Зміни структурних компонентів спинного мозку і спинномозкових нервів при експериментальному цукровому діабеті та їх корекції нікотинамідом

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Національний Медичний Університет імені О.О. Богомольця

УДК: 611.16:611.813.11:616-099:547

14.03.01 - нормальна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Зміни структурних компонентів спинного мозку і спинномозкових нервів при експериментальному цукровому діабеті та їх корекції нікотинамідом

Кривко Юрій Ярославович

Київ - 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Львівському національному медичному університеті ім. Данила Галицького

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор Черкасов Віктор Гаврилович, Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, Заслужений діяч науки і техніки України, завідувач кафедри анатомії людини.

Захист відбудеться 21.10. 2010 року о 13.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 при Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця за адресою: 03057, м. Київ-57, пр. Перемоги, 34, морфологічний корпус, конференц-зал кафедри анатомії людини.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця за адресою: 03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1.

Автореферат розісланий 19 .09. 2010 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доцент І.В. Дзевульська

Анотації

Кривко Ю.Я. Зміни структурних компонентів спинного мозку і спинномозкових нервів при експериментальному цукровому діабеті та їх корекції нікотинамідом. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.03.01 - нормальна анатомія. - Національний медичний університет імені О.О. Богомольця. - Київ, 2010.

Дисертацію присвячено проблемі вивчення особливостей структурної організації компонентів спинного мозку та спинномозкових нервів, як складових простої рефлекторної дуги, за умов фізіологічної норми та при її порушеннях на ранніх етапах розвитку діабетичної дистальної сенсорномоторної нейропатії у щурів зі стрептозотоциновим діабетом та з'ясуванню можливостей фармакологічної корекції цих порушень. У дисертаційній роботі запропоновано нове вирішення наукової проблеми, що полягає у розробці концепції морфогенезу діабетичної сенсорномоторної нейропатії, визначенні порушень структурної організації компонентів спинного мозку та спинномозкових нервів, як складових простої рефлекторної дуги, при стрептозотоциніндукованому цукровому діабеті у щурів та обґрунтуванні можливостей корекції цих порушень нікотинамідом.

Встановлено, що сенсорномоторна нейропатія при стрептозотоциніндукованому діабеті характеризується стадійністю і фазністю розвитку, прогресуючим перебігом та супроводжується біохімічними зрушеннями. Виявлено, що при стрептозотоциніндукованому цукровому діабеті в стінці кровоносних капілярів і венул пери- та ендоневрію сідничого нерва та в гемомікроциркуляторному руслі його рухових та чутливих сегментарних центрів відбуваються зміни, які є структурним свідченням пошкодження гематоневрального бар'єру. Отримано підтвердження корегуючого впливу нікотинаміду на характер розвитку сенсорномоторної нейропатії. Виявлено особливість перебігу сенсорномоторної нейропатії при стрептозотоциніндукованому діабеті у вигляді включення апоптозного каскаду, який викликає загибель не просто одного нейрона, а порушення функціонування, як мінімум, одного нейронного ланцюга з його провідниковим апаратом.

Отримано комплексну системну морфологічну та додаткову біохімічну характеристику діабетичної сенсорномоторної нейропатії на етапах її розвитку та за умов дії нікотинаміду, що може служити підґрунтям для пошуку і апробації нейро- та ангіопротекторних середників з антиапоптозними властивостями з метою зменшення ризику виникнення та рецидивів ускладнень цукрового діабету, що сприятиме підвищенню ефективності лікування і поліпшенню якості життя хворих на цукровий діабет. діабетичний сенсорномоторний нейропатія

Основні результати праці знайшли впровадження у наукову та навчальну роботу кафедр морфологічного, неврологічного та ендокринологічного профілю і практичне застосування в ендокринологічних клініках.

Ключові слова: стрептозотоциніндукований цукровий діабет, структурна організація, сенсорномоторна нейропатія, гемомікроциркуляторне русло, апоптоз, корекція, нікотинамід.

Кривко Ю.Я. Изменения структурных компонентов спинного мозга и спинномозговых нервов при экспериментальном сахарном диабете и их коррекции никотинамидом. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.03.01 - нормальная анатомия. Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца. Киев, 2010.

Диссертация посвящена проблеме изучения особенностей структурной организации компонентов спинного мозга и спинномозговых нервов в условиях физиологической нормы и при ее нарушениях на ранних этапах развития диабетической дистальной сенсорномоторной нейропатии. В диссертационной работе предложено новое решение научной проблемы, суть которой состоит в разработке концепции морфогенеза диабетической сенсорномоторной нейропатии, определении нарушений структурной организации компонентов спинного мозга и спинномозговых нервов как частей простой рефлекторной дуги при стрептозотоцининдуцированном сахарном диабете у крыс и обосновании возможностей коррекции этих нарушений никотинамидом. Структурные компоненты в норме и при эксперименте изучали при помощи гистологических, электронномикроскопического, биохимических методов исследования и биологического моделирования сахарного диабета. В работе использовано 3 экспериментальные группы: I - крысы в разные сроки развития стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета; II - крысы с развитым стрептозотоцининдуцированным сахарным диабетом, которым вводили никотинамид в дозе 200 мг на 1 кг массы; III - крысы, которым, начиная с разных сроков развития стрептозотоцининдуцированного сахарного диабета, на протяжении определенного периода вводили никотинамид в дозе 200 мг на 1 кг массы. Такое распределение животных было обусловлено заданиями исследования: а) определить лечебное действие никотинамида (II экспериментальная группа); б) определить протекторное действие никотинамида (III экспериментальная группа). Общее количество исследованных животных (204 крысы) разделили на 11 подгрупп.

Установлено, что сенсорномоторная нейропатия при стрептозотоцининдуцированном сахарном диабете характеризируется стадийностю и фазностю развития, прогрессирующим ходом и сопровождается биохимическими изменениями. Определено, что при стрептозотоцининдуцированном сахарном диабете в стенке кровеносных капилляров и венул пери- и эндоневрия седалищного нерва, а также в гемомикроциркуляторном русле его двигательных и чувствительных сегментарных центров происходят изменения, которые являются структурным свидетельством повреждения гематоневрального барьера. Получено подтвержение коррегрующего влияния никотинамида на характер развития сенсорномоторной нейропатии. Определено, что особенностью сенсорномоторной нейропатии при стрептозотоцин-индуцированном диабете является включение апоптозного каскада, который вызывает гибель не только одного нейрона, но и нарушение функционирования, как минимум, одной нейронной цепи и её проводникового аппарата.

