Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

14.01.35 - кріомедицина

УДК 612.621:615.014.41

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНА ЗБЕРЕЖЕНІСТЬ КЛІТИН ГРАНУЛЬОЗИ ТА КУМУЛЮСУ ЯЄЧНИКА ЛЮДИНИ ПІСЛЯ ДІЇ ЧИННИКІВ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ

Добрунова Інна

Володимирівна

Харків - 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, академік НАН України Грищенко Валентин Іванович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, директор

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор кафедри акушерства та гінекологіі Харківського Національного медичного університету Лазуренко Вікторія Валентинівна, доктор біологічних наук, професор Гордієнко Євген Олександрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу низькотемпературного консервування

Захист відбудеться “21” вересня 2010 р. о 13.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м.Харків, вул.Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м.Харків, вул.Переяславська, 23.

Автореферат розісланий “9” серпня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук, професор Розанов Л.Ф.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Проблема регуляції репродукції і гормонального профілю у людини і ссавців - одна з найбільш важливих в біології розвитку. Методи гормонального впливу широко застосовуються у процесі відтворення тварин і при лікуванні жіночого безпліддя, для індукції і синхронізації статевих циклів у точно регламентований термін. Проте дане лікування має і негативні результати. Тому впродовж багатьох років трансплантація яєчників розглядалась лікарями та вченими як один з альтернативних методів лікування у випадках, коли у пацієнток спостерігалися патологія гепато-біліарної системи або непереносимість до гормональних препаратів, ендокринопатії різного ґенезу, безпліддя, аменорея та ін. (П. П. Сидоров, 1927; D. Nugent et al., 1997). У зв'язку з цим удосконалення та пошук нових методів лікування порушень ендокринної і генеративної функції яєчників людини є важливим напрямком у репродуктології та гінекології.

Прогрес кріобіологічних досліджень репродуктивних клітин і тканин, а також ембріонів людини і тварин дозволив наразі активно і широко використовувати їх у сільському господарстві, репродуктивній медицині та біотехнології. Останнім часом у комплексі зі загальноприйнятою терапією кріоконсервована тканина яєчника використовується для лікування деяких форм ендокринного безпліддя (В. Е. Чадаєв, 1988), аменореї (Л. Г. Дьоміна та ін., 1989), інтерсексуальних станів (Л. Г. Дьоміна та ін., 2008), посткастраційного синдрома (Д. В. Салтовський та ін., 2003) та особливо для збереження фертильності у пацієнтів, що проходять аблаційну хіміо- та радіотерапію (D. Meirow et al., 2001; S. S. Kim et al., 2004). В експериментальних роботах було показано, що у стерильних мишей та овець після пересадки ізольованих примордіальних фолікулів або кортекса яєчників розвивались фолікули та ооцити, наставала вагітність і народжувалося потомство (S. Alkinson et al., 1996; K. Oktay et al., 1998). Тому ало- та аутотрансплантація стали більш реальними і доступними завдяки розробці способів кріоконсервування та вітрифікації оваріальної тканини людини (В. І. Грищенко та ін., 1986; J. Donnez et al., 2006; O. Hovatta et al., 2008). Проте у доступній літературі є незначна кількість робіт щодо кріоконсервування фолікулярних клітин та кумулюсу яєчників ссавців і людини (A. M. Sаeed et al., 2000; E. Lindley et al., 2001).

Ізольовані клітини гранульози і кумулюса (КГК), отримані з преовуляторних фолікулів яєчника людини, є відносно новим об'єктом для кріобіологічних досліджень. Раніше експерименти здійснювали з комплексом клітин строми яєчників, гранульози і теки, отриманих з фолікулів різних стадій розвитку (K. P. McNatty et al., 1976). У зв'язку зі складністю отримання, унікальністю та дефіцитом КГК, які здобуваються з організму під час лапаротомії або лапароскопії, а також при проведенні програм запліднення in vitro (ЗIV), можливість консервування та зберігання даного біологічного матеріалу є важливою кріобіологічною задачею. Актуальними залишаються питання збереження морфологічної цілісності КГК, можливості відновлення після заморожування-відтавання синтезу і секреції статевих гормонів, а також інших біологічно активних речовин in vivo та in vitro з метою їх подальшого застосування для імплантації та біотехнології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в ІПК і К НАН України у відділі кріобіології системи репродукції в межах науково-дослідних теми 2.2.6.96 «Вивчення особливостей дії низьких температур і гіпотермії на гамети, ембріони, ембріональні клітини в залежності від етапу гамето- та ембріогенезу, розробка середовищ зберігання, кріоконсервації та репарації нелетальних кріопошкоджень цих біооб'єктів» (№ держреєстрації 0101V003480) та 2.2.6.23 «Вивчення ефективності кріозахисту сперміїв людини, риб та собак за допомогою суміші кріопротекторів та з'ясування механізмів дії факторів кріоконсервації на спермії (при патосперміях), клітини хоріона та генетичний апарат ембріонів» (№ держреєстрації 0106U002171).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - визначити особливості впливу чинників кріоконсервування на морфофункціональні властивості клітин гранульози та кумулюсу, отриманих з преовуляторних фолікулів яєчника людини. Використовуючи експериментальні дані, разробити технологічно нетрудомісткий та ефективний метод кріоконсервування клітин гранульози та кумулюсу, який розширить можливості використання даного біологічного об'єкта у медицині та біотехнології.

