Іммобілізація протеолітичних ферментів і білків на полімерних носіях

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ І.І. МЕЧНИКОВА

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ІММОБІЛІЗАЦІЯ ПРОТЕОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ ТА БІЛКІВ НА ПОЛІМЕРНИХ НОСІЯХ

ДЕКІНА СВІТЛАНА СЕРГІЇВНА

УДК 547.56:577.151.4:577.152.1

03.00.20 - біотехнологія

Одеса - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Фізико-хімічному інституті імені О.В. Богатського НАН України

Науковий керівник:

кандидат хімічних наук, доцент

Романовська Ірина Ігорівна,

Фізико-хімічний інститут

імені О.В. Богатського НАН України,

завідувач лабораторії фізико-хімічних

основ біотехнології відділу медичної хімії

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, чл.-кор. УААН, професор Левицький Анатолій Павлович,

Державна установа

«Інститут стоматології АМН України»,

заступник директора з наукової роботи

доктор біологічних наук, професор,

Варбанець Людмила Дмитріївна,

завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

Інституту мікробіології та вірусології

імені Д.К. Заболотного НАН України

Захист відбудеться «19» лютого 2010 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.051.06 Одеського національного університету імені І.І. Мечникова за адресою: 65058, м. Одеса, пров. Шампанський, 2 (біологічний факультет), ауд. 27.

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Одеського національного університету імені І.І. Мечникова за адресою: 65082, м. Одеса, вул. Преображенська, 24.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 41.051.06 доктор біологічних наук, професор Т.О. Філіпова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

гідроліз казеїн очний лікарський

Актуальність теми. Фундаментальні дослідження в області біотехнології дозволяють отримувати нові перспективні препарати на основі іммобілізованих гідролітичних ферментів і білків. Іммобілізація біологічно-активних речовин (БАР) на полімерних носіях приводить до створення стабільних активних препаратів пролонгованої дії з контрольованим вивільненням, направленим вектором всмоктування для використання в різних областях медицини, у тому числі для терапії ран і опіків [Романовська І.І., 2009].

Згідно концепції репараційних процесів, протеолітичні ферменти виконують провідну роль на різних стадіях загоєння рани, у зв'язку з чим з їх використанням створюються біотехнологічні покриття різного типу (сорбуючі, з низькою адгезивністю, ізолюючі і ін.).

У сучасних перев'язувальних засобах нового покоління для закріплення ферментів широко використовуються полімерні носії, які повинні відповідати спільним вимогам: економічності, відсутності токсичності, можливості модифікації [Шаповалов С.Г., 2005]. З відомих методів іммобілізації найбільш перспективними в цьому напрямку є методи невалентного зв'язування ферменту з носієм і включення в гелі, відповідно до сучасних вимог оптимального часу перебування пов'язки на рані [Юданова Т.М. та ін., 2006]. Переваги іммобілізованих форм ферментів і білків над вільними відомі, найбільш суттєві з них - стабілізація, зниження імунологічних і алергічних реакцій організму за рахунок послаблення здатності стимулювати утворення антитіл і реагувати з ними.

У зв'язку з цим проблема розробки полімерних плівкових форм іммобілізованих білків, ферментів з використанням нових або недостатньо вивчених полімерних носіїв є актуальною, представляючи не лише практичний, але і теоретичний інтерес, доповнюючи знання про властивості матриць, продукти і характер взаємодії БАР-матриця, фізико-хімічні і медико-біологічні особливості їх функціонування як потенційних лікарських засобів.

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт в лабораторії фізико-хімічних основ біотехнології відділу медичної хімії Фізико-хімічного інституту імені О.В. Богатського НАН України за темою: ”Дослідження фізико-хімічних особливостей іммобілізованих білків, ферментів, алергенів в полімерні плівкові матеріали і їх медико-біологічних особливостей як нових потенційних лікарських і діагностичних засобів” (2005 - 2007 рр. № держ. реєстрації 0105U002632).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - дослідити процеси іммобілізації білків, папаїну і інших протеолітичних ферментів на полімерних носіях, фізико-хімічні властивості отриманих препаратів і сфери їх застосування.

Відповідно до поставленої мети основними завданнями роботи були наступні:

1. розробка способів іммобілізації в полівініловий спирт (ПВС) білків (сироватковий альбумін людини (САЛ), бичачий сироватковий альбумін (БСА), овальбумін (ОА)), що дозволяють отримувати стабільні препарати у формі плівок пролонгованої дії;

2. дослідження кінетики реакції гідролізу казеїну вільними протеолітичними ферментами рослинного, тваринного і мікробного походження;

3. розробка очних лікарських плівок (ОЛП) з іммобілізованими папаїном і сечовиною;

4. розробка методів іммобілізації лужної протеази, трипсину, протеази С в полі-N-вінілпіролідон (ПВП), модифікований золем полікремнієвої кислоти, і природний біогель «Ламідан» для створення полімерних і текстильних покриттів з високою протеолітичною активністю пролонгованої дії;

5. дослідження фізико-хімічних властивостей отриманих іммобілізованих препаратів (рН- і термооптимум, рН- і термостабільність, кінетичні параметри, стабільність при зберіганні);

6. вивчення застосування розроблених препаратів як потенційних засобів для комплексної терапії опіків очей; дослідження токсичності ОЛП з папаїном і сечовиною, складання лабораторного регламенту, проектів аналітичної нормативної документації.

Об'єкт дослідження - створення іммобілізованих на полімерній основі біологічно активних сполук та з'ясування їх фізико-хімічних і біологічних властивостей.