Дана комплексная системная морфологическая и дополнительная биохимическая характеристика диабетической сенсорномоторной нейропатии на этапах ее развития и в условиях действия никотинамида, что может служить основанием для поиска и апробации нейро-и ангиопротекторных препаратов с антиапоптозными особенностями с целью уменьшения риска рецидивов осложнений сахарного диабета. В целом это будет способствовать повышению эффективности лечения и улучшению качества жизни больных с сахарным диабетом.

Основные результаты исследования внедрены в научную и учебную работу кафедр морфологического, неврологического и эндокринологического профиля, а также рекомендованы для практического применения в терапевтических клиниках.

Ключевые слова: стрептозотоцининдуцированный сахарный диабет, структурная организация, сенсорномоторная нейропатия, гемомикроциркуляторное русло, апоптоз, никотинамид.

Kryvko Ju.Ya. The changes of the structural components of the spinal cord and spinal nerves in case of experimental diabetes with correction of the nikotinamid. - Manuscript.

A thesis for the Scholarly Degree of Doctor of Medical Sciences in speciality 14.03.01 - General Anatomy. - O.O. Bohomolets National Medical University in Kyiv, 2010.

The thesis sets out to explore the structural organization peculiarities of the spinal cord components and spinal nerves as constituents of a simple reflex arch in rats with streptozotocin diabetes both within the physiological norm and at early stages of diabetic distal sensomotor neuropathy. The possible pharmacological corrections of these disturbances are ascertained. A new approach to solving the scientific problem is initiated, which consists in conception elaboration of diabetic sensomotor neuropathy morphogenesis. Moreover, structural organization disturbances of spinal components and spinal nerves as constituents of simple reflex arch in rats with streptosotozininduced diabetes mellitus are identified. The possibilities to correct these disturbances with nicotinamide are substantiated.

It has been determined that sensomotor neuropathy and streptozotocininduced diabetes are characterized by staging and phasic development, progressing course accompanied by biochemical changes. The changes in the peri- and endoneurium capillary and venular walls of the sciatic nerve and in the haemomicrocirculatory bed of its motional and sensory centres indicate disturbances of haematoneural barrier in case of streptosotozin-induced diabetes. The corrective impact of nicotinamide on sensomotor neuropathy is confirmed. The peculiarity of sensomotor neuropathy as apoptose cascade inclusion is ascertained. This induces not only destructing a single neurone but malfunctioning at least one neurone chain with its conductive apparatus.

The complex systemic morphological and additional biochemical characteristics of early stages of diabetic sensomotor neuropathy with nicotinamide administration have been obtained. The achieved data may serve foundation for further exploration of neuro- and angioprotective mediators with antiapoptosic properties aimed at reducing risk of occurrence and relapses of diabetes mellitus complications. The attained results may enhance the treatment effectiveness and improve life quality in patients with diabetes mellitus.

The principal outcomes of the thesis have been applied into scientific and academic activities of morphological, neurological and endocrinological departments. The essential findings prove to be effective in practice of endocrinological clinics.

Key words: streptosotozininduced diabetes, structural organization, sensomotor neuropathy, haemomicrocirculatory channel, apoptosis, correction, nicotinamide.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Наукові дослідження останніх років свідчать про значний прогрес у пізнанні структурно-функціональної організації нервової системи. За цей період отримано численні нові дані, сформульовано цілий ряд гіпотез, створено концепції, які намагаються пояснити закономірності функціонування окремих нервових клітин, нервових центрів, їх провідникового апарату, клітин глії (Моторина М.В., 1993, Vanhatalo S. et al., 1998, Martini R., 1998, Бобрик І. І. та ін., 2001, Steward 0., 2002, Чайковський Ю.Б. та ін., 2007, Гриб В.А., 2008). Особливу зацікавленість науковців викликають нові дані про особливості впливу інсуліну на діяльність нервової системи (Третьяк Т.М. и др., 1990, Швыркова Н.А., 1995, Зиновьева О.Е. и др., 2007, Дзяк Л.А. та ін., 2008); про інсулін як нейротрофічний фактор (Smit A. et al., 1998, Мкртутян А.М. и др., 2008). Однак, в цей же час визначилась певна прогалина, яка обумовлена тим, що вивчення структури нервової системи значно відстає від дослідження її функцій. Справедливо відзначається, що це призводить до дефіциту інформації щодо численних тонких механізмів реалізації функцій нервової системи внаслідок відсутності їх структурного обґрунтування (Steward О., 2002). Це найперше стосується питання особливостей ультраструктурної організації спинного мозку і спинномозкових нервів, в тому числі, структурного оформлення простої рефлекторної дуги.

Питання про морфологію чутливих вузлів спинномозкових нервів, провідникового апарату вентральних та дорсальних корінців спинного мозку, стовбура спинномозкового нерва, його гілок та їх розгалужень, які утворені відростками рухових та чутливих нервових клітин мають велике практичне значення (Левицький В.А., 1998), особливо при вирішенні проблеми розвитку периферійної нейропатії (Сергієнко О.О. та ін., 2003). На сьогодні відсутні чітко уніфіковані показники щодо гліального оточення нейронів рухових і чутливих центрів простої рефлекторної дуги й особливості його перебудови на етапах розвитку цукрового діабету. Відсутній аналіз даних про ультраструктуру судинної стінки всіх ланок гемомікроциркулярного русла чутливих вузлів спинномозкових нервів, спинномозкових рухових центрів, корінців спинного мозку і периферійних нервів в умовах фізіологічної норми. Зокрема, не встановлено значення судин гемомікроциркуляторного русла у збереженні структурної цілісності всіх складових компонентів рефлекторної дуги; значення просторово-часових змін в них у патогенезі периферійної нейропатії.

