Молекулярно-генетичне дослідження ролі ліпоксигеназного та епоксигеназного шляхів метаболізму арахідонової кислоти у патогенезі гострого інфаркту міокарда

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність проблеми. Гострий інфаркт міокарду (ГІМ) - це одна з клінічних форм ішемічної хвороби серця (ІХС), яка характеризується розвитком ішемічного некрозу міокарда, що виникає внаслідок абсолютної або відносної недостатності кровопостачання серця. Це захворювання значною мірою визначає загальний рівень смертності внаслідок серцево-судинних захворювань, який в Україні складає 63% у структурі загальної смертності та має тенденцію до зростання [Коваленко В.М., 2008]. Встановлено, що у патогенезі ГІМ важливу роль відіграють ферменти, які метаболізують арахідонову кислоту (АК), а саме 5-ліпоксигеназа (5-ЛО) і епоксигеназа 2J2 (ЕГ2J2). Кардіопротективний ефект інгібіторів 5-ЛО показано при моделюванні ішемії-реперфузії серця in vivo та ішемії-реперфузії ізольованого серця [Hashimoto H.,1990; Колчин Ю.Н.,1990; Мойбенко А.А., 1994]. Застосування інгібіторів до білка-активатора 5-ЛО (FLAP) здійснювало антиатеросклеротичний ефект [Jawien J., 2006], а для поліморфізму гена, що кодує згаданий білок встановлено асоціацію з такими захворюваннями, як інсульт, ГІМ та ІХС у різних популяціях [Helgadottir A.,2005; Kajimoto K.,2005; Zee R.Y.,2006]. Встановлено також, що експресія гена CYP2J2, що кодує кардіоспецифічну ізоформу епоксигеназ ЕГ2J2 [Wu S.,1996], зростає при моделюванні ішемії-реперфузії серця щурів in vivo [Ao Y., 2008], а відповідні речовини (епоксиейкозатрієнові кислоти), утворювані за участі цього фермента, володіють низкою кардіопротективних ефектів, зокрема пригнічують запалення, експресію молекул адгезії та міграцію гладком'язевих клітин, а також здійснюють фібринолітичний та вазодилатуючий вплив [Node K.,1999; Node K.,2001; Oltman C.L.,1998]. Кардіопротективні властивості цих молекул були підтверджені на експериментальних моделях ішемії-реперфузії серця [Nithipatikom K.,2006; Seubert J.M.,2007].

Потреба подальших досліджень участі 5-ЛО та ЕГ2J2 у патогенезі ГІМ, випливає із суперечливості представлених різними дослідниками даних. Зокрема, опубліковано результати, які ставлять під сумнів патологічну роль ліпоксигеназного шляху перетворення АК при ішемії-реперфузії серця [Hahn R.A.,1990; Hahn R.A., 1991; Maxwell M.P.,1991] та кардіопротективні властивості метаболітів епоксигеназного шляху [Granville D.J.,2004]. Також залишається недослідженою експресія генів ALOX5 та CYP2J2, які кодують відповідно 5-ЛО та ЕГ2J2, у клітинах серця за умов ішемії-реперфузії, відповідь на яке може обґрунтувати нові підходи до терапії ГІМ.

Зазначені дані, а також інформація про зміни експресії великої кількості генів у міокарді за умов ішемії та при ішемії-реперфузії [Stanton L.W.,2000; Nanni L.,2006; Nordlie M.A.,2006], обґрунтовують необхідність розробки таких методів терапії захворювань серцево-судинної системи, які б враховували зміни експресії певних генів та дозволяли ці зміни корегувати у необхідному напрямі. Тут може знайти застосування феномен РНК-інтерференції (РНКі), який було відкрито у 1998 році, а у 2006 році відзначено Нобелівською премією в галузі фізіології та медицини [Fire A.,1998]. Було встановлено, що в клітинах існує механізм, здатний специфічно деградувати певні мРНК і, таким чином, практично повністю заглушувати відповідний ген. Технологію тимчасового пригнічення експресії генів за допомогою цього механізму, яку також називають “нокдауном” генів, вже досить широко використовують дослідники різних галузей біології та медицини [Nordlie M.A.,2006; Sledz C.A.,2005]. Вважається, що система РНКі протидіє вірусним РНК та транспозонам (при вроджених імунологічних реакціях), а також відіграє важливу роль у регуляцї розвитку організму та підтриманні цілісності геному [Mattick J.S.,2001]. Активно досліджуються терапевтичні перспективи використання РНКі у боротьбі з вірусними захворюваннями [Cullen B.R.,2005; Delgado R.,2005] та раком [Pai S.I.,2005]. Опубліковано дані, що свідчать про можливість використання РНКі для терапії ІХС [Sugano M.,2005; Song H.,2008].