Відповідно до поставленої мети були вирішені наступні задачі:

1) вивчити вплив розчинів кріопротекторів та їх суміші на структуру клітин гранульози та кумулюсу яєчника людини;

2) порівняти вплив режимів заморожування на морфофункціональні характеристики клітин гранульози та кумулюсу;

3) визначити біологічну активність клітин гранульози і кумулюсу до та після гіпотермічного зберігання і кріоконсервування;

4) дослідити можливість підвищення якості ембріонів людини шляхом їх сокультивування з кріоконсервованими клітинами гранульози та кумулюсу.

Об'єкт дослідження - кріоконсервування клітин гранульози та кумулюсу яєчника людини для ксеноiмплантації.

Предмет дослідження - морфологічна збереженість та стероїдопродукуюча функція клітин гранульози і кумулюсу яєчника людини після кріоконсервування та зберігання в умовах гіпотермії.

Методи дослідження: кріобіологічні (програмне заморожування, низькотемпературне та гіпотермічне зберігання тканини), морфологічна оцінка з використанням методів світлової та конфокальної лазерної скануючої мікроскопії, метод моношарової та тканинної зануреної культури, метод ксенотрансплантації, метод флуоресцентних зондів, радіоімунологічний та імуноферментний методи визначення гормонів, статистичні методи параметричного та непараметричного аналізу.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше отримано дані, які демонструють здатність КГК яєчника людини до розвитку в умовах культивування після дії гіпотермії та кріоконсервування, а також збереження клітинами значного стероїдогенного потенціалу in vivo та in vitro. Вперше для кріоконсервування клітин гранульози і кумулюсу яєчника людини використано двохкомпонентне кріозахисне середовище, у складі якого міститься 5% ДМСО та 5% ПЕО-400, що дозволило знизити концентрацію сполук без зниження їх кріозахисної дії. Вперше показано, що кріоконсервовані клітини гранульози та кумулюсу яєчника людини можуть бути використані при сокультивуванні з ембріонами людини як компонент живильного середовища, який сприяє дозріванню ембріонів до стадії бластоцисти. Вперше проведена оцінка стану, збереженості КГК та деяких органел клітин за допомогою різних флуоресцентних зондів після дії низьких температур.

Практичне значення отриманих результатів. Показано, що запропонований трьохетапний спосіб кріоконсервування КГК яєчника людини забезпечує високу збереженість біологічних властивостей впродовж тривалого строку їх зберігання. Експериментально встановлений факт ефективності імплантації кріоконсервованих КГК при розвитку гормонодефіциту у оваріоектомованих самок щурів є обґрунтуванням можливості їхнього використання в клінічній практиці як методу немедикаментозного лікування пацієнтів з ендокринопатіями різного генезу. Існування банку кріоконсервованих КГК дозволить в майбутньому в разі необхідності використовувати їх для ало- та аутогенної трансплантації, а також в біотехнології та фармакології.

Особистий внесок здобувача. Подані до захисту експериментальні та наукові результати отримані безпосередньо автором дисертації, яка самостійно виконала експериментальну частину роботи, провела інтерпретацію та аналіз отриманих результатів. В опублікованих зі співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає:

· у роботах [1-3] - у розробці методу культивування та спільного культивування КГК з ембріонами людини;

· у роботі [4] - у підборі кріозахисного середовища і методу кріоконсервування КГК;

· у роботах [5,6] - у підборі моделі, методу оваріоектомії та імплантації КГК щурам;

· у роботах [7,8] - у дослідженні гормонопродукуючої функції нативних КГК, які зберігалися за допомогою глибокого заморожування або гіпотермії;

· у роботі [9,10] - у дослідженні за допомогою різних флуоресцентних зондів стероїдопродукуючої активності та життєздатності кріоконсервованих КГК.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на конференціях: з'їзді ендокринологів України (Київ, 2006); конференції молодих вчених ІПКіК спільно з кафедрою UNESCO «Застосування холоду в біології і медицині» (Харків, 2008); Міжнародній конференції «Проблеми, досягнення і перспективи медико-біологічних наук та практичної охорони здоров'я» (Судак, 2008, 2009); Міжнародній конференції «Фундаментальна та клінічна ендокринологія: проблеми, здобутки, перспективи» (Харків, 2009); науково-практичній конференції з міжнародною участю „Проблемні питання ендокринології у віковому аспекті” (Харків, 2009), VI Міжнародній науково-техничній конференції «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии» (Севастополь, 2010).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 5 статей у наукових фахових журналах, 4 тези доповідей у збірниках наукових робіт вітчизняних і міжнародних конференцій і 1 патент України на корисну модель.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, розділів «Матеріали та методи дослідження», «Результати власних досліджень та їх обговорення», узагальнення, висновків, переліку цитованої літератури (250 джерел). Робота містить 5 рисунків, 3 таблиці та 33 мікрофотографії. Загальний обсяг роботи складає 150 сторінок, з яких 121 основний зміст.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Матеріалом дослідження були клітини гранульози та кумулюсу, які отримували з преовуляторних фолікулів яєчників жінок (25-35 років), що проходили курс лікування в медичних центрах «Імплант» і «ART-Клініка» з приводу безпліддя при проведенні програми ЗIV, з їх поінформованої письмової згоди. Після аспірації і вміщенні ооцит-кумулюсного комплексу в умови культивування фолікулярну рідину (ФР) з КГК збирали у стерильні пластикові пробірки та впродовж 1-2 годин транспортували на льоді в ІПК і К НАН України. Фрагменти тканини КГК (3,20,8 мм2), отримані у 32 пацієнток, відмивали від ФР і клітин крові та вміщували в середовище кріоконсервування (СК). Оскільки показано (Н.С.Пушкарь і ін., 1978), що токсична дія кріопротекторів на живі об'єкти зменшується близько нульових температурах, у наших дослідженнях до суспензії КГК додавали охолоджені СК по краплям. У роботі використали розчини 5 та 10% диметилсульфоксиду (ДМСО), 5 та 10% поліетиленоксиду з молекулярною масою 400 (ПЕО-400), 10% 1,2-пропандіолу (1,2-ПД) з 0,5 М розчином сахарози, а також двохкомпонентне крiозахисне середовище, що складалось з 5% ДМСО та 5% ПЕО-400, які готували на розчині Хенкса і додавали у співвідношенні 1:1, для отримання вищевказаних кінцевих концентрацій. Час експозиції КГК з СК становив 15-30 хв. Після інкубації фрагменти тканини вміщували в поліетиленові ампули (1 мл), герметизували, маркували та кріоконсервували, використовуючи три програми охолодження. Перша програма (n=9) ? охолодження зі швидкістю 300-400 С/хв., яке проводили шляхом занурення ампул з біо`обєктом безпосередньо у рідкий азот. Друга програма (n=15) ? на першому етапі КГК охолоджували зі швидкістю 1-2С/хв від кімнатної температури до початку кристалізації у зразку, після чого проводили напівавтоматичний сидінг протягом 5 хв, потім швидкість охолодження становила 10С/хв до ?45-50С і ампули занурювали у рідкий азот. Кріоконсервування КГК проводили на програмному заморожувачі (ЗП-10), виготовленому СКТБ ІПК і К НАН України. Третя програма (n=9) ? ампули з суспензією КГК витримували протягом 30 хв у парах рідкого азоту, після чого їх занурювали у рідкий азот. Зберігали зразки КГК при температурі -196С до дослідження. Відтавання зразків здійснювали у водяній бані при 37С.