Ріст захворюваності цукровим діабетом впродовж останніх років відзначається в цілому світі (Dyck R.Y. et al., 1999, Сергієнко О.О. та ін., 2003, Пальтов Є.В. та ін., 2006, Геращенко С.Б., 2007). Відповідно, ця патологія є однією з визначальних проблем сучасної ендокринології. Це зумовлюється ще й тим, що специфічна цукрознижуюча терапія сприяє збільшенню тривалості життя хворих, у зв'язку з чим зросла кількість діабетичних ангіонейропатій. Значне зростання частоти діабетичних нейропатій дає підставу вважати, що ураження центральної й периферійної частин нервової системи є характерною особливістю цукрового діабету (Балаболкин М.И., 1994, Дедов И.И. и др., 1998, Котов С.В. и др., 2000, Бобрик І.І.,2008, Матківський Р.М., 2008).

Отже, актуальною проблемою цукрового діабету є не тільки пізнання механізму розвитку структурних і метаболічних порушень, зокрема, при діабетичній периферійній нейропатії, але і пошук оптимальних шляхів їх корекції (Крыжановский Г.Н., 2001, Полторак В.В. и др., 2001, Черкасов В.Г., 2007). Відсутність чіткого морфологічного обґрунтування численних теорій патогенезу діабетичної нейропатії стимулює комплексні дослідження на різноманітних експериментальних моделях захворювання, найпоширенішою, сучасною та адекватною з яких є стрептозотоциновий діабет (Костюк Є.П., 1998, Титон В.Г., 1999, Котов С.В., 2000, Кіхтяк О.П. та ін., 2004, Паньків В.І., 2008, Тимченко А.М., 2008). Невирішеність зазначених вище питань зумовлює необхідність подальших досліджень особливостей структурних змін спинного мозку та спинномозкових нервів при експериментальному цукровому діабеті.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційне дослідження є фрагментом міжкафедральної планової науково-дослідної роботи кафедр нормальної анатомії, топографічної анатомії та оперативної хірургії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького "Функціональна анатомія ряду органів та архітектоніка їх судинного русла у пре- і постнатальному періодах онтогенезу при експериментальних порушеннях гемомікроциркуляції, реконструктивних операціях та цукровому діабеті" (номер держреєстрації 0195U006511). Як відповідальний виконавець автор самостійно виконав фрагмент дослідження, присвячений будові та функціональному стану компонентів спинного мозку і спинномозкових нервів у нормі, на різних етапах перебігу експериментальної дистальної сенсорномоторної нейропатії у щурів з стрептозотоциніндукованим цукровим діабетом, в тому числі в умовах корекції нейропатичних змін нікотинамідом.

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження - визначити особливості структурної організації компонентів спинного мозку, спинномозкових нервів, як складових простої рефлекторної дуги, в нормі та її порушення на ранніх етапах розвитку діабетичної дистальної сенсорномоторної нейропатії у щурів з стрептозотоциновим діабетом; з'ясувати можливості фармакологічної корекції цих порушень.

Завдання дослідження:

1. Визначити особливості ультраструктурної організації нейронів, клітин глії та компонентів стінки кровоносних судин рухових ядер та чутливих вузлів четвертого та п'ятого поперекових спинномозкових нервів: відповідних дорсального та вентрального корінців, сідничного нерва.

2. З'ясувати динаміку структурних порушень в зазначених вище структурах при моделюванні стрептозотоцинового діабету у щурів, порівняти їх з особливостями метаболічних порушень у цих структурах, визначених за допомогою комплексу біохімічних досліджень.

3. Встановити особливості впливу нікотинаміду на структурно-функціональний стан зазначених вище утворів при стрептозотоциновому діабеті у щурів.

Об'єкт дослідження: структурні компоненти спинного мозку та спинномозкових нервів щурів.

Предмет дослідження: оцінка структурної перебудови компонентів спинного мозку та спинномозкових нервів в динаміці розвитку нейропатії при стрепотозоциніндукованому діабеті та в умовах її корекції нікотинамідом.

Методи дослідження: з метою вивчення морфофункціонального стану структурних компонентів спинного мозку та спинномозкових нервів щурів у нормі, при стрепотозоциніндукованому діабеті та в умовах його корекції нікотинамідом був використаний метод експериментального моделювання діабету, а також гістологічні, електронно-мікроскопічний (трансмісійна електронна мікроскопія), біохімічні, біометричні та статистичні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що сенсорномоторна нейропатія при стрептозотоциніндукованому діабеті характеризується прогресуючим перебігом, супроводжується біохімічними зрушеннями та послідовними структурними змінами сідничого нерва, рухових і чутливих сегментарних центрів сідничого нерва. Визначено, що: а) активація поліолового шляху обміну глюкози при стрептозотоциніндукованому діабеті викликає нагромадження в тканині сідничого нерва сорбітолу і фруктози, вміст яких зростав відповідно в 7 та 13 разів; б) зниження співвідношення вільних NAD+/NADH та NADP+/NADPH в цитозолі клітин сідничого нерва активує альдозоредуктазу та інгібує сорбітолдегідрогеназу; в) активуються процеси перекисного окислення, зростає вміст дієнових кон'югатів і ТБК-позитивних продуктів та знижується активність ферментів антиоксидантного захисту: СОД, каталази, глутатіонпероксидази. Узагальнення одержаних морфологічних та біохімічних даних дозволило вперше описати стадійність і фазність розвитку діабетичної нейропатії, в якому запропоновано розрізняти: 1) першу стадію доапоптозних змін, яка складається з фази початкових змін або премітохондріальної фази (4 тижні після введення стрептозотоцину) та фази поглиблення аксональних змін або мітохондріальної фази (6 тижнів після введення стрептозотоцину); 2) другу стадію або стадію апоптозних змін, яка складається з фази початкових апоптозних змін нейронів спинномозкових вузлів та передніх рогів спинного мозку (8 тижнів після введення стрептозотоцину) та фази апоптозних змін нейронів на тлі виразного ураження судин гемомікроциркуляторного русла (10 тижнів після введення стрептозотоцину).

