Експериментальна оцінка детоксикуючої активності корвітину при каловому перитоніті

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ОЦІНКА ДЕТОКСИКУЮЧОЇ АКТИВНОСТІ КОРВІТИНУ ПРИ КАЛОВОМУ ПЕРИТОНІТІ

Деркачевська Вікторія Василівна

14.03.05 - фармакологія

Харків - 2010

Анотація

Деркачевська В.В. Експериментальна оцінка детоксикуючої активності корвітину при каловому перитоніті. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Національний фармацевтичний університет, Харків, 2010.

Дисертація присвячена експериментальному обґрунтуванню доцільності лікувально-профілактичного застосування корвітину при каловому перитоніті.

Експериментально доведено, що даний біофлавоноїдний препарат реалізує свою фармакотерапевтичну ефективність шляхом регуляції прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в організмі, тим самим попереджуючи розвиток розповсюдженої мембранопатії. Більш того, корвітин здатен нормалізувати вміст основних компонентів аденілнуклеотидної системи та рівень показників енергообміну, коригувати активність основних ферментів енергетичного гомеостазу та концентрацію головних компонентів вуглеводного обміну. Детоксикуюча та гепатопротекторна активності корвітину реалізуються за рахунок нормалізації функціонального стану печінки при каловому перитоніті.

Також встановлено, що на етапі біотранспорту корвітин здатен прискорювати процеси детоксикації циркулюючих у крові щурів ендотоксини при каловому перитоніті.

Ключові слова: каловий перитоніт, ендотоксикоз, біофлавоноїдний препарат корвітин, детоксикуюча активність.

Аннотация

Деркачевская В.В. Экспериментальная оценка детоксицирующей активности корвитина при каловом перитоните. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2010.

Диссертация посвящена экспериментальному обоснованию целесообразности лечебно-профилактического применения корвитина при каловом перитоните.

Сравнительный анализ фармакотерапевтической эффективности корвитина и референтного препарата - тиотриазолина - в условиях калового перитонита показал, что по выживаемости, а также динамике температуры тела и течению клинических симптомов на разных сроках исследования изучаемый биофлавоноидный препарат имеет достоверные преимущества.

Фармакометрическими исследованиями разработан оптимальный режим дозирования корвитина при каловом перитоните - введение препарата в дозе 368,6 мг/кг за 1 час до введения каловой взвеси и через 6,72 часа в дозе 389,0 мг/кг после моделирования калового перитонита обеспечивает максимальную выживаемость животных при минимальных вводимых дозах изучаемого биофлавоноидного препарата.

Биохемилюминисцентный анализ показал, что корвитин препятствует интенсификации свободнорадикальных реакций как в сыворотке, так и в коре головного мозга животных с каловым перитонитом, на что с высокой степенью достоверности указывает динамика изменений таких показателей биохемилюминисценции, как: амплитуда быстрой вспышки сверхслабого свечения, амплитуда медленной вспышки сверхслабого свечения, конечное значение интенсивности сверхслабого свечения, время индукции медленной вспышки и общая светосумма реакции во все сроки исследования в сравнении с контрольной группой № 1.

Доказано, что лечебно-профилактическое применение корвитина также предупреждает и накопление продуктов перекисного окисления липидов, повышая функциональную активность ферментативного (супероксиддисмутазы и каталазы) и неферментативного (глутатиона восстановленного и свободных сульфгидрильных групп) звеньев антиоксидантной системы защиты организма животных в условиях моделируемой формы эндогенной интоксикации.

Установлено, что введение корвитина нормализует соотношение в системе АТФ-АДФ-АМФ. Это реализуется коррекцией в динамике таких параметров энергообмена, как энергетический заряд, энергетический потенциал, индекс фосфорилирования, коэффициент сравнения и термодинамический контроль дыхания. Применение корвитина одновременно предупреждает снижение активности креатинкиназы и повышение активности лактатдегидрогеназы во все сроки исследования.

Также применение корвитина в условиях абдоминального сепсиса способствует повышению концентрации глюкозы, гликогена и пирувата, с одновременным снижением уровня лактата и окислительно-восстановительного потенциала в сыворотке и гомогенате печени животных с каловым перитонитом.

Комплексными исследованиями установлено, что корвитин обладает способностью не только нормализовать, но модифицировать реакции I и II фаз биотрансформации ксенобиотиков в условиях калового перитонита. Протекторное действие корвитина по отношению к ферментам монооксигеназной системы печени находит подтверждение в достоверном (Р<0,005-0,001) уменьшении длительности тиопенталового сна в сравнении с крысами контрольной серии. Также исследуемый биофлавоноидный препарат способен снижать в крови исследуемых животных концентрацию универсального маркера эндотоксикоза - молекул средней массы, в среднем на 29,8 %.

Гепатопротекторная активность корвитина проявляется в ускорении элиминации из крови бромсульфалеина (на 39,0 %), снижении активности аланинаминотрансферазы (на 37,9 %), аспартатаминотрансферазы (на 25,4%), щелочной фосфатазы (на 41,2 %) и тимоловой пробы (на 54,4 %) в сравнении с контрольной группой животных №1.

Сравнительный анализ влияния корвитина на фармакокинетические параметры на этапе биотранспорта показал, что изучаемый биофлавоноидсодержащий препарат способствует увеличению количества активных к взаимодействию с низкомолекулярными соединениями центров, а также увеличивает аффинитет и связывающую способность сывороточных протеинов, что приводит к ускорению процессов детоксикации эндотоксинов, циркулирующих в крови животных с каловым перитонитом.

Ключевые слова: каловый перитонит, биофлавоноидный препарат корвитин, эндотоксикоз, детоксицирующая активность.

Summary

Derkachevska V.V. Experimental estimation of detoxicative activity of corvitin in fecal peritonitis. - The manuscript.

