухлинах та лініях пухлинних клітин матки людини. У зразках тотальної РНК, виділеної з тканин матки, виявлено основний мРНК-транскрипт гену ruk/cin85 розміром 3,5 тпн, в той час як рівень експресії транскриптів ruk/cin85 розміром 2,5 тпн (rukm) і 1,5 тпн (ruks) був значно нижчим. У більшості проаналізованих зразках раку тіла та шийки матки виявлено підвищення рівня експресії транскрипту ruk/cin85 розміром 3,5 тпн у порівнянні з рівнем експресії даного транскрипту у відповідних зразках умовно нормальної тканини матки.

Вестерн-блот аналізом TXS фракції зразків умовно нормальних тканин та пухлин матки з використанням поліклональних анти-Ruk/CC антитіл виявлено подібний профіль імунореактивних смуг, що відповідають білкам з молекулярними масами 140, 130, 85, 56 та 40 кДа (рис. 8).

Водночас імуноблот-аналіз TTP фракції дозволив виявити зростання рівня експресії повнорозмірної форми адаптерного білка Ruk/CIN85 у зразках пухлин матки порівняно з контрольними тканинами (рис.). Зразки нормальних тканин матки характеризувались високим вмістом високомолекулярних форм (р140, р130, р100), тоді як зразки пухлин матки - високим вмістом низькомолекулярних форм (р70, р40, р34) (рис. 8).

Отримані дані свідчать, що регуляторну роль в процесі трансформації епітеліальних клітин можуть відігравати як зміна експресії множинних молекулярних форм адаптерного білка Ruk/CIN85, так і зміна їх субклітинної локалізації.

За допомогою анти-CD2AP антитіл у TTP фракції зразків умовно нормальних тканин та пухлин матки людини була детектована імунореак-тивна смуга, що відповідає білку з молекулярною масою 83 кДа (рис. 9). Порівняльним аналізом виявлено підвищення рівня експресії CD2AP/CMS у зразках пухлин матки порівняно з умовно нормальною тканиною.

Вплив естрадіолу, прогестерону та DHT на вміст повнорозмірної форми Rukl/CIN85 у Тритон Х-100-розчинній фракції. Беручи до уваги важливу роль стероїдів у фізіології матки, на наступному етапі був проаналізований можливий вплив в-естрадіолу, прогестерону та 5-б-дигідротестостерону (DHT) на вміст повнорозмірної форми Ruk/CIN85 у Тритон Х-100-розчинній фракції клітин аденокарциноми матки людини лінії HeLa.

Вестерн-блот аналізом з використанням анти-SH3A антитіла виявлено низький вміст Rukl/CIN85 в нестимульованих клітинах лінії HeLa. Клітини стимулювали стероїдними гормонами у концентраціях (0,1, 1 і 10 нM) протягом різних часових проміжків (10, 30, 60 хв; 1, 2, 3 доба). Нам не вдалося виявити змін у рівні експресії Rukl/CIN85 при тривалій стимуляції (1, 2 і 3 доба) гормонами. Водночас, короткотривала стимуляція (10, 30 і 60 хв) приводила до значного зростання вмісту Rukl/CIN85 у Тритон Х-100-розчинній фракції. Максимальні зміни вмісту р85 у TXS фракції спостерігалися на 30-у хв після стимуляції 1 нM естрадіолом, 1 нM прогестероном та 0,1 нM DHT.

Оскільки вплив андрогенів, на відміну від естрогенів та прогестерону, на клітини матки є мало дослідженим, було вирішено обрати для подальших експериментів саме дигідротестостерон. Однак в базах даних PubMed нам не вдалося відшукати інформації як стосовно експресії андрогенового рецептора (AR), так і його біологічних функцій в клітинах HeLa. Тому було зроблено спробу ідентифікувати рецептор AR в клітинах HeLa за допомогою Вестерн-блот аналізу, використавши як позитивний контроль лізати клітин аденокарциноми простати людини лінії LNCaP.

З даних, приведених на рис. 10, видно, що AR експресується в клітинах HeLa, хоча і на значно нижчому рівні. Суттєвих змін вмісту AR у TXS фракції стимульованих клітин виявлено не було.

Вплив DHT на ріст і життєздатність клітин HeLa. Для оцінки скерованості впливу DHT на ріст і життєздатність клітин лінії HeLa було використано два підходи: МТТ-тест, що дозволяв оцінити життєздатність клітин за активністю електронотранспортного ланцюга, та тест з трипановим синім, що показував, пов'язане з клітинною смертю, зростання проникності плазматичної мембрани.

Встановлено, що інкубація клітин HeLa з DHT протягом трьох діб викликає дозозалежне посилення клітинного росту, їх життєздатності та виживання. За присутності 10 нМ DHT життєздатність, клітинний ріст та виживання зросли на 55%, 61% і 14% відповідно, що свідчить про здатність DHT впливати на трансформувальний потенціал клітин HeLa in vitro (рис. 11).

