Кон’югат анти-VEGF з гематопорфірином як засіб підвищення ефективності фотодинамічної терапії

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р. Є. КАВЕЦЬКОГО

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

КОН'ЮГАТ АНТИ-VEGF З ГЕМАТОПОРФІРИНОМ ЯК ЗАСІБ ПІДВИЩЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ФОТОДИНАМІЧНОЇ ТЕРАПІЇ

14.01.07 - онкологія

МАМЧУР АНАТОЛІЙ АНАТОЛІЙОВИЧ

Київ - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України.

Науковий керівник доктор біологічних наук Лісняк Іван Олексійович, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України, провідний науковий співробітник лабораторії квантової нанобіології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Мінченко Олександр Григорович, Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, заступник директора інституту, завідувач відділу молекулярної біології;

- кандидат біологічних наук Кузьменко Олександр Петрович, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України, старший науковий співробітник відділу конструювання засобів біотерапії раку

Захист дисертації відбудеться 27 жовтня 2010 р. о 13³⁰ на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України (03022, м. Київ-22, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р. Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий «____» вересня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Л. М. Шлапацька

АНОТАЦІЯ

Мамчур А.А. Кон'югат анти-VEGF з гематопорфірином як засіб підвищення ефективності фотодинамічної терапії . - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеню кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України, Київ, 2010.

Дисертація присвячена вивченню ефективності фотодинамічної терапії пухлин із застосуванням фотосенсибілізатора - гематопорфірина, кон'югованого з антитілами до фактора росту ендотеліальних клітин (VEGF). Методом кон'югації за допомогою лінкера карбодііміду-НСl отримано кон'югат гематопорфірину з антитілами до VEGF, визначено його спектральні характеристики, фототоксичність, активність антитіл в кон'югаті, досліджено накопичення в зонах активного судиноутворення на хоріон-алантоїсних мембранах.

Встановлено, що в результаті утворення кон'югату гематопорфірину з антитілами до VEGF за допомогою лінкера не відбувається змін у специфічній активності антитіл та фотосенсибілізатора в кон'югатах. Виявлено, що у мембранах з максимальною проліферацією ендотелію та судиноутворенням (6-й день розвитку ембріонів), кон'югат накопичується в 3,6 рази більше у порівнянні з вихідним гематопорфірином.

Показано, що під дією ФДТ з використанням гематопорфірину кон'югованого з антитілами до VEGF, в сироватках крові тварин з пухлинами (карцинома Льюїс та саркома 180) спостерігався в 1,5 рази вищий рівень фактору v.Willebrand (vWF), ніж у тварин з пухлинами, котрим не проводили ФДТ. Досліджено фотодинамічну ефективність кон'югату в порівнянні з вихідним гематопорфірином на моделях меланоми В16, саркоми 180 та вихідного штаму карциноми Льюїс LLC і її варіанту LLC/R9.

Виявлено особливості акумуляції кон'югату та вихідного гематопорфірину в пухлинних тканинах мишей, пов'язані з біоритмікою продукції VEGF пухлинами.

Встановлено, що фотодинамічна терапія тварин з карциномою Льюїс та саркомою 180 з використанням кон'югату, проведена із урахуванням ритміки продукції VEGF, призводить до гальмування росту пухлин на 60,4 % за найвищого рівня VEGF в сироватці крові (о 14⁰⁰ доби) та 45 % , коли відмічається зниження рівня фактору в сироватці крові (о 2⁰⁰ доби).

Ключові слова: фотодинамічна терапія, фотосенсибілізатор, гематопорфірин, кон'югат, карцинома Льюїс, саркома 180, меланома В16.

АННОТАЦИЯ

Мамчур А. А. Конъюгат анти-VEGF с гематопорфирином как способ повышения эффективности фотодинамической терапии. Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 - онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, 2010.

Диссертация посвящена изучению эффективности фотодинамической терапии животных с опухолями с использованием гематопорфирина, конъюгированого с антителами к фактору роста эндотелиальных клеток (VEGF). Методом конъюгации с помощью линкера карбодиимида-HCl получен конъюгированный с антителами к VEGF гематопорфирин, определены его спектральные характеристики и биологические свойства (фототоксичность, активность антител в конъюгате, накопление конъюгата в зонах активного неоангиогенеза на хорион-алантоисных мембранах).

При определении фототоксичности полученного конъюгата обнаружилось, что при действии на эритроциты (реакция гемолиза) эквивалентные концентрации конъюгата и исходного фотосенсибилизатора - гематопорфирина оказались равноактивными.

Определено, что реакция конъюгирования гематопорфирина с антителами к VEGF с помощью линкера существенно не влияет на специфическую активность антител в конъюгатах.

Обнаружено, что в период активного капиллярообразования в хорион-аллантоисных мембранах куриных эмбрионов (6-й день развития эмбрионов), конъюгат накапливается в 3,6 раза больше по сравнению с накоплением исходного гематопорфирина.

Для оценки разрушения сосудов в опухоли (в частности, разрушения эндотелиальных клеток) под действием ФДТ, предложено определение концентрации в сыворотке крови фактора v. Willebrand, который рассматривают как маркер гибели ендотелиоцитов. Он выходит из эндотелиоцитов в плазму крови при их разрушении под действием различных факторов, в том числе и под действием таргетной фотодинамической терапии. Показано, что под действием ФДТ с использованием конъюгированого гематопорфирина в сыворотке крови животных с опухолями (карцинома Льюис и саркома 180) наблюдался в 1,5 раза выше уровень фактора v. Willebrand, чем у животных, которым не проводили ФДТ.

Сравнивалась эффективность фотодинамической терапии у животных с опухолями (саркома 180, карцинома Льюис - исходный штамм LLC и её вариант LLC/R9) с использованием в качестве фотосенсибилизатора конъюгата и исходного гематопорфирина.

Изучалось анитметастатическое действие целенаправленной фотодинамической терапии с использованием конъюгированного с антителами к VEGF гематопорфирина на модели перевивной карциномы Льюис. Обнаружили, что таргентая ФДТ приводит к уменшению как общего количества метастазов (в 2,5 раз), так и объема метастатического поражения (в 4 раза).

Исследованы особенности аккумуляции конъюгата в опухолях, связанные с биоритмикой продукции ими VEGF. Проведено определение и анализ суточных колебаний содержания VEGF в опухолях и сыворотке крови мышей с опухолью. В соответствии с полученными данными проведена хронофотодинамическая терапия экспериментальных опухолей с использованием конъюгированого гематопорфирина. Обнаружено, что фотодинамическая терапия карциномы Льюис и саркомы 180 с использованием конъюгата, проведенная в 14⁰⁰, приводит к торможению роста опухолей на 60,4 % (наивысший уровень VEGF в сыворотке крови) и на 45 % в 2⁰⁰, когда отмечается наименьший уровень фактора в сыворотке крови.