Мета дослідження: визначення молекулярно-генетичних механізмів участі ліпоксигенази та епоксигенази у патогенезі гострого інфаркту міокарда.

Завдання дослідження:

1. Визначити зміни експресії генів ALOX5 та CYP2J2 у культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів при моделюванні аноксії-реоксигенації;

2. Визначити зміни експресії генів ALOX5 та CYP2J2 у тканинах серця при моделюванні ішемії-реперфузії in vivo;

3. Дослідити вплив інгібіторів 5-ліпоксигенази та епоксигенази 2J2 на співвідношення живих та загиблих різними шляхами кардіоміоцитів у культурі при аноксії-реоксигенації;

4. Налагодити метод пригнічення експресії гена ALOX5 у кардіоміоцитах за допомогою малих інтерферуючих РНК in vitro та in vivo;

5. Оцінити вплив пригнічення експресії гена ALOX5 на співвідношення живих та загиблих різними шляхами кардіоміоцитів у культурі при аноксії-реоксигенації;

6. Визначити вплив пригнічення експресії гена ALOX5 на розмір некротичної ділянки міокарда при ішемії-реперфузії серця in vivo;

7. Визначити частоту поліморфізму G-50>T промотора гена CYP2J2 у хворих на гострий коронарний синдром громадян України.

1. Матеріали та методи дослідження

Експерименти виконано на первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів, отриманих із міокарда шлуночків 2-3-денних щурів лінії Вістар, а також на самках щурів цієї ж лінії вагою 300-350 г. Визначення частоти поліморфізму промотора гена CYP2J2 у хворих на гострий коронарний синдром були проведені на зразках крові пацієнтів Інституту кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України з клінічно діагностованим гострим коронарним синдромом, а саме нестабільною стенокардією, віком від 55 до 65 років у кількості 107 зразків та зразках крові практично здорових донорів від 55 до 65 років, отриманих на станціях переливання крові у кількості 104 зразків (79.7% чоловіків, 20.3% жінок).

Отримання та культивування ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура проводили за методикою, викладеною у роботі Reinecke H. et al. (1998) з деякими модифікаціями [Тумановська Л.В.,2004].

Моделювання аноксії-реоксигенації здійснювали шляхом аерації кардіоміоцитів безкисневою газовою сумішшю (5% СО2 та 95% Ar) протягом 30 хв. з подальшою заміною живильного середовища та культивуванням клітин за вихідних умов протягом 60 хв.

Визначення живих, некротичних та апоптотичних клітин проводили на флуоресцентному мікроскопі Nikon Eclipse E200 з використанням барвників біс-бензиміду (Hoeсhst 33342) та пропідіум йодиду в концентрації 8.75 мкМ/л.