DHT викликає зміни субклітинного розподілу Ruk/CIN85 у клітинах HeLa. Детальний аналіз впливу DHT на вміст Rukl/CIN85 у TXS фракції, залежно від концентрації DHT та часу дії індуктора, виявив такі законо-мірності (рис. 12). Так підвищення вмісту р85 спостері-галось вже на 2-у хв, досягаючи максиму-му на 10-у хв при концентрації DHT 0,01 нМ з наступним зниженням на 30-у хв. Цікаво також відмітити існування фазових коливань вмісту р85 залежно від концентрації гормону (рис. 12).

Для візуалізації можливих змін субклітинної локалізації Ruk/CIN85 під впливом DHT було використано конфокальну мікроскопію.

Конфокальною мікроскопією контрольних клітин HeLa, тимчасово трансфікованих pEGFP-Rukl/CIN85 було показано, що GFP-Rukl/CIN85 дифузно розподілений у цитоплазмі. При цьому у примембранній області спостерігається часткова співлокалізація повнорозмірної форми Ruk/CIN85 та актину. Стимуляція DHT супроводжувалась частковим перерозподілом сигналу. Ці зміни були пов'язані зі зменшенням ступеня співлокалізації Rukl/CIN85 і актину у примембранній зоні і відповідно нагромадженням білка у перинуклеарній області. За результатами конфокальної мікроскопії виявлені зміни залежали від концентрації гормону.

AR і повнорозмірна форма Ruk/CIN85 утворюють гормон-залежний комплекс в клітинах HeLa. Методом реципропної імунопреципітації встановлено, що при короткотривалій стимуляції клітин HeLa фізіологічними концентраціями DHT AR і Rukl/CIN85 виявляються у спільних комплексах, що містять також p85б регуляторну субодиницю PI3K, FAK та клатрин. Утворення таких комплексів корелює зі зростанням вмісту зазначених білків у Тритон Х-100-розчинній фракції і є концентраційно-залежним (рис. 13).

Отримані дані дозволяють припустити потенційну роль Ruk/CIN85 у реалізації швидких негеномних ефектів андрогенів у клітинах лінії HeLa.



Висновки

Результати проведених досліджень дають змогу припустити, що аномальна експресія адаптерних білків Ruk/CIN85 та CD2AP/CMS у пухлинах грудної залози та матки й відповідні можливі зміни функціональної активності розташованих нижче сигнальних шляхів можуть бути залучені до підтримання злоякісного фенотипу. Отримані експериментальні дані, що вказують на значне підвищення експресії Rukl/CIN85 та CD2AP/CMS в карциномах грудної залози і матки людини, дозволяють вважати досліджувані адаптерні білки одними із тканиноспецифічних маркерів пухлинного росту, що можуть бути використані як прогностичний фактор розвитку онкологічних захворювань та потенційні мішені для розробки фармакологічних препаратів скерованої дії.

1. За допомогою Вестерн-блот аналізу 31 пари зразків інвазивного протокового раку грудної залози людини 1-ої - 3-ої стадій злоякісності та оточуючих умовно нормальних тканин виявлено статистично достовірне зростання рівня експресії повнорозмірної форми білка Rukl/CIN85 та його гомолога CD2AP/CMS у пухлинних тканинах. У зразках середнього ступеня диференціювання (G2) вміст Rukl/CIN85 був достовірно вищим порівняно зі зразками пухлин низького ступеня диференціювання (G3). Обернена залежність показана для CD2AP/CMS.

2. Методом імунопреципітації продемонстровано, що адаптерні білки Rukl/CIN85 та CD2AP/CMS утворюють комплекси in vivo. Cпіввідношення (Rukl/CIN85)/(CD2AP/CMS) в імунопреципітатах відрізнялось для зразків зі ступенем диференціювання G2 та G3.

3. Імуногістохімічні дослідження з використанням моноклонального і поліклональних анти-Ruk/CIN85 антитіл показали, що в контрольній тканині грудної залози Ruk/CIN85-специфічний сигнал виявляється у вигляді барвлення низької інтенсивності в протоковому та альвеолярному епітелії з тенденцією до локалізації в апікальній зоні клітин. В поверхневих клітинах епітелію це барвлення має дещо вищу інтенсивність, що може свідчити про підвищення експресії Ruk/CIN85 в міру диференціювання клітин епітелію протоків. Для клітин пухлинних зразків характерним є загальне підвищення інтенсивності барвлення на Rukl/CIN85, особливо в зонах інвазивного росту.