Ключевые слова: фотодинамическая терапия, фотосенсибилизатор, гематопорфирин, конъюгат, карцинома Льюис, саркома 180, меланома В16.

ANNOTATION

Mamchur A. A. Anti-VEGF and hematoporphyrin conjugate as the mean to enhance the efficiency of photodynamic cancer therapy. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of the Candidate of Biological Sciences in speciality 14.01.07 - oncology. - R. E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2010.

The dissertation is devoted to the study of the photodynamic cancer therapy (PDT) efficiency while using photosensitizer (hematoporphyrin) conjugated with antibodies to VEGF. The conjugate of hematoporphyrin and antibodies to VEGF was received by the method of conjugation with the help of linker carbodiimide-HCl; spectral characteristics of conjugate, its phototoxicity, specific activity in antigen-antibody reactions, character of accumulation in the zones of active vessels formation on chorion-allantois membranes were estimated.

It was determined that the reaction of conjugate of hematoporphyrin with antibodies to VEGF formation with the help of linker does not influence significantly on antibodies specific activity and photosensitizer activity in conjugate. The conjugate accumulation in membranes with maximum endothelium proliferation and capillaries formation (6 ^th day of embryo development) was estimated to be 3.6 times more comparing to derived hematoporphyrin accumulation.

It was found that von Willebrand factor level was 1.5 times more under the influence of PDT with conjugate (hematoporphyrin-antibodies to VEGF) in animal serum with tumors (Lewis lung carcinoma and sarcoma 180) comparing to the animals with tumors which didn't undergo PDT procedure.

The photodynamic efficiency was compared with hematoporphyrin in the models of mouse sarcoma 180 and Lewis carcinoma and its variants-LLC and LLC/R9.

It was determined that the specificity of conjugate and derived hematoporphyrin accumulation in tumor tissue of mice, connected with biorhythmic of tumor VEGF production.

Application of PDT in accordance with rhythmicity VEGF production resulted in the growth inhibition both of Lewis lung carcinoma an sarcoma 180 by 60 % under the highest level of VEGF in blood serum and by 45 % when the level of VEGF in blood was is lower.

Key words: photodynamic therapy, photosensitizer, hematoporphyrin, conjugate, Lewis carcinoma, sarcoma 180, melanoma B16.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Останніми десятиріччями в онкологічну практику увійшов малотравматичний метод лікування хворих на злоякісні новоутворення - фотодинамічна терапія (ФДТ), який відрізняється від традиційних методів лікування, таких як променева та хіміотерапія, високою вибірковістю ураження пухлинної тканини, відсутністю місцевих та системних ускладнень. Метод базується на пошкодженні пухлинної тканини світловим випромінюванням у присутності фотосенсибілізатору (наприклад, гематопорфірину), який поглинає світло. Ефективність застосування ФДТ обумовлена тим, що цей метод дозволяє досягти більшої вибірковості ураження пухлинної тканини аніж будь-який інший метод (радіотерапія, хіміотерапія), прийнятий в онкологічній практиці. Така селективність у світловому пошкодженні пухлинної тканини ґрунтується на тому, що гематопорфірин через 24-72 години після введення в організм повільніше виводиться із злоякісних пухлин в порівнянні з нормальними тканинами. Інша важлива позитивна властивість ФДТ полягає в тому, що цей підхід дозволяє в деяких випадках замінювати хірургічне втручання порівняно простою, малотравматичною процедурою. Аналіз літератури з проблем ФДТ показує, що застосування методу в його класичному вигляді, тобто з використанням в якості фотосенсибілізатора гематопорфірина, не є оптимальним. Цей препарат порівняно тривало (тижні, місяці) затримується в організмі, спричиняючи у хворих шкірну фототоксичність. Малорозчинний у воді, він акумулюється на поверхні пухлинних клітин і складно виводиться із організму. Останніми роками проводяться роботи по створенню більш ефективних варіантів ФДТ та пошуку нових фотосенсибілізаторів (Гамалея Н.Ф. и др., 2003). В основу цих робіт покладені принципи таргетної терапії зі створенням кон'югатів терапевтичних агентів із біологічно активними речовинами (антитіла, їх активні фрагменти, цитокіни), які здатні специфічно зв'язуватися зі своїми мішенями. На даний момент відомо чимало таких мішеней - маркерів пухлинного росту: EGF та рецептори до нього (Roses. R.E. et al., 2009; Ismail H.M. et al., 2007; Moulder S.L. et al., 2001; Тюряева И.И., 2008) IGF-1 та його рецептори IGFR-1,

IGFR-2 (Barnes C.J. et al., 2007; Monti S. et al., 2007; Yin M. et al., 2009), фактори ангіогенезу VEGF, FGF (Sathornsumetee S. et al., 2007), тощо.

Особливого зацікавлення набуває проблема застосування препаратів таргетної терапії, поєднаних з фотосенсибілізаторами, мішенями дії яких була б васкулярна система пухлин, та розробка способів цілеспрямованої доставки таких препаратів до судин, що активно формуються в пухлині (Hanahan D. et al., 2000; Folkman J. 1971, 2002; Zetter B.R. 1998). Одним із таких препаратів може бути кон'югат на основі гематопорфірину та антитіл проти фактору росту ендотелію судин - VEGF.

В даному препараті гематопорфірин при опроміненні пухлини здатний викликати фотохімічну реакцію з утворенням синглетного кисню та перекисних сполук, які приймають участь у руйнації пухлинних клітин. В свою чергу, антитіла до VEGF цілеспрямовано доставляють фотосенсибілізатор в зону інтенсивного неоангіогенезу, тобто в пухлину, де фотодинамічна терапія може супроводжуватися як антиваскулярною, так і антиангіогенною дією. Слід зазначити, що в організмі є інші зони інтенсивного ангіогенезу (наприклад, зони регенерації), але побічні дії препарату на них нивілюються тим, що лазерному опроміненню підлягає тільки тканина пухлини. Цікавим аспектом фотодинамічної терапії є можливість її застосування з урахуванням добової ритміки синтезу VEGF пухлинними клітинами. Використовуючи цей підхід, можна забезпечити спрямовану його «досилку» безпосередньо в активно формуючу кровоносну мережу пухлини в той момент доби, коли концентрація фактора в пухлинних клітинах буде максимальною. Так, дані літератури (Rak J. et al., 1995) свідчать саме про ритмічний характер секреції пухлинами VEGF протягом доби, що відкриває можливість підвищити ефективність фотосенсибілізації пухлин за рахунок введення в організм судинотропних сенсибілізаторів у період підвищеної концентрації фактора та рецепторів до нього у пухлинній тканині.