Для оцінки біологічної активності фрагменти КГК культивували у 4-луночних планшетах з різними живильними середовищами у СО2-iнкубаторi при 37С з 5% СО2 у повітрі. Морфологічний стан культури оцінювали на 3, 6, та 10-12 доби на інвертованому мікроскопі фірми Leitz (Німеччина). На 10-12 добу середовище культивування вміщували в ампули і зберігали при -20С до моменту визначення в ньому вмісту статевих гормонів.

Для сокультивування з ембріонами людини КГК розморожували, відмивали від СК і вміщували у СО2-інкубатор на 16-24 годин у середовище культивування. При наявності адгезії і росту КГК (40% площі лунки) на моношар поміщали деконсервовані ембріони після видалення СК і спільно культивували впродовж 24-28 годин до стадії бластоцисти. Було проведено 10 сокультивувань ембріонів з нативними зразками КГК та 8 - з кріоконсервованими КГК.

Модельним об'єктом для ксеноімплантації КГК були 30 статевозрілих самок щурів лінії Вістар з масою тіла 150-200 г, яким була проведена оваріоектомія (о/е) за стандартною методикою (Я.М. Кабак, 1945). Всі експерименти з тваринами проводили відповідно до положень: „Європейська Конвенція про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985 р.) та „Загальні принципи експериментів на тваринах”, схвалені Національним конгресом з біоетики (Київ, 2004 р.) і Комітетом з біоетики ІПКіК НАН України. Всі маніпуляції з щурами, включаючи декапітацію, проводили за допомогою комбінованого наркозу (2,5 мг кетаміну та 0,5 мг ксилазину на 100 г маси тварини).

Ксеноімплантацію фрагментів КГК (3,20,8 мм2) здійснювали під капсулу лівої нирки одразу після оваріоектомії. Тварини були розділені на 3 групи: 1 (контрольна, n=3) - оваріоектомованi щури; 2 - оваріоектомованi щури (n=7), яким проводили імплантацію фрагментів КГК, що зберігались при 4С; 3 - оваріоектомованi щури (n=21), яким імплантували фрагменти КГК, кріоконсервовані за програмою 2 під захистом 10% ПЕО-400, 10% ДМСО та двохкомпонентного СК. Тварини знаходились під наглядом впродовж 10-12 діб в умовах віварію.

Визначення стероїдних гормонів у сироватці крові щурів (n=16) проводили до та пiсля імплантації КГК за допомогою радіоімунологічного методу з використанням стандартних наборів „РІА-Е-СТ” та „РІА-П-СТ” (Білорусь).

Рівень естрадіолу (Е2) та прогестерону (П) у культуральній рідині визначали модифікованим методом прямого твердофазного імуноферментного аналізу за допомогою наборів “Estradiol Elisa kit” фірми DRG (США) та „Прогестерон-ИФА-БЕСТ” (Росія) (n=10).

Гістологічному дослідженню пiдлягали ксеноiмплантати КГК разом з ниркою тварини, а також культивованi фрагменти КГК після кріоконсервування та гіпотермічного зберігання на 10-12 добу експерименту. Парафiновi зрiзи (5-7 мкм) готували на мiкротомi i забарвлювали гематоксилiном i еозином. Гістологічнi препарати оцінювали пiд свiтловим мiкроскопом при окулярi 10 та збiльшеннях об'єктиві х20, 40, 90.