The dissertation for obtaining of scientific degree for the candidate of pharmaceutical sciences in speciality 14.03.05 - pharmacology. - National pharmaceutical university, Kharkov, 2010.

The dissertation is devoted to experimental substantiation of treatment-and-prophylaxis appropriateness of corvitinum in conditions of fecal peritonitis.

It is experimentally proved that this bioflavonoid drug realizes its pharmacotherapeutic effectivity by adjusting of prooxidant-antioxidant homeostasis in an organism, preventing, thus, development of widespread membranopathy. Moreover, corvitin is able to normalize content of basic components of the adenyl nucleotide system and level of energy exchange markers, correct activity of main enzymes of energy homeostasis and concentration of basis components of carbohydrate metabolism. Detoxicative and hepatoprotector activity of corvitin will be realized due to normalization of the functional state of the liver in fecal peritonitis.

Also was ascertained that during biotransportation stage corvitin is able to promote detoxicative processes of circulating in blood endotoxins in fecal peritonitis.

Key words: fecal peritonitis, endotoxicosis, bioflavonoid drug corvitin, detoxicative activity.

фармакотерапевтичний корвітин антиоксидантний

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Навіть при значних успіхах сучасної медицини в області невідкладної хірургії однією з найбільш складних проблем залишається лікування абдомінальних гнійно-запальних захворювань і ускладнень (Farthmann E.H., Shoflet U., 2010; Shein M., 2008; Ерюхин И.А., 2003). Перитоніт, як ускладнення багатьох захворювань і операцій на органах черевної порожнини займає провідне місце в структурі хірургічної летальності, не зважаючи на вдосконалення інтенсивної терапії та техніки хірургічного втручання (Звягин А. А., Слепнев С.Ю., Курочка А.И. и соавт., 2002). Частіше за все, ці хворі гинуть внаслідок виникнення поліорганної недостатності (Chriscton N.V., 2003; Васильков В.Г., Филиппова Л.А., Чернова Т.В. и соавт., 2005), до розвитку якої призводять генералізація інфекції з прогресуючою інтоксикацією, значними енергетичними і білковими втратами, а також вторинні імунодефіцити, тяжкі розлади гомеостазу з розвитком ішемії паренхіматозних органів (Шевченко Ю.Л., Ветешев П.С., Савенкова Н.Н. и соавт., 2004).

Застосування сучасних засобів детоксикації, антибактеріальних препаратів останніх поколінь, імунокоректорів, гіпербаричної оксигенації, впровадження нових, більш раціональних, підходів до проведення комплексного та інтенсивного лікування перитоніту дозволили в останні роки знизити летальність (Брискин Б. С., Савченко З. И., 2000; Васильков В. Г., Филиппова Л. А., Чернова Т. В. и соавт., 2005).

Враховуючи, що перитоніт - це складний інфекційний процес, який супроводжується порушенням захисних сил організму, системною запальною відповіддю, яка в підсумку може призвести до розвитку сепсису та поліорганної недостатності, що відрізняється значною багаточисельністю і різноманітністю ланок патогенезу, центральне місце серед яких займає ендотоксикоз, було доречним обрати як потенційний засіб фармакотерапії гнійного перитоніту такий препарат, що був би здатний одночасно корегувати декілька різних патогенетичних ланок і, в першу чергу, проявляти детоксикуючу дію. До такого виду препаратів відноситься, як відомо (Дубніна Г.Г., Головач С.М., Приходько А.О. та співавт., 2003) біофлавоноїдні ліки, серед яких найбільш виразними фармакодинамічними ефектами володіє кверцетин. Згідно даних літератури (Rassai C.M., Liberherr M. et al., 2005; Слєсарчук В.Ю., Мамчур В.Й., 2007; Санатий А.Л., 2009), а також результатів дослідження детоксикуючих властивостей біофлавоноїдів, отриманих у лабораторії кафедри фармакології Луганського державного медичного університету (ЛугДМУ) (Грызунова Г.К., 1993; Лук'янчук В.Д., Савченкова Л.В., 1997; Савченкова Л.В., 1999), відомо, що вони володіють антидотно-лікувальною активністю при отруєнні епіхлоргідрином, динітроортокрезолом та іншими ксенобіотиками і реалізують виразні протигіпоксичні і протиішемічні ефекти.

Таким чином, наявна політропність фармакодинамічних ефектів кверцетину (корвітину) повною мірою узгоджується з багатьма ланками патогенезу розповсюдженого перитоніту та з основними патогенетичними проявами синдрому ендогенної інтоксикації, що, власне, й послугувало теоретичним обґрунтуванням доцільності всебічного вивчення цього біофлавоноїдного препарату у якості потенційного фармакотерапевтичного засобу детоксикуючого типу дії за умов цього невідкладного стану.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках планових НДР кафедри фармакології ЛугДМУ «Пошук та розробка засобів фармакокорекції екстремальних киснедефіцитних станів» (№ держ. реєстрації 0103U005539, 2004-2008 рр.) і «Пошук та вивчення лікарських засобів метаболітного типу дії за умов невідкладних станів» (№ держ. реєстрації 01080006500, 2009-2013 рр.).

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження - експериментально обґрунтувати доцільність та лікувально-профілактичну ефективність застосування корвітину та з'ясувати механізми його детоксикуючої дії на моделі калового перитоніту.

Зазначена мета передбачає розв'язання таких завдань:

1. Провести порівняльне дослідження фармакотерапевтичної ефективності корвітину і референтного препарату тіотриазоліну за умов калового перитоніту.

2. Провести експериментально-математичний аналіз дозового режиму корвітину при його лікувально-профілактичному застосуванні при перитоніті.

