Розробка складу та технології сиропу на основі фенольного комплексу із суцвіть липи серцелистої

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

15.00.01 - Технологія ліків та організація фармацевтичної справи

Розробка складу та технології сиропу на основі фенольного комплексу із суцвіть липи серцелистої

Бреусова Світлана Вікторівна

Харків 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі товарознавства Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України, м. Харків.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор ДЕМ'ЯНЕНКО ВІКТОР ГРИГОРОВИЧ, Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри товарознавства.

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України, академік Української АН ТИХОНОВ ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ, Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри аптечної технології ліків;

доктор фармацевтичних наук, професор МАЗУЛІН ОЛЕКСАНДР ВЛАДИЛЕНОВИЧ, Запорізький державний медичний університет, завідувач кафедри фармакогнозії, фармацевтичної хімії та технології ліків факультету післядипломноїосвіти.

Захист відбудеться 30.04.2010 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.02 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м, Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий 29.03. 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, проф. Д.І. Дмитрієвський

1. Загальна характеристика роботи

екстрагування суцвіття липа фітопрепарат

Актуальність теми. В останні часи у більшості країн світу захворювання шлунково-кишкового тракту (ШКТ) відносяться до найбільш розповсюджених, причому спостерігається постійна тенденція до їх зростання. Зокрема в Україні лише наприкінці 90-х років частота хвороб органів травлення збільшилася майже вдвічі.

Як відомо, лікарські засоби рослинного походження займають значне місце в терапії зазначених хвороб завдяки низькій токсичності, незначній частоті побічних ефектів і, відповідно, можливості тривалого вживання. Тому в деяких фармакологічних групах вони складають до 50% від загальної номенклатури. Однак, переважна більшість вітчизняних фітопрепаратів, на жаль, представлена достатньо простими лікарськими формами (зборами, чаями або просто фасованою сировиною), які є незручними у застосуванні та не можуть забезпечити адекватне дозування активних речовин і, як наслідок, очікувану терапевтичну ефективність.

Актуальними проблемами є також впровадження у вітчизняне фітохімічне виробництво нових видів рослинної сировини, розробка технологій їх комплексної переробки, інтенсифікація процесу екстракції й очищення біологічно активних речовин (БАР), а також стандартизація сировини і одержаних із неї субстанцій. Вирішення цього дозволить поліпшити якість та конкурентоспроможність українських фітопрепаратів у порівнянні з імпортними.

Суцвіття липи завдяки різноманітності хімічного складу та багатій сировинній базі на території України є перспективним джерелом різних лікарських субстанцій для промислового випуску препаратів із широким спектром фармакологічної активності. Проте в нашій країні й навіть за кордоном на даний час не освоєна промислова переробка даної сировини фармацевтичною промисловістю.

Крім того, вітчизняними підприємствами майже не виробляються гастроентерологічні фітопрепарати у формі сиропів (на даний час зареєстровано лише два препарати), які є найбільш придатними для лікування ШКТ, особливо в педіатрії.

Враховуючи вищевикладене, актуальними є виділення нових фітохімічних субстанцій для застосування в гастроентерології та розробка складу й технології сиропів на їх основі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт НФаУ «Фармакогностичне вивчення біологічно активних речовин, створення лікарських засобів рослинного походження» (№ держреєстрації 0103U000476) і проблемної комісії «Фармація» МОЗ та АМН України.

Мета і задачі досліджень. Метою роботи є розробка технології виділення фенольного комплексу з суцвіть липи серцелистої (ФКСЛ) та створення на його основі фітопрепарату у формі сиропу під умовною назвою «Липофен».

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

проаналізувати та узагальнити сучасні літературні та патентні джерела щодо перспектив розвитку фітохімічного виробництва в Україні та сучасних світових технологій екстрагування БАР рослинного походження;

провести аналіз асортименту сиропів, бальзамів та еліксирів на вітчизняному ринку;

провести товарознавчий і фармакогностичний аналіз різних серій вихідної сировини;

вивчити технологічні властивості суцвіть липи та шроту після екстракції зрідженими газами;

розробити методики стандартизації шроту, одержаного після екстракції суцвіть липи зрідженими газами, за основними діючими речовинами та числовими показниками;

дослідити фактори, що впливають на процес екстракції фенольних сполук зі шроту суцвіть липи, використовуючи метод математичного планування експерименту;

провести дослідження динаміки процесу екстракції фенольних сполук в залежності від режиму екстракції;

теоретично і експериментально обґрунтувати технологію очистки ФКСЛ від баластних речовин;

провести аналіз технологічних та фізико-хімічних властивостей ФКСЛ та розробити технічні умови на дану субстанцію;

провести скринінгові фармакологічні дослідження субстанції ФКСЛ і встановити дозування препарату;

теоретично й експериментально обґрунтувати склад сиропу з ФКСЛ під умовною назвою «Липофен»;

розробити технологію виробництва препарату «Липофен»;

провести аналіз якісних та кількісних показників готової лікарської форми, вивчити її стабільність в процесі зберігання;

розробити проект НД на запропонований препарат та обґрунтувати шляхи впровадження у промислове виробництво.