Предмет дослідження - створення біологічно активних полімерних матеріалів пролонгованої дії на основі полівінілового спирту, полі-N-вінілпіролідону і ламідану з іммобілізованими ферментами та іншими білками.

Методи дослідження - УФ-, ІЧ-спектроскопія, електрофорез в поліакриламідному гелі (ПААГ), віскозиметрія, комп'ютерний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів. Розроблені підходи до вивчення поведінки білкових макромолекул в розчинах полімерів фізико-хімічними методами (УФ-спектроскопія, метод молярних відношень, дослідження реологічних властивостей), які дозволили сформулювати уявлення про формування білкових асоціатів з полімерами при іммобілізації. Виявлені шляхи регулювання складу, активності і стабільності комплексів протеолітичних ферментів з нерозчинними і розчинними полімерними матеріалами за рахунок міжмолекулярних невалентних взаємодій і механічного включення.

Вперше показано субстратне інгібування реакції гідролізу казеїну папаїном, лужною протеазою, трипсином при визначенні протеолітичної активності ферментів.

Вперше розроблені принципи сумісного включення папаїну і сечовини, САЛ в ПВС, використання яких дозволяє отримувати полімерні покриття для використання в комплексній опіковій терапії очей з прогнозованим рівнем комбінованої біологічної дії.

Вперше розроблений метод іммобілізації лужної протеази і трипсину у модифікований золем полікремнієвої кислоти ПВП, який дозволяє отримувати ранові гідрогелеві покриття, що добре моделюються на рані, розм'якшують і лізують некротичні утворення, запобігають розвитку інфекції на поверхні рани; створюють на рані вологе середовище, оптимальне для нормального розвитку процесів регенерації.

Вперше вивчено фракційно-білковий склад ферментного препарату протеази С (продуцент Acremonium chrysogenum, штам 291-1, рН-оптимум 8,0, термооптимум 50ос, протеолітична активність 495 од/г), що випускається Ладижинським заводом ферментних препаратів. Визначені молекулярні маси основних білків.

Виявлена радіопротекторна дія полімеру-носія відносно іммобілізованого ферменту, показано дозозалежний вплив стерилізації г-опроміненням на протеолітичну активність ферментів.

Практичне значення одержаних результатів. Модифіковано метод визначення протеолітичної активності протеаз рослинного, мікробного і тваринного походження за казеїном шляхом виключення їх інгібування субстратом, що дозволяє збільшити точність методу і підвищити його економічність, знизивши концентрацію субстрату.

Отримані полівінілспиртові ОЛП з іммобілізованим САЛ, а також папаїном і сечовиною для швидкої і ефективної сорбційної терапії опіків очей, з подальшою ферментативною обробкою некротичних утворень. Розроблені наукові і технологічні основи створення таких плівок. Медико-біологічні дослідження розроблених ОЛП на моделях тяжких лужних опіків рогівки очей кролів показали швидкий некролітичний ефект локального характеру без ушкодження здорової тканини, що дозволяє проводити невідкладну кератопластику. Досліджено гостру токсичність ОЛП з папаїном і сечовиною, показано відсутність місцевоподразнюючої, сенсибілізуючої і токсичної дії отриманого препарату. Розроблений і представлений лабораторний регламент і проект аналітичної і нормативної документації на препарат.

Вперше отримані ранові водонерозчинні гідрогелеві покриття на основі модифікованого золем полікремнієвої кислоти ПВП з іммобілізованими лужною протеазою і трипсином для потенційного використання їх в рановій терапії. На препарат складено проект аналітичної і нормативної документації.

На основі унікального природного матеріалу з бурих морських водоростей «Ламідан» отримані ранові текстильні покриття з іммобілізованою протеазою С, пролонгованої протеолітичної, сорбційної, ранозагоючої дії.

Особистий внесок автора полягає в отриманні іммобілізованих форм БАР, проведенні спектрофотометричних, реологічних, кінетичних досліджень, аналізі спектральних даних, обробці і узагальненні отриманих результатів. Постановка завдань, аналіз, обговорення результатів досліджень і висновків на їх основі проведені спільно з керівником, зав. лаб. фізико-хімічних основ біотехнології, к.х.н., доц. Романовською І.І. Електрофоретичні дослідження проведені на кафедрі генетики біологічного факультету ОНУ імені І.І. Мечникова під керівництвом к.б.н., доц. Топтікова в.А. Медико-біологічні дослідження іммобілізованих препаратів проведені в Інституті очних хвороб і тканинної терапії імені В.П. Філатова під керівництвом к.м.н., с.н.с. Чаланової р.І. Дослідження гострої токсичності ОЛП з папаїном і сечовиною проведені в Інституті очних хвороб і тканинної терапії імені В.П. Філатова під керівництвом зав. лаб. фармакології і тканинної терапії, д. м. н., проф. Сотникової О.П.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених «Вчені майбутнього», (Одеса, Україна, 2005); VIII Конференції молодих учених та студентів-хіміків Південного регіону України (Одеса, Україна, 2005); I, II та III Всеукраїнській конференції студентів, аспірантів та молодих вчених з хімії та хімічної технології (Київ, Україна, 2005, 2006, 2007); Международной научно-практической конференции «Наука и образование - 2006» (Мурманск, РФ, 2006); Международной научной конференции “Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Минск, Беларусь, 2006); III Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием “Биотехнология. Образование. Наука. Практика” (Харьков, Украина, 2006); III International Young Scientists conference “Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution” (Odessa, Ukraine, 2007); The young scientists' and students' international scientific conference “Modern problems of microbiology and biotechnology (Odessa, Ukraine, 2007); Московском международном конгрессе «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» (Москва, РФ, 2007); Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov (Kyiv, Ukraine, 2007), X коференції молодих учених та студентів-хіміків Південного регіону України (Одеса, Україна, 2007), XII з'їзді Товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського (Ужгород, Україна, 2009), 3rd Ukranian-Polish Weigl Conference «Microbiology on Service for Human» (Odessa, Ukraine, 2009)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 наукових статей, 5 патентів і тези 16 доповідей на міжнародних і українських наукових конференціях.

