Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Імунологічна реактивність у хворих на неспецифічний виразковий коліт з різним ступенем дисбактеріозу

03.00.09 - імунологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Єгорова Світлана Юріївна

Київ - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в ДУ "Інститут гастроентерології АМН України" (м. Дніпропетровськ).

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Гаркава Катерина Григорівна,

Національний авіаційний університет МОН України, завідувач кафедри біотехнології (м. Київ).

доктор біологічних наук, професор Гавриленко Тетяна Іллівна,

Національний науковий центр "Інститут кардіології ім. акад. М.Д. Стражеска АМН України", керівник відділу імунології (м. Київ);

доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник

Мінченко Жанна Миколаївна,

Інститут клінічної радіології наукового центру радіаційної медицини АМН України, завідувач лабораторії імуногенетики відділу гематології та трансплантології (м. Київ).

Захист дисертації відбудеться "28" вересня 2010 р. о 16.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. Академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд.434.

Поштова адреса: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ім. М. Максимовича Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 58, зал № 12.

Автореферат розісланий "19" серпня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.В. Молчанець

Загальна характеристика роботи

1. Вивчити стан імунної системи у хворих на неспецифічний виразковий коліт залежно від ступеня дисбактеріозу кишечнику.

2. Визначити рівень аутоантитіл до антигенів кишечнику та перинуклеарних антинейтрофільних антитіл у хворих на неспецифічний виразковий коліт.

3. Вивчити особливості продукції цитокінів у хворих на неспецифічний виразковий коліт з різним ступенем дисбактеріозу.

4. Дослідити вплив аутоцитокінів на аутоштами мікроорганізмів у дослідах in vitro.

5. Розробити індивідуальні критерії оцінки функціональних можливостей фагоцитуючих клітин при дисбіотичних порушеннях.

6. Оцінити напруження імунітету у хворих на неспецифічний виразковий коліт за рівнем прозапальних цитокінів.

Об'єкт дослідження: стан імунологічної реактивності хворих на неспецифічний виразковий коліт з різним ступенем дисбактеріозу кишечнику та порушення мікробіоценозу кишечнику хворих на неспецифічний виразковий коліт.

Предмет дослідження: показники клітинної, гуморальної, фагоцитарної ланок імунітету, цитокінового статусу, зміни біологічних властивостей клінічних штамів мікроорганізмів під впливом комплексу аутоцитокінів.

Методи дослідження: імунологічні, мікробіологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше визначено особливості імунологічної реактивності у хворих на неспецифічний виразковий коліт залежно від ступеня дисбактеріозу кишечнику. Виявлено достовірне зниження загального рівня Т-лімфоцитів і субпопуляції CD4+Т-лімфоцитів периферичної крові, індексу імунорегуляції СD4+/СD8+, підвищення рівня лімфоцитів з фенотипом CD95+, ЦІК, ІЛ-4, ІЛ-8, ФНП-, ІФН-. Встановлено, що особливості імунологічної реактивності хворих з субкомпенсованим дисбактеріозом полягають у достовірному підвищенні рівня В-лімфоцитів, IgА, ІЛ-6, а характерною ознакою хворих з декомпенсованим дисбактеріозом є суттєва активація кисневозалежного метаболізму нейтрофілів на тлі зниження поглинальної активності, підвищений рівень лімфоцитів з рецепторами до ІЛ-2.

Уперше встановлено, що наявність антитіл до антигенів кишечнику в сироватці крові більш характерна для хворих із субкомпенсованим дисбактеріозом, а перинуклеарних антинейтрофільних антитіл - для хворих із декомпенсованим дисбактеріозом, що вказує на посилення деструктивних процесів.

Уперше встановлено підвищення спонтанної продукції мононуклеарними клітинами in vitro ІЛ-4, ІЛ-8, ФНП-, ІФН-г. Підвищений рівень ЛПС-індукованої продукції ІЛ-8 і ФНП- у хворих із субкомпенсованим і декомпенсованим дисбактеріозом свідчить про сенсибілізацію імунокомпетентних клітин до ліпополісахаридів грамнегативних бактерій при зростанні мікробного навантаження.

Експериментальні дослідження вперше продемонстрували вплив комплексу аутоцитокінів на клінічні штами мікроорганізмів в умовах in vitro. Виявлено, що комплекс аутоцитокінів пригнічує ріст і підвищує чутливість до антибіотиків представників умовно-патогенної мікрофлори, знижує адгезивні властивості досліджуваних мікроорганізмів.

Виявлено, що зниження поглинальної активності нейтрофілів до аутоштаму Escherichia coli є фактором ризику прогресування дисбактеріозу у хворих на неспецифічний виразковий коліт та доведено прогностичну значущість даного критерію.

Уперше показано, що рівні ІЛ-8 та ФНП-б у сироватці крові є інформативним параметром напруження імунітету у хворих на неспецифічний виразковий коліт, а підвищений їх рівень є прогностичним фактором несприятливого перебігу хвороби.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено індивідуальні критерії оцінки функціональних можливостей фагоцитуючих клітин при дисбіотичних порушеннях. Застосування одержаних даних дозволяє оцінити ступінь тяжкості дисбіотичних порушень та ризик поглиблення дисбактеріозу кишечнику, за цими результатами отримано деклараційний патент України на корисну модель (Патент 43741 UA).