3. Оцінити здатність корвітину регулювати стан прооксидантно-антиоксидантної системи організму у тварин з формою перитоніту, що моделюється.

4. Дослідити в динаміці вплив корвітину у порівнянні з тіотриазоліном на стан енергетичного гомеостазу, зокрема, баланс аденілових нуклеотидів та вуглеводного обміну при невідкладному стані, що вивчається.

5. Вивчити можливі механізми детоксикуючої активності корвітину у порівнянні з референтним препаратом за умов перитоніту.

6. Визначити вплив корвітину на параметри зворотнього комплексоутворення транспортних білків з лігандами при каловому перитоніті.

Об'єкт дослідження - експериментальна фармакотерапія перитоніту за допомогою корвітину.

Предмет дослідження - фармакологічні властивості, у тому числі механізми дії корвітину за умов перитоніту.

Методи дослідження - комплексний методичний підхід із залученням фармакологічних, біохімічних, фізико-хімічних, математичних та статистичних досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше теоретично та експериментально обґрунтована доцільність лікувально-профілактичного застосування корвітину, і доведена його фармакотерапевтична ефективність, яка не поступається, а за багатьма показниками й перевершує таку, що є у референтного препарату - тіотриазоліну - при гострому гнійно-запальному процесі, що розвивається за умов перитоніту. Розроблено оригінальний оптимальний режим застосування корвітину на моделі калового перитоніту.

На основі вперше проведеного аналізу параметрів біохемілюмінісценції (БХЛ) сироватки крові та головного мозку тварин з перитонітом встановлена виражена антирадикальна та антиперекисна активність корвітину, яка реалізується збереженням компонентів ферментативної та неферментативної ланок антиоксидантної системи (АОС) захисту організму.

Отримані нові дані щодо механізмів енергозберігаючої дії корвітину в частині збереження балансу аденілових нуклеотидів, а також рівня глюкози, глікогену, пірувату при зменшенні концентрації лактату за умов екстремального стану, що досліджується.

Вперше досліджено здатність корвітину модифікувати процеси зворотнього комплексоутворення сироваткових протеїнів з низькомолекулярними лігандами на етапі їх біотранспорту за умов ендотоксикозу, що формується на тлі перитоніту.

Практичне значення одержаних результатів. Результати комплексного вивчення фармакологічних властивостей та фармакотерапевтичної ефективності корвітину на моделі калового перитоніту складуть основу пакету матеріалів для представлення у ДП «Державний фармакологічний Центр» (ДФЦ) МОЗ України для отримання дозволу на розширення показань до застосування препарату в медичній практиці.

Отримані в експерименті дані можуть слугувати базовим обґрунтуванням при проведенні клінічних досліджень з питань оптимізації комбінованої фармакотерапії ендотоксикозу на тлі гнійно-запальних процесів у черевній порожнині.

За матеріалами дисертації підготовлено та видано інформаційний листок про нововведення в системі охорони здоров'я «Фармакотерапевтична ефективність корвітину при перитоніті» (Луганський ЦНТЕТ № 1, 2010р).

Матеріали дослідження впроваджені в навчальний процес на кафедрах: фармакології і клінічної фармації Кишинівського державного університету Медицини і Фармації ім. Н. Тестеміциану; промислової, клінічної фармації та клінічної фармакології Національної медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика; фармакології Вінницького, Івано-Франківського, Донецького, Одеського державних медичних університетів, а також експериментальної та клінічної фармакології з клінічною імунологією та алергологією ВДНЗ «Українська стоматологічна медична академія».

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно сформульовані мета та задачі, визначені напрямки, об'єм і методичні підходи дослідження, проведений патентно-інформаційний пошук з використанням серверів Google, Rambler, Yandex, а також медичних баз даних PubMed та Medline мережі Інтернет.

Всі етапи експериментального дослідження, включаючи аналіз та узагальнення отриманих результатів, статистичну обробку отриманих результатів, розробку основних положень роботи, її висновків, а також огляд літератури, автором проведено особисто. Співавтори опублікованих робіт надавали консультативну допомогу з методичних та теоретичних питань.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались та отримали позитивну оцінку на: науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні питання фармакології» (Вінниця, 2007); II Всеукраїнській науково-практичній конференції «Сучасні методичні підходи до аналізу стану здоров'я» (Луганськ, 2008); IV Регіональній науково-практичній конференції молодих вчених та студентів «Основні напрямки розвитку фармацевтичної науки на сучасному етапі. Погляд у майбутнє» (Луганськ, 2008); V Науково-практичній конференції з міжнародною участю «Досягнення та перспективи клінічної фармакології» (Вінниця, 2008); Науково-практичній конференції молодих вчених “Актуальні питання медицини і фармації» (Запоріжжя, 2008); ІV conferention All-Ukrainian scientific-applіed conference for students, young scientists and interns “Actual problems of fundamental and clinical medicine (in English) for young scientists and students” (Луганськ, 2008); ІІІ міжнародній науково-практичній конференції «Проблеми та перспективи методичних підходів до аналізу стану здоров`я» (Луганськ, 2009); V Регіональній науково-практичній конференції молодих вчених та студентів «Основні напрямки та тенденції вирішення актуальних питань фармації та медицини сьогодення» (Луганськ, 2009); ІV conferention All-Ukrainian scientific-applіed conference for students, young scientists and interns “Actual problems of fundamental and clinical medicine (in English) for young scientists and students” (Луганськ, 2009); VII Міжнародній медико-фармацевтичній конференції студентів і молодих вчених (Чернівці, 2010).