Між тим, дані щодо розробки способів цілеспрямованої доставки до судин пухлини, які активно формуються, фотосенсибілізуючих агентів у вигляді кон`югатів з факторами ангіогенезу та антитілами до них, відсутні. Немає в науковій літературі і повідомлень відносно спроб реалізації хронобіологічних підходів до фотодинамічної терапії пухлин. Викладене свідчить про актуальність проведення досліджень, які дозволили б не тільки оцінити ефективність таргетної анти-ангіогенної ФДТ із застосуванням кон'югату на основі гематопорфірину та антитіл до VEGF, але й підвищити ефективність фотосенсибілізації пухлин за рахунок введення в організм судинотропного фотосенсибілізатора у період підвищення концентрації VEGF у пухлинній тканині.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження за темою дисертації проводились у рамках планово-бюджетної наукової роботи Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України «Розробка нових методів фотодинамічної терапії, основаних на особливостях ангіогенезу та біоритміки в організмі з пухлиною» (2006-2008 рр., № держреєстрації 0105U005553). Дисертаційна робота виконана в період навчання в аспірантурі (2006-2009 рр.).

Мета роботи. Отримати кон'югат гематопорфірину з антитілами до VEGF та визначити його протипухлинну фотодинамічну активність в порівнянні з вихідним фотосенсибілізатором на моделях експериментальних пухлин різного гістогенезу.

Задачі досліджень:

1. Отримати кон'югат гематопорфірину з антитілами до VEGF та визначити його спектральні характеристики (поглинання в діапазоні хвиль 190-690 нм).

2. Дослідити біологічні властивості кон'югату (фотоцитотоксичність сенсибілізатора та специфічну активність антитіл в кон'югованій сполуці) і рівень накопичення його в пухлинах та нормальних тканинах.

3. Дослідити рівень накопичення кон'югату в зонах активного ангіогенезу на моделі хоріон-алантоїсних мембран курячих ембріонів.

4. Дослідити за показником рівня фактора v. Willebrand (vWF) руйнування судин пухлин (саркома 180 та карцинома Льюїс) під впливом фотодинамічної терапії з використанням кон'югату.

5. Провести порівняльну оцінку фотодинамічної активності кон'югованого гематопорфірину та вихідного фотосенсибілізатора у тварин з перещепленими пухлинами (саркома 180 та карцинома Льюїс).

6. Дослідити ефективність фотодинамічної терапії з використанням кон'югату гематопорфірину з антитілами до VEGF та врахуванням добової ритміки синтезу VEGF у тварин з перещепленими пухлинами (саркома 180 та карцинома Льюїс).

Об'єкт дослідження: миші лінії С57Bl/6 та нелінійні миші, курячі ембріони, саркома 180, карцинома легені Льюїс (вихідний штам LLC i його варіант LLC/R9), меланома В16.

Предмет дослідження: протипухлинна фотодинамічна активність кон'югованого з антитілами до VEGF гематопорфірину.

Методи дослідження: методи експериментальної онкології - для оцінки динаміки росту злоякісних пухлин та підрахунку кількості метастазів та об'єму метастатичного ураження; хімічні - для одержання кон'югатів; імунологічні - для одержання антисироваток та антитіл до VEGF; імуноферментні - для оцінки біологічної активності антитіл, кон'югованих з фотосенсибілізатором, визначення вмісту VEGF; спектрофотометричний - для визначення накопичення фотоімунокон'югату в пухлинній і нормальних тканинах та для визначення його фізико-хімічних властивостей; метод фотогемолізу еритроцитів - для визначення фототоксичності гематопорфірину, кон'югованого з антитілами до VEGF; прийоми проведення фотодинамічної терапії тварин з використанням лазерних випромінювачів.

Наукова новизна дослідження. Отримано кон'югат на основі фотосенсибілізатора гематопорфірина та антитіл до фактора росту ендотеліальних клітин - VEGF, досліджені його спектральні характеристики в діапазоні хвиль 190-690 нм та біологічні властивості - цитофототоксичність та рівень специфічності антитіл в кон'югаті. Проведено порівняльний аналіз рівнів накопичення кон'югованого фотосенсибілізатора та вихідного гематопорфірина в пухлинах (саркома 180 та карцинома Льюїс), крові та нормальних тканинах (шкіра, печінка, нирка).

Виявлена судинотропність кон'югату та вибіркове його накопичення в зонах з інтенсивним новоутворенням судинної мережі на моделі хоріон-алантоїсних мембран курячих ембріонів.

На моделях пухлинного росту (карцинома Льюїс та саркома 180) встановлено високу протипухлинну фотодинамічну активність кон'югату (гальмування росту пухлин, подовження терміну тривалості життя тварин з пухлинами, пригнічення метастатичного процесу) в порівнянні з вихідним гематопорфірином.

Після проведення ФДТ із застосуванням кон'югату виявлено підвищений рівень фактору v. Willebrand в сироватці крові тварин за рахунок виходу його в кров'яне русло в результаті руйнації ендотеліальних клітин судин пухлин. Визначення концентрації фактору v. Willebrand в сироватці крові запропоновано для оцінки ступеню руйнування судин пухлин під дією ФДТ.

Вперше при застосуванні синтезованого кон'югату гематопорфірин-антитіла до VEGF у фотодинамічній таргетній терапії враховано добову ритміку секреції VEGF пухлинними клітинами, що дозволяє забезпечити спрямовану «досилку» його безпосередньо в активно формуючу кровоносну мережу пухлини в той момент доби, коли продукція фактора пухлинами є максимальною.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати визначають підхід до підвищення ефективності фотосенсибілізації пухлин за рахунок використання ангіоген-спрямованого кон'югату гематопорфірин-антитіла до VEGF та його введення в організм у період підвищення вмісту VEGF у пухлинній тканині.