4. Продемонстровано, що сублінії клітин аденокарциноми грудної залози MCF-7, які стабільно надекспресують Rukl/CIN85, характеризуються змінами як динаміки, так і інтенсивності Erk1/2- і Akt-залежного сигналювання, індукованого EGF. Показано, що EGF індукує швидку і потужнішу активацію Erk1/2 і Akt, рівень якої підтримується до 30 хв інкубації з фактором росту, у порівнянні з клітинами MCF-7, які були стабільно трансфіковані вектором без вставки.

5. Виявлено зростання рівнів експресії мРНК і білка повнорозмірної форми Rukl/CIN85 та білка CD2AP/CMS у пухлинах матки порівняно з умовно нормальною оточуючою тканиною. Характерною особливістю профілю експресії множинних молекулярних форм Ruk/CIN85 як в контрольних тканинах, так і доброякісних пухлинах, був високий вміст високомолекулярних форм, 140 і 130 кДа, тоді як в зразках злоякісних пухлин спостерігалось зростання вмісту форм з молекулярною масою 40 і 30 кДа.

6. Вперше ідентифіковані андрогенові рецептори в клітинах аденокарциноми матки людини лінії HeLa, показано дигідротестостерон-залежне утворення комплексу між Rukl/CIN85 та андрогеновим рецептором, встановлено роль Rukl/CIN85 в реалізації швидких негеномних ефектів рецепторів андрогенів.



Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Expression of adaptor protein Ruk/CIN85 isoforms in cell lines of various tissue origins and human melanoma / O. Mayevska, H. Shuvayeva, N. Igumentseva, S. Havrylov, O. Basaraba, Y. Bobak, M. Barska, N. Volod'ko, J. Baranska, V. Buchman, L. Drobot // Exp. Oncol. -- 2006. -- Vol. 28, № 4. -- P. 275-281.

2. Study of Ruk/CIN85 isoforms expression in normal and transformed human tissues / B. Vynnytska, O. Basaraba, Ya. Bobak, G. Shuvayeva, O. Mayevska, M. Barska, O. Fedorko, L. Drobot // Вісник Львівського університету, Серія біологічна. -- 2006. -- № 41. -- С. 26-30.

3. Study of CIN85/Ruk isoforms expression in human glyoblastoma multiforme / Ya. Bobak, О. Basaraba, G. Shuvayeva, O. Mayevska, N. Ihumentseva, B. Vynnytska, О. Fedorko, L. Drobot // Annales Universitatis Mariae Curie-Skіodowska Lublin-Polonia. -- 2006. -- Т l.XIX, № 1, 38. -- С. 183-185.

4. Поліморфізм експресії адаптерного білка CIN85/Ruk у пухлинах мозку людини / Я. П. Бобак, О. І. Басараба, Б. О. Винницька, О. І. Федорко, Л. Б. Дробот // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології. -- 2007. -- Т. 1. -- С. 415-418.

5. Expression features of adapter proteins Ruk/CIN85 and CD2AP/CMS in normal and transformed human thyroid tissues / O. I. Basaraba, H. V. Pasichnyk, K. V. Kyrylkova, Ya. P. Bobak, A. A. Samoylenko, S. M. Marchenko, V. N. Marina, V. I. Kolomiytsev, L. B. Drobot // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. -- 2008. -- № 4. -- С. 45-53.

6. Експресія адаптерних білків родини (Ruk/CIN85)/(CD2AP/CMS) в аденокарциномах молочної залози людини / О. І. Басараба, М. Л. Барська, Я. П. Бобак, Г. Ю. Шуваєва, С. М. Марченко, В. Р. Савран, Н. А. Володько, В. Л. Бухман, Л. Б. Дробот // Медична хімія. -- 2009. -- Т. 11, № 3. -- С. 9-12.

7. Comparative study of expression of adaptor proteins Ruk/CIN85 and CD2AP/CMS in normal and tumor human uterus tissues / O. I. Basaraba, Ya. P. Bobak, H. Yu. Shuvayeva, O. M. Mayevska, N. I. Igumentseva, S. M. Marchenko, N. A. Volodko, V. L. Buchman, L. B. Drobot // Біологічні Студії. -- 2009. -- Т. 3, № 3. -- С. 5-16.

8. Дослідження експресії адаптерних білків Ruk/CIN85 та CD2AP/CMS у пухлинах матки людини / О. Басараба, Я. Бобак, Г. Шуваєва, С. Марченко, О. Маєвська, Н. Ігуменцева, Н. Володько, В. Бухман, Л. Дробот // Клінічна та експериментальна патологія. -- 2009. -- Т. VIII, № 4. -- С. 125-130.

9. Дослідження експресії множинних молекулярних форм CIN85/Ruk у нормальних і трансформованих тканинах людини / О. І. Басараба, Н. I. Кічула, M. A. Шепель, Г. Ю. Шуваєва, Я. П. Бобак, O. M. Маєвська, Л. Б. Дробот // II Міжнародна наукова конференція студентів і аспірантів “Молодь і поступ в біології”: Збірка тез, (Львів, 21-24 березня 2006). -- Львів. -- 2006. -- С. 333.