Об'єкти досліджень. Об'єктами досліджень є суцвіття липи серцелистої, шрот, одержаний після екстракції суцвіть липи зрідженим дифторхлорметаном (хладоном-22), фенольний комплекс із суцвіть липи, сироп «Липофен».

Предмет досліджень. Предметом досліджень служить стандартизація шроту суцвіть липи після екстракції хладоном-22, розробка технології екстракції та очистки ФКСЛ, вивчення його технологічних, фізико-хімічних і фармакологічних властивостей, розробка складу та технології сиропу з ФКСЛ «Липофен» для застосування в гастроентерології.

Методи досліджень. При виконанні даної роботи використовувалися наступні методи:

фармакопейні методи визначення технологічних і фізико-хімічних властивостей вихідної сировини, субстанції та готового препарату;

тонкошарова хроматографія та якісні хімічні реакції для ідентифікації об'єктів дослідження;

газова хроматографія для визначення залишкових кількостей розчинників;

спектрофотометричні та гравіметричні методи кількісного аналізу екстрактивних та діючих речовин;

методи математичного планування експерименту;

мікробіологічні дослідження контамінації субстанції та препарату;

фармакологічні методи визначення специфічної активності та нешкідливості субстанції;

статистична обробка експериментальних даних за допомогою програми Microsoft Excel XP.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше виявлені закономірності впливу зрідженого дифторхлорметану на технологічні властивості суцвіть липи.

Теоретично та експериментально обґрунтовано методики стандартизації шроту, одержаного після екстракції суцвіть липи зрідженими газами, що використовується в даній роботі, як вихідна сировина для одержання ФКСЛ.

Вперше досліджено вплив різних факторів на процес екстракції фенольних сполук зі шроту суцвіть липи з використанням методу математичного планування експерименту.

Вперше разом зі співавторами розроблено спосіб комплексної переробки суцвіть липи, який дозволяє одержувати три субстанції з різними механізмами фармакологічної дії. Запропонована технологія захищена патентом України на корисну модель № 36485.

Вперше теоретично обґрунтовано й експериментально відтворено склад та технологію оригінального препарату на основі ФКСЛ у формі сиропу. Проведено дослідження фізико-хімічних та технологічних показників сиропу з ФКСЛ, розроблено методики контролю якості готової лікарської форми, вивчено її стабільність при зберіганні.

Практичне значення одержаних результатів.

Розроблено методики стандартизації вихідної сировини.

Одержано субстанцію фенольного комплексу із суцвіть липи, проведено її фармакологічний скринінг та виявлено противиразкову активність, достатню для створення препарату з ФКСЛ.

Розроблено проект технічних умов на субстанцію ФКСЛ і технологічну інструкцію на її виробництво. На основі даної субстанції створено новий оригінальний препарат - сироп „Липофен” для застосовування в гастроентерології. Розроблено проекти аналітичної нормативної документації та технологічного регламенту на препарат „Липофен”. Технологія препарату апробована в умовах промислового виробництва на ВАТ „ХФЗ” Червона зірка”(акт апробації від 08.10.2009р).

Окремі фрагменти роботи впроваджені в навчальний процес Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Івано-Франківського національного медичного університету, Луганського державного медичного університету, Донецького державного медичного університету, Національного фармацевтичного університету (м. Харків).

Особистий внесок дисертанта. Автором особисто проведено патентний і літературний пошук з питань сучасного стану фітохімічного виробництва в Україні, нових технологій екстрагування рослинної сировини та виробництва рідких лікарських форм фітопрепаратів.

Дисертантом досліджено технологічні властивості суцвіть липи та шроту після екстракції хладоном-22, проведено їх якісний та кількісний аналіз.

В наукових роботах, опублікованих зі співавторами, вивчено вплив різних факторів на процес екстракції фенольних сполук зі шроту суцвіть липи, проведено очистку одержаних витягів різними методами, досліджено динаміку екстракції ФКСЛ, проведено якісний та кількісний аналіз виділеної субстанції.

Автором особисто обґрунтовано склад сиропу з ФКСЛ під умовною назвою „Липофен”, розроблено технологію його виробництва та методики контролю якості препарату. Спільно зі співавторами створено технічні умови на субстанцію ФКСЛ та проект АНД на препарат „Липофен”, проект технологічного регламенту на сироп „Липофен”, проект технологічної інструкції.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на трьох Всеукраїнських науково-практичних конференціях студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (Харків, 2007, 2008 та 2009 рр.), на Всеукраїнському конгресі „Сьогодення та майбутнє фармації” (Харків, 2008 р.).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 8 наукових праць, у тому числі 1 патент, 2 статті у фахових журналах та 5 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, 4 розділів експериментальної частини, загальних висновків, списку використаних літературних джерел та додатків. Дисертація викладена на 167 сторінках машинописного тексту, містить 37 таблиць і 16 рисунків. Бібліографія включає 187 літературних джерел, у тому числі 81 іноземних.