Структура і об'єм дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури (розділ 1), матеріалів і методів експерименту (розділ 2), результатів і їх обговорення (розділи 3, 4), висновків, списку цитованої літератури (216 джерел) і додатків. Робота викладена на 164 сторінках комп'ютерного тексту, містить 55 рисунків і 28 таблиць.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. У роботі використовували БСА, ОА («Sigma»), САЛ (ДП «Біофарма»), лужну протеазу, протеазу С (ДП «Ензим»), папаїн («Merck»), трипсин, полівініловий спирт («Хімреактив»), альгінат натрію (ДП Одеського центру ЮГНІРО), ламідан з Laminaria japonica Aresch (ТОВ “Ламідан”). ПВП був люб'язно наданий с.н.с. Московської державної академії тонкої хімічної технології імені М.В. Ломоносова к.х.н. Пашкіним І.І.

Визначення білка в препаратах проводили методом Лоурі-Хартрі [Hartree E.E., 1972], Брадфорда [Bradford M., 1976] і методом прямої спектрофотометрії [Асатіані В.С., 1965]. Протеолітичну активність вільних і іммобілізованних ферментів визначали методом Ансона [Полигаліна Г.В. та ін., 2003]. Концентрацію сечовини визначали методом Мішона і Арно [Асатіані В.С., 1965]. Визначення фракційно-білкового складу препарату протеази С проводили на апараті Helicon (Росія) в системі Леммлі методом електрофорезу в 15 % ПААГ [Духін С.С. та ін., 1976]. Аналіз отриманих матриць, типу їх взаємодії з препаратами білкової природи проводили методами ІЧ-спектроскопії, УФ-спектрофотометрії, віскозиметрії. Експериментальні дані оброблені методами варіаційної статистики. Кількість експериментів в серіях дослідження становила 7-10. Коефіцієнти кореляції лінійних анаморфоз досліджуваних залежностей перевищували 98 %.

Результати досліджень і їх обговорення. Враховуючи унікальні властивості альбуміну вибірково зв'язувати низькомолекулярні сполуки і створювати неспецифічні комплекси з полімерними носіями [Топчієва І.М. та ін., 1998], представляло інтерес вивчення утворення їх адуктів з ПВС. Об'єктами дослідження були БСА, ОА, САЛ.

Зменшення кінематичної в'язкості вивчених розчинів полімеру з білками свідчить про компактизацію білкової молекули через утворення асоціату з ПВС.

Методом молярних відношень визначили критичні молярні відношення білок: ПВС, нижче яких іммобілізація відбувається шляхом механічного включення (рис. 1). Даний підхід виявив утворення кон'югатів білок-ПВС і певну закономірність - іммобілізація білків проходить через стадію насичення полімеру з подальшим механічним включенням.

На основі ПВС отримані плівкові форми білків з їх кількісним вмістом. Детальніше досліджували плівки з САЛ як перспективні для комплексного підходу в терапії опіків рогівки очей.

Опіки очей є медико-соціальною проблемою і супроводжуються ураженням рогівки, повік, кон'юнктиви різного ступеня тяжкості. У зв'язку з цим розроблений комплексний підхід в їх лікуванні за допомогою ОЛП, що полягає у застосуванні сорбційної терапії з подальшою ферментативною обробкою. Для сорбційної терапії розробили ОЛП з іммобілізованим САЛ, враховуючи його дезінтоксикаційні властивості.

В результаті іммобілізації отримані ОЛП пролонгованої дії з кількісним включенням білка при мольних відношеннях білок: матриця 1:4 - 1:11, стабільні при зберіганні. Сорбційні властивості ОЛП по відношенню до кислот і лугів вивчали, визначаючи статичну обмінну ємність (СОЄ). Значна частина речовин поглиналася в перші хвилини контакту (рис. 2, 3).

Медико-біологічні дослідження проводилися на модельованих тяжких лужних опіках рогівки очей 15 кролів породи Шиншила. У контрольній групі застосовували антибактеріальну терапію, в експериментальних - розчини і ОЛП з САЛ, одночасно з антибактеріальною терапією. У дослідних групах ознаки запалення були відсутні після 4 діб лікування, що в 1,5 рази швидше, ніж в контрольних, при цьому ОЛП з САЛ давали аналогічну розчину білка дію в концентрації САЛ, в 100 разів менше.

Враховуючи дані літератури про різний ступінь точності існуючих методів лінеаризації рівняння Міхаеліса-Ментен, провели аналіз кінетики початкових швидкостей реакції гідролізу казеїну трипсином найбільш поширеними методами: графічними - Лайнуївера-Берка, Хейнса і розрахунковим - Корніш-Боуден-Ейзенталя. Показано, що вживання всіх трьох методів виправдано, значення Км і Vмакс близькі, однак метод Корніш-Боуден-Ейзенталя дозволяє оцінити достовірність отриманих результатів. Методом Хейнса визначені кінетичні параметри реакції гідролізу казеїну папаїном і лужною протеазою.

