Лікувально-профілактична ефективність вінборону при експериментальній ішемії сітківки та зорового нерва

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Одеський державний медичний університет

УДК 617.73:616.833.152-08-084:615.015

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Лікувально-профілактична ефективність вінборону при експериментальній ішемії сітківки та зорового нерва

14.03.05 - фармакологія

Черешнюк Ігор Леонідович

Одеса 2010

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Відомо, що патологія сітківки та зорового нерву займає значне місце серед причин непрацездатності та інвалідності населення по зору. При цьому в Україні спостерігається постійне збільшення рівня звернень хворих за офтальмологічною допомогою з приводу цих захворювань [Левтюх В. І. та співавт., 1999; Анина Е. А., Мартопляс К. В., 2005].

Згідно сучасним уявленням саме ішемія є однією з основних патогенетичних ланок і тим пусковим механізмом, який і спричиняє більшість важких захворювань сітківки та зорового нерва, зокрема, таких як непрохідність центральної артерії сітківки, оптичні нейропатії, у т.ч. глаукомна, вікова макулодистрофія, міопічна дегенерація сітківки та ін. [Кацнельсон Л. А. и соавт., 1990; Кузнецова М. В., 2004; Киселева Т. Н. и соавт., 2006; Бакшинский П. П. и соавт., 2007; Osborne N. N. et al., 2004; Hayreh S. S., 2009].

Водночас, існуючі засоби для фармакотерапії вказаних патологій, такі як: вазоактивні препарати, фібринолітики та ферменти, антикоагулянти, антиагреганти, антигіпоксанти, ноотропні засоби, антагоністи кальцію, антиоксиданти, вітамінні препарати та їх комплекси, гормональні препарати та анаболічні стероїди, препарати тканинної терапії, поліпептидні біорегулятори та ін. [Елисеева Т. О., Бишеле Н. А., 2000; Веселовька Н. М., 2002; Еременко А. И. и соавт., 2006; Максимов И. Б., Нероев В. В., 2007; Бездетко Н. В., Бездетко П. А., 2008; Машковський М. Д., 2008; Морозов В. И., 2009] не завжди є достатньо ефективними і не можуть повністю захистити або відновити структуру та функцію ішемізованих тканин ока, оскільки кожний з них впливає на окремі патогенетичні ланки. Разом з цим наявність у них небажаних ефектів часто обмежують їх застосування, а одночасне призначення великої кількості препаратів призводить до поліпрагмазії та виникнення різноманітних ускладнень [Ферфильфайн И. Л., Числова Т. Д., 2001; Машковський М. Д., 2008; Байрак Д. М., 2009]. Тому проблема фармакотерапії захворювань органа зору, що супроводжується ішемією сітківки та зорового нерва, залишається надзвичайно актуальною в сучасній офтальмофармакології та спонукає до пошуку нових більш ефективних та безпечних препаратів.

Враховуючи багатогранність патогенезу ішемічних ушкоджень органа зору [Osborne N. N. et al., 2004], на наш погляд, для відновлення функціонування сітківки та зорового нерва можуть бути використані препарати з політропними фармакологічними властивостями. На підставі цього привертає увагу новий вітчизняний препарат вінборон (ресинтезований на ЗАТ НВЦ “Борщагівський ХФЗ” фенікаберан), політропні фармакологічні властивості якого - спазмолітична, протиішемічна, антигіпоксична, антиоксидантна, антиагрегантна, антисклеро-тична, здатність покращувати мозковий кровообіг, протинабрякова, протимікробна, імуномодулююча, знеболююча, стимулючий вплив на мікроцир-куляцію та репаративні процеси [Степанюк Г. І. та співавт., 2007], при відсутності суттєвого впливу на артеріальний тиск, добре співставляються з патогенезом ішемічних захворювань органа зору. Все це стало підставою для проведення даного дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках планової науково-дослідної роботи МОЗ України кафедри фармакології Вінницького національного медичного університету (ВНМУ) ім. М. І. Пирогова за темою „Експериментальне дослідження нейро- та кардіопро-текторних властивостей аліциклічних, ароматичних та гетероциклічних сполук” (№ державної реєстрації 0109U004812). Дисертант був співвиконавцем даної теми.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є експериментальне обґрунтування доцільності застосування вінборону як засобу для лікування та профілактики ішемічних ушкоджень сітківки та зорового нерва.

Задачі дослідження:

1. Оцінити вплив вінборону на офтальмотонус у інтактних тварин та тварин з експериментальною офтальмогіпертензією.

2. Охарактеризувати вплив вінборону на регіонарну гемодинаміку та мікроциркуляцію заднього відділу ока у тварин в умовах гострої неповної ішемії органа зору.

3. Вивчити дію вінборону на гістоструктуру сітківки та зорового нерва при неповній ішемії ока тварин.

4. Дослідити нейроретинопротекторну дію вінборону на моделі тотальної ішемії та ішемії-реперфузії ока.

5. Обґрунтувати доцільність застосування вінборону при дистрофічних процесах в сітківці та зоровому нерві.

Об'єкт дослідження - підвищення ефективності фармакопрофілактики та фармакотерапії ішемічних процесів сітківки та зорового нерва.

Предмет дослідження - доцільність застосування вінборону при ішемії сітківки та зорового нерва.