Виділено критерії напруження імунітету у хворих на НВК за рівнем прозапальних цитокінів ІЛ-8 та ФНП-б, отримано деклараційний патент України на корисну модель (Патент 41829UA).

Результати дисертаційного дослідження впроваджено в практику роботи відділення захворювань кишечнику ДУ "Інститут гастроентерології АМН України" (акти впровадження від 9.11.09 та 19.11.09), в І терапевтичному відділенні 9-ї міської лікарні м. Дніпродзержинська (акт впровадження від 25.11.09), в діагностичному центрі "Діагноз" м. Дніпропетровська (акти впровадження від 1.10.09 та 21.10.09), у відділенні гастроентерології 6-ї міської лікарні м. Дніпропетровська (акти впровадження від 18.01.10 та 9.03.10).

Особистий внесок здобувача. Планування напрямків дослідження, постановка завдань і обґрунтування науково-практичних висновків проводилися разом з науковим керівником д. б. н.К.Г. Гаркавою. Автором самостійно здійснено інформаційно-патентний пошук, проведено імунологічні дослідження, сформовано базу даних, проведено статистичну обробку отриманих результатів, аналіз, теоретичне їх узагальнення, оформлення роботи.

Дослідження проводили на базі відділення захворювань кишечнику ДУ "Інститут гастроентерології АМН України" (завідувач відділення, к. мед. н. Т.Й. Бойко). Розроблено спосіб прогнозування дисбіотичних порушень та спосіб визначення напруження імунітету у співпраці з завідувачем лабораторії мікробіології та імунології ДУ "Інститут гастроентерології АМН України", к. б. н.В. Є. Кудрявцевою та к. б. н. Л.В. Тропко.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались та були обговорені на Всеукраїнській науковій конференції "Сучасні питання фізіології та медицини" (Дніпропетровськ, 26-28 вересня 2007 р.), V Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю "Сучасні проблеми патофізіології: від молекулярно-генетичних до інтегративних аспектів" (Запоріжжя, 17-19 вересня 2008 р.), ІІ Українському гастроентерологічному тижні (Дніпропетровськ, 23-26 вересня 2008 р.), XІV Російському гастроентерологічному тижні (Москва, 6-8 жовтня 2008 р.), Всеукраїнській науковій конференції з міжнародною участю "Актуальні проблеми сучасної біохімії та клітинної біології" (Дніпропетровськ, 30-31 жовтня 2008 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 наукових робіт, серед яких 5 статей у наукових фахових виданнях, що рекомендовані ВАК України, 2 деклараційні патенти України, 2 статті у збірниках наукових праць, 9 тез у матеріалах конференцій та конгресів.

Структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів власних досліджень (3 розділи), аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел. Роботу викладено на 158 сторінках друкованого тексту, ілюстровано 30 таблицями та 10 рисунками. Список літератури налічує 255 джерел.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Проведено імунологічне обстеження 90 хворих на НВК (51 жінка та 39 чоловіків). Середній вік пацієнтів склав 39,9±2,16 років. У першу групу ввійшли 27 пацієнтів із компенсованою формою дисбактеріозу (І ступінь дисбактеріозу), у другу групу ввійшло 22 пацієнти з субкомпенсованою формою дисбактеріозу (ІІ ступінь), третю групу склав 41 пацієнт із декомпенсованою формою дисбактеріозу (ІІІ ступінь). Базисний лікувальний комплекс включав дієтотерапію, препарати 5-аміносаліцилової кислоти, панкреоферментні препарати, пробіотики. Контрольну групу становили 30 практично здорових осіб.

Субпопуляційний склад лімфоцитів периферичної крові визначали методом непрямої імунофлуоресценції за допомогою моноклональних антитіл виробництва ЗАТ "Сорбент-сервіс" (Москва): CD3+ (Т-лімфоцити), CD22+ (В-лімфоцити), CD4+ Т-лімфоцити, CD8+ (Т-цитотоксичні лімфоцити), CD16+ (натуральні кілери), CD25+ (лімфоцити з рецепторами до ІL-2), CD95+ (лімфоцити з рецепторами до апоптозу), HLA-DR+ (лімфоцити з експресією антигенів гістосумісності II класу). Вміст імуноглобулінів А, М, G у сироватці крові визначали імуноферментним методом за допомогою тест-систем ТОВ НВЛ "Гранум" (Харків) за рекомендаціями виробника. Циркулюючі імунні комплекси (ЦІК) визначали за методом V. Haskova (1978).

ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-8, ФНП-, ІФН-, ІФН- визначали методом кількісного імуноферментного аналізу за допомогою тест-систем ЗАО "Вектор-Бест" (Новосибірськ) за рекомендаціями виробника.

Бактерицидну здатність нейтрофілів периферичної крові вивчали за допомогою проведення реакції фагоцитозу прямим візуальним методом із культурою Staphylococcus aureus, штам АТСС 25923, культурою Escherichia coli, штам О55: К59 3912/41, та клінічними штамами Escherichia coli, виділеними від хворих на НВК [Меншиков, 1987]. Функціональну активність нейтрофілів оцінювали в спонтанному та стимульованому латексом НСТ-тесті за реакцією відновлення нітросинього тетразолію [Park et al., 1968].