Значний інтерес викликає спостережуване субстратне інгібування реакції, що істотно впливає на визначаєму активність досліджуваних ферментів різної структури і походження. Методом Діксона визначені константи інгібування протеаз, оптимальні концентрації субстрату (табл. 1).

Т.ч., для точнішого визначення протеолітичної активності вивчених протеаз доцільне використання менших концентрацій казеїну (0,35-0,9 %), за яких субстратне інгібування не чинитиме істотного впливу.

Для ферментативної обробки опіків очей розроблені ОЛП з папаїном і сечовиною. Папаїн - препарат вибору в офтальмології внаслідок специфічності, відсутності алергізуючої дії, економічності, ефективність дії якого підвищується при додаванні сечовини. Сечовина, маючи додаткову денатуруючу дію, призводить до розриву водневих зв'язків білка, дезагрегації білків струпа, що забезпечує більшу доступність пептидних зв'язків для папаїну. Використання в офтальмології розчинів папаїну і сечовини супроводжується швидкою інактивацією ферменту, різкою болісною дією, подразненням, складністю дозування препарату, що викликає необхідність його іммобілізації.

При сумісній іммобілізації папаїну і сечовини в ПВС фермент утворює комплекс з носієм і зберігає високу активність в межах молярних відношень 1:5,4 - 1:38,3, а сечовина механічно включається в структуру полімеру, що підтверджується даними віскозиметрії, УФ-спектроскопії.

В результаті іммобілізації були отримані ОЛП пролонгованої дії.

Дослідження властивостей іммобілізованого препарату, порівняно з вільним, показало його стабілізацію в області кислих і лужних значень рН (3,5-9,5), розширення термооптимуму (15-70 оС), обумовлені стеричними обмеженнями ферменту матрицею (рис. 4, 5).

Розширення термооптимуму іммобілізованої форми поряд зі зниженням констант термоїнактівації, свідчить про підвищення термостабільності іммобілізованого папаїну.

Вивчення кінетичних особливостей гідролізу казеїну іммобілізованим папаїном показало зменшення Км і Vмакс, що обумовлено створенням локальної концентрації ферменту в матриці і наявністю дифузійних обмежень.

Як і в разі вільного ферменту, спостерігали інгібування субстратом. Константи інгібування і оптимальні концентрації субстрату представлені в таблиці 2.

Досліджено активацію папаїну дитіотреїтолом, аскорбіновою кислотою, сумішшю L-цистеїну і динатрієвої солі етилендіамінтетраоцтової кислоти (Na-ЕДТА). Максимальне збільшення активності спостерігалося при використанні останньої суміші активаторів, що дозволяє підвищити активність вільного і іммобілізованого ферменту в 4,3 і 10,6 разів, відповідно, і використовувати значно менші дозування папаїну (рис. 6).

Медико-біологічні дослідження показали, що використання ОЛП на моделях лужних опіків рогівки очей кролів приводить до повного площинного відторгнення щільної, некротично зміненої ділянки рогівки через 45 хв дії, дозволяючи проводити невідкладну кератопластику (рис. 7, 8).

Вивчено гостру токсичність ОЛП, показано офтальмонешкідливість препарату. Складені лабораторний регламент, що містить технологічну схему отримання іммобілізованого папаїну (рис. 9) і проект АНД.

Відомо, що ранові покриття третього покоління представлені гідрогелевими полімерними матеріалами [Юданова Т.М. та ін., 2006]. Перспективним носієм для створення таких матеріалів є ПВП. Внаслідок модифікації ПВП золем полікремнієвої кислоти отримано полімерний гідрогелевий матеріал - органо-неорганічний гібрид - продукт об'єднання кремнійвмісної речовини і водорозчинного синтетичного полімеру в цілісну структуру.

Модифікація носія здійснюється шляхом утворення водневих зв'язків між киснем карбонільних груп ПВП і воднем силанольних груп золю діоксиду кремнію.

Створений матеріал еластичний, нетоксичний, біосумісний, має пористість, паропроникність, нерозчинний у фізіологічних умовах.

В результаті іммобілізації лужної протеази і трипсину в модифікований ПВП отримані гідрогелеві полімерні покриття з 75-100 % збереженням протеолітичної активності (65 і 163 од/г, відповідно), стійкі до г-стерилізації, стабільні при зберіганні протягом року.

Вивчення реологічних властивостей полімеру показало значне зростання в'язкості розчинів ПВП у присутності золю полікремнієвої кислоти і трипсину, що свідчить про наявність взаємодії матриці і ферменту (рис. 10).

Отримані матеріали пролонгованої протеолітичної дії (протягом 1 доби).

При вивченні впливу рН середовища відмічено розширення рН-профілю активності для іммобілізованого трипсину в область кислих значень на 3-4 од., і його деформація для іммобілізованої лужної протеази (рН-оптимум зміщений на 2,5-3 од. в область кислих значень), обумовленого впливом лужного рН середовища носія (рис. 11). Іммобілізовані препарати стабільні при рН 5,5, що дозволяє їх застосовувати в умовах ранового вмісту.

Температурний оптимум іммобілізованої лужної протеази залишається незмінним і становить 37 оС; трипсину - розширюється з 37 оС до 30-50 оС, що можна пояснити стабілізуючим ефектом полімерної матриці, яка утруднює теплові конформаційні переходи білкової молекули (рис. 12).

Іммобілізація ферментів в модифікований ПВП приводить до підвищення їх термостабільності, про це свідчать константи термоінактивації, що становлять 2,76•10-2 хв-1 і 8,47•10-4 хв-1 для вільної і іммобілізованої лужної протеази; 0,75 хв-1 і 0,41 хв-1 для вільного і іммобілізованого трипсину, відповідно.