Методи дослідження: фармакологічні, патофізіологічні, гістоморфологічні, цитологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що вінборон спроможний знижувати внутрішньоочний тиск в умовах експериментальної офтальмогіпертензії у кролів, а також не впливає на офтальмотонус у інтактних тварин.

Вперше, за допомогою власної методики, встановлено, що внутрішньовенне введення вінборону наркотизованим собакам з однобічною оклюзією загальної сонної артерії, на відміну від еуфіліну, сприяє поліпшенню регіонарної гемодинаміки ішемізованого ока. На тлі вінборону підвищувались швидкості кровотоку що досліджувались на стороні змодельованої патології у бік їх нормалізації, знижувався периферичний опір крові, покращувалась перфузія та мікрогемоциркуляція без ознак виникнення «ефекту обкрадання». Вплив вінборону на порушену гемодинаміку ока корелював з позитивною гістологічною картиною сітківки та зорового нерва у вигляді зменшення їх деструктивних змін та послаблення периваскулярного та міжклітинного набряку.

Вперше у вінборону виявлено наявність нейроретинопротекторних властивостей, що проявлялось вірогідним зменшенням кількості пошкоджених внаслідок некрозу та апоптозу клітин сітківки при превентивному введенні препарату щурам з тотальною ішемією ока.

Вперше доведено, що вінборон при лікувальному введенні за умов тотальної ішемії-реперфузії ока у щурів також сприяв покращенню гістоструктури сітківки і збереженню найбільш чутливих до пошкодження гангліозних клітин.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень розширили та поглибили існуючі уявлення про фармакодинаміку вінборону.

Розроблена методика ультразвукового доплерографічного дослідження дає можливість отримувати більш відтворювані безпосередні показники регіонарної гемодинаміки ока як в експерименті, так і в клініці. За цим отримано патент України на винахід “Спосіб визначення гемодинаміки ока” (№ 52295 А від 16.12.2002 р.).

Результати проведеного дослідження є підставою для клінічної апробації вінборону при захворюваннях сітківки та зорового нерва ішемічного генезу.

Отримані дані впроваджено в педагогічний процес кафедри фармакології ВНМУ ім. М. І. Пирогова, кафедр фармакології Луганського державного, Тернопільського державного, Харківського національного медичних університетів та Дніпропетровської державної медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто визначено актуальність теми, проведений патентно-інформаційний пошук, вибраний та виконаний основний обсяг експериментальних досліджень, опрацьовано необхідні методики досліджень, самостійно виконані всі експериментальні дослідження ефективності вінборону на моделях ішемічних ушкоджень сітківки та зорового нерва, а також статистична обробка, аналіз та узагальнення отриманих результатів. Разом з науковим керівником сформулювані всі положення та висновки дисертації. Гістологічні дослідження проведені при консультативній допомозі завідувача кафедри гістології ВНМУ ім. М. І. Пирогова, д.мед.н., професора М. С. Пушкаря, за що автор висловлює йому щиру вдячність.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені та обговорені на: науково-практичній конференції „Актуальні питання фармакології”, присвяченої 70-річчю кафедри фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М. І. Пирогова (Вінниця, 2007), V-й Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології на тему “Досягнення та перспективи клінічної фармакології” (Вінниця, 2008), XIV-й університетській науково-практичній конференції молодих вчених та фахівців, (Вінниця, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 робіт, з них 5 статей в наукових фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 1 патент України, 3 тези.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена державною мовою на 147 сторінках комп'ютерного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів дослідження, висновків та списку літературних джерел у кількості 315 робіт, з яких 145 викладені кирилицею, 170 - латиницею. Робота ілюстрована 38 рисунками та 7 таблицями.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Для дослідження взято вітчизняний лікарський засіб вінборон (рис. 1) у вигляді ліофілізованого порошку в ампулах по 0,01(ЗАТ НВЦ “Борщагівський ХФЗ”, Україна).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Вінборон (ресинтезований фенікаберан): 2-феніл-3-карбетокси-4-диметиламінометил-5-оксибензофурану гідрохлорид

вінборон ішемія сітківки зоровий

Експерименти проведено на 40 щурах лінії Вістар обох статей масою 180-230 г, 24 безпородних собаках обох статей масою 10-15 кг та 14 кролях породи Шиншила масою 2,8-3,2 кг. Усі тварини утримувались у віварії ВНМУ ім. М. І. Пирогова на стандартному водно-харчовому раціоні при вільному доступі до води та їжі. Під час роботи з лабораторними тваринами дотримувались рекомендацій Європейської комісії щодо проведення медико-біологічних досліджень з використанням тварин та методичними рекомендаціями Державного фармакологічного центру МОЗ України. Досліди проводили з урахуванням „Правил доклінічної оцінки безпечності фармакологічних засобів (GLP)” (Стефанов О. В., 2001). Дослідження проводили в лабораторії кафедри фармакології, сертифікованої Державним фармакологічним центром МОЗ України (посвідчення №1 від 23.02.2006 р.) та в науково-дослідній лабораторії функціональної морфології та генетики розвитку науково-дослідного центру ВНМУ ім. М. І. Пирогова (атестат акредитації № 002088 від 20.10.2004) у повній відповідності з вимогами Комісії з біоетики ВНМУ ім. М. І. Пирогова (протокол № 3 від 18.02.2009 р.). Евтаназію тварин проводили шляхом передозування тіопенталу натрію.