Введення дволанцюгових РНК у ізольовані неонатальні кардіоміоцити. Дволанцюгові РНК, які не впливають на експресію жодного гену (контрольні РНК), та дволанцюгові РНК, специфічні до мРНК гена ALOX5 (інтерферуючі РНК), були синтезовані на замовлення компанією “Metabion international AG” (Німеччина). 2 мкг контрольних чи інтерферуючих РНК вводили у кардіоміоцити шляхом електропорації на приладі Nucleofector (Amaxa, США) з використанням набору реактивів для трансфекції неонатальних кардіоміоцитів Rat Cardiomyocytes Neo Nucleofector Kit (Amaxa, США). Визначення експресії генів ALOX5 та CYP2J2 у ізольованих кардіоміоцитах. Виділення РНК з культур кардіоміоцитів проводилося за допомогою набору реактивів для виділення РНК Trizol RNA-prep (Isogen, Росія). Концентрацію виділеної РНК визначали на спектрофотометрі NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, USA). Зворотну транскрипцію проводили за допомогою First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва), використовуючи 1.2-1.5 мкг РНК та гексамерний праймер. Комплементарну ДНК (кДНК) використовували для ампліфікації фрагментів досліджуваних генів за допомогою ПЛР у реальному часі з використанням специфічних праймерів: ALOX5-F 5`-GCC TAA GAA GCT CCC AGT GAC-3`, ALOX5-R 5`-ACT GGT GTG TAC AGG GGT CAG-3`, CYP2J2-5-F 5`-GCT GTC ACC TTT CTG TTC CTG-3` та CYP2J2-R 5`-GAA GGG ATA GGT GTG GCT GTT-3`. Експресію обох генів стандартизували відносно експресії мРНК гена 18S рРНК, для визначення якої було використано специфічні праймери: 18S-F 5`-CTT AGA GGG ACA AGT GGC G-3` та 18S-R 5`-GGA CAT CTA AGG GCA TCA CA-3`. Ампліфікацію фрагментів усіх згаданих генів проводили на термоциклері “7500 Fast Real-Time PCR System”. Програма ампліфікації включала активацію AmpliTaq Gold® ДНК-полімерази протягом 10 хв при 95 °C та складалася з 50 циклів: денатурація - 95 °C, 15 с, приєднання праймерів та елонгація - 64 °C, 1 хв. Аналіз отриманих данних проводили з використанням 7500 Fast Real-time PCR Software. Моделювання ішемії-реперфузії серця in vivo проводилося за описаною в літературі методикою [Roger A.W., 2000] з деякими модифікаціями [Lisovyy O.O., 2009]. За 20 хв до закінчення реперфузії тваринам вводили внутрішньовенно 0,05% розчин пропідіум-йодиду. Тваринам, на яких проводились дослідження по заглушенню експресії гена ALOX5, за 4 доби до операції вводили внутрішньовенно 200 мкг контрольних чи ALOX5-специфічних інтерферуючих РНК. Визначення розміру зони некротичного ураження міокарда проводили за описаною в літературі методикою [Roger A.W.,2000]. Серця розрізалися перпендикулярно повздовжної осі на 4 трансверсивні долі, з кожної з яких отримували зрізи товщиною 12 мкм. Пропідіум-йодид-позитивні зони зрізів фотографували за допомогою мікроскопу Nikon Eclipse E200 (фільтр D/PI, довжина хвилі збудження 510-560 нм). Сумарна площа некротичної зони визначалася планиметрично з використанням програмного забезпечення ImageJ 1.37V. Визначення експресії генів ALOX5 та CYP2J2 у тканинах серця було проведене шляхом ампліфікації фрагментів цих генів методом ПЛР у термоциклері “GeneAmp System 2700” (“Applied Biosystems”, США) з використанням згаданих вище пар праймерів. Програма ампліфікації фрагментів генів ALOX5 та CYP2J2 складалася з 35 циклів: денатурація - 95С (45 сек), приєднання праймерів - 64С (45 сек) і елонгація - 72С (45 сек) і крім цього включала в себе кінцеву елонгацію - 72С (7 хв). Експресію генів ALOX5 та CYP2J2 стандартизували відносно експресії гена гліцеральдегід-3-фосфат-дегідрогенази (GAPDH), програма ампліфікації якого складалася з 37 циклів: денатурація - 94С (50 сек), приєднання праймерів - 58С (60 сек) і елонгація - 72С (60 сек) і крім цього включала в себе кінцеву елонгацію - 72С (7 хв). Визначення активності 5-ліпоксигенази при моделюванні ішемії-реперфузії серця in vivo проводили шляхом визначення концентрації ейкозаноїду LTC4 у спиртових екстрактах зразків тканин серця за допомогою радіоімунного методу з використанням реактивів фірми "Amersham" (Англія). Визначення алельних варіантів гена CYP2J2 у хворих на гострий коронарний синдром проводили за допомогою методу ПЛР та рестрикційного аналізу як описано в літературі Spiecker M., Darius H., 2004.