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені в лабораторії кафедри фармакології ЛугДМУ, сертифікованій ДФЦ МОЗ України (свідоцтво № 07 від 29 вересня 2005 р. та № 3 від 25 грудня 2008 р.) згідно вимог Комісії з біоетики ЛугДМУ (протокол № 4 від 09 квітня 2010 р.) та відповідно до методичних рекомендацій, затверджених ДФЦ МОЗ України (Купраш Л. П., Безверха І. С., 2000; Cтефанов О. В., 2002), а також інших інструктивно-методичних матеріалів, у тому числі, що стосуються GLP (Stiles T., 1997).

Досліди виконані на 1041 білому статевозрілому нелінійному щурі обох статей масою 200-240 г після проходження карантину протягом 14 днів в умовах віварію ЛугДМУ. Тварини отримували стандартну дієту у вигляді гранульованого корму за встановленими нормами та мали вільний доступ до води. Декапітацію тварин здійснювали передозуванням ефіру для наркозу згідно вимогам Комісії з біоетики.

Експериментальною моделлю калового перитоніту слугував патологічний процес, що розвивається на тлі одноразового внутрішньоочеревинного введення 10 % водної калової зависі із розрахунку 300 мг/кг (Ременник С.С., 1965), що відповідало дозі, при ін'єкції якої наступала загибель 1 тварини із 6 в групі.

На першому етапі досліджень вивчалась, у порівняльному аспекті, фармакотерапевтична ефективність біофлавоноїдного препарату «Корвітин» («Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод») та обраного в якості референтного, всебічно вивченого засобу схожого типу дії - тіотриазоліну (АТ «Галичфарм», корпорація «Артеріум»).

Тварин поділяли на 4 групи: контрольну № 1, контрольну №2, дослідну та референтну. Щурам дослідної серії фармакотерапію експериментального перитоніту проводили комбінацією двох препаратів - антибіотиком ванкоміцином (Тева Фармацевтичні Підприємства Лтд., Угорщина) та біофлавоноїдним препаратом корвітином за умов їх внутрішньоочеревинного введення у наступному режимі: за 1 год та через 6 год від моменту введення 10 % калової зависі вводили ванкоміцин у дозі 20 мг/кг у вигляді 0,2 % водного розчину (Деев В.А., Рыбалко С.Л., Дядюн С.Т. и соавт., 2004) і корвітин у дозі 200 мг/кг, у вигляді 10 % водного розчину. Тварини референтної групи отримували дозу ванкоміцину, що й у дослідній групі, і тіотриазолін із розрахунку 117 мг/кг у вигляді 2,5 % водного розчину (Болгов Д.М., 2003) у тому ж режимі дозування. Щури контрольної групи №2 отримували у вищезазначеному режимі дозування ванкоміцин, а контрольної групи № 1 - внутрішньоочеревинно еквіоб'ємну кількість 0,9 % розчину натрію хлориду. При виборі режиму дозування вищезазначених препаратів виходили з аналізу даних літератури (Дзубан Е.М., 1994; Бєлоусова І.П., 1999; Бибик О.Ю., 1999; Савченкова Л.В., 1999; Мищенко Е.М., Коробков А.А, 2000), а також багаторічного досвіду роботи співробітників кафедри фармакології ЛугДМУ у сфері пошуку та розробки засобів фармакокорекції екстремальних станів гіпоксичного ґенезу і вивчення фармакодинаміки препаратів метаболічного типу дії.

Фармакометричну серію дослідів для розробки режиму дозування корвітину за умов вивчаємого екстремального стану проводили за допомогою внутрішньоочеревинного введення комбінації двох препаратів - антибіотика ванкоміцину у дозі 20 мг/кг (0,2 % водний розчин) та досліджуваного біофлавоноїдного препарату у вигляді 10 % водного розчину у різних дозах (0; 200; 400 мг/кг).

Математичну залежність фармакотерапевтичного ефекту від доз досліджуваного препарату визначали із залученням методу двофакторного експерименту за спеціально розробленою доц. кафедри фармакології ЛугДМУ, к.мед.н. Д.С. Кравцем^**) Висловлюємо щиру подяку доценту Д.С. Кравцю за надану оригінальну програму та постійну увагу до роботи.⁾ програмою.

Біосубстратами для проведення комплексних досліджень слугували цільна кров, сироватка крові, а також гомогенати кори головного мозку та печінки (концентрація 20 %).

Антирадикальні властивості корвітину за умов калового перитоніту досліджували за методом БХЛ. Кінетику надслабкого світіння оцінювали за наступними показниками: амплітуда швидкого спалаху (І₁), час індукції повільного спалаху (?), амплітуда повільного спалаху (І₂), амплітуда кінцевого значення БХЛ (І_К), а також загальна світлосума реакції (S).

Стан процесів ПОЛ у тварин з формою перитоніту, що моделюється, оцінювали за вмістом у крові і гомогенаті печінки кінцевих продуктів ліпідпереокислення, що реагують із 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реактанти) (Стальная И.Д., Гаришвили Г.Г., 1977).

Стан основних компонентів АОС захисту організму оцінювали за активністю двох ключових ензимів її ферментативної ланки - супероксиддисмутази (СОД) (Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалев Ж.А., 1990) і каталази (Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., 1988), а також за рівнем компонентів неферментативної ланки - глутатіону відновленого (Ellman G. L., 1959) та вільних SH-груп (Sedluck J., Lindsay H., 1969).

З метою більш коректного судження про ефективність корвітину в плані його здатності протистояти окисному стресу, що формується при ендотоксикозі, аналізували інтегральний показник стану АОС захисту організму - фактор антиоксидантної активності, який розраховували за формулою, як це зазначено у методичних рекомендаціях ДФЦ МОЗ України (Купраш Л.П., Безверха І.С., 2000).

Ступінь забезпеченості організму тварин ендогенними антиоксидантами у досліджуваних умовах експерименту аналізували за показником стану перекисної резистентності еритроцитів (ПРЕ) за методом (Архипова О.Г., 1988).