Дослідження впливу вінборону в порівнянні з еуфіліном на локальну гемодинаміку внутрішніх очних артерій у собак в умовах гострої оклюзії загальної сонної артерії (ЗСА) виконані на 24 собаках (по 8 тварин в групі). Моделлю експериментального часткового порушення кровопостачання ока служила однобічна перев'язка правої загальної сонної артерії [Бунин А. Я., Кацнельсон Л. А., 1967; Михальчик Т. С., 1997; Насибуллин Б. А., Иваницкая Е. В., 2004; Shakoor A. et al., 2005], яка дозволяє викликати на стороні ушкодження порушення кровопостачання та дистрофічні зміни в задньому відділі ока, подібні тим, які спостерігаються при ішемічних захворюваннях сітківки та зорового нерва в клініці [Кацнельсон Л.А. и соавт., 1990; Завгородняя Н. Г. и соавт. 2008; Madonna R. J., 1993; Biousse V., 1997]. Знеболення тварин викликалось внутрішньовенним введенням тіопенталу натрію (40 мг/кг).

Локальну гемодинаміку досліджували методом ультразвукової кольорової доплерографії [Yang H., Wu Z., 1993; Williamson T. H. et al. 1995; Gelatt-Nicholson K. J. et al., 1999] на приладі з кольоровим картруванням сигналу «АНГИОДИН-2М» («БИОСС», Росія).

Доплерографічне дослідження виконувалось за розробленим нами способом (патент України № 52295 А від 16.12.2002 р.). Стан гемодинаміки оцінювали за показниками: систолічної (S), діастолічної (D) та середньої (М) швидкості кровотоку, індексів циркуляторного опору Пурсело (Ri) та пульсації Гослінга (Рі) в обох внутрішніх очних артеріях (ВОА). Індекси Ri (S-D)/S) та Рі (S-D)/М) характеризували циркуляторний, включаючи судинний, опір у басейні досліджуваної артерії. Збільшення цих індексів вказує на підвищення циркуляторного опору, включаючи судинний, а їх зменшення -- на зниження периферичного опору в басейні досліджуваної артерії. Обидва показники характеризують стан перфузії та мікрогемоциркуляції в оці [Ciulla T. A. et al., 2002; Harris A. et al., 2003; Pedersen D. B. et al., 2005].

Вплив вінборону (1 мг/кг) внутрішньовенно (в/в), взятого в оптимальній судинорозширюючій дозі [Маметова А. Н., 1995], на локальну гемодинаміку у внутрішніх очних артеріях (ВОА) собак порівнювали з дією еуфіліну (2,4 мг/кг в/в) (ЗАТ “Фармацевтична фірма “Дарниця”, Україна), який згідно з наказом МОЗ України № 117 від 15.03.2007 р. “Про затвердження протоколів надання медичної допомоги за спеціальністю „Офтальмологія”, рекомендований для комплексної терапії ішемічних ушкоджень органа зору.

Морфологічна оцінка впливу вінборону на перебіг дегенеративних процесів в ішемізованій сітківці ока та зоровому нерві досліджувалась в експерименті виконаному на 24 собаках. Модель ішемії ока, як і в попередньому дослідженні, відтворювали шляхом гострої однобічної оклюзії правої ЗСА в умовах тіопентал-натрієвого (40 мг/кг в/в) наркозу. Тварин було розподілено на три групи. Першу групу (n=8) склали собаки з однобічною перев'язкою ЗСА без лікування (контроль). Другу групу (n=8) - собаки з однобічною перев`язкою ЗСА, яких лікували вінбороном (1 мг/кг в/в). Першу ін'єкцію робили через 10 хв після моделювання патології, а далі -- щоденно протягом 7 діб. Третю групу (n=8) склали псевдооперовані тварини, яким виконувався лише хірургічний доступ до ЗСА. Для гістологічного дослідження брали очі (по 8 очей з кожної групи). Зрізи стінки ока забарвлювали гематоксиліном-еозином.

Профілактичну (ретинопротекторну) ефективність вінборону при тотальній експериментальній ішемії та ішемії-реперфузії сітківки досліджувалась в експерименті, проведеному на 40 щурах. Тотальну ішемію ока викликали шляхом накладення ретробульбарної лігатури на зоровий нерв та судини [Roth S. et al., 1998] на тлі кетамінового (120 мг/кг внутрішньоочеревинно (в/о)) наркозу. Ретинопротекторну (профілактичну) дію вінборону (1 мг/кг в/о) в заданих умовах експерименту вивчали на 16 щурах (8 тварин слугували контролем). Препарат вводили одноразово за 1 год до накладання ретробульбарної лігатури, ефективність оцінювали за показниками рівнів некрозу та апоптозу клітин сітківки методом лазерної протокової цитометрії [Carmody R. J. et al., 1998; Givan A. L., 2001; McCoy J. P., 2001]. Після енуклеацій та мікрохірургічного видалення сітківок готували суспензії клітин у фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) з рН=7,4, за методом [Wilson G. D., 2000]. Отриману суспензію клітин фільтрували через фільтр Filcons 50 мкм і відмивали в 1,5 мл ФСБ центрифугуванням (300g 5 хв.). Після видалення супернатанта і додавання до осаду ФСБ проводили інкубацію отриманої суспензії клітин Annexin V-FITC (1 мкл) та Propidium Iodide (2,5 мкл) відповідно до протоколу-інструкції використання „APOPTESTTM-FITC” (Dako, Нідерланди). На ранній стадії апоптозу цілісність клітинної мембрани зберігається, однак, відбувається перебудова її фосфоліпидних компонентів, і на поверхні клітини з'являється фосфатидилсерин. Аннексин V-FITC здатний з'єднуватися з фосфатидилсерином у присутності кальція і маркувати апоптозні клітини. Пропидія йодид проникає тільки через пошкоджену мембрану клітин і маркує некротизовані клітини [Castedo E. et al., 2007]. Цитофлуориметрію проводили на лазерному проточному цитофлуориметрі (аргон, 488 нм) „PAS” (Partec, Німеччина) з наступним аналізом за допомогою програмного забезпечення для аналізу великих масивів даних FloMax. Протоковий аналіз суспензій клітин сітківок проводили через 60 та 120 хв після моделювання патологічного стану.