2. Результати досліджень та їх обговорення

Експресія генів ALOX5 та CYP2J2 у ізольованих кардіоміоцитах при аноксії-реоксигенації. Відносний рівень мРНК гена ALOX5 у ізольованих кардіоміоцитах становив 7.5Ч10-5 ± 7.5Ч10-6 у.о. в нормальних умовах та практично не змінювався після аноксії-реоксигенації, в той час як експресія гена CYP2J2 за таких умов зменшувалася у 2.5 рази (Р<0.005). Вплив інгібіторів ліпоксигенази та епоксигенази на кардіоміоцити при аноксії-реоксигенації. Інгібітор ліпоксигенази кверцетин та його водорозчинну форму “Корвітин” вводили в середовище культивування кардіоміоцитів перед аноксією та реоксигенацією у дозі 2,5 мкМ, а специфічний інгібітор епоксигенази N-метилсульфоніл-6-(2-пропаргілоксифеніл) гексамід (MS-PPOH) у дозі 10 мкМ. Кверцетин та MS-PPOH розчиняли у чистому диметилсульфоксиді. Час інкубації клітин з інгібіторами становив 15 хв. Співвідношення живих, некротичних та апоптотичних кардіоміоцитів у контролі становило 89.8±0.90%, 3.2±0.33% та 5.8±0.73% відповідно. Після відтворення аноксії-реоксигенації кількість живих кардіоміоцитів зменшувалася до 79.1±1.31%, а кількість некротичних та апоптотичних клітин становила 7.7±1.11% та 11.9±1.04% відповідно (Р<0.05). Кверцетин та «Корвітин» у концентрації 2.5 мкМ здійснювали протективний ефект на кардіоміоцити при аноксії-реоксигенації, зменшуючи кількість некротичних та апоптотичних клітин.

Таблиця 1. Співвідношення (%) живих, некротичних та апоптотичних кардіоміоцитів у культурі при моделюванні аноксії-реоксигенації (АР) та введенні кверцетину та корвітину

Приріст некротичних і апоптотичних кардіоміоцитів після АР на тлі введення селективного інгібітора ЕГ2J2 MS-PPOH у концентрації 10 мкМ вірогідно не відрізнявся від такого, що мав місце при АР без застосування інгібітора.

Вплив заглушення гена ALOX5 на кардіоміоцити при аноксії-реоксигенації. Введення в культуру кардіоміоцитів ALOX5-специфічних інтерферуючих РНК призводило до зниження експресії відповідного гена в 4.7 рази (Р<0.005).

Через добу після введення у кардіоміоцити контрольних РНК співвідношення живих, некротичних та апоптотичних клітин становило 83.34±2.89%, 11.2±2.61% та 5.5±1.55% відповідно. У культурах, в які вводилися ALOX5-специфічні РНК це співвідношення було 76±3.65%, 15±1.43% та 8.9±2.54%. Після аноксії-реоксигенації кількість живих клітин у контрольних культурах зменшувалася до 62.7±1.85%, у той час як кількість некротичних клітин зростала до 29.5±2.61% (Р<0.05 у порівнянні з контрольною групою перед АР). Кількість апоптотичних клітин при цьому вірогідно не змінювалася. Співвідношення живих та некротичних клітин після аноксії-реоксигенації кардіоміоцитів із заглушеним геном ALOX5 становило 76±1.27% та 14.9±1.32% (Р<0.05 у порівнянні з контрольною групою після АР), у той час як кількість апоптотичних клітин за таких умов вірогідно не змінювалася.

Експресія генів ALOX5 та CYP2J2 у тканинах серця при ішемії-реперфузії. Експресія генів ALOX5 та CYP2J2 вірогідно не відрізнялася у тканинах серця удавано-оперованих щурів та тварин, на яких моделювали ІР серця in vivo. Внутрішньовенне введення ALOX5-специфічних інтерферуючих РНК призводило до зменшення експресії гена ALOX5 на 19.3±0.5% порівняно зі щурами, на яках моделювали ІР серця та тваринами, ІР серця яких передувало введення контрольних РНК (Р<0.05).