Визначення концентрації АТФ, АДФ і АМФ проводили методом тонкошарової хроматографії на силікагелевих пластинах фірми "Sorbfil" (Росія) (Захарова Н.Б., Рубин В.И., 1980). Концентрацію фосфору неорганічного (Фн) ідентифікували у сироватці крові тварин за допомогою наборів виробництва «Філісіт-Діагностика» (Україна). При цьому розраховували комплекс показників, котрі характеризують стан енергетичного обміну: енергетичний заряд (ЕЗ) за формулою ЕЗ=(АТФ+1/2АДФ)/(АТФ+АДФ+АМФ), енергетичний потенціал (ЕП) за співвідношенням ЕП=АТФ/АДФ, порівняльний коефіцієнт (Кпор) за формулою Кпор=(АТФ+АМФ)/АДФ, індекс фосфорилювання (ІФ) за співвідношенням ІФ=АТФ/(АДФ+АМФ), термодинамічний контроль дихання (ТКД) за формулою ТКД=АДФ/АМФ та ступінь фосфорилювання (СФ) за співвідношенням СФ=АТФ/(АДФ*Фн) (Мецлер Д., 1980; Лук'янчук В.Д., Савченкова Л.В., 2000).

Активність головних ензимів енергообміну - лактатдегідрогенази (ЛДГ) визначали за допомогою біохімічних наборів фірми «Філісіт-Діагностика» (Україна), а креатинкінази (КК), використовуючи тест-системи «PLIVA-Lachema» (Чехія).

Про вплив досліджуваного біофлавоноїду на стан вуглеводного обміну у щурів з формою перитоніту, що моделюється, судили за рівнем головних постачальників енергії у клітинах - глюкози за допомогою біохімічних наборів фірми «Філісіт-діагностика» та глікогену за методом (Покровський А.А., 1964), а також проміжного продукту метаболізму глюкози - піровиноградної кислоти (ПВК) і кінцевого метаболіту її анаеробного перетворення - молочної кислоти (МК) у крові та корі головного мозку тварин ідентифікували за допомогою неферментативної методики в одній пробі (Герасимов И.Г., Плаксина Е.Н., 2000). Для більш всебічно оцінки стану вуглеводного обміну розраховували окислювально-відновний потенціал (ОВП) системи молочна-піровіноградна кислоти за формулою (Райскина М.Е., Онищенко Е.А., Шаргородский Б.М. и соавт., 1974).

Стан детоксикуючої системи печінки на фоні застосування корвітину при каловому перитоніті, оцінювали за активністю НАДФ^?Н-залежної монооксигеназної гідроксилюючої системи печінки. Про інтенсивність процесів метаболізму судили за виведенням із сечею основних метаболітів тест-препарату амідопірину - 4-аміноантипірин та N-ацетил-4-аміноантипірин за методом (Леоненко О.В., Попова Т.А.,1981).

Про вплив корвітину на стан монооксигеназної гідроксилюючої системи печінки щурів за умов перитоніту судили за тривалістю сну, викликаного внутрішньоочеревинним введенням тіопенталу-натрію у вигляді 1 % водного розчину у дозі 35 мг/кг (Коцюмбас І.Я., Малик О.Г., 2006).

Для оцінки ступеню інтенсивності ендогенної інтоксикації на тлі перитоніту визначали концентрацію її основного маркеру - молекул середньої маси (МСМ) з використанням методу (Корякина Е.В., Белова С.В., 2004).

Для оцінки екскреторної функції печінки використовували бромсульфалеїнову пробу за методикою В.В. Меньшикова (1971).

Ступінь гепатопротекторної активності вивчаємого біофлавоноїдного препарату оцінювали за його впливом на функціональний стан печінки, про який судили за такими біохімічними показниками крові, як рівень тимолової проби, активність лужної фосфатази (ЛФ), аланінамінотрансферази (АлТ) та аспартатамінотрансферази (АсТ), а також розрахованому на основі двох останніх ферментів коефіцієнту де Рітісу. Коефіцієнт де Рітісу дорівнює відношенню концентрацій АсТ до АлТ. Усі показники визначали у сироватці крові колориметрично за допомогою біохімічних наборів фірми «Філісіт-Діагностика» (Україна).

Центральний етап фармакокінетики корвітину - біотранспорт - вивчали методом рівноважного діалізу. З цією метою використовували діалізний апарат С.І. Чьогера (Чёггёр С.И., 1975) у модифікації О.І. Луйка і В.Д. Лук'янчука (Луйк А.И., Лукьянчук В.Д., 1984). Принцип методу заснований на дифузії вільної фракції низькомолекулярної речовини через напівпроникну мембрану, яка затримує молекули білка і зв'язаного з ним ліганда. В якості тест-ліганда використовували 2,4-динітро-6-метилфенол (динітроортокрезол - ДНОК), що є всебічно вивченою сполукою в плані її зворотнього комплексоутворення з сироватковими протеїнами (Луйк А.И., Лукьянчук В.Д., 1981).

Кількісні параметри зворотнього комплексоутворення - константу асоціації комплексу “білок-ліганд” (К_ас) і число місць зв'язування (N) обчислювали згідно методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України (Головенко Н.Я., Лукьянчук В.Д., Жук О.В. та співавт., 1999) на основі графіків в координатах Скетчарда за допомогою розробленої на кафедрі фармакології ЛугДМУ комп'ютерної програми (Кравец Д. С., 2000).

Всі використані при виконанні даної роботи одиниці вимірів і параметри наведені відповідно до міжнародної системи одиниць (Липперт Г., 1980). Отримані дані обробляли на персональному комп'ютері статистично загальноприйнятими методами з використанням програми Statgraf, оцінюючи вірогідність на рівні значимості не менш 95 % (Р<0,05) з використанням критерію t Ст'юдента (Гублер Е.В., 1978), а також за допомогою непараметричних критеріїв статистики - точного метода Фішера для чотирьохпільної таблиці (Фишер М., 2003).