Особистий внесок здобувача. При виконанні дисертаційної роботи дисертантом була зібрана та проаналізована література за темою дисертації, самостійно проведені експериментальні дослідження, зокрема, дослідження цитотоксичності кон'югата та гематопорфірину в моделі фотоіндукованого гемолізу еритроцитів та його специфічної активності, дослідження ступеню накопичення кон'югату в зонах активного утворення судин, визначення в сироватці крові вмісту фактору v. Willebrand (vWF), дослідження протипухлинної та антиметастатичної активності кон'югату, дослідження ефективності ритмоорієнтованої ФДТ. Розробка методології досліджень, аналіз отриманих результатів, їх обговорення та інтерпретацію проведено спільно з науковим керівником д.б.н. І.О. Лісняком. На певних етапах роботи брали участь співавтори публікацій.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на XXVIIІ Міжнародній науково-практичній конференції «Применение лазеров в медицине и биологии» (18-21 апреля, 2007 г., Харьков, Украина); XXIX Міжнародній науково-практичній конференції «Применение лазеров в медицине и биологии» (21-24 мая, 2008 г., Харьков, Украина); ІХ Міжнародній конференції молодих онкологів «Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології» (23-24 квітня 2008 р., Київ, Україна); ХХХІІ Міжнародній науково-практичній конференції «Применение лазеров в медицине и биологии», IV Шахбазовские чтения, (7-10 октября, 2009, МДЦ «Артек» Гурзуф).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, з яких 5 статей у провідних фахових виданнях, затверджених ВАК України, 1 патент та 4 тез доповідей у збірках українських та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, розділу матеріалів та методів досліджень, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальненню одержаних результатів, висновків та списку використаної літератури. Основний зміст дисертації викладений на 136 сторінках машинописного тексту, містить 9 таблиць та 13 рисунків. Список використаних джерел включає 217 найменувань, з них 23 російською і українською мовами та 194 англійською мовою.

фотодинамічний терапія пухлина кон'югат

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проведені на 397 лабораторних тваринах (нелінійних мишах білої масті та мишах лінії С57Вl/6 із масою тіла 18-22 г). Експериментальні тварини були отримані з розводки віварію ІЕПОР НАН України. В експериментах використовували мишей обох статей віком 8-10 тижнів. Всі дослідження на тваринах здійснювались згідно вимогам регіонального Комітету з етики роботи з піддослідними тваринами та з додержанням правил роботи з лабораторними тваринами.

В роботі було використано 6 кролів та 45 ембріонів курей породи «Білий леггорн». При дослідженні фотодинамічної активності кон'югату in vivo в якості експериментальних моделей пухлин використовували вихідний штам карциноми Льюїс LLC та її модифікований варіант LLC/R-9, саркому 180 та меланому В16. Користуючись нагодою, автор висловлює подяку працівникам віварію за допомогу у проведенні експериментів з використанням лабораторних тварин.

Для синтезу кон'югату антитіл до VEGF з гематопорфірином використовували лінкер карбодіімід-НСl та поліклональні антитіла до VEGF, приготування яких включало такі етапи: отримання VEGF із тканини карциноми Льюїс миші, імунізація кролів виділеним VEGF, отримання із сироваток кролів поліклональних антитіл до VEGF.

VEGF отримували з тканини карциноми Льюїс. Тканину здрібнювали, тричі промивали та гомогенізували у фосфатному буфері (рН 7,2) у співвідношенні 1:5. До гомогенату додавали колагеназу (2мг/мл) та інкубували протягом 3 годин при температурі 37⁰С. Після інкубації гомогенат центрифугували, надосадкову рідину збирали, додавали СМ-сефадекс G-50 («Pharmacia», Швеція) із розрахунку 2 г на 1 л надосадкової рідини. Суміш витримували протягом 12 годин (4⁰С) при постійному перемішуванні. Після цього суміш переносили на колонку, промивали фосфатним буфером, що містив 0,1 моль/л NaCl. Далі колонку промивали фосфатним буфером, який містив 0,5 моль/л NaCl. Елюат збирали, проводили діаліз супроти дистильованої води, наносили на колонку (гепарин-сефароза; «Pharmacia», Швеція), яку промивали 0,01 моль/л трис-Cl буфером, рН 7,0 від 0,1 до 0,5 моль/л. Після цього матеріал, який афінно зв'язувався з гепарин-сефарозою, елюювали 0,6 моль/л NaCl з контролем оптичної густини при 280 нм.

Застосування такої схеми елюції обумовлено тим, що з гепарином афінно зв'язується не тільки VEGF, але й EGF, TGF-б та TGF-в ?. При цьому EGF елююється з колонки 0,1 моль/л NaCl, а TGF-б та TGF-в - розчином NaCl в концентрації від 0,1 до 0,3 моль/л, в той час як VEGF - 0,6 моль/л NaCl. Отриманий елюат збирали, ліофілізували та тестували ангіогенну активність на хоріон-алантоїсній мембрані курячих ембріонів 9-ї доби розвитку. Білкову фракцію з високою антиангіогенною активністю, яку отримували шляхом елюції 0,6 моль/л NaCl, діалізували супроти дистильованої води, ліофілізували, зберігали при температурі 25⁰С та використовували для отримання поліклональних антитіл. Специфічність отриманого VEGF порівнювали зі специфічністю рекомбінантного VEGF-165 («Sigma»,США) в імуноферментному тесті з моноклональними антитілами анти-VEGF («Sigma»,США).

В подальшому проводили імунізацію кролів фактором росту ендотеліальних клітин, одержаного з тканини карциноми Л'юїс, для чого антиген (VEGF) в кількості 100 мкг перемішували з 50 мкл повного ад'юванта Фрейнда до утворення емульсії. Отриману суміш вводили кролям у надколінні лімфовузли. Через місяць імуноген з повним ад'ювантом Фрейнда в тій же дозі вводили внутрішньом'язево у регіон лімфовузлів, а через 2 тижні отримували проби сироватки та визначали титр антитіл методом імунодифузії у 2 % агарі Difco. Надалі, через 2-3 тижні, повторювали ін'єкції антигену під шкіру спини. Через 2 тижні після останнього введення антигену збирали всю кров та отримували з неї сироватку, що містила антитіла до VEGF.

Для отримання кон'югованого з антитілами до VEGF гематопорфірину використовували гематопорфірин - дигідрохлорид («Fluka», Нідерланди). Синтез кон'югату проводили за допомогою лінкеру карбодііміда-HCl за наступною схемою: 20 мг гематопорфірину розчиняли в 3 мл розчинника (вода-диметилформамід, 2,5:0,5). До розчину добавляли 20 мг карбодііміду-HCl в 0,5 мл води. Суміш розчинів гематопорфірину та лінкеру витримували при кімнатній температурі протягом 30 хв. Після реакції до утвореного активного комплексу гематопорфірин - лінкер додавали 900 мг поліклональних антитіл, розчинених в 5мл PBS і залишали цю суміш на 5 годин, періодично її перемішуючи, після чого до реакційної суміші додавали 50 мкл моноетаноламіну для зупинки реакції. Надалі суміш залишали на 12 годин при кімнатній температурі.