2. Основний зміст роботи

У вступі дисертації викладена актуальність теми, сформульована мета та основні завдання роботи, наведені об'єкти, методи та предмет досліджень, визначена наукова новизна та практичне значення одержаних результатів.

У першому розділі „Сучасний стан та тенденції розвитку лікарських засобів рослинного походження” розглянуті основні проблеми фітохімічного виробництва. Встановлено, що більшість вітчизняних фітопрепаратів представлені на ринку простими лікарськими формами - зборами, фіточаями, настойками, рідкими екстрактами, які виробляються за найбільш спрощеними технологіями та об'єктивно не стандартизуються. У той же час близько 80% стандартизованих субстанцій рослинного походження, зареєстрованих в Україні, є імпортованими. Доведено, що наукові дослідження з розробки і впровадження у виробництво нових технологій фітопрепаратів є актуальними на даний час.

Проаналізовано номенклатуру сиропів, бальзамів та еліксирів. Показано, що на українському ринку домінуючу позицію займають іноземні фітопрепарати в зазначених лікарських формах. Отже, необхідно розширювати вітчизняний асортимент препаратів рослинного походження.

У другому розділі „Обґрунтування загальної концепції та методів досліджень” викладено загальну методологію проведення досліджень, описано характеристики вихідної сировини, діючої та допоміжних речовин. Наведено прилади та методики якісного та кількісного аналізу об'єктів досліджень.

Обґрунтовано технологію виділення БАР з вихідної сировини, їх очистки від баластних речовин та вибір готової лікарської форми - сиропу. Діючу субстанцію (ФКСЛ) одержували зі шроту після попередньої екстракції подрібнених суцвіть липи зрідженим дифторхлорметаном (хладоном-22). Зазначений підхід дозволяє проводити комплексну переробку ЛРС та одержувати декілька активних інгредієнтів з різною фармакологічною активністю.

У процесі розробки сиропу „Липофен” було використано ФКСЛ як основну діючу речовину, а також допоміжні речовини, дозволені до медичного застосування. При вивченні якісних та кількісних показників готової лікарської форми застосовувалися загальноприйняті методи органолептичних, технологічних, фізико-хімічних, мікробіологічних та фармакологічних досліджень.

У третьому розділі „Дослідження технологічних властивостей та розробка методик стандартизації суцвіть липи” представлено результати вивчення технологічних, фармакогностичних, товарознавчих та фізико-хімічних показників вихідної сировини з метою її стандартизації.

Об'єктами досліджень були подрібнені суцвіття липи та шрот, одержаний після екстракції зазначеної сировини зрідженим дифторхлорметаном (хладоном-22).

Для вивчення технологічних властивостей відбирали дві фракції сировини і шроту з розмірами часток 0,5-1,0 мм (фракція 1) і 1,0-2,0 мм (фракція 2), які є найбільш прийнятними для екстрагування БАР.

Як видно з одержаних даних (табл. 1), обробка суцвіть липи зрідженими газами супроводжується збільшенням пористості, коефіцієнтів поглинання та набухання, що покращує умови екстрагування гідрофільними розчинниками.

Насипна густина сн та плинність помітно залежали від ступеня подрібнення: сн дрібних фракцій була приблизно в 1,4 рази вище, ніж крупних; плинність дрібних фракцій була низькою, а в крупних - взагалі була відсутня.

Коефіцієнти поглинання та набухання в значній мірі залежали від виду екстрагента та подрібненості сировини. При екстрагуванні 20% етанолом величина Кп знаходилася в межах 7,0-8,25 для тонкоподрібнених зразків і 5,47 - для більш крупної фракції. Підвищення концентрації спирту супроводжується зниженням величин Кп та Кн.

Таблиця 1 Результати визначення технологічних показників досліджуваних зразків

Технологічний показник	Сировина 0,5-1,0 мм	Сировина 1,0-2,0 мм	Шрот 0,5-1,0 мм	Шрот 1,0-2,0 мм
Вологість %	8,65±0,25	7,34±0,10	8,47±0,21	7,38±0,08
Плинність, сек/100 г	118,8±2,9*	відсутня	121,1±4,8*	відсутня
Насипна густина сн, г/см3	0,332±0,005	0,238±0,001	0,339±0,004	0,239±0,002
Об'ємна густина со, г/см3	1,071±0,026	0,989±0,030	0,899±0,044	0,823±0,021
Порозність	0,689±0,011	0,759±0,006	0,619±0,018	0,709±0,006
Пористість	0,295±0,017	0,349±0,020	0,409±0,029	0,459±0,014
Коефіцієнт поглинання: в 20% етанолі в 60% етанолі в 96% етанолі	7,00±0,09 5,72±0,12 3,40±0,13	5,48±0,13 3,42±0,17 1,81±0,14	8,25±0,10 6,50±0,12 3,37±0,02	5,47±0,09 4,83±0,28 1,88±0,07
Коефіцієнт набухання: в 20% етанолі в 60% етанолі в 96% етанолі	6,58±0,08 7,15±0,08 5,17±0,08	6,53±0,03 7,07±0,03 6,42±0,08	8,67±0,08 8,70±0,05 4,88±0,07	7,17±0,08 8,08±0,08 6,88±0,07

Дослідження показників якості проводилися у 6 зразках сировини: суцвіттях липи серцелистої, зібраних у 2007 році в Донецькій (1Д), Кримській (2Кр), Київській (3К), Житомирській (4Ж), Рівненській (5Р) областях, а також у шроті після екстракції зразку 5Р хладоном-22 (6Ш). Результати наведені в таблиці 2.