Результати досліджень та їх обговорення.

Порівняльна оцінка фармакотерапевтичної ефективності корвітину та референтного препарату тіотриазоліну за умов калового перитоніту дозволила дійти висновку, що за виживаністю, результати якої наведені в табл.1, а також за даними термометричного моніторингу та плином клінічних симптомів у динаміці, які характеризують комплекс поведінкових, вегетативних реакцій і нервово-м'язову збудливість достовірні переваги над референтним препаратом у різні терміни дослідження має кверцетинвмісткий препарат, що досліджується.

Таблиця 1 Вплив корвітину на виживаність тварин із каловим перитонітом у динаміці

Примітки: * - P<0,001-0,02 - у порівнянні з контролем №1; ** - з контролем №2.

Розробка оптимального дозового режиму корвітину на моделі калового перитоніту із застосуванням експериментально-математичного моделювання дозволило встановити оптимальний режим використання корвітину з лікувально-профілактичною метою за умов розлитого перитоніту, а саме: внутрішньоочеревинне введення в дозі 368,6 мг/кг за 1 годину та через 6,7 годин у дозі 389,0 мг/кг від моменту введення калової зависі в очеревинну порожнину. Раціональне застосування такого режиму дозування корвітину забезпечує максимальну виживаність тварин та сприятливий плин клінічних симптомів гнійно-запального процесу, що моделюється, при найменших дозах препарату.

Оцінка впливу корвітину на кінетику вільнорадикальних реакцій і стан антиоксидантної системи у динаміці при моделюємій формі ендотоксикозу показало, що фармакотерапевтична ефективність препарату реалізується більш вираженою, у порівнянні з референтним препаратом, здатністю регулювати в динаміці прооксидантно-антиоксидантну рівновагу в організмі тварин з розлитим перитонітом. Так, згідно біохемілюмінісцентного аналізу фармакодинаміки корвітину із залученням таких показників кінетики вільнорадикальних реакцій, як амплітуди швидкого та повільного спалахів, кінцеве значення інтенсивності БХЛ, час індукції повільного спалаху та загальна світлосума.

Отже, доведена виразна антирадикальна активність препарату за умов патології, що вивчається. Це, в свою чергу, за умов раціонального застосування корвітину при розповсюдженому перитоніті, сприяє збереженню активності ферментативної (СОД, каталаза) та неферментативної (глутатіон відновлений, вільні SH-групи) ланок АОС захисту, а також збільшення перекисної резистентності мембран та фактора антиоксидантної активності, про що свідчать дані.

Дослідження стану енергетичного та вуглеводного обмінів у динаміці на фоні застосування корвітину у порівняльному аспекті з тіотриазоліном за умов калового перитоніту довело високу лікувально-профілактичну ефективність цього лікарського засобу щодо здатності ліквідувати дисбаланс у системі АТФ-АДФ-АМФ та фосфату неорганічного. Цей фармакодинамічний ефект корвітину у повному обсязі знаходить своє відображення в регуляції енергетичного гомеостазу у щурів з модельованою формою перитоніту шляхом модифікації наступних параметрів: збільшення ЕП на 36,8-45,1 %, ЕЗ на 19,7-21,3 %, ТКД на 17,4-24,0 %, ІФ - 48,2 %, ПК на 6,7-25,9 %, СФ - 20,3 %, а також підвищення активності КК (на 21,9-27,0 %) та зниження - ЛДГ (на 16,3 %).

Експериментально доведено, що лікувально-профілактичне застосування корвітину за умов екстремального стану, що вивчається, реалізується стимуляцією глюконеогенезу шляхом збільшення у сироватці крові та печінці концентрації глюкози в середньому на 50,1 % та ПВК на 33,3 % при одночасному зниженні вмісту лактату на 19,1 % та рівня окисно-відновного потенціалу на 47,9 % у порівнянні з контролем №1.

Окремий фрагмент роботи був присвячений комплексним дослідженням механізмів детоксикуючої активності корвітину у порівнянні із референтним препаратом за умов калового перитоніту. Доведено що корвітин володіє більш виразною здатністю інтенсифікувати процеси біотрансформації за допомогою реакцій І (N,N - деметилювання) та ІІ (N-ацетилювання) фаз, що реалізується скороченням тривалості тіопенталового сну на 45,3 %. При цьому відносно контролю №1 зменшується вміст універсального маркеру ендотоксикозу - МСМ (на 29,8 %) та процент затримки бромсульфалеїну - на 39,0 % у всі терміни дослідження. Гепатопротекторна активність корвітину за умов, що досліджуються, продемонстрована здатністю цього лікарського засобу сприятливо впливати на активність печінкових ензимів (АлТ, АсТ, лужна фосфатаза), нормалізуючи при цьому коефіцієнт де Рітісу.

Заключний етап комплексного дослідження присвячено вивченню впливу корвітину на параметри зворотнього комплексоутворення транспортних білків із лігандами при каловому перитоніті. Фармакокінетичний аналіз детоксикуючої дії корвітину на етапі його біотранспорту довів, що в процесі переносу препарату кров'ю ключову роль відіграє саме сироватковий альбумін. Як видно з табл. 2., під впливом корвітину у більш пізні терміни перебігу перитоніту має місце збільшення спорідненості лігандів до транспортних протеїнів (на 37,1-56,3 %). При цьому важливо наголосити, що комплексоутворюючі властивості білків плазми за умов застосування корвітину превалюють над такими, що є при введенні референтного препарату (див. табл. 2). Крім того, на тлі фармакотерапії корвітином спостерігається майже двократне збільшення числа місць фіксації низькомолекулярних лігандів на молекулі білка.