В кінці цього терміну отриману суміш діалізували проти розчинника вода: діметилсульфоксид (2,5:0,5) впродовж 72 годин. Після діалізу отриманий кон'югат ліофілізували та використовували для всіх подальших досліджень.

Спектральні характеристики отриманого кон'югату визначали за поглинанням в діапазоні хвиль 190-690 нм на спектрофотометрі Nanodrop ND-1000 (США).

Оцінку специфічної активності антитіл до VEGF в їх кон'югатах з гематопорфірином здійснювали, використовуючи метод імуноферментного аналізу. Антиген адсорбували в планшетах в дозі 10 нг/лунку та додавали по 0,2 мл розведеного (1:100) кон'югату. Після інкубації впродовж 2 год. при кімнатній температурі та відмивання, в лунки додавали по 0,2 мл кон'югату антитіл з пероксидазою («DАКО», Німеччина) та інкубували 2 год. при кімнатній температурі. Після відмивання в лунки додавали 0,2 мл розчину субстрату (12,8 мг

о-фенілендіаміну·2НСl в цитрат-фосфатному буфері з вмістом 0,02 % перекису водню), інкубували впродовж 30 хвилин при кімнатній температурі. Реакцію зупиняли додаванням в лунки по 0,05 мл 3М H₂SO₄ та проводили вимірювання інтенсивності забарвлення на фотометрі «Multiscan» при довжині хвилі 492 нм.

Цитофототоксичність імунокон'югату визначали в моделі фотоіндукованого гемолізу еритроцитів за активністю гематопорфірину в сполуці. Для цього кров здорових мишей відмивали розчином PBS в співвідношенні 1:5. Після процедури відмивки еритроцити осаджували центрифугуванням при 500g впродовж 5 хв. Осад еритроцитів розводили розчином PBS у співвідношенні 1:20. В пробірки вносили 200 мкл розведеної суспензії еритроцитів та 150 мкл PBS, додавали по 50 мкл досліджуваного кон'югату, опромінювали звичайним освітлювачем з інтенсивністю світлового потоку до 1,5 мW/см² впродовж 5 хв та додавали реактив Дробкіна (тест-система для кількісного визначення гемоглобіну). Спектрофотометрично при 540 нм визначали кількість гемоглобіну, який вивільнювався в результаті руйнації еритроцитів гематопорфірином після опромінення за калібровочною кривою, яку вибудовували згідно інструкції для тест-системи.

Дослідження ступеню накопичення кон'югатів в зонах неоангіогенезу проводили на хоріон-алантоїсних мембранах курячих ембріонів. Фотосенсибілізатори (кон'югований та вихідний гематопорфірин) в дозі 2 мг/кг, об'ємом 0,2 мл вводили в алантоїс ембріонів на 6 та 10 день розвитку. Через 24 години після введення фотосенсибілізаторів хоріон-алантоїсні мембрани видаляли, гомогенізували в 0,1N NaOH та центрифугували при 15.000 g впродовж 20 хв. У відібраних супернатантах визначали вміст фотосенсибілізуючого агенту-гематопорфірину спектрофотометрично при 505 нм (спектрофотометр NanoDrop, США) .

Для оцінки рівня накопичення кон'югату пухлинами та нормальними тканинами організму використовували метод флуориметрії з використанням спектрофлуориметра Nanodrop 3300 (США). Вміст фотосенсибілізуючого агенту визначали за його специфічною флуоресценцією при хвилі збудження 365 нм. Для аналізу використовували 2 піки флуоресценції, які спостерігалися при довжині хвилі 620 та 680 нм.

Для оцінки руйнування судин пухлин під впливом ФДТ визначали концентрацію фактора v. Willebrand (vWF) в крові тварин з пухлинами, рівень якого визначали імуноферментним методом в сироватці крові. В якості антитіл для визначення рівня vWF використовували кролячі поліклональні антитіла до епітопу vWF людини (Chemicon, США), що є ідентичним за первинною структурою епітопам миші та щура.

Протипухлинну фотодинамічну активність кон'югату вивчали у мишей з саркомою 180, карциномою Льюїс (вихідний високометастазуючий штам LLC та її варіант LLC/R9 - низькометастазуюча лінія, отримана в результаті селективного впливу цисплатину in vivo після 9-ти послідовних курсів хіміотерапії з його застосуванням) та меланомою В16. Матеріалом для перещеплення слугували пухлинні клітини лінії вихідного штаму карциноми та її варіанту, які нарощували in vitro. Клітини в необхідній для перещеплення кількості були люб'язно надані співробітниками відділу фармакокорекції онкогенезу ІЕПОР (керівник - д.ф-м. наук Г.І. Соляник). Нарощені в умовах in vitro клітини карциноми Льюїс перещеплювали мишам лінії C57Bl/6 для подальшого підтримання цього пухлинного штаму в умовах in vivo. Мишам вводили внутрішньом'язево по 0,1 мл (1,0х10⁶ клітин) клітинної суспензії. Штами карциноми постійно підтримували пасажами на мишах лінії С57Вl/6 та використовували для перещеплення пухлин тваринам в подушечку лапки в тій же кількості клітин для серійних досліджень. Аналогічно проводили перещеплення меланоми В16.

Саркому 180 попередньо підтримували в умовах in vivo на білих нелінійних мишах. Суспензію пухлинних клітин у кількості 1,0х10⁶ клітин на тварину перещеплювали підшкірно.

Перед проведенням фотодинамічної терапії кон'югований гематопорфірин розчиняли у суміші фізiологічного розчину і діметилсульфоксиду в співвідношенні 5:1. Кон'югат вводили тваринам внутрішньочеревинно при досягненні пухлинами розміру 5-7 мм в діаметрі з розрахунку 3 мг кон'югату в 0,1 мл суміші-розчинника. Кількість гематопорфірину в кон'югаті складала 0,04-0,05 мг. Такою ж була і кількість вихідного сенсибілізатора. Через добу після введення кон'югату пухлини опромінювали лазером впродовж 5 хвилин при вихідній потужності 25 мВт та дозою опромінення 30Дж/см².