Аналіз морфологічних і біохімічних даних вперше дозволив засвідчити, що виявлені ультраструктурні прояви ураження цитоскелету і плазматичної мембрани нейронів та ендотеліоцитів судин гемомікроциркуляторного русла, а також позаклітинного матриксу (особливо базальної мембрани мікросудин) є наслідком неензиматичного глікозилювання протеїнів. Показано, що в принципі, однаковому механізмі ураження цих структур, ступінь прояву їх пошкодження (зважаючи на те, що уражена нервова тканина) є різним. В нейронах структурних змін зазнають нейротрубочки та нейрофіламенти (органели, що відповідають за внутрішньоклітинну і міжклітинну передачу сигналу). В свою чергу, в мієлінізованих волокнах змін зазнає мієлінова оболонка. При таких суттєвих первинних патологічних змінах нервових структур судинна складова вивченої сенсорномоторної діабетичної нейропатії стає принципово важливою.

Встановлено, що одним із факторів, який забезпечує перехід першої стадії діабетичної нейропатії у другу є деструкція мітохондрій нейронів чутливих вузлів спинномозкових нервів та передніх рогів спинного мозку. Висловлене припущення, що в умовах дослідженої нейропатії пошкодження мітохондріальних мембран є свідченням актуалізації мітохондріального шляху трансдукції сигналу апоптозу.

Вперше у щурів зі стрептозотоциніндукованим діабетом виявлено, що зміни ультраструктури синапсів на великих рухових нейронах передніх рогів спинного мозку (які свідчать про їхню підвищену функціональну активність) поєднуються з дегенеративними змінами окремих аксодендритних і аксосоматичних синапсів. У зв'язку з цим висунуто припущення, що поряд зі зворотніми перебудовами на ранніх стадіях розвитку цукрового діабету (4 тижні після введення стрептозотоцину) відбуваються стійкі зміни окремих синапсів, які призводять до втрати їх функції (6 тижнів після введення стрептозотоцину). З'ясовано, що найбільш виражені структурні зміни торкаються утвореної аксоном пресинаптичної частини синапсу, що, в цілому, свідчить про перевагу ураження аксонів при даній патології.

Доведено, що особливістю перебігу сенсорномоторної нейропатії при стрептозотоциніндукованому діабеті є включення апоптозного каскаду, який викликає загибель не просто одного нейрона, а порушення функціонування, як мінімум, одного нейронного ланцюга з його провідниковим апаратом. В процесі розвитку нейропатії з'являється патологічна система - патодинамічна організація з первинно змінених (дія стрептозотоцину) і вторинно змінених (дія гіперглікемії) компонентів простої рефлекторної дуги; ця патологічна система функціонально малоактивна і має дизадаптивну і пряму патогенну дію. Виникаючи ендогенно, як результат патологічного процесу, вона стає причиною його подальшого розвитку.

З'ясовано, що значну роль в індукції чутливих і рухових порушень при діабетичній нейропатії відіграють чутливі і рухові нейрони зі структурними ознаками гіперактивності, які вийшли з-під інтегративного контролю (розпад функціональної рефлекторної дуги). Ці нейрони визначають активність інших, пов'язаних з ними структур, і разом з ними утворюють гіперактивні патологічні системи.

Нами висунуто гіпотезу, що гіперактивні нейрони є патологічною детермінантою розвитку терапевтичного патоморфозу нейропатії під впливом нікотинаміду. Пригнічені нікотинамідом і збережені у вигляді структурно-функціональних слідів (окремі дистрофічно змінені і гіперактивні нейрони, структурно змінені аксони та синапси) патологічні системи та їх патологічні детермінанти є фактором ризику рецидиву діабетичної нейропатії.

Практичне значення одержаних результатів. Виконане дослідження поглиблює і доповнює відомості про механізми розвитку сенсорномоторної нейропатії при експериментальному моделюванні цукрового діабету за допомогою стрептозотоцину. В цій широко використовуваній у теперішній час моделі вперше описані два механізми (або дві послідовні хвилі) в розвитку апоптозу нейронів (і в розвитку самої нейропатії). Перший механізм пов'язаний з короткочасною дією стрептозотоцину, а другий є довготривалим і обумовлений дією гіперглікемії (триває після 8 тижня експерименту).

Вперше показано, що введення упродовж 2 та 4 тижнів нікотинаміду щурам з розвиненим цукровим діабетом (через 6 та 8 тижнів після введення стрептозотоцину) призводить до порушень двостадійного морфогенезу діабетичної сенсорномоторної нейропатії, які можна охарактеризувати як прояви терапевтичного патоморфозу нейропатії під впливом нікотинаміду. Нікотинамід знімає стадію апоптозних змін і нормалізує метаболічні зрушення в сідничому нерві.

Практичне значення мають вперше одержані дані про те, що корегуючий вплив нікотинаміду на характер розвитку сенсорномоторної нейропатії проявляється: а) гальмуванням поліолового шляху обміну глюкози в тканині сідничого нерва (що свідчить про антисорбітоловий ефект нікотинаміду); б) зменшення вмісту окислених метаболітів, пригніченням інтенсивності перекисного окислення ліпідів, підвищенням активності ферментів антиоксидантного захисту (що свідчить про антиоксидантний ефект нікотинаміду); в) загальною виразною антиапоптозною дією. Нормалізація показників метаболізму в сідничому нерві після введення нікотинаміду, однак, не нівелює усі структурні прояви діабетичної нейропатії, що свідчить про наявність у процесі розвитку нейропатії ендогенної складової.

Вперше висловлено припущення, що протекторна антиапоптозна дія нікотинаміду пов'язана з його здатністю блокувати периферійний бензодіазепіновий рецептор. Таким чином, нікотинамід можна віднести до окремої групи препаратів "загальної антиапоптозної дії". До цієї групи препаратів можуть увійти інші ліганди бензодіазепінових рецепторів (діазепін, кінуренін, пуріни), антиапоптозні властивості яких до теперішнього часу залишаються не вивченими.