Лікувальну ефективність вінборону на моделі ішемії-реперфузії ока досліджено на 24 щурах (із них 8 слугували контролем, 8 - інтактні). Препарат (1 мг/кг в/о) вводили після зняття лігатури. Контрольні тварини отримували еквівалентну кількість 0,9 % розчину NaCl. Ефективність терапії оцінювали гістоморфологічним методом (забарвлення гематоксиліном-еозином).

Вплив вінборону (1 мг/кг в/в) на нормальний офтальмотонус та внутрішньоочний тиск (ВОТ) в умовах гострої тимчасової офтальмогіпертензії досліджували на 14 кролях (28 очей). ВОТ вимірювали тонометром Маклакова вагою 10,0 г під інстиляційною анестезією розчином алкаїну (пропаракаїну гідрохлориду) 0,5 % (Alcon, Бельгія). З метою виключення патології офтальмотонусу та стандартизації досліджень відбирались кролі з асиметрією ВОТ не більшим ніж 2-3 мм рт. ст. Для зменшення впливу циркадних ритмів на коливання ВОТ, згідно даних літератури [Rowland et. al., 1981], експерименти проводились у денний час.

Спочатку досліджували вплив вінборону на нормальний офтальмотонус протягом 240 хв після одноразового введення препарату. Контрольним тваринам (n=7) вводили еквівалентну кількість 0,9 % розчину NaCl. Через 2 тижні на тих самих кролях досліджували вплив вінборону на офтальмотонус в умовах офтальмогіпертензії, змодельованої за методом McDonald T. O. et al., 1969. ВОТ вимірювали до та через 60 хв після введення вінборону, а також через 30, 60, 90 та 120 хв після моделювання офтальмогіпертензії.

Цифрові дані обробляли методом варіаційної статистики з використанням t-критерію Ст'юдента [Лапач С. Н., Чубенко А. В., Бабич П. Н., 2001], розбіжності вважали вірогідними при p0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. При дослідженні впливу вінборону на офтальмотонус встановлено, що початкові показники ВОТ у кролів основної та контрольної груп практично не відрізнялись і становили відповідно 17,64±0,49 та 17,79±0,33 мм рт. ст. Введення вінборону, як і фізіологічного розчину, тваринам відповідно основної та контрольної груп без патології не викликало зміни показників офтальмотонусу через 30, 60, 90 та 120 хв спостереження. При цьому на тлі вінборону на 30-90 хв. досліду відмічена певна тенденція до пониження офтальмотонусу відносно показників ВОТ контрольної групи.

В другій серії дослідів встановлено, що введення вінборону кролям з нормальним офтальмотонусом також не викликало суттєвих змін ВОТ. Інтрагастральне навантаження цих же тварин дистильованою водою призвело до різкого підвищення ВОТ у кролів обох груп, максимальні значення якого відмічались в терміни 30-60 хв з наступним його дещо повільним зниженням, і в термін 120 хв достовірно не відрізнялось від показників ВОТ, визначених на початку експерименту (табл. 1).

Таблиця 1. Вплив вінборону на офтальмотонус (мм рт.ст.) у кролів з експериментальною офтальмогіпертензією, M±m, n=14

Примітки: 1. * - p0,05 відносно контрольного показника;

2. в дужках позначена динаміка показників у відсотках відносно контролю

Однак, в групі тварин з офтальмогіпертензією, яким попередньо вводився вінборон, на 30-й та 60-й хв експерименту відмічено достовірне зниження ВОТ на 10-13 %. Дана властивість вінборону є досить цінною, оскільки зниження ВОТ сприяє покращенню перфузії сітківки [Густов А. В. и соавт., 2000]. Це може стати підґрунтям для розширення показань до застосування препарату при різноманітних станах ока, які супроводжуються офтальмогіпертензією.

При досліджені впливу вінборону (1 мг/кг в/в) на порушену гемодинаміку сітківки та зорового нерва як можливого потенційного коригуючого засобу в умовах патології кровопостачання ока методом ультразвукової кольорової доплерографії встановлено, що у контрольних тварин після накладання лігатури на праву ЗСА виникали виражені зміни гемодинаміки у BOA на боці оклюзії: на 30-35 та 60-65-й хвилині експерименту вірогідно знижувались систолічна відповідно на 31,2 % та 28,8 %, діастолічна (28,2 % та 24,6 %) та середня (29% та 25,3%), швидкості кровотоку причому найбільше знижувалась пікова систолічна швидкість. При цьому індекси Ri та Рі на тлі оклюзії ЗСА статистично не відрізнялись за величиною від початкових показників (табл. 2).