Для дослідження життєздатності та стероїдогенної активності КГК при впливі чинників кріоконсервування у роботі були використані відомі та нові флуоресцентні зонди (ФЗ): Нільський червоний, пропідіум йодид (Sigma, США), 4-(N-диметиламіностирил)-1-метил піридин-N-толуолсульфонат (ДСМ), 3-ДАБ, BQBF. Аналіз флуоресценції клітин та мікрофотозйомку препаратів КГК здійснювали за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопу LSM-510 META (Carl Zeiss, Німеччина) з об'єктивами х5, 20, 40, 63. Інтенсивність флуоресценції визначали в індивідуальних клітинах препарату.

Статистичну обробку результатів проводили залежно від характеру розподілу даних за допомогою параметричного методу статистичного аналізу (t-критерій Стьюдента) або непараметричного методу Vann-Whitney з використанням програмного пакету Microsoft Excel 2000. Статистично значимими вважали росходження при р0,05.

Результати власних досліджень та їх обговорення.

На першому етапі досліджень проведено порівняльне вивчення впливу методів культивування та різних живильних середовищ: Meneso В2 (Франція), HTF (США), DMEM (Serva, Німеччина), HEM-F10 (Serva, Німеччина), RPMI-1640 (Serva, Німеччина), IVF (Cook, Данія), середовище 199 (Росія) з 10 % кріоконсервованою фолікулярною рідиною або 10% сироваткою пуповинної крові, на розвиток КГК яєчника людини in vitro. Всі середовища були збалансовані за рН=7,0-7,4 і мали осмолярність 280-300 мОсм. Культивування КГК здійснювали під мінеральною олією, що сприяло стабілізації умов росту клітин у культурі і, крім того, дозволяло досліджувати об'єкт під мікроскопом без різкого перепаду рН і температури.

У результаті проведених досліджень встановлено, що адгезія і міграція клітин з фрагментів КГК відбувалась на другу добу культивування у всіх середовищах за виключенням середовища НTF, що, можливо, пов'язано з швидким залуженням даного середовища. На 7-му добу культивування КГК відзначали множинну міграцію клітинних елементів по основі підкладки з багатошарових фрагментів тканини КГК

Нерідко спостерігали трансформацію КГК у фібробластоподібні клітинні елементи, відмінною ознакою яких є витягнуте овальне ядро і тіло, що переходять у тонкі цитоплазматичні відростки. Між фібробластоподібними клітинами розташовувались доволі крупні кулеподібні клітини з тонко гранульованою цитоплазмою, які, розростаючись, утворювали клітинні скупчення. До 12-14 доби більшість клітин і фрагментів відкріплялись від дна планшету, що свідчило про настання фази старіння культури. З'являлись потьмянілі конденсовані ділянки КГК. Найкращі показники росту і розвитку КГК були отримані при культивуванні у середовищі Meneso B2, яке застосовували у подальших експериментах. Для оцінки життєздатності КГК на етапах кріоконсервування було обрано метод тканинної зануреної культури, керуючись тим, що для імплантації зазвичай використовуються фрагменти оваріальної тканини.

У наступній серії експериментів було досліджено вплив на морфофункціональні властивості КГК гіпотермічного зберігання (18-20С та 4С) впродовж 1-2 та 20-24 годин, після виділення їх з преовуляторних фолікулів яєчника людини, що зумовлено організаційними та технічними моментами, пов'язаними з їх транспортуванням та кріоконсервуванням.

В результаті експериментів не було виявлено суттєвих змін у розвитку культури та структурно-функціональних характеристиках КГК в залежності від температури та строку зберігання. Міграцію клітинних елементів вздовж дна планшету спостеригали на 2-3 добу культивування. На 10-у добу культивування в середовищі Meneso B2 з 10%-ю кріоконсервованою ФР визначались ділянки КГК з фібробластоподібними клітинами, що активно проліферували. При гістологічному дослідженні експлантатів клітини гранульози мали щільне невелике овальне ядро, яке було розташовано, як правило, ексцентрично. У цитоплазмі спостерігалась дрібнозерниста грануляція. гранульоза ембріон сокультивування кріоконсервований

Таким чином, отримані дані свідчать про те, що гіпотермічне збереження КГК не впливає на характер розвитку КГК у тканинній зануреній культурі, зразки КГК впродовж 20-24 годин після вилучення з яєчників можуть бути використані для імплантації і кріоконсервування.

Успіх кріоконсервування біологічних об'єктів значною мірою залежить від використаних кріозахисних середовищ. У зв'язку з цим, на наступному етапі роботи визначали вплив різних концентрацій 1,2 ПД, ДМСО та ПЕО-400 і їх суміші на структуру КГК. Після контакту КГК з СК в усіх зразках була збережена архітектоніка тканини, клітини були рівномірно розподілені по всьому фрагменту.

Не відзначалось значної зміни тинкторіальних властивостей. Цитоплазма клітин була слабобазофільною з дрібнозернистою структурою. У деяких клітинах морфологічні зміни проявлялись у вигляді пікнозу ексцентрично розміщених ядер. Взагалі гістологічна оцінка препаратів після дії різних концентрацій проникаючого й непроникаючого кріопротекторів не виявила значних змін у структурі КГК яєчника людини, однак ефективність їх сумісної дії при кріоконсервуванні даного біооб'єкта, включно повільне програмне охолодження, до дійсного часу оцінена не була. Тому у наступних експериментах для кріоконсервування КГК були використані 5 і 10% ДМСО, 5 і 10% ПЕО-400 та двохкомпонентне СК - 5% ДМСО + 5% ПЭО 400.