Отримана комплексна системна морфологічна та додаткова біохімічна характеристика діабетичної сенсорномоторної нейропатії на етапах її розвитку та за умов дії нікотинаміду є підґрунтям для пошуку і апробації нейро- та вазопротекторних середників з антиапоптозними властивостями з метою зменшення ризику виникнення та рецидивів ускладнень цукрового діабету, що сприятиме підвищенню ефективності лікування і поліпшенню якості життя хворих на цукровий діабет.

Матеріали дисертації впроваджені у навчальний процес на кафедрі анатомії людини Національного медичного університету імені О.О. Богомольця, кафедрі анатомії людини Запорізького державного медичного університету, кафедрі анатомії людини Буковинського державного медичного університету, кафедрі анатомії людини та гістології медичного факультету Ужгородського національного університету, кафедрі анатомії людини Івано-Франківського національного медичного університету, кафедрі анатомії людини Дніпропетровської медичної академії, кафедрі анатомії людини Кримського державного медичного університету ім. С. І. Георгієвського, кафедрі анатомії людини Харківського національного медичного університету, кафедрі анатомії людини Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, в ендокринологічних відділеннях ОКЛ м. Ужгорода, у відділеннях Вінницького обласного медичного ендокринологічного диспансера, у відділеннях Київської міської ендокринологічної лікарні, у відділеннях Інституту проблем ендокринної патології імені В.Я. Данилевського АМН України, у відділеннях обласного ендокринологічно-клінічного диспансеру Чернівецької УОЗ ОДА, у відділеннях комунальної 4-ї міської клінічної лікарні м. Львова, у відділеннях Обласного ендокринологічного диспансеру УОЗ ОДА.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто обґрунтовано актуальність проблеми, здійснено патентно-інформаційний пошук, сформульовано концепцію, мету та задачі дослідження. Самостійно відтворено модель стрептозотоциніндукованого цукрового діабету, здійснено набір та обробку фактичного матеріалу. Проаналізовано і узагальнено отримані результати, сформульовано положення, висновки і практичні рекомендації. Автором не були використані результати виконаної ним раніше кандидатської дисертації та ідеї співавторів публікацій. Основною є участь автора у підготовці статей для опублікування у фахових журналах. Автор самостійно готував дані для інших публікацій, виступав на різних наукових форумах (з'їздах, конференціях, конгресах), особисто оформляв дисертаційну роботу та автореферат. Дисертантом написані всі розділи дисертації, сформульовано основні положення та висновки, підготовлено до друку результати власних досліджень. Запозичень ідей та розробок співавторів публікацій не було.

Апробація результатів дисертації. Основні результати доповідались і обговорювались на: 11-th International Congress on cardiovascular pharmacotherapy (Canada, Monreal, 2002), III-му Національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України (Київ. 2002), Міжнародній конференції "Саміт нормальних анатомів України та Росії" присвяченій року Росії в Україні (Тернопіль, 2003), VІІ-му з'їзді Всеукраїнського лікарського товариства (Тернопіль, 2003), науково-практичній конференції "Актуальні питання клінічної медицини та післядипломної освіти" (Ялта, 2004), VІ-ій міжнародній науково-практичній конференції морфологів України присвяченій проблемам функціональної анатомії (Львів, 2004), V-му Міжнародному конгресі інтегративної антропології (Вінниця, 2004), Національних Пироговських читаннях (Вінниця, 2004), Х-му Конгресі Світової Федерації Українських лікарських товариств (Чернівці, 2004), Всеукраїнській науковій конференції "Актуальні питання клінічної анатомії та оперативної хірургії" (Чернівці, 2004), ІV-му Національному Конгресі анатомів, гістологів, ембріологів та топографоанатомів України (Алушта, 2006), Міжнародній науковій конференції (Одеський медичний університет, 2009), Всеукраїнській науково-практичній конференції "Медична наука-2009" (Полтава 2009), Всеукраїнській науково-практичній конференції (Дніпропетровськ 2009), Всеукраїнській науково-практичній конференції (Вінниця 2009).

Публікації. Основні наукові положення і висновки опубліковано у 32 наукових працях, із них 27 статей (одноосібних - 17) у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 305 сторінках; складається з вступу, аналітичного огляду літератури, опису методів і обсягу дослідження, розділу власних досліджень, аналізу та узагальнення власних результатів дослідження, висновків. Список використаних джерел літератури складається із 480 найменувань (188 - кирилицею, 292 - латиницею). Робота ілюстрована 79 рисунками та 19 таблицями.

Основний зміст роботи

Дослідження виконано на 204 статевозрілих щурах-самцях масою 100-130г лінії "Вістар", віком 4,5-7,5 місяців. Матеріал для проведення морфологічного дослідження норми забирали під контролем біохімічних показників крові (цукор крові, рівень глікозильованого гемоглобіну та гемоглобін). Характеристика експериментального матеріалу наведена у таблиці 1.

Тварин для проведення дослідів ретельно відбирали. Кожну тварину оглядали, зважували та проводили маркування. Відібрану групу тварин утримували в окремій клітці на стандартному харчовому раціоні віварію. Ретельний огляд передбачав запобігання попаданню тварин з проявами внутрішньовіварійної інфекції у групу, яка передбачалася для забору матеріалу, на якому проводили дослідження.

Усі тварини знаходились в умовах віварію. При виконанні досліджень дотримувалися Конвенції Ради Європи про охорону хребетних тварин, що використовують в експериментах та інших наукових цілях (1986), Директиви ЄЕС № 609 (1986) та наказу МОЗ України № 281 від 01.11.2000р. "Про заходи щодо подальшого вдосконалення організаційних норм роботи з використанням експериментальних тварин".

В роботі використано 3 експериментальні групи тварин: І - щури у різні терміни розвитку стрептозотоциніндукованого цукрового діабету; ІІ - щури з розвиненим стрептозотоциніндукованим цукровим діабетом, яким вводили нікотинамід в дозі 200 мг на 1 кг маси; ІІІ - щури, яким, починаючи з різних термінів розвитку стрептозотоциніндукованого цукрового діабету, упродовж певного часу вводили нікотинамід в дозі 200 мг на 1 кг маси. Такий поділ тварин був обумовлений тим, що завданням дослідження було з'ясувати: а) можливу лікувальну дію нікотинаміду (ІІ експериментальна група); б) можливу протекторну дію нікотинаміду (ІІІ експериментальна група).