Досліджуючи кінетичну криву початкових швидкостей гідролізу казеїну іммобілізованими ферментами, обчислили кінетичні параметри реакції, приведені в табл. 3. Методом Діксона обчислені константи інгібування протеаз, оптимальні концентрації субстрату.

Складено проект АНД на іммобілізовану лужну протеазу.

Текстильні ранові покриття залишаються найбільш широко використовуваним перев'язувальним матеріалом [Олтаржевська Н.Д. та ін., 2002]. Перспективним природним носієм для створення таких є природний екстракт-біогель ламідан з ламінарії японської (Laminaria japonica Aresch), його основою на 35 % є альгінат натрію. Крім того, препарат містить вітаміни, ліпіди, має високу здатність регенерувати пошкоджені шкірні покриви, прискорювати відновлення тканин, що піддалися опіку різного ступеня тяжкості і етіології. Іммобілізацією протеолітичного ферменту в такий носій можна отримати перспективний матеріал для терапії гнійних ран і опіків.

Нами вивчено можливість іммобілізації ряду протеаз, що застосовуються в лікуванні ран і опіків в медицині (табл. 4). Проте лише протеаза С (Acremonium chrysogenum, штам 291-1) практично повністю зберігала свою протеолітичну активність. Така втрата активності після іммобілізації у протеаз може бути пояснена інактивуючою дією ламідану, внаслідок наявності великої іонної сили гелю.

Висока активність ферменту зберігається в широкому діапазоні масових співвідношень, що дозволяє варіювати вміст протеази в препараті. Значне зменшення в'язкості полімеру при додаванні до нього ферменту може свідчити про утворення білкового асоціату альгінат-білок і компактизації молекул за рахунок іонних взаємодій.

Вивчено фракційно-білковий склад ферментного препарату методом SDS-електрофорезу в 15 % ПААГ. У спектрі протеази ідентифіковано 13 білкових фракцій в діапазоні молекулярних мас від < 10 до 43 кДа (рис. 13). Молекулярні маси основних білків: 10 - 16 кДа (? 50 %), 18 - 20 кДа (? 20 % всіх білків) і 24 - 43 кДа (? 30 % білків). З результатів нативного електрофорезу випливає, що 65 % всього білка має протеолітичну активність (рис. 14). Найбільш висока активність відмічена для фракції, що становить 2,36 % всього білка. Препарат протеази С містить активні білки як кислого, так і основного характеру.

Іммобілізований препарат протеази С закріпили на тканинній основі і отримали текстильні покриття з протеолітичною активністю 475 од/г, стабільні при зберіганні протягом 1,5 років.

Іммобілізована протеаза С - препарат пролонгованої дії, в основі якого лежать процеси набрякання і розчинення полімеру (I), десорбція його і ферменту (II) і масоперенос протеази в зовнішнє середовище (рану) (III) (рис. 15).

Вивчення залежності протеолітичної активності від рН середовища показало, що в процесі іммобілізації не порушений природний діапазон функціонування ферменту, рН-стабільність іммобілізованої протеази С значно вище (при рН 5,5 і 37 оС): через 2 год інкубації активність іммобілізованої протеази становить 60 %, а вільний фермент в даних умовах практично не функціонує.

Істотних змін термопрофілю активності не відмічено, однак при порівнянні констант термоінактивації протеази С встановлено, що іммобілізований фермент стійкіший до дії високих температур, ніж його вільна форма.

Таким чином, на основі ламідану отримані текстильні покриття з іммобілізованою протеазою С, з високим ступенем збереження протеолітичної активності, пролонгованої дії, тривалого терміну зберігання для потенційного вживання в рановій і опіковій терапії.

ВИСНОВКИ

На основі теоретичних і експериментальних досліджень розроблені методи іммобілізації білків, папаїну і інших протеолітичних ферментів на полімерних носіях природного і синтетичного походження, вивчені фізико-хімічні особливості функціонування отриманих препаратів, перспективних для терапії ран і опіків.

1. Шляхом іммобілізації альбумінів в ПВС отримані їх плівкові форми пролонгованої дії з кількісним ступенем включення, стабільні при зберіганні (8 міс. - 1 рік). Зміна значень в'язкості розчинів носія і білків, вивчення комплексоутворення свідчать про наявність асоціатів білок: носій при мольних відношеннях БСА: ПВС, ОА: ПВС, САЛ: ПВС відповідно 1: 2,5; 1: 3,1; 1: 4; їх зменшення призводить до механічного включення білків в полімер. Показано, що ОЛП з САЛ при концентрації білка в 100 разів нижче за таку в розчині, мають високу поглинаючу здатність до кислот і лугів, що перспективно для сорбційної терапії опіків очей.

2. Дослідження кінетики гідролізу казеїну протеазами рослинного, тваринного і мікробного походження показало істотне (50 %-ве) субстратне інгібування протеолітичної активності папаїну, трипсину і лужної протеази, що дозволяє рекомендувати для точнішого визначення казеїнолітічної активності використання 0,35 - 0,9 % розчину субстрату.

3. Розроблені умови сумісної іммобілізації папаїну і сечовини в ПВС, що сприяють отриманню ОЛП зі збільшеною в 1,2 рази протеолітичною активністю (389 од/г), пролонгованої дії, стабільністю при г-стерилізації і зберіганні протягом 1 року. Встановлено, що іммобілізація папаїну відбувається за рахунок невалентних взаємодій з ПВС, сечовини - шляхом механічного включення. Проведені медико-біологічні випробування ОЛП з папаїном і сечовиною показали перспективність їх використання в опіковій терапії очей.