Таблиця 2.Результати аналізу зразків суцвіть липи та шроту відповідно до вимог ЕР та ДФУ 1.2

Показники	Нормування	№ зразку
		1Д	2Кр	3К	4Ж	5Р	6Ш
Опис	Згідно ДФУ 1.2	+	+	+	+	+	+
Зовнішні ознаки	Згідно ДФУ 1.2	+	+	+	+	+	+
Мікроскопія	Згідно ДФУ 1.2	+	+	+	+	+	+
Сторонні домішки	(Tilia americana L., Tilia tomentosa Moench)	не вияв.	не вияв.	не вияв.	не вияв.	не вияв.	не вияв.
Вологість	не більше 12 %	8,17	1,42	3,50	7,37	9,14	9,30
Сторонні домішки	не більше 2 %	0,1	0,45	0,65	0,15	0,2	0,2
Загальна зола	не більше 8 %	7,5	7,2	6,0	4,8	4,2	4,2

Проведені товарознавчі й фармакогностичні дослідження показали, що за усіма показниками якості суцвіття липи серцелистої, які були заготовлені в різних регіонах України, а також шрот після екстракції ліпофільного комплексу зрідженими газами відповідали вимогам монографій ЕР 5 та ДФУ 1.2.

Якісний аналіз досліджуваної сировини проводився методами тонкошарової (ТШХ) та паперової (ПХ) хроматографії в наступних системах розчинників:

- для тонкошарової хроматографії: кислота мурашина - вода - метилетилкетон - етилацетат (10:10:30:50) (А) за ДФУ 1.2; етилацетат - кислота мурашина - вода (70:15:15) (Б); етилацетат - метанол - вода (10:2:1) (В); етилацетат - кислота мурашина - кислота оцтова - вода (100:11:11:26) (Г);

- для паперової хроматографії: 15% кислота оцтова (Д); 2% кислота оцтова (Е).

Як видно з одержаних даних (рис. 1), система А, що внесена у фармакопейну монографію ДФУ 1.2, с.490, не забезпечує достатнє розділення флавоноїдів. Найоптимальнішою виявилася система Б, яка достатньо чітко розділяла 11 сполук, що входять до спиртового витягу із суцвіть липи.



Рис. 1 Схема тонкошарових хроматограм етанольного (60%) екстракту із суцвіть липи в системах А, Б , В, Г

Враховуючи, що вищенаведені методики ТШХ спрямовані на ідентифікацію флавоноїдів, необхідно було провести також аналіз оксикоричних (фенольних) кислот, що входять до складу ФКСЛ, методом ПХ.

На паперовій хроматограмі в системі Д виявлялося до 9 флавоноїдів та 3 сполуки з класу фенольних кислот. Для досягнення кращого розділення останніх нами проводилося хроматографування водних та спиртових екстрактів, одержаних з різних зразків сировини, в системі Е.

Експериментальні дані (рис. 2) показали, що фенольні сполуки добре розділяються в системі Е. В залежності від типу екстрагента та місця заготовки сировини на хроматограмах виявлялося від 2 до 4 плям, що відповідають флавоноїдам, та до семи зон оксикоричних кислот.

При порівнянні різних серій сировини було встановлено, що суцвіття липи, заготовлені в Криму, помітно відрізнялися за якісним складом від інших зразків. Виявлено також, що фенольні сполуки погано екстрагуються водою із ЛРС, зібраної в Київській області. Решта зразків давала досить стабільні, відтворювані результати. Серед випробуваних екстрагентів найоптимальнішим для аналітичної методики є 20% етанол (рис. 2).

Рис. 2 Схема паперових хроматограм екстрактів, одержаних різними розчинниками із сировини по регіонам заготівлі (система Е) чорним кольором виділені зони з жовтою або коричневою флюоресценцією; сірим - з синьо-зеленою або блакитною; плями без заливки - з зеленою

Наступним етапом даної роботи була розробка методик кількісного визначення діючих речовин, оскільки сучасні фармакопейні монографії на квітки липи й досі не містять відповідного розділу.

Як відомо, основною групою БАР, обумовлюючих більшість фармакологічних ефектів суцвіть липи (гепатопротекторний, седативний, протизапальний, імунотропний), є сума флавоноїдів, які представлені, в основному, глікозидами кверцетину (75-85%) та в меншому ступені - кемпферолу (15-25%).