Швидке заморожування КГК (програма 1) при використанні різних СК призводило до значних деструктивних змін, які являлись у порушенні тинкторіальних властивостей тканини, різкій базофілії цитоплазми клітин, пікнозі ядер, появі значних мікротріщин. У цьому випадку при культивуванні КГК не було виявлено міграції клітин. Впродовж усього строку культивування фрагменти КГК знаходились у шарі культурального середовища і не прикріплювалися до дна планшету На 10-12 добу культивування КГК спостерігали затемнені ділянки з ознаками некрозу.

Кріоконсервування фрагментів КГК за програмою 2 (3-етапне охолодження) під захистом 10% ДМСО також негативно впливало на структуру клітин. Цитотоксична дія ДМСО виявлялась у значній кількості пошкоджених клітин з утворенням дербесу після розморожування зразків. При культивуванні, після відмивання фрагментів від 10% ДМСО, на поверхні мембран деяких клітин після розморожування з'являлись випинання у вигляді пухирів, які не виникали при культивуванні КГК, кріоконсервованих під захистом 5% ДМСО, ПЕО-400 та двохкомпонентного СК. У культурі, отриманій після кріоконсервування КГК з двохкомпонентним СК, на 10-ту добу культивування форма клітин в основному не змінювалась і залишалась округлою. Клітини мали щільне кругле або овальне ядро, розміщене іноді ексцентрично, цитоплазма містила гранули. Клітини мігрували з основного фрагменту по підкладці планшету (рис.1,а).

Рис. 1. Культивування КГК (10 доба), кріоконсервованих за програмою з двохкомпонентним кріозахисним середовищем. Міграція клітин з фрагменту (а), утворення агрегатів (б), х240, 480.

У деяких препаратах виявлялись епітеліоподібні клітини, що мали мікрофіламенти (актиноподібні фібрили, здатні до скорочувальної функції), які утворювали моношар. Розростаючись, вони обмежували порожнини різної величини, набуваючи характер органотипового росту (рис.1,б). Деякі клітини знаходились у стані мітозу. На 12-ту добу культивування спостерігалось формування агрегованих тяжів.

Підсумовуючи результати проведеного дослідження впливу програм кріоконсервування, слід відзначити, що використаний трьохетапний режим охолодження для фрагментів КГК є доцільним. Це обумовлено збереженістю структури КГК та здатністю клітин до розвитку в умовах тканинної зануреної культури. Як до, так і після кріоконсервування у досліджених нами культурах спостерігалось утворення клітинних агрегатів, яке є результатом взаємодії клітин між собою та із субстратом, а також результатом активної міграції клітин.

Ці дані були підтверджені аналізом гормонопродукуючої функції при культивуванні кріоконсервованих КГК та клітин, які зберігалися в умовах гіпотермії. Було виявлено, що на 10-ту добу культивування рівень секреції прогестерону та естрадіолу був статистично значимо вищим, ніж у контролі (середовище культивування після 1 години інкубації з КГК) (Таблиця 1). Зменшення секреції естрадіолу після кріоконсервування, можливо, пов'язане як з морфологічними змінами у кріоконсервованих фрагментах КГК яєчника людини, так і зі зниженням кількості базального субстрату, необхідного для синтезу цього гормону. Крім того, КГК переходять у стадію лютеїнізації, коли під впливом лютропіну збільшується синтез прогестерону.

Таблиця 1 Вміст гормонів у живильному середовищі на 10-ту добу культивування

Культивування	Естрадіол, нмоль/л	Прогестерон, пмоль/л
Контроль	0,280,08	1,30,09
Після гіпотермії КГК	6,92,6	1489,6
Після кріоконсервування КГК	3,01,1	12510,5

- статистично значимі відмінності в порівнянні з контролем, р0,05.

Важливими ознаками життєздатності та стероїдогенної активності КГК яєчника людини є стан плазматичних мембран і наявність ліпідних включень після їх кріоконсервування. Тому ми вважали доцільним проведення експеріментів по визначенню життєздатності КГК за допомогою флуоресцентного зонду пропідіум йодит (РІ), який проникає в ядро клітин, зв'язується з ДНК та флуоресціює червоним тільки у тому випадку, коли бар'єрна функція цитоплазматичної мембрани порушується.

При дослідженні препаратів КГК у присутності РІ на конфокальному лазерному скануючому мікроскопі встановлено, що після кріоконсервування збільшується кількість пошкоджених КГК приблизно до 20%, (рис.2), що узгоджується з даними оцінки гістологічних препаратів і культури тканини.



Рис. 2. Флуоресценція КГК: а) інтактні зразки; б) після кріоконсервування з двохкомпонентним середовищем за програмою 2; забарвлення пропідіум йодидом.

Використовуючи забарвлення нільським червоним (НЧ), визначали наявність стероїдогенних клітин в нативних, після дії СК та кріоконсервованих фрагментах КГК (рис.3). У цитоплазмі КГК у нормі міститься значна кількість ліпідних гранул - депо холестерину, який є субстратом для синтезу стероїдних гормонів. Нільский червоний, легко проникаючи крізь клітинну мембрану, має властивість специфічної локалізації у ліпідних гранулах цитоплазми фолікулярних клітин (P. Greenspan et al., 1985, D. T. Yourka et al., 2003). При збуренні геліо-неоновим лазером з довжиною хвилі 543 нм НЧ ідентифікував стероїдогенні клітини, що флуоресціюють червоним світлом з максимумом емісії 631 нм як в нативних, так й експериментальних зразках. Інтенсивність світіння в окремих клітинах була різною, що імовірно залежить від ступеня їх гормональної активності і розміщення ліпідних крапель.