4. На основі модифікованого золем полікремнієвої кислоти полі-N-вінілпіролідону вперше розроблені ранові водонерозчинні гідрогелеві покриття з іммобілізованими лужною протеазою і трипсином, з високими виходами по активності (75,6-100 %), стійкі при зберіганні і г-стерилізації, пролонгованої дії (24 год). Дослідження співвідношень матриця-фермент, кінетичних параметрів гідролізу субстрату вільним і іммобілізованим ферментом, виявлення дозозалежного ефекту при г-опроміненні, надає можливість оптимізації дози і, відповідно, протеолітичної активності іммобілізованого препарату.

5. Наявність протеолітичної активності білкових фракцій протеази С як в кислому (рН 4,9), так і в лужному (рН 8,9) середовищах (нативний електрофорез у ПААГ) дозволила вперше на основі природного біогелю «Ламідан» отримати текстильне покриття з іммобілізованим ферментом, з високим ступенем збереження протеолітичної активності (95,9 %), пролонгованої дії, тривалого терміну зберігання (1,5 роки) для потенційного вживання в рановій і опіковій терапії.

6. Розроблені лабораторний регламент на ОЛП з папаїном і сечовиною і проекти АНД на іммобілізовану лужну протеазу і ОЛП з папаїном і сечовиною.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Романовська І.І. Розробка ранового гідрогелевого покриття з іммобілізованою лужною протеазою Bacillus subtilis на основі модифікованого полі-N-вінілпіролідону / І.І. Романовська, С.С. Декіна // Досягнення біології та медицини. - 2007. - № 1. - С. 88-91. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення матеріалу, написання статті.

2. Романовська І.І. Іммобілізація папаїну та сечовини в полівініловий спирт / І.І. Романовська, С.С. Декіна // Медична хімія. - 2007. - №1. - С. 35-40. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення матеріалу, написання статті, написання та підготовка статті до друку.

3. Романовская И.И. Некоторые особенности кинетики гидролиза казеина папаином, трипсином и щелочной протеазой из Bacillus subtilis / И.И. Романовская, С.С. Декина, О.В. Севастьянов // Ученые записки ТНУ, Сер. «Биология, химия». - 2007. - Т. 20 (59), № 2. - С. 126-130. Особистий внесок здобувача: проведення кінетичних досліджень, узагальнення матеріалу, написання статті.

4. Романовська І.І. Розробка очних лікарських плівок з сироватковим альбуміном людини / І.І. Романовська, С.С. Декіна, Р.І. Чаланова, Г.В. Глущак // Медична хімія. - 2008. -Т. 10, № 1.-С. 15-19. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання і підготовка статті до друку.

5. Романовська І.І. Іммобілізація протеази С в біогель ламідан / І.І. Романовська, С.С. Декіна, Н.Б. Мартинюк // Досягнення біології та медицини. - 2009.- Т. 14, № 2. - С. 25-28. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, написання і підготовка статті до друку.

6. Романовская И.И. Иммобилизация биологически активных веществ с целью создания потенциальных диагностических и лекарственных средств / И.И. Романовская, Т.И. Давиденко, С.С. Декина, И.И. Пашкин, С.А. Андронати // Журнал орг. та фарм. хімії. - 2009. - Т.7, вип. 3(27). - С. 69-78. Особистий внесок здобувача проведення досліджень, участь у написанні статті.

7. Романовская И.И. Иммобилизация щелочной протеазы и лизоцима в модифицированный поли-N-винилпирролидон / И.И. Романовская, С.С. Декина, И.И. Пашкин //Хим.-фарм. журн. - 2009. - Т.43, №10. - С. 88-91. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання статті.

8. Пат. 13238, Україна, МПК(2006) A61F 9/007 Романовська І.І., Декіна С.С., Бондаренко Г.І., Чаланова Р.І., Якіменко С.А., Давиденко Т.І. Композиція інгредієнтів для очної лікарської плівки. Заявка № 4200602317. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, підготовка матеріалу до написання патенту.

9. Пат. 26190, Україна, МПК (2006) А61F 9/007 Романовська І.І., Декіна С.С., Чаланова Р.І., Глущак М.А. Композиція інгредієнтів для очної лікарської плівки. Заявка № u 2007 04273. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, підготовка матеріалу до написання патенту.

10. Пат. 22088, Україна, МПК(2006) A61L 15/16 Романовська І.І., Декіна С.С., Пашкін І.І., Пухлік С.М. Ранозагоювальний засіб. Заявка № u 2006 12771. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, підготовка матеріалу до написання патенту.

11. Пат. 31802, Україна, МПК(2006) С12N 11/00 Романовська І.І., Декіна С.С. Спосіб іммобілізації протеази С. Заявка № u 2007 13120. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, підготовка матеріалу до написання патенту.

12. Пат. 83786, Україна, МПК(2006) С12N 11/00 Романовська І.І., Декіна С.С. Спосіб іммобілізації протеази С. Заявка № a 2007 13084. Декіна С.С. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, підготовка матеріалу до написання патенту.

13. Декина С.С. Иммобилизация сывороточного альбумина человека в поливиниловый спирт / С.С. Декина, И.И. Романовская // «Наука и образование - 2006»: Международная научно-техническая конференция, Мурманск, 4-12 апреля 2006 г. - Мурманск, 2006. - С. 645. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.