Таблиця 2. Вплив вінборону та еуфіліну на параметри кровотоку в гомолатеральній BOA з однобічною оклюзією ЗСА (М±m, n=8)

Примітки: 1. * - р?0,05 відносно контрольної групи;

2. о - р?0,05 відносно показника «до оклюзії».

У той же час у контралатеральних ВОА спостерігалась лише незначна тенденція до посилення кровотоку, що ймовірно носило компенсаторний характер. При цьому індекси Ri та Pi не відрізнялись від початкових (табл. 3).

Введення вінборону собакам з оклюзією ЗСА краще, ніж еуфілін усувало порушення регіонарної гемодинаміки ока. При цьому стимулююча дія вінборону в заданих умовах експерименту спостерігалась як на боці оклюзії ЗСА, так і на контралатеральній стороні, а еуфіліну - лише на контралатеральній стороні. Так, на 30-35 хв досліду на тлі вінборону систолічна, діастолічна та середня швидкості кровотоку у ВОА були вірогідно вищими, ніж в контролі (відповідно на 11,2, 47,1 та 23,5 %). В той же час під дією еуфіліну спостерігалось вірогідне зниження цих показників відносно контролю.

Таблиця 3. Вплив вінборону та еуфіліну на параметри кровотоку в контралатеральній BOA з однобічною оклюзією ЗСА (М±m, n=8)

Примітки: 1. ° - р?0,05 відносно контролю; 2. * - р?0,05 відносно показника «до оклюзії»

Аналогічні зміни гемодинаміки у ВОА під дією обох препаратів спостерігались і на 60-65 хв експерименту (див. табл. 2 та 3).

Водночас під дією вінборону в більшій мірі, ніж на тлі еуфіліну, мало місце вірогідне зменшення величини індексів Ri та Pi відносно контролю (табл. 2), що свідчило про більшу спроможність вінборону, ніж референс препарату, знижувати судинний опір в гомолатеральній ВОА і, як наслідок покращувати перфузію ішемізованого ока.

Таким чином, проведене дослідження показало, що одноразове в/в введення вінборону (1 мг/кг) на відміну від еуфіліну (2,4 мг/кг) покращує гемодинаміку ока в умовах його експериментальної ішемії: на тлі досліджуваного препарату у внутрішніх очних артеріях (в більшій мірі на стороні змодельованої патології) підвищуються швидкості кровотоку в бік їх нормалізації, знижується периферичний опір крові, збільшується перфузія судин, покращується мікроциркуляція без ознак виникнення “ефекту обкрадання”.

При гістологічному дослідженні ішемізованих очей собак (однобічна перев'язка ЗСА) на 7 добу у нелікованих тварин виявлялись ознаки набряку, пошкодження епітелію рогівки, радужки, колагенової основи рогівки та склери, судинної оболонка ока та зорового нерва. У стані набухання з явищами десквамації перебувала сітківка ока. В останній розвивались найбільш істотні патологічні зміни. Ушкодженими були усі її шари без винятку, особливо зовнішній, внутрішній ядерний і гангліозний. Отримані дані свідчили, що найбільш чутливими до зростаючої ішемії та гіпоксії є клітини третьої нейронної ланки, які руйнуються в масовому порядку. Хоча подекуди і виявлялись частково збережені гангліозні клітини, але частіше вони були незворотньо дегенеровані. Можливо також, що найбільший ступінь ушкодження нейронів цього шару в умовах гіпоксії обумовлювався фактором часу. У цьому шарі, як найбільш віддаленому від судинної оболонки ока, стан гіпоксії розвивався раніш за все, тому існує більш тривалий час, ніж в інших ядерних шарах. Інша картина спостерігалась в ішемізованому оці собак, лікованих вінбороном, який значно зменшував ознаки диструктивних змін в ішемізованих тканинах ока. Активований препаратом колатеральний кровообіг значною мірою компенсував перекриття основних шляхів кровопостачання. В результаті цього дегенеративні процеси в сітківці та зоровому нерві значно гальмувались, про що свідчила істотна збереженість нейронів усіх клітинних шарів сітківки. Багато нейронів гинуло, але дистрофічні зміни, що залишались, були зворотніми. При цьому послаблювались явища набряку в сітківці і зоровому нерві, спричинені передуючою ішемією.

Дослідження профілактично-лікувальної ефективності вінборону при тотальній ішемії ока, викликаної шляхом накладання ретробульбарної лігатури. За даними лазерної протокової цитометрії у щурів встановлено, що через 60 хв після повного припинення кровопостачання ока 52,28±3,94 % клітин сітківки перебували в некротичному стані (маркувалось пропидія йодидом), а 9,06±1,50 % маркувалось аннексином, що вказувало на їх апоптоз (табл. 4, рис. 2).

Таблиця 4. Вплив вінборону на динаміку (%) апоптозу та некрозу клітин сітківки в умовах тотальної ішемії ока у щурів (M±m, n=8)

Приміка. * - p?0,05 порівняно з групою контроля.

А

Б

Рис. 2. Приклад результату лазерної протокової цитометрії. А - без профілактики; Б - профілактика ішемії вінбороном. Експресія аннексину (апоптоз) RN1 та пропидія йодиду (некроз) RN2 клітинами сітківки через 60 хв. після створення ішемії

Через 120 хв після створення ішемії реєструвалась майже повна загибель клітин сітківки - 95,12±1,20 % маркувалось пропидія йодидом та 1,28±0,21 % аннексином.