Таблиця 2 Показники зворотнього комплексоутворення білків сироватки крові щурів з каловим перитонітом на тлі застосування корвітину (n = 6)

Примітки: * - Р<0,05-0,001 - вірогідно у порівнянні з інтактною групою; ? - з контролем №1; ? - з контролем №2; ^ - з референтною групою; n - кількість тварин у групі.

Таким чином, отримані в роботі результати експериментальних досліджень слід вважати такими, які обґрунтовують доцільність застосування кверцетинвмісного препарату - корвітину - як високоефективного лікувально-профілактичного засобу при гнійно-запальному процесі, що розвивається за умов розлитого перитоніту.

Висновки

У дисертації наведено нове рішення актуальної наукової задачі, що визначається в теоретичному та експериментальному обґрунтуванні доцільності застосування з лікувально-профілактичною метою біофлавоноїдвмісного препарату - корвітину - при гнійно-запальному процесі, що розвивається за умов розлитого перитоніту.

1. Порівняльний аналіз фармакотерапевтичної ефективності корвітину та референтного препарату - тіотриазоліну - на моделі калового перитоніту показав, що за виживаністю, даними термометрії та плином клінічних симптомів, які характеризують низку поведінкових і вегетативних реакцій, а також нервово-м'язову збудливість, достовірні переваги у різні терміни дослідження має кверцетинвмісткий препарат, що досліджується.

2. Застосування експериментально-математичного моделювання дозволило розробити наступний оригінальний оптимальний режим використання корвітину з лікувально-профілактичною метою за умов розлитого перитоніту, а саме: внутрішньоочеревинне введення в дозі 368,6 мг/кг за 1 годину та через 6,7 годин у дозі 389,0 мг/кг від моменту введення калової зависі в очеревинну порожнину. Це забезпечує максимальну виживаність тварин при найменших дозах корвітину, які застосовуються при досліджуваному екстремальному стані.

3. Фармакотерапевтична ефективність корвітину реалізується більш вираженою, у порівнянні з референтним препаратом, здатністю регулювати в динаміці прооксидантно-антиоксидантну рівновагу в організмі тварин з разлитим перитонітом. Це досягається шляхом реалізації антирадикальної активності корвітину щодо показників кінетики вільнорадикальних процесів: амплітуд швидкого та повільного спалахів, кінцевого значення інтенсивності БХЛ, часу індукції повільного спалаху та загальної світлосуми реакції. У кінцевому підсумку корвітин забезпечує збереження активності ферментативної (СОД, каталаза) та рівня компонентів неферментативної (глутатіон відновлений, вільні SH-групи) ланок АОС захисту, а також збільшення перекисної резистентності мембран та фактора антиоксидантної активності за умов моделюємого невідкладного стану.

4. Лікувально-профілактичне застосування корвітину на моделі калового перитоніту ефективно усуває дисбаланс у системі АТФ-АДФ-АМФ та фосфату неорганічного, а також регулює енергетичний гомеостаз шляхом модифікації наступних параметрів: збільшення ЕП на 36,8 - 45,1 %, ЕЗ на 19,7- 21,3 %, ТКД на 17,4 - 24,0 %, ІФ на 48,2 %, ПК на 6,7- 25,9 %, СФ на 20,3 %, а також підвищення активності КК (на 21,9 - 27,8 %) та зниження ЛДГ (на 16,3 %).

Крім того, введення корвітину на тлі перитоніту стимулює глюконеогенез шляхом збільшення у сироватці крові та печінці концентрації глюкози в середньому на 32,9 %, глікогену на 50,1 % та ПВК на 33,3 % при одночасному зниженні вмісту лактату на 19,1 % та рівня окисно відновного потенціалу на 47,9 % відносно контролю №1.

5. Комплексне порівняльне дослідження механізмів детоксикаційної активності корвітину та референтного препарату за умов розлитого перитоніту показало, що вивчаємий препарат більш виразно володіє здатністю інтенсифікувати процеси біотрансформації за допомогою реакцій І (N, N - деметилювання) та ІІ (N-ацетилювання) фаз. Це сприяє скороченню тривалості тіопенталового сну на 45,3 %, а також зменшенню вмісту універсального маркеру ендотоксикозу - МСМ (на 29,8 %) та проценту затримки бромсульфалеїну на 39,0 % відносно контролю №1 у всі терміни спостереження. Поряд з цим, корвітин сприятливо впливає в експерименті на стан «печінкових» ензимів, зменшує активність лужної фосфатази (на 32,7 - 49,7 %), АлТ (на 22,9 - 57,0 %), АсТ (на 11,5 - 49,2 %), нормалізуючи коефіцієнт де Рітісу, а також зменшує показник тимолової проби.

6. Аналіз центральної ланки фармакокінетики корвітину - біотранспорту - показав, що комплексоутворюча здатність сироваткових протеїнів у відношенні до лігандів при застосуванні цього препарату обумовлена зворотньою взаємодією саме з сироватковим альбуміном.

Доведено, що в останній термін дослідження (78 год) К_ас комплексу «білок-ліганд» на тлі терапії корвітину та референтним препаратом складає, відповідно, 1,67 ± 0,06 і 1,32 ± 0,07 проти 0,73 ± 0,04 моль^-1*10⁶ у контролі (перитоніт без лікування). При цьому кількість фіксуючих центрів на молекулі транспортного білка під впливом корвітину збільшується на 5, а референтного засобу - на 4 у порівнянні з контрольною серією.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Лук'янчук В.Д. Стан компонентів антиоксидантної системи захисту організму у щурів з каловим перитонітом на тлі фармакологічної корекції корвітином / В.Д. Лук'янчук, В.В. Деркачевська // Журнал «Екстремальної медицини ім. Г.О. Можаєва». - 2009. - №1. - С.55-61 (Особистий внесок здобувача - експериментальні дослідження, обробка та інтерпретація даних, підготовка матеріалу до друку).