14. Декина С.С. Изучение термической инактивации щелочной протеазы из Bacillus subtilis, иммобилизованной в модифицированный поли-N-винилпирролидон / С.С. Декина, Ю.А. Шестеренко, И.И. Романовская // I Всеукраїнська конференція студентів, аспірантів та молодих вчених, Київ, 27-29 квітня 2006р. - Київ, 2006. - С. 188 Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.

15. Декина С.С. Иммобилизация щелочной протеазы из Bacillus subtilis в модифицированный диоксидом кремния поли-N-винилпирролидон / С.С. Декина, И.И. Романовская, И.И. Пашкин // «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии»: Материалы международной научной конференции, Минск, 1-2 июня 2006 г. - Минск, 2006. - С. 365-366. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.

16. Декина С.С. Разработка потенциального противораневого полимерного покрытия на основе поли-N-винилпирролидона с иммобилизованной щелочной протеазой / С.С. Декина, И.И. Романовская, Ю.А. Шестеренко //«Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006» Конференція-конкурс робіт молодих учених, Київ, 6-7 червня 2006. - Киев, 2006. - С. 11. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.

17. Декина С.С. Разработка противораневого гидрогелевого покрытия с иммобилизованной протеазой из Bacillus subtilis / С.С. Декина, И.И. Романовская // «Биотехнология. Образование. Наука. Практика»: III Всеукраинская научно-практическая конференция с международным участием, Харьков, 18-20 октября 2006. - Харьков, 2006 - С. 152. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.

18. Декина С.С. Разработка иммобилизованных форм белковых и протеолитических ферментных препаратов / С.С. Декина, И.И. Романовская // «Биотехнология: состояние и перспективы развития»: материалы Четвертого Московского международного конгресса, Москва, 12-16 марта 2007. - Москва, 2007. - С. 94. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.

19. Декина С.С. Изучение кинетики гидролиза казеина щелочной протеазой Bacillus subtilis / С.С. Декина, И.И. Романовская, О.В. Севастьянов // II Всеукраїнська конференція студентів, аспірантів та молодих вчених, Київ, 26-28 квітня 2007. - Киев, 2007. - С. 25. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.

20. Dekina S. Investigation of casein hydrolysis kinetics by papain, trypsin and Bacillus subtilis alkaline protease / S. Dekina, I. Romanovskaya, O. Sevastyanov // «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution»: Materials of III International Young Scientists Сonference, Odessa, 15 - 18 May 2007. - Odessa, 2007. - P. 182. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.

21. Dekina S.S. The development of ocular antiburn films with immobilized human serum albumin / S.S. Dekina, I.I. Romanovskaya // «Modern problems of microbiology and biotechnology»: The young scientists' and students' international scientific conference, Odessa, 28 - 31 May 2007 - Odessa, 2007. - P. 138. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.

22. Dekina S.S. The development of antiwound hydrogel coating with immobilized trypsіn / S.S. Dekina // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. Dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov, Kyiv, 20-22 september 2007. - Київ, 2007. - С. 113. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.

23. Декина С.С. Иммобилизация протеазы С в ламидан / С.С. Декина, Ю.С. Каравелкова // X коференція молодих учених та студентів-хіміків Південного регіону України, Одеса, 16-17 жовтня 2007. - Одеса, 2007. - С. 15. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.

24. Романовская И.И. Потенциальные раневые покрытия с протеазами микробного происхождения / И.И. Романовская, С.С. Декина // XII з'їзд Товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського, Ужгород, 25-30 травня 2009 р. - Ужгород, 2009. - С. 247. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.

25. Romanovska I. Potentially wound coating with alkaline protease from Bacillus subtilis immobilized on modified poly-N-vinyl pyrrolidone / I. Romanovska, S. Dekina, I. Pashkin, V. Topticov // “Microbiology on Service for Human”: 3rd Ukranian-Polish Weigl Conference, Odessa, 14-17 September 2009. - Odessa, 2009. - P. 103-104. Особистий внесок здобувача: проведення досліджень, узагальнення результатів, написання тез.

АНОТАЦІЯ

Декіна С.С. Іммобілізація протеолітичних ферментів і білків на полімерних носіях. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія (біологічні науки). Одеський національний університет імені І.І. Мечникова, Одеса, 2010.

Дисертація присвячена дослідженню процесів іммобілізації протеолітичних ферментів і білків на синтетичних і природних полімерних носіях. Показано, що іммобілізація білків в ПВС відбувається як шляхом комплексоутворення, так і механічним включенням білка в полімер. В результаті іммобілізації САЛ в ПВС отримані ОЛП пролонгованої дії з кількісним ступенем включення, стабільні при довготривалому зберіганні, з високою поглинаючою здатністю відносно кислот і лугів, що перспективно для сорбційної терапії опіків очей.

Виявлено субстратне інгібування активності папаїну, трипсину і лужної протеази, що дозволило рекомендувати використання 0,35 - 0,9 % розчину казеїну.

Сумісна іммобілізація папаїну і сечовини привела до отримання ОЛП з підвищеною в 1,2 рази протеолітичною активністю, пролонгованої дії, стабільних при г-опроміненні і зберіганні, перспективних для опікової терапії рогівки очей.

Показано, що розроблений метод іммобілізації лужної протеази і трипсину в модифікований золем полікремнієвої кислоти ПВП приводить до одержання ранових водонерозчинних гідрогелевих покриттів з високою протеолітичною активністю, стійкістю при зберіганні і г-стерилізації, пролонгованої дії.