Добові коливання вмісту VEGF в пухлинах та сироватці крові у мишей з карциномою Льюїс та саркомою 180 визначали імуноферментним методом. Враховуючи дані стосовно добових коливань вмісту VEGF та накопичення кон'югату в пухлинах мишей (карцинома Льюїс та саркома 180), проводили ритмоорієнтовану ФДТ мишей з цими пухлинами за наступною схемою: кон`югований з антитілами до VEGF гематопорфірин та вихідний фотосенсибілізатор вводили мишам в вищезазначених дозах внутрішньочеревинно в час максимального (о 14⁰⁰) та мінімального (о 2⁰⁰) вмісту VEGF в пухлинах. ФДТ проводили через добу в ті ж часові точки, тобто о 14⁰⁰ та о 2⁰⁰, використовуючи червоне випромінювання лазера (л = 635 нм,) в дозі 30 Дж/см² при вихідній потужності 30 мВт та щільності потужності 26 мВт/см².

Статистичну обробку результатів проводили з використанням програми Statistica 6.0. Для міжгрупових порівнянь результатів використовували параметричний критерій Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Велике значення для терапевтичного ефекту отриманого кон'югату гематопорфірину з антитілами до VEGF має збереження спектральних характеристик як фотосенсибілізатора, так і білкового компонента кон'югованої сполуки. При кон'югації фотосенсибілізатору з антитілами можуть змінюватись його абсорбційні властивості, які визначають такі важливі характеристики, як продукція синглетного кисню та глибина терапевтичної дії лазерного опромінення в біологічній тканині - пухлині. Тому однією з перших задач було дослідити спектральні характеристики отриманого кон'югату.

Спектри отриманого кон'югату гематопорфірину з антитілами до VEGF представлені на рис. 1. В поглинанні порфіринових сполук (гематопорфірину в тому числі) в діапазоні 390 - 600 нм характерна присутність чотирьох складових спектру, серед яких найбільш характерною є наявність лінії Соре (плато поглинання при 410 нм). В спектрі поглинання кон'югованої сполуки в цьому ж діапазоні зберігаються ті ж піки абсорбції, серед яких присутня і лінія Cоpе. Порівняння спектрів поглинання вихідного гематопорфірину та кон'югату вказує на відсутність змін у фізичних властивостях порфіринової компоненти кон'югату. Не зазнав значних змін у спектральних характеристиках і білковий компонент кон'югованої сполуки - антитіла. В розгорнутому спектрі поглинання (190-690 нм) спостерігається незмінний пік абсорбції при 280 нм, який характерний для білків.

Отже, отримані спектри абсорбції кон'югату гематопорфірин-антитіла проти VEGF свідчать про відсутність змін в поглинанні його порфіринової та білкової компоненти в порівнянні зі спектром поглинання мінорної складової - гематопорфірину (див. рис. 1).

При дослідженні фотоцитотоксичності кон'югата та гематопорфірину в моделі фотоіндукованого гемолізу еритроцитів спостерігали їх однакову активність в еквівалентних концентраціях (рис. 2). Відсутність реакції гемолізу в пробах, які витримували в темряві протягом 24 годин, вказує на те, що отриманому кон'югату не властива темнова фототоксичність.

Рис. 1. Спектри абсорбції гематопорфірину та його кон'югату з антитілами до VEGF (- - - - гематопорфірин, --- - кон'югат гематопорфірину з антитілами до VEGF)

Рис. 2. Фотоцитотоксичність кон'югованого та вихідного гематопорфірину в реакції гемолізу еритроцитів

Дослідження специфічної активності антитіл в їх кон'югаті з порфіриновою частиною показали, що титр антитіл в імуноферментному тесті складав 1:12800, між тим, був нижчим в два рази в порівнянні з титром некон'югованих антитіл (1:25600).

Дослідження ступеню накопичення кон'югату в зонах активного утворення судин проводили на хоріон-алантоїсних мембранах курячих ембріонів, яким на 6 і 10 день розвитку в алантоїс вводили кон'югат та вихідний гематопорфірин і оцінювали їх кількість в мембранах спектрофотометрично через 24 год. після введення препаратів. Виявлено, що в мембранах ембріонів в період максимальної проліферації ендотелію та формування кровоносних судин (6-й день розвитку ембріонів), кон'югат накопичувався в 3,6 рази більше в порівнянні з вихідним гематопорфірином, на відміну від акумуляції кон'югату та вихідного гематопорфірину в період стабілізації процесу неоангіогенезу (10-й день розвитку). Це дає підстави для ствердження про судинотропні властивості кон'югату (рис. 3).

* - Р < 0,05 (по відношенню до гематопорфірину)

Рис. 3. Накопичення кон'югованого з антитілами до VEGF гематопорфірину та вихідного фотосенсибілізатора в хоріон-алантоїсних мембранах курячих ембріонів 6 та 10 дня розвитку

Для доказу руйнації судин пухлин під впливом фотодинамічної терапії з використанням судинотропного кон'югату нами проведено визначення в сироватці крові вмісту фактору v. Willebrand (vWF). Цей фактор представляє собою глікопротеїд, який синтезується ендотеліальними клітинами та мегакаріоцитами і вивільнюється клітинами з виходом в кров'яне русло при їх руйнуванні під дією різноманітних чинників. В експериментальних дослідженнях рівень фактору v. Willebrand (vWF) визначали в сироватках крові мишей з перещепленими пухлинами - карциномою Льюїс та саркомою 180.

В результаті проведених досліджень було встановлено, що у сироватці крові мишей з карциномою Льюїс після проведення ФДТ з кон'югатом рівень фактору v.Willebrand становив 526±92 нг/мл проти 434±59 нг/мл (р < 0,05) у тварин з цією ж пухлиною після ФДТ з гематопорфірином. В сироватках крові тварин з саркомою 180 після проведення ФДТ із застосуванням кон'югату та гематопорфірину рівень vWF становив 509±81 нг/мл та 437±65нг/мл (р < 0,05) відповідно. У тварин контрольної групи, яким не вводили сенсибілізаторів та не проводили ФДТ, рівень фактору становив 316±35нг/мл та 305±34нг/мл у мишей з карциномою Льюїс та з саркомою 180 відповідно.

Підвищення рівня vWF можна пояснити саме руйнуванням судин пухлин під впливом ФДТ з кон'югатом із подальшим виходом vWF в кров'яне русло. Саме антитіла до VEGF, кон'юговані з гематопорфірином, забезпечували безпосереднє транспортування фотосенсибілізатора до мішеней - ендотеліальних клітин, а подальший фотодинамічний вплив на пухлини спричиняв руйнацію клітин ендотелію та вивільнення vWF.