Антитіла до антигенів кишечнику та перинуклеарні антинейтрофільні антитіла (рANCA) у сироватці крові визначали методом непрямої імунофлуоресценції за допомогою діагностичного набору "EUROIMMUN" (Німеччина).

Дослідження видового та кількісного складу мікрофлори кишечнику проводили методом посіву десятикратних розведень на стандартний набір селективних та диференційно-діагностичних поживних середовищ [Грачева с соавт., 1987].

Комплекс аутоцитокінів отримували при культивуванні мононуклеарних клітин (МНК) периферичної крові хворих на НВК у присутності мітогену ФГА [Ковальчук, 1995]. Для оцінки спонтанної та індукованої продукції цитокінів виділені МНК інкубували при 37^оС в атмосфері 5% СО₂ протягом 24 годин без додавання індуктору (спонтанна продукція) та в присутності мітогену ФГА і ЛПС E. coli ? (індукована продукція).

Для оцінки впливу комплексу аутоцитокінів на чисельність мікроорганізмів використовували метод секторних посівів, визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків проводили методом дифузії в агар з використанням дисків (на підставі нормативного виробничо-практичного видання "Бактеріологія і вірусологія", 2007). Визначення адгезивних властивостей мікроорганізмів проводили за методом В.І. Бріліс (1986).

Рейтинговий алгоритм імунних порушень визначали за А.М. Земським (2003).

Статистична обробка результатів досліджень здійснювалася методами варіаційної статистики, реалізованими стандартним пакетом прикладних програм Statistica for Windows 6.0. Для визначення ступеня взаємозв'язку між двома показниками був проведений кореляційний аналіз із визначенням достовірних (p<0,05) коефіцієнтів кореляції (r) [Петри, 2003].

Результати дослідження та їх обговорення. Проведені мікробіологічні дослідження виявили наявність суттєвих розладів у стані мікробіоценозу кишечнику у хворих на НВК. Для 55,6% хворих 1-ї групи були притаманні зниження вмісту мікроорганізмів роду Lactobacillus і підвищення кількості мікроорганізмів роду Enterococcus. У хворих 2-ї групи домінувало зниження вмісту Lactobacillus і E. coli з нормальною ферментативною активністю (E. coli НФА) (у 63,6% хворих), підвищення кількості Enterococcus (у 86,4%). У 3-й групі переважали зміни, зумовлені зниженням Bifidobacterium (у 68,3%), Lactobacillus (у 78,1%) і E. coli НФА (у 52,7%), підвищення кількості мікроорганізмів роду Enterococcus (у 85,4%) і дріжджоподібних грибів роду Candida (у 58,5%). Встановлено підвищення рівня гемолітичних біоварів E. coli у 22,7% хворих 2-ї групи і 43,9% хворих 3-ї групи, підвищення рівня умовно-патогенних ентеробактерій (у 22,2% хворих 1-ї групи, у 27,3% і 34,2% хворих 2-ї і 3-ї груп відповідно).

В усіх групах хворих на НВК встановлена Т-лімфопенія за рахунок зменшення кількості СD4+Т-лімфоцитів. Рівень СD4+ був достовірно зниженим у 1-й, 2-й і 3-й групах до (29,98±1,44) %, (25,83±3,80) % і (22,92±1,08) % відповідно проти (38,71±0,52) % у групі контролю. Рівень СD3+ та СD4+ лімфоцитів був зниженим в 3-й групі порівняно з 1-ю групою (р<0,05).

Рівень CD8+ клітин був достовірно підвищеним у 2-й групі. У 3-й групі кількісний склад субпопуляції CD8+ мінявся неоднозначно: як підвищення, так і зниження рівня СD8+ спостерігали практично в однакової кількості пацієнтів.

В усіх групах хворих на НВК спостерігали достовірне зниження індексу імунорегуляції, що відображає стійкі порушення в імунній системі та хронізацію патологічного процесу. Зниження співвідношення СD4+/СD8+ спостерігали у 18 (66,7%) хворих 1-ї групи, у 14 (63,6%) 2-ї групи, у 28 (68,3%) пацієнтів 3-ї групи.

Тенденцію до підвищення відсоткового і абсолютного вмісту CD16+-клітин спостерігали у хворих 3-ї групи.

Рівень CD95+ лімфоцитів був достовірно підвищеним в усіх групах порівняно з контролем, що є фактором ризику патологічного апоптозу у хворих зі слабкою імунною відповіддю, оскільки формується недостатній захисний фон для відміни апоптозу активованих імунокомпетентних клітин. Підвищення рівня CD95+ лімфоцитів спостерігали у 18 (66,7%) хворих 1-ї групи, у 14 (63,6%) хворих 2-ї групи, у 28 (68,3%) хворих 3-ї групи.

У 3-й групі спостерігали достовірне підвищення рівня лімфоцитів з рецепторами до IL-2, що відображає гіперактивацію імунітету, зумовлену аутоімунними змінами при неспецифічному виразковому коліті.