На відміну від цього, при дослідженні рівнів апоптозу та некрозу в суспензіях клітин ішемізованої сітківки щурів, які попередньо отримували вінборон, через 60 хв після моделювання патологічного стану відмічаються вірогідно нижчі (p?0,05) рівні апоптозних (3,58±0,64 %) і особливо некротизованих (30,51±3,03 %) клітин порівняно з аналогічними показниками контрольної групи (див. рис. 2, табл. 3). Однак, через 120 хв від початку тотальної ішемізації ока і на тлі профілактики вінбороном так, як і в контролі, реєструвалась їх майже повна некротична загибель (93,62±1,80 %).

Отримані дані щодо виживання клітин сітківки в контролі методом протокової цитометрії узгоджуються з результатами інших дослідників [Hayreh S. S., Weingeist T. A., 1980; Sellйs-Navarro I. et al., 1996], отриманими іншими методами: часткове відновлення функції сітківки за допомогою лікувальних заходів можливе в межах годинної ішемії і різко знижується в період 60-120 хв, а в термін через 2 год це явище практично неможливе. Профілактичне введення вінборону в заданих умовах експерименту проявляється ретинопротекторною дією, про що свідчить зменшення рівнів апоптозу та некрозу клітин в задньому відділі ока за рахунок фармакодинамічних ефектів, що властиві препарату.

Захисна дія вінборону на ішемізовану стіківку виявлена також і на моделі гострої тотальної ішемії-реперфузіїї ока у щурів. Так, через 1 год після створеної нами тотальної ішемії та через 24 год реперфузії у нелікованих тварин пошкодження сітківки реєструвалось у внутрішньому ядерному шарі, внутрішньому сітчастому шарі, гангліонарному шарі та шарі нервових волокон. Краще виглядав зовнішній ядерний шар. Набряк спостерігався в шарі нервових волокон, гангліонарному і внутрішньому плексиформному шарах і був менш помітний у внутрішньому ядерному і зовнішньому ядерному шарах сітківки. Велика кількість клітин внутрішнього ядерного шару і, особливо, більшість клітин гангліонарного шару були пошкоджені. Відмічалось зменшення щільності у фоторецепторному, зовнішньому та внутрішньому ядерних шарах. Особливо постраждав шар гангліонарних нервових клітин, який місцями практично не містив збережених нейронів, вкрай рідко виявлялись поодинокі групи із ектопованими набряклими або пікнотизованими ядрами з явищами хроматолізу і перицеллюлярної інкрустації, оточені зернами розпаду їхньої цитоплазми внаслідок важкої ішемії. Патологічні гістоморфологічні зміни в сітківках контрольних тварин співпадають з такими, які були отримані на даній моделі патології й іншими дослідниками [Hangai M. et al., 1997].

При гістологічному вивченні експериментального матеріалу у тварин, які після створення ішемії отримували вінборон, також спостерігалось деяке зменшення щільності внутрішнього ядерного шару. Однак, структура зовнішнього ядерного шару та шару фоторецепторів практично не відрізнялась від норми. Водночас, в збереженому стані візуалізувався і шар гангліонарних клітин, хоча кількість нервових клітин у ньому була вочевидь меншою, ніж в нормі, що пояснюється його надзвичайною чутливістю до ішемії. Тобто, експериментальна ішемія-реперфузія ока без фармакологічної корекції викликає ушкодження у всіх шарах сітківки - фоторецепторному, зовнішньому та внутрішньму ядерних шарах, внутрішньому плексиформному шарі і, особливо, в гангліонарному. В протилеж-ність цьому, на тлі лікування вінбороном виявлений суттєвий позитивний ефект корекції наслідків ішемії-реперфузії.

Таким чином, проведене дослідження показало, що вінборону притаманні властивості підвищувати толерантність сітківки та зорового нерва до ішемії в умовах як тривалого (7 днів) порушення кровопостачання органа зору, так і при гострій тотальній ішемії та ішемії-реперфузії ока.

Висновки

У дисертаційній роботі подано нове вирішення науково-практичної задачі, спрямованої на підвищення ефективності фармакотерапії та фармакопрофілактики ішемічних ушкоджень сітківки та зорового нерва шляхом використання вінборону як лікарського засобу з політропними фармакологічними властивостями.

1. Вінборон (1 мг/кг в/в) суттєво не впливає на нормальний офтальмотонус і сприяє зниженню внутрішньоочного тиску при тимчасовій експериментальній офтальмогіпертензії у кролів на 10-13 % (р<0,05).

2. Вінборон (1 мг/кг в/в) на відміну від еуфіліну (2,4 мг/кг в/в) покращує гемодинаміку ока в умовах його експериментальної ішемії у наркотизованих собак (однобічна оклюзія загальної сонної артерії). На тлі застосування вінборону на 30-35 хв експерименту у внутрішніх очних артеріях (в більшій мірі на стороні змодельованої патології) підвищуються швидкості кровотоку у бік їх нормалізації на 11,2 % - систолічна, на 47,1 % - діастолічна та на 23,5 % середня швидкості, знижується периферичний опір крові на 41,9 %, збільшується перфузія судин, покращується мікроциркуляція без ознак виникнення “ефекту обкрадання”.