Рис. 3. Інтенсивність флуоресценції КГК: а) нативні; б) з двохкомпонентним СК; в) кріоконсервовані за програмою 2. Конфокальна мікроскопія, забарвлення НЧ+ДСМ.

При одночасовом використанні флуоресцентних зондів ДСМ і НЧ було встановлено, що вони накопичуються в одних і тих же зонах клітин, проте інтенсивність світіння першого з них є більшою в нативних та після дії двохкомпонентного СК препаратах (Рис.3,а,б), тим часом як після кріоконсервування в клітинах переважала яскраво червона флуоресценція, специфічна для НЧ (Рис.3,в). Враховуючи проведені на інших об'єктах дослідження (Г. Е. Добрецов, 1986; Е. I. Гончарук та ін., 2008), можна припустити, що ДСМ вбудовується в КГК не тільки в ліпідні краплі, а й у мітохондрії - органели, які тісно пов'язані зі стероїдогенезом. Можливо, активність мітохондрій після заморожування-відтавання знижується, що і є причиною падіння інтенсивності флуоресценції ДСМ.

При визначенні збереженості біологічних властивостей КГК після дії низьких температур досліджували стан ембріонів людини при їх сокультивуванні. На даний час в репродуктивній медицині і кріобіології найбільш важливим питанням є можливість реабілітації ембріонів людини після процедури кріоконсервування. З цією метою використовують їх попереднє культивування на моношарі епітеліальних клітин яйцевіда корів (K. Wiemer et al., 1998), епітеліальних клітин ендометрія (C. Simon et al., 1999), нативних клітин гранульози (E. Lindley et al., 2001), додавання в середовище культивування ФР (R. Hemmings et al., 1994). Але не завжди вживання вищевказаних способів можливо і збігається з часом розморожування ембріонів. Тому в наших дослідженнях кріоконсервовані за програмою 3 фолікулярні клітини були використані як живильне середовище для створення умов сокультивування для дозрівання ембріонів людини до стадії бластоцисти. Було виявлено, що при використанні кріоконсервованих КГК кількість ембріонів, які досягли стадії бластоцисти, складала 87±7,2 %, що статистично значимо не відрізнялося по відношенню до сокультивування ембріонів з нативними КГК (92,2±6,8 %), проте було значно вище в порівнянні з показниками, представленими в літературі, при використанні інших систем поєднаного культивування.

Метою наступного етапу роботи було дослідження можливості та доцільності використання КГК для трансплантації. Для вирішення цих питань була здійснена ксеноімплантація оваріоектомованим самкам щурів кріоконсервованих фрагментів тканини КГК або, які зберігалися за гіпотермії. На 10-ту добу після підсадки у щурів, яким імплантували фрагменти КГК, що зберігались в умовах гіпотермії, на гістологічних препаратах була виявлена незначна дистрофія графту, яка характеризвалась пікнозом ядер у клітинах (рис.4,а), тоді як кріоконсервовані зразки мали більш значні ознаки дегенеративних змін: пористість цитоплазми, базофілію, пікноз ядер (рис.4,б). Крім того, гістологічні дослідження імплантатів КГК, кріоконсервованих під захистом 10% ДМСО, показали у 4 тварин (57% випадків) наявність некрозу графта, інфільтрацію і формування сполучної тканини. Особливістю макромолекулярної архітектоніки імплантатів КГК після гіпотермії та кріоконсервування з двохкомпонентним СК є утворення псевдофолікулярних структур (рис.4), які нагадують фолікул, що розвивається в інтактному яєчнику.



Рис. 4. Ксеноімплантат КГК: а) після зберігання в умовах гіпотермії; б) після кріоконсервування. Забарвлення гематоксилін-еозином, х240, 480.

Передбачаєтся, що фолікулоподібні структурні перебудови відбуваються за рахунок міжклітинних контактів, які ініціюються ендогенними чинниками, оскільки тваринам не видаляли гіпоталамо-гіпофізарний комплекс.

При дослідженні гормонального статусу тварин було виявлено, що рівень стероїдних гормонів у сироватці крові експериментальних тварин-реципієнтів був статистично значимо вищим, ніж у оваріоектомованих щурів, яким не проводили імплантацію, проте значно знижувався у порівнянні з інтактними щурами (контроль) (рис.5).

Рис. 5. Вміст естрадіолу та прогестерону у сироватці крові щурів: 1 - інтактні (контроль); 2 - після оваріоектомії; 3 - після імплантації КГК, що зберігалась в умовах гіпотермії; 4 - після імплантації КГК, кріоконсервованих за програмою 2 з двохкомпонентним СК.

Подібні результати були продемонстровані і у дослідах інших вчених, що проводили ксенотрансплантацію оваріальної тканини, яка зберігалась в умовах гіпотермії, імунодефіцитним мишам (R. L. Schmidt et al., 2003).

Таким чином, представлені в дисертації дані свідчать про те, що запропонований метод кріоконсервування КГК під захистом двохкомпонентного СК, що містить 5% ДМСО та 5% ПЕО-400, може бути використаний для створення низькотемпературного банку цих клітин для ауто- та алотрансплантації з метою оптимізації існуючих методів лікування ендокринопатій різного ґенезу, а також безпліддя у програмах допоміжних репродуктивних технологій. Високий адаптаційний потенціал і компенсаторно-пристосувальна реакція даних клітин, можливо, генетично детермінована для захисту ооцита від несприятливих умов зовнішнього середовища.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлено теоретичне та експериментальне обґрунтування наукової проблеми, яка відноситься до дослідження морфо-функціональних характеристик клітин гранульози та кумулюсу, вилучених з преовуляторних фолікулів яєчника людини, на етапах кріоконсервування та доцільності використання кріоконсервованих КГК при спільному культивуванні з ембріонами людини, а також для підтримки стероїдогенної функції у оваріоектомованих щурів.