У хворих на НВК встановлена активація гуморальної ланки імунітету. Рівень лімфоцитів CD22+ був підвищеним в усіх групах хворих, у 2-й і 3-й групах ці зміни носили достовірний характер. Підвищення рівня CD22+ спостерігали у 12 (44,4%) хворих 1-ї групи, у всіх хворих 2-ї групи і 26 (63,4%) хворих 3-ї групи.

У 2-й групі спостерігали достовірне підвищення рівня IgA ? (3,17±0,63) г/л проти (2,25±0,26) г/л в контролі. Одночасне підвищення рівня IgA та IgG у 9 (40,9%) хворих даної групи на тлі пригнічення Т-клітинної ланки свідчить про участь їх у компенсаторній реакції гуморального імунітету на посилене антигенне навантаження.

В усіх групах хворих ми спостерігали достовірне підвищення рівня циркулюючих імунних комплексів, що свідчить про високу активність запального процесу: підвищення рівня ЦІК спостерігали у 12 (44,4%) хворих 1-ї групи, у 20 (90,9%) хворих 2-ї групи; і у 32 (78,1%) хворих 3-ї групи. Вміст ЦІК у периферичній крові хворих на НВК підвищувався паралельно з поглибленням дисбактеріозу, в 3-й групі спостерігали підвищення в 2,1 раза порівняно з контролем.

На підставі отриманих даних одержано рейтингові алгоритми імунних порушень досліджених груп хворих. Було відібрано діагностично цінні показники, які найбільше відрізнялися від рівня норми, і розташовано їх у порядку зниження вагомості відмінностей від норми. У 1-й групі до складу рейтингового алгоритму імунних порушень увійшли: Т-лімфоцити, індекс СD4+/СD8+, СD4+Т-лімфоцити, CD95+ лімфоцити, ЦІК. У 2-й групі: ЦІК, В-лімфоцити, CD95+ лімфоцити, IgA, СD4+/СD8+, СD4+Т-лімфоцити, Т-лімфоцити. У 3-й групі: ЦІК, В-лімфоцити, CD25+ лімфоцити, CD95+ лімфоцити, Т-лімфоцити, СD4+Т-лімфоцити.

Наведені дані свідчать про те, що з поглибленням дисбактеріозу у хворих на НВК зростають імунологічні порушення.

В усіх групах хворих спостерігали достовірно підвищені порівняно з контролем показники спонтанного НСТ-тесту, крім того, в 3-й групі вони були достовірно підвищеними порівняно з 1-ю і 2-ю групами. У пацієнтів 1-ї групи зміни показників НСТ-тесту носили різноспрямований характер: у 6 (42,9%) підвищення, у 5 (35,7%) зниження показника. У 2-й групі спостерігали підвищення цього показника у 6 (60,0%) пацієнтів, у 3-й групі - у 13 (54,2%) пацієнтів. Напруження киснево-залежного метаболізму нейтрофілів, найбільш виражене в 3-й групі, може бути однією із причин порушення цілісності слизових оболонок кишечнику та відігравати важливу роль у розвитку процесів аутоагресії.

Резерви функціонально-метаболічної активності фагоцитуючих клітин (НСТ-тест, стимульований латексом) у хворих 1-ї та 2-ї груп були знижені порівняно з контролем (р<0,05).

У реакції фагоцитозу з культурою S. аureus спостерігали кількісний дефіцит активно фагоцитуючих клітин (ФІ) і зниження індексу поглинання (ФЧ) в 2-й і 3-й групах. У хворих 1-ї групи спостерігали різноспрямовані зміни ФЧ: у 2 (14,3%) дефіцит, у 5 (35,7%) стимуляція, у 7 (50,0%) показник перебував у межах норми. У 2-й групі хворих у 3 (30,0%), в 3-й групі у 13 (54,2%) спостерігали зниження цього показника.

Достовірне зниження здатності перетравлювати поглинутий мікроорганізм встановлено в усіх групах хворих на НВК. Індекс бактерицидності нейтрофілів у 3-й групі був достовірно зниженим (р?0,05) порівняно з 1-ю та 2-ю групами. Проведений кореляційний аналіз виявив залежність між ступенем дисбактеріозу і ФІ у хворих на НВК (r= ?0,58; p<0,05), та ФЧ (r= - 0,76; р<0,05).

При дослідженні цитокінового статусу встановлено, що рівень ФНП-б в усіх групах був достовірно підвищеним відносно контролю (табл.1).

Таблиця 1

Рівні цитокінів у сироватці крові хворих на неспецифічний виразковий коліт, пг/мл; (М±m)

Примітки:

1. * - р<0,05 у порівнянні з контролем;

2. - р<0,01 у порівнянні з контролем.

Рівень ІЛ-8 у 1-й групі зростав у 2 рази (р<0,05), у 2-й групі в 10 разів (р<0,05), у 3-й групі в 5,5 разів (р<0,01). Рівень ІЛ-6 був достовірно підвищеним порівняно з контролем у 2-й групі в 3,6 разів, у 3-й групі в 3 рази.