Загальна кількість тварин, що були задіяні у дослідженні (204 щурі) розділили на 11 підгруп:

1) 20 інтактних щурів (норма);

2) 40 щурів з цукровим діабетом, що розвивається (4 тижні після введення стрептозотоцину);

3) 40 щурів з розвиненим цукровим діабетом (6 тижнів після введення стрептозотоцину);

4) 16 щурів з розвиненим цукровим діабетом (8 тижнів після введення стрептозотоцину);

5) 16 щурів з розвиненим цукровим діабетом (10 тижнів після введення стрептозотоцину);

6) 10 щурів з розвиненим цукровим діабетом (6 тижнів після введення стрептозотоцину), котрим потім впродовж 2 тижнів вводили нікотинамід;

Таблиця 1. Характеристика експериментального матеріалу

7) 10 щурів з розвиненим цукровим діабетом (6 тижнів після введення стрептозотоцину), котрим потім впродовж 4 тижнів вводили нікотинамід;

8) 10 щурів з розвиненим цукровим діабетом (8 тижнів після введення стрептозотоцину), котрим потім впродовж 2 тижнів вводили нікотинамід;

9) 22 щура з цукровим діабетом, що розвивається (4 тижні після введення стрептозотоцину), котрим потім впродовж 2 тижнів вводили нікотинамід;

10) 10 щурів з цукровим діабетом, що розвивається (4 тижні після введення стрептозотоцину), котрим потім впродовж 4 тижнів вводили нікотинамід;

11) 10 щурів з цукровим діабетом, що розвивається (4 тижні після введення стрептозотоцину), котрим потім впродовж 6 тижнів вводили нікотинамід.

Таким чином загальна тривалість експерименту не перевищувала 10 тижнів.

При виконанні роботи застосовували комплекс методів дослідження: 1) гістологічне дослідження (світлова мікроскопія препаратів); 2) електронномікроскопічне дослідження; 3) біохімічне дослідження (рівень цукру крові, гемоглобін крові, рівень глікозильованого гемоглобіну, визначення метаболізму сорбітолу в тканині сідничого нерва; 4) біологічне моделювання стрептозотоциніндукованого цукрового діабету; 5) корекція проявів цукрового діабету нікотинамідом; 6) статистична обробка результатів дослідження за допомогою програми EXCEL для Windows XP.

Забір матеріалу для морфологічного та біохімічного досліджень проводили після евтаназії тварин. Саму евтаназію викликали методом передозування внутрішньоочеревенного наркозу з використанням тіопенталу (з розрахунку 25 мг/кг).

Матеріал з поперекового відділу спиного мозку (передні роги сегментів L4-L5) та середньої третини сідничого нерва обробляли за загальноприйнятою методикою гістологічного та електронномікроскопічного аналіза. Гістологічні препарати вивчали і фотографували під мікроскопом МБИ-1. Ультратонкі зрізи для електронної мікроскопії готували на ультрамікротомі УМТП-ЗМ за допомогою скляних ножів. Вивчення і фотографування матеріалу проводили за допомогою мікроскопа УЕМВ-100К (Україна) при прискорюючій напрузі 75 кВ.

Дослідження біохімічних показників крові включало - визначення рівня цукру крові глюкозооксидазним методом з використанням набору "ГЛЮКОЗА-ФКД", призначеного для кількісного виміру вмісту глюкози в крові і сечі. Визначення гемоглобіну проводили гемоглобін-цианідним методом. Досліджували також рівень глікозильованого гемоглобіну та метаболізм сорбітолу в тканині сідничого нерва.

У щурів інсулінзалежну форму цукрового діабету І типу, подібного до інсулінзалежної форми цукрового діабету І типу у людини, викликали одноразовим внутрішньоочеревенним введенням стрептозотоцину фірми "Sigma" з розрахунку 7 мг на 100 г маси тіла (виготовленому на 0,1 М цитратному буфері, рН = 4,5). Розвиток цукрового діабету протягом 70 днів контролювали за зростанням рівня глюкози в крові, яку вимірювали глюкозооксидазним методом. Відразу після ін'єкції стрептозотоцину щурам надавали необмежену кількість рідини (з метою стабілізації водного балансу та запобігання зневоднення). Критичний період після введення стрептозотоцину становив перших три-чотири доби. Дослідження проводили на тваринах з рівнем глюкози понад 13,48 ммоль /1л. Терміни дослідження експериментальної моделі стрептозотоциніндукованого інсулінзалежного цукрового діабету становили 4, 6, 8, 10 тижнів. Інтактні тварини відповідного віку складали контрольні групи.

Усіх експериментальних тварин утримували у контрольованих умовах оточуючого середовища: температура, вологість, 12-годинна зміна освітлення (день/ніч). Одержану модель цукрового діабету оцінювали за функціональними (зміна маси тварин, споживання корму і води), біохімічними (дослідження крові та тканини сідничого нерва) і морфологічними показникам (патоморфологічні зміни в сідничому нерві, його чутливих та рухових сегментарних центрах). Щоденно здійснювали клінічний огляд усіх піддослідних тварин з метою оцінки їх фізичного стану. До симптомів цукрового діабету, що відповідали стану організму при розвитку захворювання, у відповідності з рекомендаціями щодо моделювання цукрового діабету за допомогою стрептозотоцину, відносили: збільшення споживання рідини на фоні виразної поліурії, зниження маси тіла при незміненому або підвищеному споживанні їжі, ретинопатію, зниження рухової активності і підвищення втоми, парези та паралічі кінцівок.

Матеріал науково-дослідної роботи розглянуто членами комісії з біоетики Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького, протокол засідання №8 від 15.12.2004 p. Члени комісії дійшли узгодженої думки, що надані для експертизи матеріали науково обґрунтовані, при виконанні дослідження передбачені заходи стосовно морально-етичних норм у відповідності до принципів Гельсінської декларації прав людини, Конвенції Ради Європи про права людини і біомедицини та відповідних законів України.