1. Проведено порівняльне вивчення впливу кріопротекторів ДМСО, ПЕО-400, 1,2-ПД та їх комбінацій на морфофункціональні показники КГК. Встановлено, що найменш токсичним щодо фрагментів КГК є кріозахисне середовище, яке містить 5% ДМСО та 5% ПЕО-400.

2. Гіпотермичне зберігання КГК впродовж 20-24 годин не впливає на характер розвитку КГК у тканинній зануреній культурі.

3. Трьохетапне охолодження фрагментів КГК при кріоконсервуванні з двохкомпонентним середовищем забезпечує збереження їх морфологічної структури та стероїдогенної активності in vivo та in vitro.

4. Показано, що використання кріоконсервованої суспензії клітин гранульози для сокультивування з ембріонами людини сприяє розвитку 87±7,2% ембріонів до стадії бластоцисти.

5. Доведено, що при ксенотрансплантації оваріоектомованим щурам фрагментів КГК, які зберігалися в умовах гіпотермії або після кріоконсервування, відбувається розвиток графтів з утворенням фолікулоподібних структур та зберігаються їх стероїдогенні властивості.

6. Встановлено, що стероїдогенна активність на етапах кріоконсервування КГК може визначатись за інтенсивністю флуоресценції зондів нільского червоного та 4-(N-диметиламіностирил)-1-метилпирідин N-толуенсульфоната.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Чадаев В. Е. Модельный обьект для определения возможности трансплантации криоконсервированной тестикулярной ткани в терапии человека / В. Е. Чадаев, И. В. Добрунова, К. А. Гольцев // Вісник проблем біології і медицини. - 2007. - №3. - С. 24-27.

2. Добрунова И. В. Культивирование клеток гранулезы и кумулюса после гипотермического хранения / И. В. Добрунова, Н. Н. Чуб, М. П. Петрушко // Проблемы криобиологии - 2008. - Т.18, №1 - С.98-100.

3. Чуб Н. Н. Морфофункциональное состояние клеток гранулезы и кумулюса яичника человека / Н. Н. Чуб, В. И. Пиняев, М. П. Петрушко, И. В. Добрунова, В.В. Кирошка // Транспланталогия. - 2008. - Т. 10,№1. - С.135-136.

4. Кирошко В. В. Морфофункциональные характеристики клеток гранулезы и кумулюса яичника человека, имплантированных овариоэктомированным крысам / В. В. Кирошко, Н. Н. Чуб, Ю. О. Тищенко, И. В. Добрунова, Л. Г. Демина, М. П. Петрушко // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения: Тр. Крымского ГМУ. - 2009. - Т.145,№2. - С. 150-152.

5. Чуб Н. Н. Исследование клеток гранулезы и кумулюса яичника человека с помощью флуоресцентных зондов / Н. Н. Чуб, И. Ф. Коваленко, Т. С. Дюбко, В. И. Пиняев, И. В. Добрунова // В сб. тр. VI международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии». - Севастополь, 2010 - С.46-49.

6. Пат. №46451, України МПК С12N 5/00. Спосiб пiдвищення якостi ембрiонiв людини / Грищенко В. I., Петрушко М. П., Пiняев В. I., Чуб Н. Н., Добрунова I. В.; заявник ІПК і К НАН України - №200906110; заявл. 15.06.2009; опубл. 25.12.2009. Бюл. № 24.

7. Чуб Н. Н., Гормональная активность криоконсервированной овариальной ткани человека / Н. Н. Чуб, Л. Г. Демина, Н. А. Карпенко, А. И. Гладкова, И. В. Добрунова, К. Н. Хромушкин // Ендокринологія. - 2007. - Т.12. - С. 316.

8. Грищенко В.И. Низкотемпературное консервирование овариальной ткани и фолликулярных клеток яичника человека / В. И. Грищенко, Н. Н. Чуб, Л. Г. Демина, Г. С. Лобынцева, И. В. Добрунова, М. П. Петрушко // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения: Тр. Крымского ГМУ. - 2008. - Т.144,№4. - С. 280.

9. Чуб Н. Н. Эстрогенная активность ткани яичника человека в культуре до и после низкотемпературного консервирования / Н. Н. Чуб, Л. Г. Демина,

И. В. Добрунова // Фундаментальна та прикладна ендокрiнологiя: проблеми, здобутки, перспективи: Матеріали наук.-практ. конф. - Харкiв, 2009. - С. 133- 134.

10. Чуб Н. Н. Исследование стероидогенной активности клеток гранулезы и кумулюса яичника человека с помощью флуоресцентных зондов / Н. Н. Чуб, Т. С. Дюбко, И. В. Коваленко, И. В. Добрунова, А. В. Пахомов, В. И. Пиняев // Проблемнi питання ендокринологii у вiковому аспектi : сб. наук. праць за матеріалами наук.-практ. конф. з міжнародною участю - Харкiв, 2009. - С. 123-124.

АНОТАЦIЯ

Добрунова I.В. Морфофункцiональна збереженiсть клiтин гранульози та кумулюсу яєчника людини пiсля дії чинників кріоконсервування - Рукопис.