Вплив заглушення гена ALOX5 на активність 5-ліпоксигенази та ступінь ушкодження міокарда при ішемії-реперфузії серця. ІР серця на тлі введення контрольних РНК супроводжувалася зростанням вмісту ЛТС4 у тканинах серця у 1.75 разів у порівнянні з удавано-оперованими тваринами (Р<0.05). Заглушення гену ALOX5 супроводжувалося зниженням вмісту ЛТС4 у тканинах серця після ішемії-реперфузії в 3.3 рази порівняно з тими тваринами, проведенню ІР серця яких передувало введення контрольних РНК (Р<0.05).

Після ІР розмір некротичної ділянки міокарда збільшувався в 5.8 разів у порівнянні з контролем (Р<0.05). При моделюванні ішемії-реперфузії серця in vivo на тлі заглушення гена ALOX5, відбувалося зменшення площі некротичної ділянки міокарда у 3.8 рази у порівнянні з тими тваринами, яким до ішемії-реперфузії вводили індиферентні РНК (Р<0.05).

Частота G-50T поліморфізму промотора гена CYP2J2 у хворих на гострий коронарний синдром та у практично здорових осіб. Співвідношення генотипів G/G, G/T і T/T у дослідній групі склало 91%, 9% та 0% відповідно (у контролі - 92%, 7%, 1%; Р>0.05 за 2-критерієм). Серед 211 генотипованих людей було знайдено лише одну патологічну гомозиготу T/T.

Аналіз отриманих даних дозволяє зробити певні висновки про значення ліпоксигеназного та епоксигеназного шляхів метаболізму АК у процесах, що мають місце при ішемії-реперфузії серця та аноксії-реоксигенації культури кардіоміоцитів. Вперше визначено експресію генів ALOX5 та CYP2J2 у ізольованих кардіоміоцитах щурів, а також продемонстровано, що аноксія-реоксигенація не впливає на експресію гена ALOX5 у ізольованих кардіоміоцитах, у той час як експресія гена CYP2J2 в аналогічних умовах вірогідно зменшується. Відповідно, кардіоміоцити можуть експресувати ці гени та виступати джерелом відповідних ейкозаноїдів. Біофлавоноїд кверцетин, який є неспецифічним інгібітором ліпоксигеназ, здійснював протективний ефект на кардіоміоцити при аноксії-реоксигенації, в той час як специфічний інгібітор ЕГ2J2 не був ефективним за таких умов. Специфічне заглушення гена ALOX5 у кардіоміоцитах за допомогою інтерферуючих РНК дозволило збільшити кількість живих клітин після аноксії-реоксигенації за рахунок зменшення клітин, що загинули некротичним шляхом. Такий ефект може пояснюватися тим, що оскільки за каталітичної дії 5-ЛО утворюються прооксидантні речовини (гідроперекиси ліпідів), зрозуміло, що за участі даного ферменту відбувається порушення цілісності плазмалеми та мембран органел, що є провідною причиною розвитку некрозу [Duvoisin R.M.,1998; Festjens N.,2006; Kuhn H.,1990; Spiteller G.,2003]. А отже, за зменшення експресії гена ALOX5 та можливості утворення його білкового продукту, ймовірність розвитку подій за описаним сценарієм знижується. Деякі дані свідчать також про залучення ліпоксигеназ до запуску апоптотичної програми, зокрема спричиненої впливом TNF [Maccarrone M.,2001; Spiteller G.,2003]. За нашими даними, заглушення гена ALOX5 не запобігало апоптотичній загибелі кардіоміоцитів, що опосередковано свідчить про те, що запуск апоптозу кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації не потребує залучення ліпоксигеназ чи їх продуктів. Іншим механізмом впливу ліпоксигеназ на функціонування кардіоміоцитів та їх резистентність до ішемії є активація рецепторів лейкотрієнів (CysLT1 та CysLT2) [Liu P.,2003]. Останнім часом, із застосуванням різних методів, включаючи гібридизацію in situ, Northern blotting, та ПЛР, було показано наявність транскриптів згаданих рецепторів у тканинах серця [Heise C.E.,2000; Kamohara M.,2001; Lynch K.R.,1999; Ogasawara H.,2002]. Таким чином, лейкотрієни можуть аутокринно впливати на кардіоміоцити, взаємодіючи із специфічними рецепторами. В роботі Liu P. та ін. (2003) було встановлено, що мобілізація кальцію, індукована впливом ангіотензину ІІ в кардіоміоцитах, опосередковується активацією рецепторів лейкотрієнів, а інгібітор 5-ЛО AA-861 та селективний антагоніст рецептору CysLT1 (MK-571) запобігали збільшенню концентрації внутрішньоклітинного кальцію за впливу ангіотензину ІІ. Ці дані, дозволяють припустити, що протекторний ефект заглушення гена ALOX5 пов'язаний із зменшенням перевантаження кальцієм кардіоміоцитів, що значною мірою проявляється за умов гіпоксії. Про значення кальцій-залежного ушкодження кардіоміоцитів, зокрема при індукції некрозу, відомо досить давно [Nakayama H.,2007; Zimmermann K.C.,2001].