При дослідженні рівня накопичення кон'югату (через 24 год. після внутрішньочеревинного його введення) в пухлинах та тканинах організму з пухлиною (саркома 180 та карцинома Льюїс) методом флуориметрії в гомогенатах цих тканин встановлено, що флуоресценція, індукована присутністю кон'югату, спостерігається в пухлинах та органах (шкіра, печінка, нирки) мишей через добу після його ін'єкції. Між тим, найбільш інтенсивна флуоресценція відмічена в пухлинах, що вказує на високий рівень селективності акумуляції кон'югату саме в пухлинній тканині (табл. 1). Через добу після введення вихідного гематопорфірину, його максимальна флуоресценція спостерігається в шкірі та печінці, однак її рівень нижчий рівня флуоресценції кон'югованого сенсибілізатора, що свідчить про більш високий рівень акумуляції саме кон'югованого гематопорфірину. При досліджені залежності флуоресценції кон'югованого гематопорфірину у сироватці крові тварин від терміну ін'єкції виявили, що максимальний рівень флуоресценції кон'югованого гематопорфірину спостерігається вже через 4 год. після його ін'єкції (рис. 4).

Таблиця 1 Накопичення кон'югату та вихідного гематопорфірину (в.о./г) у тканинах та пухлинах мишей із саркомою 180 та карциномою Льюїс

тканина	Саркома 180	Карцинома Льюїс
	Вихідний гематопорфірин	Кон'югат	Вихідний гематопорфірин	Кон'югат
Шкіра	160,0±12,5	503,0±85,0*	170,8±10,8	467,1±80,0*
Печінка	101,0±2,5	165,0±21,0*	119,8±2,8	165,5±13,0*
Нирки	73,0±2,4	589,0±27,0*	68,5±1,3	770,4±70,3*
Пухлина	42,3±10,1	1120,1±109,2*	35,8±0,9	1590,5±340,5*

Примітка. * - P < 0,05.

В наступних експериментах проводили дослідження протипухлинної активності кон'югату в порівнянні з вихідним фотосенсибілізатором у мишей з перещепленими пухлинами.

Виявлено, що в групі тварин з вихідним штамом карциноми Льюїс (LLC), яким проводили ФДТ з кон'югатом, на 7 добу спостережень показник гальмування росту пухлин становив 61 % на відміну від групи тварин, яким проводили ФДТ з гематопорфірином, де такий показник складав лише 38 %.



Рис. 4. Зміна інтенсивності флуоресценції кон'югату у сироватці крові мишей в різні терміни після введення

Важливо було дослідити також вплив ФДТ з кон'югатом на тривалість життя тварин-пухлиноносіїв. В досліді вивчалась виживаність мишей з вихідною карциномою Льюїс (лінія LLC). Миші, яким проводили фотодинамічну терапію з кон'югатом, склали першу групу, з вихідним гематопорфірином - другу групу, третьою групою, контрольною, слугували миші з пухлинами, яким не вводили сенсибілізатор та не проводили сеанс ФДТ. Тварин спостерігали протягом трьох тижнів після ФДТ - до загибелі останньої тварини в контрольній групі. Динаміка виживаності в групах показана на рисунку (рис. 5).



* - Р < 0,05 (в порівнянні з контрольною групою тварин)

Рис. 5. Виживаність мишей з карциномою Льюїс (LLC) після проведення ФДТ

Видно, що до другого тижня після фотодинамічної терапії виживаність тварин в усіх групах залишається приблизно на одному рівні. На третьому тижні після лікування, всі миші контрольної групи та групи, що отримувала гематопорфірин, загинули. Виживаність в групі з кон'югатом становила 40 % на третій тиждень після проведення ФДТ.

В зв'язку з цим виникла необхідність подальшого вивчення протипухлинної фотодинамічної активності кон'югованого фотосенсибілізатора на інших моделях пухлинного росту. В результаті проведених досліджень було показано, що висока протипухлинна активність кон'югату в порівнянні з гематопорфірином (гальмування росту пухлини до 63 %) відмічається і у мишей з варіантом карциноми Льюїс LLC/R9. При дослідженні протипухлинної дії кон'югату у тварин із саркомою 180 гальмування росту пухлин на 12 добу після проведення ФДТ становило 60 % за тих же доз кон'югату та опромінення (рис.6). Отже, висока протипухлинна активність кон'югату була підтверджена крім вихідного штаму карциноми Льюїс на іншому її варіанті - LLC/R9 та саркомі 180. Крім того, кон'югат виявився більш ефективним протипухлинним агентом у порівнянні з нативним гематопорфірином при застосуванні ФДТ. Наступним етапом було вивчення протипухлинної дії кон'югату у тварин з меланомою В16. Ми намагалися з'ясувати, чи здатний кон'югований гематопорфірин підвищити ефективність терапії тварин з меланомою В16 при тому ж режимі, при якому спостерігається протипухлинний і антиметастатичний ефект у тварин з карциномою Льюїс. Проте, протипухлинний ефект кон'югату при меланомі В16 був значно гірший в порівнянні з тваринами з карциномою Льюїс та саркомою 180 (рис. 6).

Рис. 6. Гальмування росту пухлин під дією ФДТ із застосуванням гематопорфірину та його кон'югату

Задачею наступних дослідів було вивчення дії кон'югату в порівнянні з вихідним фотосенсибілізатором на виникнення метастазів на моделі карциноми Льюїс LLC. Виявилося, що кон'югований гематопорфірин в порівнянні з нативним на 28 добу після проведення ФДТ призводить до зменшення у тварин з пухлинами карциноми Льюїс LLC як загальної кількості метастазів (в 2,5 рази), так і об'єму метастатичного ураження (в 4 рази).

Важливою ланкою подальших досліджень було експериментальне обґрунтування ефективності хронобіологічно-орієнтованих підходів до ФДТ пухлин з використанням кон'югату. Згідно даних літератури, де засвідчується ритмічний характер секреції пухлинами VEGF протягом доби (Rak J. et al., 1995), теоретично відкривається можливість підвищити ефективність фотосенсибілізації пухлин за рахунок введення в організм судинотропних сенсибілізаторів у період підвищеної концентрації VEGF у пухлинній тканині.

Для експериментального підтвердження цього припущення проводили визначення добових коливань вмісту VEGF в пухлинах та сироватці крові мишей з карциномою Льюїс та саркомою 180. Показано, що протягом доби спостерігаються коливання продукції ангіогенного фактору. Найвищий вміст фактора в сироватці крові тварин з пухлинами та в самих пухлинах виявлено в середині світлової фази доби, а найнижчий його показник - в середині нічної половини доби (рис.7).