10. Експресія адаптерного білка CIN85/Ruk в аденокарциномах молочної залози людини / М. Л. Барська, О. І. Басараба, О. М. Маєвська, В. В. Стадник, A. М. Манченко, В. В. Лізогубов, В. С. Усенко, В. Р. Савран // ІХ Український біохімічний з'їзд: Збірка тез, (Харків, 24-27 жовтня 2006). -- Харків. -- 2006. -- Т. 2. -- С. 27.

11. Дослідження експресії адаптерного білка Ruk/CIN85 у пухлинах молочної залози та матки людини / О. І. Басараба, Я. П. Бобак, М. Л. Барська, Г. Ю. Шуваєва, В. Р. Савран, Н. А. Володько, Л. Б. Дробот // Конференція молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології-2007”, (Київ, 7-8 червня 2007), Укр. біохім. журн. -- 2007. -- Т. 79, № 4. -- С. 116.

12. Дослідження адаптерного білка CIN85/Ruk в злоякісних пухлинах молочної залози / О. П. Качмарик, М. Л. Барська, О. І. Басараба, Л. Б. Дробот // III Міжнародна наукова конференція студентів і аспірантів “Молодь і поступ в біології”: Збірка тез, (Львів, 23-27 квітня 2007). -- Львів. -- 2007. -- С. 58.

13. Adaptor proteins Ruk/CIN85 and CD2AP/CMS are up-regulated in human breast adenocarcinoma / O. I. Basaraba, Ya. P. Bobak, M. L. Barska, G. Yu. Shuvayeva, V. R. Savran, N. A. Volodko, V. V. Lisogybov, V. S. Usenko, V. L. Buchman, L. B. Drobot // III Міжнародна наукова конференція студентів і аспірантів “Молодь і поступ в біології”: Збірка тез, (Львів, 23-27 квітня 2007). -- Львів. -- 2007. -- С. 403.

14. Adaptor protein Ruk/CIN85 is up-regulated in human breast adenocarcinoma / M. Barska, O. Basaraba, Ya. Bobak, G. Shuvayeva, O. Mayevska, V. Savran, N. Volodko, V. Lysogubov, V. Usenko, V. Buchman, L. Drobot // VI Parnas Conference, (Krakow, 30 May-2 June 2007), Acta Biochimica Polonica. -- 2007. -- Vol. 54, Suppl. 2. -- P. 53.

15. Study of adaptor protein Ruk/CIN85 and CD2AP/CMS expression in human uterus tumor / O. Basaraba, Ya. Bobak, G. Shuvayeva, N. Volodko, V. Buchman, L. Drobot // VI Parnas Conference, (Krakow, 30 May-2 June 2007), Acta Biochimica Polonica. -- 2007. -- Vol. 54, Suppl. 2. -- P. 54.

16. Basaraba O. I. Comparative analysis of Ruk/CIN85 isoforms expression profiles in normal and transformed human tissues / O. I. Basaraba // Конференція молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології-2008”, (Київ, 12-13 червня 2008), Укр. біохім. журн. -- 2008. -- Т. 80, № 4. -- С. 109.

17. Study of adapter protein Ruk/CIN85 subcellular redistribution after stimulation of HeLa cells with activators of PI3K / O. Basaraba, N. Kozlova, A. Pasichnyk, I. Dikic, L. Drobot // ECCO 15 -- ESMO 34th Multidisciplinary Congress: abstract book, (Berlin, 20-24 September 2009), EJC Supplements. -- Berlin. -- 2009. -- Vol. 7, № 2. -- P. 96-97.

18. Study the biological role of adapter protein Ruk/CIN85 in human cervical adenocarcinomas / O. Basaraba, A. Pasichnyk, N. Kozlova, D. Gerashchenko, Ya. Bobak, G. Shuvayeva, N. Igumentseva, N. Volodko, L. Drobot // VII Parnas Conference, (Yalta, 3-7 October 2009), Укр. біохім. журн.-- 2009. -- Vol. 81, № 4. -- P. 55.

19. Overexpression of adaptor protein Ruk/CIN85 affects epidermal growth factor-dependent signalling in MCF-7 breast adenocarcinomas cells / A. Samoylenko, B. Vynnytska, N. Byts, K. Palyvoda, O. Basaraba, S. Marchenko, Y. Rzhepetsky, G. Shuvayeva, T. Kietzmann, V. Buchman, L. Drobot // VII Parnas Conference, (Yalta, 3-7 October 2009), Укр. біохім. журн. -- 2009. -- Vol. 81, № 4. -- P. 72.

...