Для проведення корекції проявів цукрового діабету внутрішньом'язево вводили нікотинамід в дозі 200 мг на 1 кг маси тіла щоденно протягом 2 та 4 тижнів тваринам з розвиненою гіперглікемією (II,III експериментальні групи).

Статистичний аналіз результатів дослідження проводили з використанням пакету Excel ХР на комп'ютері Intel Pentium IV.

Програма дозволяє одержати результати досліджень у вигляді наступних прогнозованих значень:

-середнє прогнозоване значення досліджуваного параметру (М);

-прогнозоване значення стандартної похибки (відхилення) досліджуваного параметру (t);

-середнє квадратичне відхилення (т).

Достовірність оцінювали коефіцієнтом Стьюдента при р<0,05.

Результати досліджень. Проведене дослідження показало, що сенсорномоторна нейропатія при стрептозотоциніндукованому діабеті характеризується прогресуючим перебігом, супроводжується біохімічними зрушеннями, які є проявами активації поліолового шляху обміну глюкози, змінами окисно-відновного стану NAD(P)-пар, інтенсифікації процесів перекисного окислення ліпідів, включення механізмів неензиматичного глікозування протеїнів та послідовними структурними змінами сідничого нерва, його рухових і чутливих сегментарних центрів.

Нами встановлено, що визначну роль у розвитку патологічних змін нервових та гліальних клітин має пошкодження мітохондрій, які найбільш тісно пов'язані з окисним обміном. Патологія мітохондрій виражається в осередковому просвітленні матриксу, частковому або повному зникненні крист, набуханні, порушенні цілісності внутрішньої мембрани і, нарешті, вакуолізації. Є певна нерівномірність ступеня пошкодження мітохондрій не тільки в різних нейронах, але і в одному нейроні, що залежить, мабуть, від різної реактивності мітохондрій в межах одного нейрона. З одного боку, мітохондрії пошкоджуються в ранні терміни експерименту, з іншого - вони залишаються порівняно збереженими тривалий час навіть в клітинах з вираженими пошкодженнями інших органелл. Це вказує на те, що в нервових клітинах тривалий час залишаються резервні можливості відновлення окисного обміну за рахунок збережених мітохондрій. Однак ураження мітохондрій вказує на серйозні порушення окисного обміну в цих клітинах, що викликає, в свою чергу, цілу низку змін ультраструктури нейронів та клітин глії. При цьому слід підкреслити, що в механізмах патологічних змін клітини важливу роль відіграє не тільки недостатність кисню, але й негайно слідуюче за ним накопичення недоокисних продуктів, що призводить до порушень внутрішньоклітинного гомеостазу. Морфологічним проявом цього є зміна стану внутрішньоклітинних колоїдів і реакція органел клітин, не пов'язаних безпосередньо з дихальною функцією клітини. В першу чергу це відноситься до органел, які забезпечують білоксинтезуючі функції клітини (ядро, ядерце, гранулярна ендоплазматична сітка, рибосоми, полісоми, агранулярна ендоплазматична сітка і т.д.). Патологічні зміни білоксинтезуючих структур починаються зі зменшення кількості полісом і рибосом, набухання і розпаду цистерн гранулярної ендоплазматичної сітки, збільшення кількості елементів агранулярної ендоплазматичної сітки, активації ядра. Одночасно в цитоплазмі клітини з'являються численні дрібні вакуолі, які, напевно, формуються в результаті розпаду ліпопротеїдів цитоплазми. Зміни ліпопротеїдів цитоплазми і каріоплазми в поєднанні з порушенням ультраструктури мембранних систем клітини призводять до підвищення осміофілії нервових клітин і появи різних форм "темних" нейронів, які характеризуються високою електронною щільністю ядра і цитоплазми. Отримані нами дані дозволяють стверджувати, що останні є характерною формою змін нервових клітин при стрептозотоциніндукованій діабетичній нейропатії.

Дослідження сегментарних центрів сідничого нерва в динаміці стрептозотоциніндукованої периферійної нейропатії вказує, що на початкових етапах у перикаріонах рухових нейронів виникають мало виражені зміни, які відображають реакцію трофічного центра на пошкодження периферійного відростка. Згодом спостерігається виникнення і прогресування ретроградних дистрофічних змін, обумовлених глибокими пошкодженнями аксонів, і порушення структурної організації гемато-нейронального бар'єру.

Структура перикаріонів аферентних нейронів спинномозкових вузлів характеризується раннім виникненням дистрофічних порушень, які в динаміці розвитку нейропатії прогресують і поглиблюються. Характер дистрофічних процесів у "світлих" і "темних" перикаріонів відрізняється. Для перших властиве первинне пошкодження білоксинтезуючого апарату, яке проявляється прогресуванням хроматолізу, і наростаючі деструктивні зміни мітохондрій. Для "темних" нейронів явища хроматолізу не характерні - зміни гранулярної ендоплазматичної сітки проявляються у вираженому набуханні і вакуольній трансформації. Однак у цих нейронах переважно пошкоджується ядро і ядерце. Раннє виникнення дистрофічних змін аферентних нейронів поєднується з посиленням процесів трансендотеліального транспорту і порушенням структури кровоносних мікросудин.

Клінічно в експериментальних тварин, починаючи з 6 тижня експерименту, визначається зниження рухової активності, на 8-10 тижнях - парези тазових кінцівок. Таким чином, при стрептозотоциніндукованому діабеті, нейропатія є первинною аксонопатією з прогредієнтним перебігом, прогресуванням дистрофічних змін мієлінових і безмієлінових нервових волокон, яка завершується атрофією, дегенерацією і розпадом переважно мієлінових нервових волокон різного діаметру. У морфогенезі токсичної нейропатії, викликаної стрептозотоциніндукованим цукровим діабетом, можна виділити:

- першу стадію або стадію доапоптозних змін, яка складається з: а) фази початкових змін або премітохондріальної фази (4 тижні після введення стрептозотоцину); б) фази поглиблення аксональних змін або мітохондріальної фази (6 тижнів експерименту);

- другу стадію або стадію апоптозних змін, яка складається з: а) фази початкових апоптозних змін нейронів спинномозкових вузлів та передніх рогів спинного мозку (8 тижнів експерименту); б) фази апоптозних змін нейронів на фоні виразного ураження судин гемомікроциркуляторного русла (10 тижнів експерименту).