3. Курсове (7 днів) лікування вінбороном (1 мг/кг в/в двічі на добу) при експериментальній ішемії сітківки та зорового нерва (однобічна оклюзія загальної сонної артерії) у собак забезпечує суттєве покращення коллатерального кровообігу, послаблюючи розвиток периваскулярного та міжклітинного набряку, зменшує пошкоджуючий вплив ішемії на клітинні структури сітківки і зоровий нерв.

4. Профілактичне введення вінборону (1 мг/кг в/о) перед моделюванням експериментальної 60-хвилинної тотальної ішемії ока у щурів проявляється ретинопротекторною дією у вигляді меншої кількості апоптозних та некротизованих клітин в задньому відділі ока відповідно на 60,5 % та на 41,6 % (р?0,05).

5. Лікування вінбороном (1 мг/кг в/о) експериментальної тотальної ішемії-реперфузії ока у щурів забезпечує захист від руйнівної дії ішемії та реперфузії усіх шарів сітківки - фоторецепторного, зовнішнього та внутрішнього ядерного, внутрішнього сітчастого, а також гангліонароного - найбільш чутливого до пошкодження.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Черешнюк І. Л. Вінборон - лікарський засіб з політропними фармакологічними властивостями / Г. І. Степанюк, І. Л. Черешнюк, Н. Г. Степанюк, С. В. Сергєєв, О. В. Дякова, О. С. Пашинська, А. Б. Гордійчук, О. О. Столярчук, В. М. Чорнобровий, А. С. Шаламай // Вісник Вінницького державного медичного університету. - 2002. - Т. 6, № 1. - С. 111-114.

2. Черешнюк І. Л. Вивчення гістоморфології сітківки і зорового нерва в умовах експериментальної ішемії ока без і на тлі застосування вінборону / І. Л. Черешнюк // Вісник морфології. - 2002. - T. 8, № 2. - С. 283-286.

3. Черешнюк І. Л. Вплив вінборону на офтальмотонус у кролів в умовах гострої тимчасової офтальмогіпертензії / І. Л. Черешнюк, Г. І. Степанюк // Вісник Вінницького національного медичного університету. - 2008. - T. 12, № 2. - C. 335-337.

4. Черешнюк І. Л. Профілактично-лікувальна ефективність вінборону при експериментальній ішемії-реперфузії сітківки / І. Л. Черешнюк // Вісник морфології. - 2008. - T. 14, № 1. - С. 161-164.

5. Черешнюк І. Л. Вплив вінборону на стан гемодинаміки у внутрішніх очних артеріях в умовах неповної експериментальної ішемії ока за даними кольорової ультразвукової доплерографії / І. Л. Черешнюк, М. Е. Мельник, Г. І. Степанюк // Вісник морфології. - 2009. - Т. 15, № 2. - С. 479-483.

6. Патент № 52295 А України, МПК7 А 61 F 9/00. Спосіб визначення гемодинаміки ока / І. Л. Черешнюк, М. Е. Мельник, Й. Р. Салдан., Ю. П. Довгалюк ; заявник та патентовласник Вінницький державний медичний університет ім. М. І. Пирогова. - № 2002042671 ; заявл. 03.04.2002 ; опубл. 16.12.2002, Бюл. № 12. - 2 с.

7. Черешнюк І. Л. Дослідження впливу вінборона на офтальмотонус у кролів / І. Л. Черешнюк, Г. І. Степанюк // Вісник Вінницького національного медичного університету. - 2007. - Т. 11, № 2/2. - C. 817-818. (Актуальні питання фармакології : наук.- практ. конф. з міжнар. участю, присвячена 70-річчю кафедри фармакології ВНМУ ім. М. І. Пирогова. Вінниця, 26-27 жовтня 2007 р. : тези доп.).

8. Черешнюк І. Л. Характеристика лікувальної дії вінборону при експериментальній ішемії ока за даними ультразвукової доплерографії / І. Л. Черешнюк, М. Е. Мельник, Г. І. Степанюк // XIV Університетська наук.-практ. конф. молодих вчених та фахівців, 14 травня 2008 р. : матеріали. - Вінниця, 2008. - С. 151-153.

9. Черешнюк І. Л. Ретинопротекторна дія вінборону в умовах експериментальної ішемії ока / І. Л. Черешнюк, Г. І. Степанюк // Вісник Вінницького національного медичного університету. - 2008. - Т. 12, № 1. - С. 272. (Досягнення та перспективи клінічної фармакології : V Всеукраїнська наук.- практ. конф. з міжнар. участю з клінічної фармакології. Вінниця, 12-13 травня 2008 р. : тези доп.).

Анотація

Черешнюк І. Л. Лікувально-профілактична ефективність вінборону при експериментальній ішемії сітківки та зорового нерва. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2010.

Дисертація присвячена підвищенню ефективності лікування та профілактики ішемічних ушкоджень сітківки та зорового нерва шляхом використання препарату з політропними фармакологічними властивостями - вінборону. В експериментах на кролях доведено, що вінборон не впливає на нормальний офтальмотонус, однак сприяє зниженню внутрішньоочного тиску при тимчасовій експериментальній офтальмогіпертензії. У наркотизованих собак вінборон, на відміну від еуфіліну, покращує гемодинаміку ока в умовах його експериментальної ішемії: підвищуються швидкості кровотоку у бік їх нормалізації, знижується периферичний опір крові, збільшується перфузія та покращується мікроциркуляція без ознак виникнення “ефекту обкрадання”. Вінборон ослаблює розвиток периваскулярного та міжклітинного набряку, зменшує пошкоджуючий вплив ішемії на клітинні структури сітківки та зоровий нерв. Лікування вінбороном експериментальної тотальної ішемії-реперфузії ока у щурів забезпечує захист від впливу ішемії та реперфузії усіх досліджуваних структур сітківки. Профілактичне застосування вінборону в умовах тотальної одночасової ішемії ока проявляється антиапоптозною та антинекротичною дією.