Рівень ІФН- був достовірно підвищеним в усіх групах порівняно з контролем (у 1-й і 3-й групах у 3,7 разів, у 2-й групі в 2 рази). У 1-й та 3-й групах рівень даного цитокіну був достовірно підвищеним порівняно з 2-ю групою. Рівень ІЛ-4 був достовірно підвищеним в усіх групах відносно контролю: в 1-й і 3-й групах у 2 рази, в 2-й групі в 1,8 раза.

Таким чином, неспецифічний виразковий коліт, згідно з нашими дослідженнями, супроводжується підвищеним синтезом цитокінів, які мають як прозапальну, так і протизапальну дії, що підтверджується працями сучасних авторів [Царегородцева, Серова, 2003]. Збільшення синтезу цитокінів можна розглядати як показник інтенсивності запалення, залучення до патологічного процесу імунної системи, її розбалансованості.

У 40,0% пацієнтів 1-ї групи, у 58,8% 2-ї групи та у 42,3% 3-ї групи в сироватці крові виявлено антитіла до антигенів кишечнику. Перинуклеарні антинейтрофільні антитіла виявлені у 46,7% хворих 1-ї групи, у 47,1% 2-ї групи та у 73,1% 3-ї групи.

Рівні антитіл до антигенів кишечнику та перинуклеарних антинейтрофільних антитіл були достовірно підвищеними в усіх групах порівняно з контролем (табл.2).

Таблиця 2

Титри аутоантитіл у хворих на неспецифічний виразковий коліт, ум. од.

Примітка. * - р<0,05 у порівнянні з контролем.

Встановлено підвищення титрів перинуклеарних антинейтрофільних антитіл відповідно до важкості дисбактеріозу: у хворих 3-ї групи рівень аутоантитіл був підвищеним порівняно з 1-ю та 2-ю групами. Рівень рANCA у хворих з декомпенсованим дисбактеріозом корелював з рівнем ФНП- (r=0,38; р<0,05) та показниками спонтанного НСТ-тесту (r=0,53; р<0,05).

З метою уточнення характеру взаємозв'язків між імунологічною реактивністю та станом мікрофлори кишечнику у хворих на НВК був проведений кореляційний аналіз за допомогою парних кореляцій. У хворих на НВК з компенсованим дисбактеріозом встановлено позитивні тісні зв'язки між концентрацією E. coli НФА та рівнем CD22+ лімфоцитів (r=0,98; р<0,05), рівнем CD8+ лімфоцитів (r=0,95; р<0,01), індексом бактерицидності нейтрофілів (r=0,86; р<0,05). У хворих з субкомпенсованим дисбактеріозом з'являються негативні кореляційні зв'язки між концентрацією E. coli НФА і показниками поглинальної активності (r= - 0,87; р<0,05) та рівнем активно фагоцитуючих клітин (r= - 0,62; р<0,05), тобто стимулюючий вплив мікрофлори на фагоцитарну активність клітин імунної системи змінюється на пригнічення ії функції. У хворих з декомпенсованим дисбактеріозом встановлено тісні негативні кореляційні зв'язки між концентрацією мікроорганізмів роду Enterococcus і рівнем лімфоцитів з фенотипом СD3+ (r= - 0,60; р<0,05), СD4+ (r= - 0,59; р<0,05), між концентрацією E coli НФА та СD22+ (r= - 0,72; р<0,05), СD95+ (r= - 0,73; р<0,01) лімфоцитами. Поява нових негативних кореляційних зв'язків між показниками імунітету та концентрацією мікроорганізмів свідчить про перенапруження імунної системи, зумовлене антигенним навантаженням. Показники фагоцитарної активності визначалися концентрацією E. coli НФА: (r=0,68; р<0,05) - для фагоцитарного індексу, (r=0,70; р<0,05) - для фагоцитарного числа, (r= - 0,40; р<0,05) - для рівня НСТ-позитивних клітин; концентрацією мікроорганізмів роду Enterococcus: (r= - 0,60; р<0,05) - для фагоцитарного індексу, (r= - 0,78; р<0,05) - для фагоцитарного числа та (r=0,54; р<0,05) - для рівня НСТ-позитивних клітин. Встановлені кореляційні зв'язки дозволяють стверджувати, що характер зрушень у фагоцитарній ланці імунітету визначає ступінь дисбіотичних порушень у хворих на НВК.

Аналіз індивідуальних показників, тобто зіставлення кількісного та якісного складу мікрофлори кишечнику до і після лікування у кожного обстеженого хворого окремо з визначенням спрямованості змін (нормалізація, поліпшення, погіршення, відсутність змін) визначив перевагу позитивної динаміки в обстежених хворих (рис.1). У 3 (11,1%) пацієнтів 1-ї групи після лікування спостерігали еубіоз, у 15 (55,6%) пацієнтів залишалася компенсована форма дисбактеріозу, а в 9 (33,3%) спостерігали погіршення стану мікробіоценозу. У 2-й групі спостерігали поліпшення стану мікробіоценозу у 14 (63,6%) хворих (серед них у 2 (9,1%) спостерігали еубіоз), відсутність змін ? у 6 (27,3%) пацієнтів, перехід субкомпенсованої форми в декомпенсовану ? у 2 (9,1%) пацієнтів. У 3-й групі в 32 (78,0%) спостерігали зменшення дисбалансу мікрофлори, що визначалося зниженням ступеня дисбактеріозу (серед них у 6 (14,6%) спостерігали еубіоз, у 7 (17,1%) компенсований дисбактеріоз, у 19 (46,3%) субкомпенсований дисбактеріоз), а в 9 (22,0%) пацієнтів спостерігали відсутність динаміки.