Винайдений спосіб іммобілізації протеази С в біогель «Ламідан» дозволив створити текстильні покриття з кількісним збереженням протеолітичної активності, пролонгованої дії, тривалого терміну зберігання для потенційного використання в рановій і опіковій терапії.

Розроблено лабораторний регламент на ОЛП з папаїном і сечовиною і проекти АНД на іммобілізовану лужну протеазу і ОЛП з папаїном і сечовиною.

Ключові слова: білки, протеолітичні ферменти, іммобілізація, полівініловий спирт, полі-n-вінілпіролідон, ламідан, опіки рогівки очей.

АННОТАЦИЯ

Декина С.С. Иммобилизация протеолитических ферментов и белков на полимерных носителях. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология (биологические науки). Одесский национальный университет имени И.И. Мечникова, Одесса, 2010.

Диссертация посвящена изучению процессов иммобилизации протеолитических ферментов и белков на синтетических и природных полимерных носителях.

В рамках выполнения работы в результате иммобилизации альбуминов в ПВС получены пленочные формы белков пролонгированного действия с количественной степенью включения, стабильные при хранении в течение 8 мес. - 1 года. Методами УФ-спектроскопии, вискозиметрии показано образование ассоциатов белок: носитель при мольных отношениях БСА: ПВС, ОА: ПВС, САЧ: ПВС соответственно 1: 2,5; 1: 3,1; 1: 4; при уменьшении которых иммобилизация происходит путем механического включения белка в полимер.

ГЛП с САЧ при концентрации белка в 100 раз ниже таковой в растворе, обладают высокой поглощающей способностью в отношении кислот и щелочей. Экспериментальные исследования, проведенные на моделированных щелочных ожогах роговицы глаз 15 кроликов показали перспективность их применения для сорбционной терапии ожогов.

Детальное исследование кинетики начальных скоростей гидролиза казеина протеолитическими ферментами растительного, животного и микробного происхождения выявило наличие субстратного ингибирования протеолитической активности папаина, трипсина и щелочной протеазы, во избежание которого рекомендовано использование 0,35 - 0,9 % раствора субстрата.

В результате совместной иммобилизации папаина и мочевины в ПВС получены ГЛП с увеличенной в 1,2 раза протеолитической активностью (389 ед/г), обусловленной дополнительным гидролитическим эффектом мочевины, пролонгированного действия, стабильные при г-облучении и хранении в течение 1 года. Проведенные медико-биологические испытания ГЛП с папаином и мочевиной показали перспективность их использования в терапии ожогов глаз.

Показано, что разработанный метод иммобилизации щелочной протеазы Bacillus subtilis и трипсина в высокомолекулярный поли-N-винилпирролидон, модифицированный золем поликремниевой кислоты (органо-неорганический гибрид), позволил получить потенциальные раневые водонерастворимые гидрогелевые полимерные покрытия с высокими выходами по активности (75,6-100 %), стабильные при хранении и г-стерилизации, пролонгированного действия в течение суток.

Изучен фракционно-белковый состав протеазы С, продуцируемой Acremonium chrysogenum, с использованием электрофореза в ПААГ. Разработанный способ иммобилизации протеазы С в природный биогель «Ламидан» приводит к получению текстильных покрытий с высокой степенью сохранения протеолитической активности (95,9 %), пролонгированного действия, длительного срока хранения (1,5 года) для потенциального применения в терапии ран и ожогов.

Составлены лабораторный регламент на ГЛП с папаином и мочевиной и проекты аналитической и нормативной документации на иммобилизованную щелочную протеазу и ГЛП с папаином и мочевиной.

Ключевые слова: белки, протеолитические ферменты, иммобилизация, поливиниловый спирт, поли-N-винилпирролидон, ламидан, ожоги роговицы глаз.

SUMMARY

Dekina S.S. Proteolytic enzymes and proteins immobilization on polymeric supports. - Manuscript.

Thesis, submitted for a candidate's degree in biological sciences, speciality 03.00.20 - biotechnology (biological sciences). The I.I. Mechnikov's Odessa's National University, Odessa, 2010.

The thesis is devoted to study of proteolytic enzymes and proteins immobilization on synthetic and natural polymeric supports. It was shown, that the proteins immobilization in PVA occurs both by complex formation and mechanical entrappment of protein in polymer. As a result of HSA immobilization in PVA were obtained OMI of prolonged action, with quantitative degree of entrappment, stable for a long time, with high adsorbtive capaсity towards acids and alkalies, which is prospective for sorbtive therapy of ocular burns.

The substrate inhibition of papain, trypsin and alkaline protease was found, which allowed to recommend usage of 0,35 - 0,9 % casein solution.

Joint immobilization of papain and urea had brought to obtaining OMI with 1,2-fold increased proteolytic activity, prolonged action, stable to г-irradiation and storage, prospective for cornea burn therapy.

It was shown, that the developed method of alkaline protease and trypsin immobilization in PVP, modified by polysilicic acid sol, broughts to obtaining water insoluble hydrogel wounds coatings with high proteolytic activity, stable at storage and г - irradiation, prolonged action.

The invented method of protease C immobilization in biogel «Lamidan» had allowed to create textile coatings with quantitative retaining of proteolytic activity, prolonged action and long-term storage for potential usage in wound and burn therapy.

The laboratory rules on OMI with papain and urea; the technical code project on immobilized alkaline protease and OMI with papain and urea were drawn up.

Key words: proteins, proteolytic enzymes, immobilization, poly(vinyl)alcohol, poly-N-vinyl pyrrolidone, lamidan, ocular burns.

Размещено на Allbest.ru

...