Ключові слова: ішемія, сітківка, зоровий нерв, вінборон, еуфілін.

Аннотация

Черешнюк И.Л. Лечебно-профилактическая эффективность винборона при экспериментальной ишемии сетчатки и зрительного нерва. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Одесский государственный медицинский университет МЗ Украины, Одесса, 2010.

Диссертация посвящена разработке нового подхода к повышению эффективности лечения и профилактики ишемических повреждений сетчатки и зрительного нерва путем использования винборона - отечественного препарата с политропными фармакологическими свойствами.

Целью работы было экспериментальное обосноваие целесообразности применеия винборона в качестве препарата для лечения и профилактики ишемичеких поражений зрительного нерва и сетчатки. Оценено влияние винборона на офтальмотонус, регионарную гемодинамику, микроциркуляцию, гистоструктуру органа зрения. Исследовано нейропротекторное действие винборона при тотальной ишемии и ишемии-реперфузии глаза, обосновано применение винборона при дистрофических изменениях в сетчатке и зрительном нерве.

В ходе проведенных экспериментов на кроликах установлено, что винборон (1 мг/кг внутривенно) не влияет на нормальный офтальмотонус, однако способствует снижению внутриглазного давления на 10-13 % при временной экспериментальной офтальмогипертензии, смоделированной методом интрагастрального введения воды.

В экспериментах на наркотизированных собаках винборон (1 мг/кг внутривенно) в отличие от эуфиллина (2,4 мг/кг внутривенно), по данным цветной ультразвуковой допплерографии, улучшает гемодинамику глаза в условиях его экспериментальной ишемии (односторонняя окклюзия общей сонной артерии): повышаются показатели скорости кровотока в сторону их нормализации, снижается периферическое сопротивление крови, увеличивается перфузия и улучшается микроциркуляция без признаков “эффекта обкрадывания”. При гистологическом исследовании ишемизированных глаз собак установлено, что винборон ослабляет развитие периваскулярного и межклеточного отека, уменьшает повреждающее влияние ишемии на клеточные структуры сетчатки и зрительный нерв.

В экспериментах на наркотизированных крысах доказано, что лечение винбороном (1 мг/кг внутрибрюшинно) экспериментальной тотальной ишемии-реперфузии глаза, смоделированной методом наложения ретробульбарной лигатуры, обеспечивает защиту от повреждающего влияния ишемии и реперфузии всех исследуемых структур сетчатки - фоторецепторного, внутреннего ядерного, внутреннего сетчатого и, особенно ганглионарного слоя - наиболее чувствительного к действию повреждающих факторов.

С помощью метода лазерной проточной цитометрии установлено, что профилактическое применение винборона (1 мг/кг внутрибрюшинно) в условиях экспериментальной одночасовой тотальной ишемии глаза у крыс проявляется антиапоптозным и антинекротическим (ретинопротекторным) эффектом в виде регистрации меньшего количества апоптозных и некротических клеток в заднем отделе глаза (соответственно на 60,5 % и 41,6 %) .

Таким образом, проведенное исследование показало, что винборону присущи свойства повышать толерантность сетчатки и зрительного нерва к ишемии в условиях как длительного (7 дней) нарушения кровоснабжения органа зрения, так и при острой (одночасовой) тотальной ишемии и ишемии-реперфузии глаза.

Ключевые слова: ишемия, сетчатка, зрительный нерв, винборон, эуфиллин.

Summary

Chereshnyuk I. L. Treatment-and-prophylactic effectivity of vinboron at experimental ischemia of a retina and optic nerve. - Manuskript.

Dissertation for competition for scientific degree of Kandidate of medical sciences on speciality 14.03.05 - Pharmacology. - Odesa State Medical University of the Ministry of Health of Ukraine, Odesa, 2010.

Dissertation is dedicated to increasing effectivity treatments and preventive maintenances ischemic damages of the retina and optic nerve by use vinboron - a preparation of with polytrop pharmacological characteristic. In experiment on rabbits is installed that vinboron not influence upon normal intraocular pressure, however promotes the reduction of intraocular pressures during experimental ophthalmic hypertension. In experiment on narcotical dogs vinboron, in contrast to euphylline, perfects the hemodynamic of the eye in conditions of its experimental ischemia: increase the blood flow velocities aside their normalizations, falls the peripheric resistance shelters, increases perfusion and improves microcyrculation without sign of the reduction "steal effect". Vinboron weakens the development of perivascular and intercelluar of the edema, reduces the pathogenic influence of ischemia on celluar structures of the retina and optic nerve. In experiment on narcotical rats is proved that treatment by vinboron under experimental total ischemia - reperfusion eye provides protection from influence of ischemia and reperfusion all under investigation structures of the retina. Preventive using of vinboron of experimental one-hour total ischemia eye reveals antiapoptotic itself and antinecrotic action.

Key words: ischemia, retina, optic nerve, vinboron, euphylline.

Размещено на Allbest.ru