Після лікування нормалізація мікробіоценозу кишечнику відбувалася за рахунок відновлення популяційного рівня головних симбіонтів - Bifidobacterium і Lactobacillus. У 1-й групі хворих зростання концентрації Lactobacillus, а в 3-й Bifidobacterium носило достовірний характер. В усіх досліджених групах знизилась частота виділення дріжджоподібних грибів, але ці зміни не були достовірні.

Рис. 1. Динаміка змін стану мікрофлори кишечнику після лікування у хворих на НВК

Під впливом комплексного лікування у хворих на НВК спостерігалось поліпшення показників імунного статусу. У 1-й групі після лікування ми спостерігали достовірне підвищення рівня загальних Т-лімфоцитів (у 63,0% відбувалася нормалізація показника) і зниження рівня В-лімфоцитів, показники спонтанного НСТ-тесту знизилися до рівня норми. У 2-й групі достовірно знизились рівні ІЛ-6 (у 3 рази), ІЛ-8 (в 4,5 раза), ФНП-б (в 2 рази). У 3-й групі достовірно підвищився рівень загальних Т-лімфоцитів (нормалізація показника у 4 (9,8%), у решти пацієнтів - підвищення рівня) і бактерицидна активність нейтрофілів у реакції фагоцитозу (у 12 (52,2%) пацієнтів нормалізація показника), знизився рівень ФНП-б (майже у 2 рази). Повного відновлення вивчених імунологічних показників у хворих на НВК не встановлено, що зумовлено хронічним характером обраної патології та тяжкістю захворювання.

Під час дослідження продукції цитокінів мононуклеарними клітинами периферичної крові in vitro встановлено, що у хворих на НВК збільшується спонтанна продукція ІЛ-4 у відповідь на підвищення секреції прозапальних цитокінів ІЛ-6, ІЛ-8, ФНП-, ІФН-, що забезпечує функціонування системи цитокінів у зв'язку з біологічної агресією. Спонтанна продукція ІЛ-6, ФНП-, ІФН- підвищувалась паралельно зі зростанням мікробного навантаження в кишечнику. Відсутність росту індукованої продукції ІЛ-4, ІЛ-6, ІФН- свідчить про виснаження функціональних резервів МНК у хворих на неспецифічний виразковий коліт. ЛПС-індукована продукція ІЛ-8 та ФНП- в 2-й і 3-й групах суттєво перевищувала спонтанну (функціональний резерв становив від 47,4% до 62,1%), що свідчить про сенсибілізацію імунокомпетентних клітин до ліпополісахаридів при зростанні мікробного навантаження.

Дисбаланс продукції цитокінів може порушити існуючі взаємозв'язки у міжклітинних взаємодіях макроорганізму, впливати на механізми взаємовідношень макроорганізму з його аутофлорою. Враховуючи, що для цитокінової регуляції характерна каскадність продукції цитокінів і синергізм дії, вперше в умовах in vitro досліджено вплив комплексу аутоцитокінів на клінічні штами мікроорганізмів, виділених від хворих на НВК.

Для оцінки впливу комплексу аутоцитокінів на чисельність мікроорганізмів проводили преінкубацію суспензій штамів мікроорганізмів з комплексом аутоцитокінів протягом 60 хвилин при 37°С для забезпечення взаємодії цитокінів з поверхневими рецепторами мікроорганізмів.

Чисельність E. coli НФА після впливу аутоцитокінів у 4 рази перевищувала чисельність мікроорганізмів у контролі (р<0,05) ? (68,0±13,6) Ч10⁶ КУО/мл проти (17,1±9,2) Ч10⁶ КУО/мл. У 50,0% вивчених штамів E. coli НФА ми спостерігали значну стимуляцію росту (у 8-10 разів відносно контролю), у 30,0% - помірну стимуляцію (у 2-5 раз), у 20,0% не було відповіді.

У той же час комплекс аутоцитокінів in vitro пригнічував ріст 50,0% штамів гемолітичної E. coli (в середньому у 7,8 разів), 60,0% штамів S. аureus (в 10,3 разів) і 60,0% мікроорганізмів роду Proteus (в 15,9 разів).

Під впливом комплексу аутоцитокінів встановлено зміни чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів: достовірне підвищення чутливості штамів S. aureus до пеніциліну на 42,3% порівняно з контролем; підвищення чутливості до тетрацикліну та ампіциліну для штамів гемолітичної E. coli на 47,3% та 33,1% відповідно (р<0,05). Вказані зміни чутливості мікроорганізмів до антибіотиків спостерігали у 40,0% штамів S. аureus, у 50,0% штамів гемолітичної E. coli (до тетрацикліну) і 30,0% штамів гемолітичної E. coli (до ампіциліну).

Аналізуючи отримані дані, встановили, що пригнічення росту і підвищення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів відбувалося під впливом комплексу аутоцитокінів з підвищеним вмістом ФНП-б та ІФН-г.