Для кількісного аналізу зазначених БАР в наших дослідженнях використовувалися методи прямої спектрофотометрії за власним поглинанням флавоноїдів в областях 350-380 нм та диференціальної спектрофотометрії комплексів з алюмінію хлоридом, які мають максимуми абсорбції при 400-430 нм.

Експериментальні дані (табл. 3) показали, що методика прямого спектрофотометричного визначення флавоноїдів непридатна для екстрактів, одержаних із сировини 20 та 40% етанолом, внаслідок відсутності чіткого піку при довжині хвилі 370 нм. Використання 80% етанолу також дає нестабільні результати. Це пов'язано, очевидно, з наявністю супутніх речовин, які викликають інтерференцію спектрів та значно змінюють величину адсорбції в аналітичному діапазоні довжин хвиль.

Таблиця 3.Результати кількісного аналізу флавоноїдів в залежності від умов екстрагування

№ досліду	Тривалість кожного етапу екстракції, хв.	Концентрація етанолу, %	Співвідношення сировина : екстрагент	Кількість етапів екстракції	Вихід суми флавоноїдів, %
1	80	60	1:20	2	3,59
2	60	60	1:15	4	2,89
3	40	40	1:20	4	2,51 (пік нечіткий)
4	40	20	1:15	3	немає піка
5	60	80	1:20	3	1,7 (пік нечіткий)
6	60	40	1:5	1	немає піка
7	120	80	1:30, 1:20	2	2,0

Наступним завданням наших досліджень було перевірити придатність диференціальної спектрофотометрії для кількісного визначення флавоноїдів в екстрактах із суцвіть липи, одержаних етанолом різної концентрації.

Було встановлено, що спектри усіх досліджуваних зразків незалежно від міцності взятого екстрагенту мали чіткий максимум при 427±2 нм.

З використанням зазначеної методики було проаналізовано вміст суми флавоноїдів у сировині, заготовленій в Рівненській (2007 та 2008 рр.), Вінницькій, Хмельницькій та Житомирській областях (2008 р.).

Встановлено, що вміст вказаних БАР коливався в широких межах (від 0,25 до 0,52%) в залежності від місця заготівлі, причому найвищі показники фіксувалися в ЛРС із Рівненської області як 2007, так і 2008 року заготівлі (табл. 4). З огляду на це, дані серії сировини використовувалися в подальших дослідженнях.

Таблиця 4 Вміст суми флавоноїдів у суцвіттях липи, заготовлених в різних регіонах України

Область та рік заготівлі сировини	Вінницька 2008	Житомирська 2008	Хмельницька 2008	Рівненська 2008	Рівненська 2007
Вміст суми флавоноїдів в перерахунку на абсолютно суху сировину, %	0,3412± 0,0059	0,3002± 0,0044	0,2427± 0,0068	0,5173± 0,0128	0,4620± 0,0090
Відносна похибка, %	1,73	1,46	2,81	2,48	1,95

Як видно з даних табл. 4, методика кількісного аналізу флавоноїдів суцвіть липи з використанням диференціальної спектрофотометрії має достатню точність та відтворюваність, відносна похибка не перевищує 3%.

У четвертому розділі „Теоретичне та експериментальне обґрунтування технології виділення фенольного комплексу із суцвіть липи” наведено результати досліджень процесу екстракції фенольних сполук з вихідної сировини, обґрунтовано вибір методу очищення фенольного комплексу від баластних речовин, вивчено технологічні та фізико-хімічні властивості субстанції ФКСЛ.

Як відомо, ефективність процесу екстракції залежить від цілого ряду факторів, обумовлених типом екстрагента, технологічними властивостями сировини і гідродинамічними умовами екстрагування.

Для обґрунтування оптимальних умов процесу екстракції фенольних сполук з вихідної сировини нами був застосований метод математичного планування експерименту - греко-латинський квадрат 4Ч4. Під час проведення оптимізації досліджували вплив наступних змінних факторів на вихід екстрактивних речовин та БАР: часу екстрагування (20-80 хв), кратності витягів (1-4 рази), концентрації етанолу (20-80%), співвідношення сировини до екстрагенту (1:5 - 1:20).

Як видно з даних табл. 5, найбільший вихід екстрактивних речовин досягався при 4- кратному екстрагуванні 20% етанолом протягом 80 хвилин кожний раз навіть при мінімальному співвідношенні сировина / екстрагент (1:5).