Дисертацiя на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 - кріомедицина. - Iнститут проблем кріобіології ї кріомедицини НАН України, м. Харків, 2010.

Дисертаційна робота присвячена оцінці впливу різних чинників кріоконсервування на морфофункціональну збереженість клітин гранульози і кумулюсу (КГК) яєчника людини. На підставі експериментальних досліджень за допомогою метода тканинної зануреної культури, ксенотрансплантації КГК оваріоектомованим самкам щурів, використанню флуоресцентних зондів і гістологічних препаратів розроблено метод кріоконсервування КГК, отриманих з преовуляторних фолікулів яєчників людини. Доведено, що кріозахисна дія двохкомпонентного середовища (5% ДМСО + 5% ПЕО-400) у порівнянні з різними концентраціями розчинов кріопротекторів ДМСО, ПЕО-400, 1,2-ПД при застосуванні трьохетапного охолодження, статистично значимо вище й дозволяє зберігати їх структуру та стероїдогенну активність in vivo та in vitro. Використання кріоконсервованої суспензії клітин гранульози для сокультивування з ембріонами людини сприяло розвитку ембріонів до стадії бластоцисти у 87±7,2% випадків.

Ключові слова: кріоконсервування, клітини гранульози та кумулюсу, флуоресцентні зонди, кріозахисне середовище, культивування.

Добрунова И.В. Морфофункциональная сохранность клеток гранулезы и кумулюса яичника человека после действия факторов криоконсервирования - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.35 - криомедицина. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков, 2010.

Диссертационная работа посвящена изучению влияния различных факторов криоконсервирования на морфофункциональную сохранность клеток гранулезы и кумулюса (КГК), полученных из преовуляторных фолликулов яичника человека.

В задачи исследования входило: оценить особенности влияния проникающих и непроникающих криопротекторов, а также различных режимов криоконсервирования и гипотермического хранения на морфологические характеристики и функциональную активность КГК in vivo и in vitro, полученных из преовуляторных фолликулов яичника человека; определить целесообразность трансплантации данного биологического объекта.

Результаты исследования показали, что эквилибрация с двухкомпонентной криоконсервирующей средой, состоящей из 5%ДМСО + 5% ПЭО-400 и растворами криопротекторов - 5 % ДМСО, 5 и 10% ПЭО-400, 10% 1,2-ПД с

0,5 М сахарозой, незначительно влияют на структуру КГК после замораживания-оттаивания по сравнению с 10% ДМСО.

Показано, что трехэтапный способ охлаждения со скоростью 1-2С/мин на первом этапе, с использованием сидинга в момент начала кристаллизации, и скоростью охлаждения 10-12С/мин на втором этапе до -40-50С с последующим погружением образцов в жидкий азот, значительно лучше сохраняет структуру и стероидогенную активность фрагментов КГК по сравнению с быстрым замораживанием со скоростью 300-400оС/мин.

Методом культивирования была показана возможность сохранения криоконсервированными и хранившимися в условиях гипотермии фрагментами КГК биологической активности, которая проявлялась в адгезии, миграции и специфическом развитии клеток in vitro. Однако было отмечено, что после криоконсервирования с 10% ДМСО клетки значительно хуже развивались в культуре и на поверхности мембран образовывались «пузыри», которые не наблюдали при криоконсервировании с другими криопротекторами.

Использование криоконсервированных и хранившихся при гипотермии фрагментов КГК для ксенотрансплантации овариоэктомированным крысам подтвердило их морфофункциональную сохранность, что выражалось в восстановлении стероидопродуцирующей функции in vivo. Особенностью развития ксеноимплантатов было образование фолликулоподобных структур. Применение криоконсервированной суспензии клеток гранулезы в качестве обогащения питательной среды при сокультивировании с эмбрионами человека способствовало развитию эмбрионов до стадии бластоцисты в 87±7,2% случаев, что также является подтверждением жизнеспособности КГК после действия низких температур.

Результаты работы свидетельствуют о том, что полученные из преовуляторных фолликулов КГК могут быть использованы для криоконсервирования и создания банка КГК яичника человека, которые можно успешно применять в составе сред культивирования для биотехнологии, а также для ауто- и аллотрансплантаций в клинике при эндокринопатиях различного генеза

Ключевые слова: криоконсервирование, клетки гранулезы и кумулюса, флуоресцентные зонды, криозащитные среды, культивирование.

Dobrunova I.V. Morphofunctional integrity of granulose and cumulus cells of human ovary after cryopreservation factors' effect - Manuscript.

Dissertation for the candidate of medical sciences degree in specialty 14.01.35 - Cryomedicine. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2010.

Thesis is devoted to the estimation of the effect of different cryopreservation factors on morphofunctional integrity of granulose and cumulus cells (GCCs) of human ovary. On the base of experimental studies by means of the submerged culture method, xenotransplantation of GCCs to ovariectomized female rats, fluorescent probes and histological preparations there was designed the cryopreservation method for GCCs. It has been shown that cryoprotective effect of two-component cryopreserving medium (0.7 DMSO+0.3 PEO-400) if compared with different concentrations of a solution of cryoprotective agents DMSO, PEO-400, 1,2-PD using the stepwise cooling protocol statistically and significantly higher and enables to preserve their structure and steroidogenic activity in vivo and in vitro. Application of cryopreserved suspension of granulose cells for co-culturing with human embryos contributed to the development of embryos up to the stage of blastocyst in 87,2 % cases.

Key words: cryopreservation, granulose and cumulus cells, fluorescent probes, culturing.

Размещено на Allbest.ru

...