Вивчення адгезивних властивостей мікроорганізмів під впливом комплексу аутоцитокінів показало достовірне зниження адгезивності штамів E. coli НФА та S. aureus в 1,4 раза, гемолітичної E. coli в 2 рази; підвищення адгезивних властивостей штамів Lactobacillus в 1,9 раза. Зниження адгезивних властивостей мікроорганізмів під впливом комплексу аутоцитокінів, можливо, відбувається за рахунок блокування рецепторного апарату мікробної клітини до еритроцитів людини, що є позитивним фактором у плані зупинки першого етапу розвитку запального процесу.

З огляду на те, що майбутнє цитокінової терапії пов'язують з комбінованим застосуванням цитокінів у фізіологічних дозах, на нашу думку, дослідження взаємодії мікро - і макроорганізмів за допомогою цитокінів перспективні для вирішення проблеми розробки засобів імунокорекції, а також визначення об'єктивних методів оцінки їх ефективності.

При дослідженні фагоцитарної активності в реакції з музейною культурою E. сoli О55: К59 3912/41 і з виділеним у конкретного хворого на НВК штамом гемолітичної E. coli встановлено гальмування поглинання та перетравлювання аутоштаму кишкової палички порівняно з музейною культурою.

Середні показники фагоцитарної активності хворих на НВК в реакції фагоцитозу з аутоштамами E. coli були зниженими порівняно з контролем і порівняно з показниками в реакції з музейною культурою E. сoli. Тоді як поглинальна здатність нейтрофілів в реакції з аутоштамами E. coli після 60 хвилин інкубації у хворих 2-ї і 3-ї груп була знижена в 3 рази порівняно з 1-ю групою (р<0,01), в реакції фагоцитозу з музейною культурою ми спостерігали лише тенденцію до зниження.

Тим часом індивідуальні зміни показників фагоцитозу були різноспрямовані. Так, ФІ у обстежених хворих на НВК коливався від 35 до 90%, ФЧ коливався від 2,1 до 12,6 ум. од. У реакції фагоцитозу з музейною культурою E. сoli в 1-й групі у 7 (50,0%) хворих спостерігали підвищення поглинальної здатності нейтрофілів, у 4 (28,6%) - зниження, у 3 (21,4%) - показник був у межах норми. У 2-й групі в 3 (30,0%) хворих спостерігали зниження поглинальної здатності, у 7 (70,0%) - показник був у межах норми. У 3-й групі в 9 (37,5%) хворих показник був у межах норми, у 15 (62,5%) - спостерігали зниження показника.

Під час проведення реакції фагоцитозу з аутоштамами E. сoli в 1-й групі у 5 (35,7%) хворих спостерігали підвищення поглинальної здатності нейтрофілів, у 6 (42,9%) - зниження, у 3 (21,4%) - показник був у межах норми. У 2-й групі у 4 (40,0%) хворих спостерігали зниження поглинальної здатності нейтрофілів, у 6 (60,0%) - показник був у межах норми. У 3-й групі у 6 (25,0%) хворих показник був у межах норми, у 18 (75,0%) - спостерігали зниження показника.

З метою оцінки функціонального стану нейтрофілів у конкретного хворого ми визначали співвідношення фагоцитарного числа в реакції фагоцитозу з музейною культурою E. coli до фагоцитарного числа з аутоштамом E. coli. У 43,7% досліджених хворих коефіцієнт був у межах від 1 до 2, що свідчить про збережені резерви функціонального стану нейтрофілів і легкий ступінь дисбіотичних порушень. У 41,7% хворих - у межах від 2 до 4, що свідчить про зниження функціональних резервів фагоцитуючих клітин і середній ступінь дисбіотичних порушень. У 14,6% хворих коефіцієнт був вище 4, що свідчить про виснаження функціональних резервів фагоцитуючих клітин, тяжкий ступінь дисбіотичних порушень, ризик поглиблення дисбактеріозу.

Як показав аналіз індивідуальних змін цитокінового статусу хворих на НВК, вони характеризуються гетерогенністю. У більшості випадків підвищення рівнів ІЛ-8 та ФНП-б збігалося з підвищенням концентрації E. сoli з гемолітичними властивостями та умовно-патогенних ентеробактерій. Підвищення вмісту ФНП-б на тлі високого рівня ІЛ-8 у хворих на НВК вказує на переважне залучення факторів природженої резистентності. Поряд з тим, у 10,3% хворих на НВК поява мікроорганізмів з ознаками агресії відбувалася на тлі нормальних рівнів прозапальних цитокінів, що свідчить про пригноблення функціональної, у тому числі і цитокінпродукуючої активності імунокомпетентних клітин.

У ході роботи був розроблений спосіб оцінки напруження імунітету за рівнями прозапальних цитокінів ІЛ-8 та ФНП-б у сироватці крові. Нормальний рівень вказаних цитокінів (0 - 35,4 пг/мл для ІЛ-8 та 0 - 6,5 пг/мл для ФНП-б) свідчить про слабке напруження імунітету. Підвищений рівень (36 - 130 пг/мл для ІЛ-8 та 7 - 30 пг/мл для ФНП-б) свідчить про помірне напруження імунітету. При значно підвищених рівнях цитокінів (вище 135 пг/мл для ІЛ-8 та ФНП-б вище 35 пг/мл) констатують виражене напруження імунітету, що вказує на несприятливий перебіг захворювання.