При ішемії-реперфузії серця продукти ліпоксигеназного шляху метаболізму АК опосередковують низку патогенних ефектів. Лейкотрієни виступають хемоатрактантами для нейтрофілів, опосередковують коронароконстрикцію та здійснюють аритмогенний ефект. У наших експериментах при ішемії-реперфузії серця in vivo спостерігалося незначне збільшення експресії гена CYP2J2 та зменшення експресії гена ALOX5, яке досить складно пояснити з огляду на зростання активності 5-ЛО при ішемії-реперфузії, встановлене у наших дослідах та описане раніше в літературі [Carry M.,1992]. Однак слід враховувати той факт, що регуляція активності 5-ЛО значною мірою залежить від білка FLAP, експресію якого ми не досліджували. Заглушення гена ALOX5 супроводжувалося зниженням утворення відповідних ейкозаноїдів та здійснювало протективний ефект при ішемії-реперфузії серця in vivo, а саме суттєво зменшувало зону некрозу міокарда. Таким чином, вперше показано, що специфічне пригнічення експресії гена, що кодує 5-ліпоксигеназу, здійснює кардіопротективний ефект.

Несуттєва різниця в розподілі алельних варіантів гену CYP2J2 у хворих на ГКС та практично здорових українців, яка була встановлена у наших експериментах, свідчить про те, що зниження експресії цього гена, яке відбувається при досліджуваному поліморфізмі його промотора, не відіграє важливої ролі у патогенезі ГКС в українській популяції або компенсується експресією інших факторів.

Отримані нами результати не дозволяють підтвердити дані про суттєву роль епоксигеназного шляху метаболізму АК у кардіопротеції тому метаболізм АК у процесі ішемії-реперфузії серця та ГІМ, скоріше за все, має більшою мірою патогенний характер. Ліпоксигеназний шлях перетворення АК, утворення лейкотрієнів та їх вплив на коронарний кровообіг та серце, а також інтенсивне утворення вільних радикалів кисню як у процесі оксидативних реакцій власне 5-ЛО, так і за рахунок приваблених нейтрофілів, має відносно більшу вагу в патогенезі гострого інфаркту міокарда. Технологія специфічного заглушення генів із застосуванням інтерферуючих РНК, яка була використана для запобігання ушкодження кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації та міокарду при ішемії-реперфузії в даній роботі, на нашу думку, відкриває великі перспективи для специфічної генотерапії інфаркту міокарда та ішемічного ушкодження інших органів.

Висновки

ішемічний ліпоксигеназа кардіоміоцит реоксигенація

У дисертаційній роботі за допомогою сучасних молекулярно-генетичних методів проведено дослідження ролі ліпоксигеназного та епоксигеназного шляхів метаболізму арахідонової кислоти у патогенезі ішемічно-реперфузійних уражень міокарда; розроблено метод заглушення гена, що кодує 5-ліпоксигеназу (ALOX5), доведено кардіопротективний ефект цього втручання, що відкриває нові перспективи терапії ішемічної хвороби серця.