Таблиця 5 Вихід екстрактивних речовин та БАР в залежності від умов екстракції

Фактори та їх рівні	Вихід екстрак. речовин, %	Вихід флавоноїдів відносно наважки сировини, %	Повнота витягу суми флавоноїдів, %
час екстрагування, хв.	концентрація етанолу, % об.	співвідношення сировина: екстрагент	кратність витягів
60 хв.	20	1:10	2 рази	21,86	0,1135	23,75
20 хв.	20	1:20	1 раз	18,28	0,1697	35,49
40 хв.	20	1:15	3 рази	27,49	0,1256	26,28
80 хв.	20	1:5	4 рази	32,27	0,0892	18,65
60 хв.	40	1:5	1 раз	18,77	0,1987	41,56
20 хв.	40	1:15	2 рази	23,65	0,2603	54,46
40 хв.	40	1:20	4 рази	27,86	0,3133	65,55
80 хв.	40	1:10	3 рази	26,43	0,3342	69,91
20 хв.	60	1:5	3 рази	12,43	0,1958	40,95
40 хв.	60	1:10	1 раз	11,41	0,1787	37,39
60 хв.	60	1:15	4 рази	26,62	0,4651	97,31
80 хв.	60	1:20	2 рази	23,16	0,3759	78,64
20 хв.	80	1:10	4 рази	16,10	0,2611	54,63
40 хв.	80	1:5	2 рази	9,64	0,3283	68,69
60 хв.	80	1:20	3 рази	18,91	0,3131	65,50
80 хв.	80	1:15	1 раз	10,88	0,2835	59,31

Однак достатньо високі виходи (26-27%) спостерігалися також при екстракції 40% і навіть 60% етанолом, але при більших співвідношеннях сировини до екстрагенту. Це можна пояснити доброю розчинністю екстрактивних речовин у розведених спиртах. При підвищенні міцності етанолу їх розчинність погіршується, тому потрібно більше екстрагенту.

Екстрагування суми флавоноїдів доцільно проводити 60% етанолом 4 рази по 60 хвилин при співвідношенні сировина/екстрагент 1:15 або 2 рази по 80 хвилин при співвідношенні 1:20.

Наступним етапом даної роботи було обґрунтування способу очистки екстракту від баластних речовин, які в більшості випадків негативно впливають на якість готових лікарських засобів та їх фармакологічні й біофармацевтичні властивості.

В наших дослідженнях застосовувалися найбільш розповсюджені методи - рідинна екстракція та осадження шляхом зміни розчинника.

Було апробовано три системи розчинників, які мають достатню селективність до фенольних сполук: А - етилацетат - ізобутанол - вода (1:1:0,2); Б - етилацетат - ізобутанол (9:1); В - етилацетат.

Встановлено, що очистка підкислених первинних витягів системою А призводить до значного збагачення субстанції ФКСЛ флавоноїдами, вміст яких збільшується в 4 рази порівняно із неочищеними сухими екстрактами. У той же час вихід екстрактивних речовин (сухого залишку) відносно маси вихідної сировини зменшується в 4,5 рази. Таким чином, втрачається близько 10% флавоноїдів (табл. 6).

Таблиця 6 Ефективність різних способів очистки екстрактів із суцвіть липи

Спосіб очистки	Вихід екстрактивних речовин, % від маси сировини	Вміст суми флавоноїдів у сухому залишку, %	Вихід суми флавоноїдів, % від маси сировини	Втрати БАР після очистки, %
	Без очистки	після очистки	Без очистки	Після очистки	Без очистки	Після очистки
Рідинна екстракція системою А	23,15	5,76	1,62	5,23	0,375	0,301	19,7
Рідинна екстракція системою А із кислого середовища	22,75	5,07	1,75	7,02	0,398	0,356	10,6
Осадження баластних речовин 96% етанолом 1:2	26,81	26,13	2,05	2,18	0,550	0,569	0,0
Осадження баластних речовин 96% етанолом 1:5	26,81	22,47	2,05	2,08	0,550	0,467	15,1
Двократне осадження баластних речовин 96% етанолом 1:3, 1:2	26,81	19,41	2,05	1,75	0,550	0,340	38,2

Як видно з даних табл. 6, найоптимальнішим методом очистки є осадження баластних речовин із випарених екстрактів 96% етанолом у двократному співвідношенні відносно кубового залишку.

Результати фармакологічних досліджень показали, що субстанції, очищені органічними розчинниками та осадженням спиртом, за противиразковою дією практично не відрізняються від неочищених екстрактів, але екстракт після осадження етанолом має значно нижчу токсичність, тому даний метод використовувався при розробці технології препарату.

Якість субстанції ФКСЛ оцінювалася за наступними показниками: опис, втрата в масі при висушуванні, ідентифікація, температура плавлення, важкі метали, кількісний вміст діючих речовин, мікробіологічна контамінація.

Встановлено, що досліджувані серії ФКСЛ, одержані за розробленою нами технологією, характеризувалися стабільними показниками якості (табл. 7).

При вивченні технологічних та фізико-хімічних властивостей субстанції було встановлено, що вона має дуже високу гігроскопічність навіть при п'ятикратній кількості наповнювачів (лактози та магнію карбонату) та низьку плинність. Отже, найбільш доцільним є розробка рідкої лікарської форми з ФКСЛ.