Таким чином, характер і виразність імунологічних зрушень при неспецифічному виразковому коліті визначають ступінь тяжкості дисбактеріозу кишечнику, а індивідуальний підхід до хворого дозволяє оцінити ризик поглиблення дисбактеріозу. Дослідження продукції прозапальних цитокінів дозволяє оцінити напруження імунітету у хворих на НВК та прогнозувати перебіг захворювання.

Комплексне дослідження фагоцитарної активності нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові до аутоштаму Escherichia coli та рівня прозапальних цитокінів ІЛ-8 та ФНП-б у сироватці крові рекомендується використовувати як критерії прогнозування ризику поглиблення дисбактеріозу кишечнику та перебігу неспецифічного виразкового коліту.

імунологічна реактивність неспецифічний коліт

Висновки

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Визначення поглинальної активності нейтрофілів до аутоштаму Escherichia coli порівняно з музейною культурою Escherichia coli О55: К59 3912/41 дозволяє оцінити ступінь тяжкості дисбіотичних порушень кишечнику та прогнозувати ризик їх поглиблення.

2. Для оцінки напруження імунітету та прогнозування перебігу захворювання у хворих на неспецифічний виразковий коліт доцільно визначати рівень ІЛ-8 та ФНП-б у сироватці крові.

3. Комплексне дослідження фагоцитарної активності нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові та рівня прозапальних цитокінів ІЛ-8 та ФНП-б у сироватці крові рекомендується використовувати як критерії прогнозування ризику поглиблення дисбактеріозу кишечнику та перебігу неспецифічного виразкового коліту.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.09 - імунологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2010.

Дисертаційну роботу присвячено дослідженню імунологічних порушень у хворих на неспецифічний виразковий коліт залежно від ступеня дисбактеріозу кишечнику.

Встановлено зниження загального рівня Т-лімфоцитів і субпопуляції CD4+Т-лімфоцитів, індексу імунорегуляції СD4+/СD8+, підвищення рівня лімфоцитів з фенотипом CD95+, ЦІК, ІЛ-4, ІЛ-8, ФНП-б, ІФН-г. У хворих з декомпенсованим дисбактеріозом виявляється суттєва активація кисневозалежного метаболізму нейтрофілів на тлі зниження їх поглинальної активності. Встановлено, що частота виявлення та титри антитіл до антигенів кишечнику у сироватці крові вищі у хворих з субкомпенсованим дисбактеріозом, а перинуклеарних антинейтрофільних антитіл - у хворих з декомпенсованим дисбактеріозом. У дослідах in vitro виявлено вплив комплексу аутоцитокінів на біологічні властивості представників умовно-патогенної мікрофлори.

Встановлено, що зниження поглинальної активності нейтрофілів до аутоштаму Escherichia coli є фактором ризику прогресування дисбактеріозу у хворих на НВК. Доведено, що підвищений рівень ІЛ-8 та ФНП-б у сироватці крові вказує на виражене напруження імунітету та несприятливий перебіг захворювання.

Ключові слова: клітинний імунітет, гуморальний імунітет, фагоцитарна активність нейтрофілів, цитокіни, дисбактеріоз, неспецифічний виразковий коліт.

Егорова С.Ю. Иммунологическая реактивность у больных неспецифическим язвенным колитом с разной степенью дисбактериоза. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.09 - иммунология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2010.

Диссертационная работа посвящена исследованию иммунологических нарушений у больных неспецифическим язвенным колитом в зависимости от степени дисбактериоза кишечника.

При проведении комплексного иммунологического обследования больных неспецифическим язвенным колитом установлено снижение уровня CD3+, CD4+ лимфоцитов периферической крови, иммунорегуляторного индекса СD4+/СD8+, повышение уровня CD95+ лимфоцитов, ЦИК, ИЛ-4, ИЛ-8, ФНО-б, ИФН-г. Выявлена зависимость изменений иммунитета от степени дисбактериоза. Концентрация ЦИК и ФНО-б повышается параллельно с усугублением дисбиоза, а уровень CD3+ и CD4+ лимфоцитов в группе с декомпенсированной формой дисбактериоза достоверно ниже, чем в группе с компенсированной формой. Особенности иммунологической реактивности больных с субкомпенсированной формой дисбактериоза заключаются в достоверном увеличении уровня CD22+ лимфоцитов, IgА, ИЛ-6; больных с декомпенсированным дисбактериозом - в активации кислородзависимого метаболизма нейтрофилов на фоне снижения их поглотительной активности, увеличении уровня лимфоцитов с рецепторами к ИЛ-2.

Частота обнаружения и титры аутоантител к антигенам кишечника в сыворотке крови больных неспецифическим язвенным колитом выше у больных с субкомпенсированным дисбактериозом, а перинуклеарных антинейтрофильных цитоплазматических антител - у больных с декомпенсированным дисбактериозом, что свидетельствует об усилении деструктивных процессов.