1. Моделювання аноксії-реоксигенації неонатальних кардіоміоцитів щурів та ішемії-реперфузії серця щурів in vivo не призводить до вірогідних змін експресії гена ALOX5;

2. Налагоджений метод посттранскрипційного пригнічення гена ALOX5 за допомогою РНК-інтерференції дозволяє знизити рівень експресії цього гена у міокарді на 19 % при моделюванні ішемії-реперфузії серця in vivo та в 4.7 рази у ізольованих кардіоміоцитах при їх аноксії-реоксигенації у порівнянні з відповідними контролями;

3. Пригнічення гена ALOX5 здійснює кардіопротективний ефект як при проведенні ішемії-реперфузії серця, так і при аноксії-реоксигенації ізольованих кардіоміоцитів, зменшуючи розмір некротичної ділянки міокарда (у 3.8 рази) та кількість кардіоміоцитів у культурі, що гинуть шляхом некрозу;

4. Моделювання аноксії-реоксигенації неонатальних кардіоміоцитів щурів супроводжується зниженням експресії гена CYP2J2 у 2.5 рази, в той час як за умов ішемії-реперфузії серця щурів in vivo експресія цього гену вірогідно не змінюється;

5. Застосування специфічного інгібітора епоксигенази 2J2 не призводить до вірогідних змін у кількості живих, некротичних та апоптотичних кардіоміоцитів у культурі при аноксії-реоксигенації у порівнянні зі змінами, що мають місце при аноксії-реоксигенації без застосування інгібітору;

6. Поліморфізм промотору гена CYP2J2 не асоційований з гострим коронарним синдромом в українській популяції;

7. Отримано нові дані стосовно ролі ліпоксигеназного та епоксигеназного шляхів метаболізму арахідонової кислоти у патогенезі гострого інфаркту міокарда, які, зокрема, підтверджують патогенну роль 5-ліпоксигенази при ішемії-реперфузії серця та аноксії-реоксигенації культури кардіоміоцитів. Показано протективний ефект застосування РНК-інтерференції, направленої на ген ALOX5 при аноксії-реоксигенації кардіоміоцитів та ішемії-реперфузії серця in vivo.

Література

1. Гошовська Ю.В., Лісовий О.О., Шиманська Т.В., Сагач В.Ф. Зміни експресії генів UCP2 та UCP3, функціонального стану і кисневої вартості роботи міокарда в умовах старіння та ішемії-реперфузії // Фізіологічний журнал. - 2009. - Т. 55, № 3. - С. 26-37.

2. Лісовий О.О., Нагібін В.С., Сурова О.В., Тумановська Л.В., Досенко В.Є., Мойбенко О.О. Заглушення експресії гена ALOX5 із застосуванням малих інтерферуючих РНК запобігає некротичній загибелі неонатальних кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації // Фізіологічний журнал. - 2009. - Т. 55, № 3. - С. 37-44.

3. Лисовой А.О., Досенко В.Е., Пархоменко А.Н., Мойбенко А.А.Частота полиморфизма промотора гена, кодирующего эпоксигеназу 2J2, у больных с острым коронарным синдромом // Цитология и генетика. - 2009. - Т. 44, № 2. - С. 53-57.

4. Lisovyy O.O., Dosenko V.E., Nagibin V.S., Tumanovska L.V., Korol M.O., Surova O.V., Moibenko O.O. Cardioprotective effect of 5-lipoxygenase gene (ALOX5) silencing in ischemia-reperfusion // Acta Biochimica Polonica. - 2009. - Vol. 56, №4. - Р. 687-694.

5. Dosenko V.E., Tumanovska L.V., Lisovyy O.O., Moybenko O.O., Nagibin V.S. Interrelation between different death mechanisms in anoxia-reoxygenation of neonatal rat cardiomyocytes // Journal of Molecular and Cellular Cardiology. - 2008. - V. 44, І. 4. - P. 740, Abstracts XXVIII European Section Meeting of the International Society for Heart Research (Athens, Greece, 28-31 May 2008).

Размещено на Allbest.ru