Таблиця 7 Показники якості досліджуваних серій субстанції ФКСЛ

Показники якості	Досліджувані зразки
	Серія 1	Серія 2	Серія 3	Серія 4
Опис	Однорідний середньо-дрібний порошок від жовто-коричневого до коричнево-бежевого кольору зі слабким, специфічним „рослинним” запахом, дуже гігроскопічний
Втрата маси при висушуванні, %	1,75	1,38	0,50	3,02
Температура плавлення, °С	88-92	87-90	88-93	88-91
Якісні реакції: органолептична (1) на флавоноїди (2) на фенольні кислоти (3)	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +
Важкі метали, %	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
Кількісний вміст суми флавоноїдів, %	2,18± 0,03	2,08± 0,06	2,15± 0,02	2,19± 0,06
Мікробіологічна чистота, КУО/г: загальне число бактерій загальне число грибів род. Enterobacteriaceae	50 40 відсутні	40 50 відсутні	40 60 відсутні	50 50 відсутні

У п'ятому розділі „Розробка складу та технології сиропу з фенольним комплексом із суцвіть липи” обґрунтовано склад та технологію сиропу „Липофен”, описано стадії технологічного процесу виробництва препарату, наведено результати досліджень показників якості та стабільності „Липофену”.

Раціональний вибір готової лікарської форми базується на технологічних й фізико-хімічних властивостях діючої та допоміжних речовин, а також особливостей дозування препарату. Враховуючи відносно високу добову дозу ФКСЛ, яка складає 0,45 г, та технологічні властивості субстанції, необхідно було розробити склад та технологію рідкої лікарської форми - сиропу.

Для обґрунтування складу сиропу нами був застосований метод математичного планування експерименту - греко-латинський квадрат 4Ч4. Досліджували вплив змінних факторів: типу солюбілізатору, його кількості (5-35 г), маси доданого 96% етанолу (0-15г), кількості сахарози (0-30 г) - на однорідність та прозорість одержаного сиропу.

Однорідність та прозорість сиропу оцінювали візуально безпосередньо після приготування та через 72 години за 4-бальною умовною шкалою: 0 балів - сироп неоднорідний, з осадом, флокулятом або дуже каламутний; 1 бал - сироп каламутний, непрозорий, але без ознак розшарування інгредієнтів; 2 бали - спостерігається невелика опалесценція; 3 бали - абсолютно прозорий розчин.

Повну однорідність та прозорість мали композиції № 10, 13 та 14 (табл. 8). Однак, внаслідок дуже високої в'язкості складу №13, його було вилучено з подальших експериментів. Дисперсійний аналіз одержаних результатів показав, що кількість солюбілізатору найбільше впливає на гомогенність сиропів.

Враховуючи одержані дані та рекомендацій ДФУ щодо сиропів, нами було приготовлено композиції 10 та 14 із вмістом сахарози 45% (зразки 1 та 2). Після 14 діб зберігання при кімнатній температурі в першому зразку спостерігалися незначні сторонні включення (агрегати) та ознаки мікробної забрудненості. Отже, для подальших досліджень був обраний зразок 2.

Дослідження ефективності антимікробних консервантів показали, що введення до складу сиропу 0,2% кислоти сорбінової забезпечувало надійний ефект.

При обґрунтуванні вибору коригентів смаку та запаху методом експертних оцінок було встановлено, що найкращі властивості мають зразки, які містять комбінації ваніліну із абрикосовим або барбарисовим ароматизатором.

Таким чином, на основі проведених досліджень знайдено найбільш оптимальний склад сиропу „Липофен”: ФКСЛ - 4,5 г, ПЕО-400 - 35 г, сахарози - 45 г, кислоти сорбінової - 0,2 г, ароматизатору „Абрикосовий” - 0,2 г, ваніліну - 0,02 г, води очищеної - до одержання 100 мл сиропу.

При розробці технології препарату обґрунтовано послідовність введення інгредієнтів: у воді розчиняти ПЕО-400, консервант і ароматизатори; суху діючу речовину потрібно змішувати із сахарозою, а потім гомогенізувати всі інгредієнти.

Таблиця 8 Композиції сиропів з ФКСЛ та їх органолептичні характеристики

№ складу	Інгредієнти, г	Вода очищена	Однорідність та прозорість, балів
	Гліцерин	ПЕО-400	Пропілен-гліколь	Сорбіт	Етанол 96%	Сахароза		після пригот.	через 72 години
1	5	-	-	-	15	-	до 100 мл	0	0
2	-	5	-	-	10	20	до 100 мл	0	0
3	-	-	5	-	5	10	до 100 мл	1	1
4	-	-	-	5	-	30	до 100 мл	1	1
5	15	-	-	-	10	10	до 100 мл	2	2
6	-	15	-	-	15	30	до 100 мл	2	1
7	-	-	15	-	-	-	до 100 мл	2	2
8	-	-	-	15	5	20	до 100 мл	1	1
9	25	-	-	-	-	20	до 100 мл	2	2
10		25	-	-	5	-	до 100 мл	3	3
11	-	-	25	-	10	30	до 100 мл	3	2
12	-	-	-	25	15	10	до 100 мл	2	2
13	35	-	-	-	5	30	до 100 мл	3	3
14	-	35	-	-	-	10	до 100 мл	3	3
15	-	-	35	-	15	20	до 100 мл	3	2
16	-	-	-	35	10	-	до 100 мл	2,5	1

Визначено основні параметри технологічного режиму приготування сиропу: гомогенізацію слід проводити в реакторі з турбінною мішалкою при швидкості 3000 об/хв протягом 40 хвилин при кімнатній температурі або 20 хв. - при 40°С.