А



В

Рис. 7. Добові коливання вмісту VEGF в сироватці крові тварин з пухлинами (А) та в пухлинах (В)

Крім цього, нами було проведено визначення рівня акумульованого в різні часові точки доби кон'югованого та вихідного сенсибілізатора в сироватці крові та пухлинній тканині мишей з карциномою Льюїс та саркомою 180. Вищий рівень накопичення кон'югату (на 35-40 %) порівняно з накопиченням вихідного гематопорфірину було відмічено в пухлині та сироватці крові тварин з карциномою Льюїс в години доби з максимальною продукцією VEGF (о 14.00 год. доби) на відміну від накопичення вихідного гематопорфірину. Така ж направленість в акумуляції сенсибілізатора спостерігається в пухлині та сироватці крові тварин з іншою пухлиною - саркомою 180.

Враховуючи дані стосовно добових коливань вмісту VEGF та накопичення кон'югату в пухлинах мишей (карцинома Льюїс та саркома 180), було проведено ритмоорієнтовану ФДТ мишей з цими пухлинами. На рис. 8 наведені результати ФДТ на прикладі тварин із саркомою 180. Пухлини, які опромінювались в час доби з максимальним синтезом VEGF (о 14⁰⁰), мали на 12 добу (по завершенні експерименту) меншу масу, ніж пухлини, які опромінювались о 2⁰⁰, коли синтез фактору був зниженим. В групі мишей, що опромінювались о 14⁰⁰, гальмування росту пухлин порівняно з контролем склало 60,4 %, а в групі тварин, що опромінювались вночі, цей показник склав 45 %. Таким чином, гальмування росту пухлин у мишей, яким проводили ФДТ в час доби з максимальним синтезом VEGF, достовірно перевищило гальмування росту пухлин у мишей, яким проводили ФДТ, коли продукція фактору була зниженою. Аналогічний ефект спостерігався і при проведенні ритмоорієнтованої ФДТ мишей з карциномою Льюїс.

* - Р < 0,05 (у порівнянні з тваринами, які опромінювали у 2⁰⁰)

Рис. 8. Ритмоорієнтована фотодинамічна терапія саркоми 180 із застосуванням кон`югованого гематопорфірину

ВИСНОВКИ

Експериментальними дослідженнями в порівнянні з вихідним гематопорфірином доведена ефективність фотодинамічної терапії пухлин при використанні судинотропного фотосенсибілізатора - кон'югату гематопорфірину з антитілами до фактора росту ендотеліальних клітин (VEGF).

1. Отримано активний фотосенсибілізуючий агент - кон'югат гематопорфірину з антитілами до VEGF, досліджено його спектри поглинання в діапазоні хвиль 190-690 нм, фототоксичність та специфічну активність в реакції антиген-антитіло.

2. При визначенні фотоцитотоксичності отриманого імунокон'югату встановлено, що еквівалентні концентрації кон'югату і вихідного фотосенсибілізатора-гематопорфірина є рівноактивними. Отриманий кон'югат зберігає фізичні та біологічні властивості, притаманні окремо білковому компоненту кон'югату - антитілам і хромофорній частині - гематопорфірину. Встановлено, що кон'югат проявляє вищу селективність до пухлин в порівнянні з нормальними тканинами та значно більше накопичується в пухлинній тканині по відношенню до нативного гематопорфірину.

3. Виявлено, що в хоріон-алантоїсних мембранах курячих ембріонів в період інтенсивного формування кровоносних судин (6-й день розвитку ембріонів), накопичувалося в 3,6 рази більше кон'югату в порівнянні з накопиченням вихідного гематопорфірину, що дає підстави для твердження про судинотропні властивості кон'югату.

4. Під дією ФДТ з використанням створеного кон'югату спостерігається підвищений рівень фактору v. Willebrand в сироватці крові тварин з пухлинами за рахунок його виходу у кров'яне русло в результаті руйнації ендотеліальних клітин судин пухлин.

5. Встановлено, що гальмування росту перещеплених пухлин (карцинома Льюїс, саркома 180 та меланома В16) є вищим при використанні кон'югованого гематопорфірину в порівнянні з вихідним фотосенсибілізатором (23 %, 22 % та 24 % відповідно). Виживаність тварин з карциномою Льюїс та саркомою 180, яким проводили ФДТ із застосуванням кон'югату дорівнює 40 % по відношенню до групи тварин, які отримували вихідний гематопорфірин. ФДТ з кон'югованим гематопорфірином тварин з карциномою Льюїс призводить до зменшення як загальної кількості метастазів (в 2,5 рази), так і об'єму метастатичного ураження

6. (в 4 рази).

7. Виявлено, що проведення ФДТ із використанням кон'югату тваринам з карциномою Льюїс та саркомою 180 о 14⁰⁰ (за умов найвищого вмісту VEGF в сироватці крові) призводить до більшого гальмування росту пухлин у порівнянні з групою тварин, яких опромінювали в час доби із зниженим вмістом VEGF в сироватці крові (о 2⁰⁰ доби)

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мамчур А. А Фотоактивні біокон'югати для цілеспрямованої фотодинамічної терапії пухлин / А. А. Мамчур, І. О Лісняк, Н. Л. Новиченко // Онкология. - 2008. - Т. 10, № 2. - С. 206-212. (Особистий внесок дисертанта: проведений аналіз літературних джерел, підготовлено матеріал до друку).

2. Study of photodynamic efficiency of the hematoporphyrin conjugated with antibody to VEGF in mouse Lewis carcinoma / N. L. Novichenko, A. A. Mamchur, I. O. Lisniak, M. F. Gamaliya // Experimental Oncology. - 2008. - Vol. 30, № 4. - Р. 315-318. (Особистий внесок дисертанта: проведені досліди на тваринах по визначенню ефективності ФДТ із застосуванням кон'югованого з антитілами проти фактору росту ендотеліальних клітин, статистична обробка результатів)

3. Фактор v. Willebrand у сироватці крові як показник руйнування судин пухлини під впливом цілеспрямованої антиангіогенної фотодинамічної терапії / І. О. Лісняк, А. С. Тимченко, А. А. Мамчур, Н. Л. Новиченко, М. Ф. Гамалія // Гематологія та переливання крові : зб. - 2008. - № 34. - С. 259-263. (Особистий внесок дисертанта: проведені роботи по перещепленню пухлин експериментальним тваринам, отриманню сироватки крові, підготовлено матеріал до друку).

...