Нами з'ясовано, що одним з факторів, який забезпечує перехід першої стадії діабетичної нейропатії в другу (і, одночасно, виступає як перша найсуттєвіша структурна ознака високої потенційної можливості прогредієнтного перебігу нейропатії) є деструкція мітохондрій нейронів спинномозкових вузлів та передніх рогів спинного мозку. В умовах дослідженої нейропатії пошкодження мітохондріальних мембран нейронів є свідченням актуалізації мітохондріального шляху трансдукції сигналу апоптозу.

Цікавою особливістю перебігу нейропатії при стрептозотоциніндукованому цукровому діабеті виявилась відносно більша (у порівнянні з нейронами) чутливість та висока апоптогенна залежність клітин глії та ендотеліоцитів судин гемомікроциркуляторного русла як в тканині сідничого нерва, так і в його рухових і чутливих сегментарних центрах. У зв'язку з останнім не виключено, що зміни клітин глії і розвиток мікроциркуляторної гіпоксії певним чином індукують, посилюють та моделюють апоптозні зміни нейронів.

На всіх стадіях розвитку сенсорномоторної нейропатії при стрептозотоциніндукованому діабеті має місце гіперглікемія та зростання рівня глікозильованого гемоглобіну. Ультраструктурним проявом пошкодження білків організму надміром глюкози є ураження цитоскелету і плазматичної мембрани нейронів та ендотеліоцитів судин гемомікроциркуляторного русла, мієлінових оболонок, клітин глії, а також позаклітинного матриксу (особливо базальної мембрани мікросудин). При цьому судинна складова морфогенезу діабетичної нейропатії є додатковою, але не менш важливою.

Суттєвим фактором, що призводить до появи фази поглиблення аксональних змін або до мітохондріальної фази (6 тижнів експерименту) і переходу до другої стадії або стадії апоптозних змін (8 тижнів експерименту) є встановлений нами парадоксальний феномен спазму артеріол і повнокрів'я венул в ендо- та периневрії сідничого нерва, який, ймовірно, пов'язаний з відкриттям артеріоло-венулярних анастомозів. Поява цього феномену поглиблює структурні та метаболічні прояви ішемічної гіпоксії сідничого нерва і сприяє прогредієнтному перебігу набряку периневральної та ендоневральної сполучної тканини. Іншим можливим поясненням вперше описаного нами феномену є визнання факту, що спазм багатьох артеріол не призводить до повноцінного стискання їх просвіту. За рахунок останнього кров таки потрапляє у просвіт кровоносних капілярів. Таким чином слід відзначити, що артеріоли втрачають свою функцію регуляторів кровотоку, а фізіологічні за своєю сутністю захисні механізми гемомікроциркуляції (зокрема, загальновідомо, що спазм артеріол запобігає розвитку набряку) у випадку сенсорномоторної діабетичної нейропатії є спотвореними і виступають як додаткові чинники гіпоксії і порушень процесів обміну речовин.

У ході проведеного нами дослідження виявлено, що у щурів на етапах розвитку стрептозотоциніндукованого діабету, поряд зі змінами ультраструктури великих рухових нейронів (альфа-мотонейронів) у передніх рогах спинного мозку, що свідчать про їх підвищену функціональну активність, виявляються також дегенеративні зміни аксодендритних і аксосоматичних синапсів. У зв'язку з цим можна казати, що поряд з оборотніми перебудовами на ранніх етапах розвитку цукрового діабету (4 тижні після введення стрептозотоцину) спостерігаються стійкі зміни окремих синапсів, що призводять до повного випадіння їх комунікативної функції (6 тижнів після введення стрептозотоцину). Найбільш виражені структурні зміни торкаються утвореної аксоном пресинаптичної частини синапсу, що, в цілому, свідчить про переважаюче пошкодження аксонів при даній патології.

Неоднорідність пошкодження синапсів на рівні одного і того ж сегмента і навіть одного рухового нейрона, напевно пов'язана із загальновідомим фактором, що на одному альфа-мотонейроні закінчуються різні терміналі спінальних і супраспінальних шляхів. У рамках використаних нами методів визначити патофізіологічну сутність дегенеративних змін терміналей важко. Можна припустити, що виявлена структурно-функціональна активація синапсів частково пов'язана із посиленням при цукровому діабеті аферентної імпульсації, що було показано нейрофізіологічними дослідженнями.

На підставі проведеного нами комплексного дослідження сідничого нерва і його сегментарних центрів можна стверджувати, що введення нікотинаміду щурам з розвиненим цукровим діабетом (через 6-8 тижнів після введення стрептозотоцину та 2-4 тижні введення нікотинаміду) призводить до порушень фазного морфогенезу діабетичної сенсорномоторної нейропатії. Ці порушення можна трактувати як прояви терапевтичного патоморфозу, що характеризується появою сукупності суттєвих і стійких змін властивостей діабетичної сенсорномоторної нейропатії під впливом нікотинаміду. У цьому випадку порівняння відповідних (за часом розвитку стрептозотоциніндукованого цукрового діабету) експериментальних підгруп: 3,4,5 (з І експериментальної групи) та 6,7,8 (з ІІ експериментальної групи) свідчить про якісно інші структурні механізми і прояви нейропатії. Слід, однак, зазначити, що етапність розвитку нейропатії зберігається, що дозволяє виділити у її перебігу:

1) І період (у щурів 6 екпериментальної підгрупи), який характеризується поєднанням помірного пошкодження перикаріонів аферентних нейронів спинномозкових вузлів, мієлінових нервових волокон і безмієлінових нервових волокон, що відбуваються на тлі структурних змін системи мікроциркуляції і вазогенного набряку ендоневрію. Головними дистрофічними проявами є дезорганізація будови ядерця і ядра великих аферентних нейронів спинномозкових вузлів, порушення ультраструктури органел цитоплазми.