2. Лук'янчук В.Д. Математичний аналіз та оптимізація режиму дозування корвітину за умов калового перитоніту / В. Д. Лук'янчук, В. В. Деркачевська, Д. С. Кравець // Запорожский медицинский журнал. - 2009. - T.11, №6. - C.69-72 (Особистий внесок здобувача - експериментальні дослідження, підготовка матеріалу до друку).

3. Деркачевська В.В. Біохемілюмінісцентний профіль сироватки крові тварин при застосуванні корвітину за умов калового перитоніту / В.В. Деркачевська // Клінічна фармація. - 2010. - Т.14, №2. - С.49-52.

4. Лук'янчук В.Д. Стан транспортної функції сироваткових протеїнів при застосуванні корвітину на моделі калового перитоніту / В.Д. Лук'янчук, В.В. Деркачевська, Д. С. Кравець. // Фармакологія та лікарська токсикологія. - 2010. - №1-2 (14-15). - С.57-60 (Особистий внесок здобувача - експериментальні дослідження, підготовка матеріалу до друку).

5. Деркачевська В. В. Вплив корвітину на стан аденілнуклеотидної системи у щурів із каловим перитонітом / В. В. Деркачевська // Фармацевтичний журнал. -- 2010. - №2. - С.93-97.

6. Лук'янчук В. Д. Вплив корвітину на процеси детоксикації при каловому перитоніті в експерименті / В. Д. Лук'янчук, В. В. Деркачевська // Український журнал клінічної та лабораторної медицини. - Т.5, №1. - 2010. - С.146-150 (Особистий внесок здобувача - експериментальні дослідження, обробка та інтерпретація даних, підготовка матеріалу до друку).

7. Бадинов А. В. Фармакотерапевтическая эффективность корвитина на экспериментальном синдроме эндогенной интоксикации / А. В. Бадинов, В. В. Деркачевская // Вісник Вінницького національного медичного університету - 2007. - № 11 (2/2). - С. 747 (Особистий внесок здобувача - експериментальні дослідження).

8. Деркачевская В. В. Теоретическое обоснование применения корвитина при каловом перетоните / В. В. Деркачевская // Сучасні підходи до аналізу стану здоров`я : ІІ Всеукр наук.-практ. конф., 17-18 березня 2008 р., м. Луганськ : тез. доп. - Луганськ, 2008. - С. 75-76.

9. Деркачевская В. В. Корвитин - потенциальное средство фармакотерапии калового перитонита / В. В. Деркачевская // Вісник Вінницького національного медичного університету - 2008. - № 12 (1). - С. 263.

10. Деркачевська В. В. Порівняльна оцінка виживаємості тварин при застосуванні корвітину та тіотриазоліну на моделі калового перитоніту / В. В. Деркачевська // Основні напрямки розвитку фармацевтичної науки на сучасному етапі. Погляд у майбутнє : IV Регіональна науково-практична конференція молодих вчених та студентів, 20 березня 2008 р., м. Луганськ : тези доп. - Луганськ, 2008. - С. 66-68.

11. Derkachevskaya V. V. Farmacocorection of endotoxicosis by corvitinum in conditions of peritonitis / V. V. Derkachevskaya, V. S. Kurchanova // Український медичний альманах, 2009, Т.12, №1 (додаток). - С. 19 (Особистий внесок здобувача - експериментальні дослідження, підготовка матеріалу до друку).

12. Деркачевська В. В. Вплив корвітину на параметри вуглеводного обміну в умовах калового перитоніту / В. В. Деркачевська // Актуальні питання медицини і фармації : Наукова практична конференція молодих вчених, 15 вересня 2008 року, м. Запоріжжя : тези. доп. -Запоріжжя, 2008. - С. 14-15.

13. Деркачевська В. В. Вплив корвітину на динаміку основних компонентів аденілнуклеотидної системи на тлі перитоніту / В. В. Деркачевська // Основні напрямки та тенденції вирішення актуальних питань фармації та медицини сьогодення : V Регіон. наук.-практ. конф. молодих вчених та студентів, 31 березня 2009 р., м. Луганськ : тези доп. - Луганськ, 2009. - С. 59-60.

14. Деркачевська В. В. Вплив корвітину на активність ферментів енергетичного обміну за умов калового перитоніту / В. В. Деркачевська // Проблеми та перспективи методичних підходів до аналізу стану здоров`я : ІІІ міжнар. наук.-практ. конф., 26-27 березня 2009 р., м. Луганськ : тези. -Луганськ, 2009. - С. 25.

15. Derkachevskaya V.V. Dynamic changes of energy homeostasis under conditions of corvitin use in peritonitis / V.V. Derkachevskaya // Український медичний альманах. - 2010. - Т.13, № 1 (додаток) - p. 29-30.

16. Деркачевська В.В. Динаміка змін комплексоутворюючих властивостей сироваткових протеїнів на фоні застосування корвітину при каловому перитоніті / В.В. Деркачевська // Всеукраїнський медичний журнал молодих вчених «Хист». - вип. 12. - 2010. - С. 40.

17. Лук'янчук В.Д. Фармакотерапевтична ефективність корвітину при перитоніті / В.Д. Лук'янчук, В.І. Бондарев, В. В. Деркачевська // Інформаційний листок про нововведення в системі охорони здоров'я №1. - Луганськ, 2010 (Особистий внесок здобувача - експериментальні дослідження, підготовка матеріалу до друку).

Размещено на Allbest.ru