На підставі проведених досліджень нами була розроблена промислова технологія сиропу „Липофен”, схема якої представлена на рис. 3.

За розробленою технологією було одержано 4 серії сиропу. В зразках, відібраних від кожної серії досліджувалися наступні показники якості: опис, ідентифікація, рН, густина, об'єм вмісту контейнеру, показник заломлення, кількісний вміст суми флавоноїдів, мікробіологічна контамінація (табл. 9).

Як видно з табл. 9, всі серії сиропу мали стабільні показники якості та відповідали вимогам ДФУ. При вивченні стабільності препарату встановлено, що його показники якості практично не змінюються протягом 18 місяців.

Таблиця 9 Показники якості досліджуваних серій препарату „Липофен”

Показники якості	Досліджувані зразки
	Серія 1	Серія 2	Серія 3	Серія 4
Опис	Прозора, середньо-в'язка рідина коричневато - бурого кольору із кислувато-солодким смаком та приємним запахом абрикосу і ванілі.
Якісні реакції: на флавоноїди на фенольні кислоти	+ +	+ +	+ +	+ +
Значення рН	4,8	4,2	4,7	4,4
Густина, г/см3	1,2198	1,2190	1,2182	1,2185
Об'єм вмісту контейнеру, мл	100,5	101,2	100,4	100,8
Показник заломлення	1,4470	1,4480	1,4475	1,4480
Вміст сахарози, %	44,8	45,2	45,7	44,3
Кількісний вміст суми флавоноїдів, %	0,095± 0,002	0,090± 0,002	0,094± 0,001	0,096± 0,002
Мікробіологічна чистота, КУО/г: загальне число бактерій загальне число грибів род. Enterobacteriaceae	відсутні 20 відсутні	10 10 відсутні	відсутні 10 відсутні	20 10 відсутні

Фармакологічні дослідження противиразкової активності фенольного комплексу з суцвіть липи серцелистої та сиропу на його основі, проведені на моделі гострого виразкового ураження шлунку в щурів, виявили наявність противиразкової активності досліджених зразків. Була визначена умовно-терапевтична доза фенольного комплексу з суцвіть липи серцелистої, яка складає 25 мг/кг, що в перерахунку на добову дозу для людини з урахуванням коефіцієнтів видової специфічності за Ю.Р. Риболовлєвим становить 0,45 г.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3 Технологічна схема виробництва препарату „Липофен”

Загальні висновки

1. Теоретично та експериментально обґрунтовано технологію виділення фенольного комплексу суцвіть липи серцелистої та створено на його основі фітопрепарат у формі сиропу під умовною назвою «Липофен».

2. Досліджено технологічні властивості суцвіть липи до та після обробки дифторхлорметаном. Показано, що вони закономірно залежать від ступеня подрібнення сировини. Встановлено також, що після обробки сировини дифторхлорметаном пористість зростала на 32-38%; коефіцієнти набухання та поглинання - на 15-20% при екстрагуванні 20-60% спиртом.

3. Проведено товарознавчий і фармакогностичний аналіз суцвіть липи серцелистої. Показано, що всі серії сировини, які були заготовлені в різних регіонах України, а також шроту після екстракції зрідженими газами, відповідали вимогам монографій ЕР та ГФ ХІ за всіма показниками якості.

4. Розроблено методики якісного та кількісного аналізу вихідної сировини. Показано, що для виявлення флавоноїдів найбільш оптимальною є тонкошарова хроматографія 60%-них спиртових витягів у системі етилацетат - кислота мурашина - вода (70:15:15), а для виявлення фенольних кислот - паперова хроматографія 20%-них спиртових витягів у 2% оцтовій кислоті.

5. При проведенні кількісного аналізу суми флавоноїдів у різних серіях сировини було виявлено, що вміст зазначених БАР коливався в широких межах (від 0,25 до 0,52%) в залежності від місця заготівлі. Найвищі показники фіксувалися в ЛРС із Ровенської області як 2007, так і 2008 року заготівлі.

6. Досліджено динаміку процесу екстракції вихідної сировини 60% спиртом. Встановлено, що основна частина екстрактивних речовин та суми флавоноїдів витягалася протягом 80 хвилин, при цьому ступінь їх вивільнення складала 73% та 52% відповідно. Після цього наставав стан рівноваги.

7. За допомогою методу математичного планування експерименту було досліджено вплив різних факторів на ефективність екстракції. Встановлено, що вихід екстрактивних речовин значно залежить від концентрації етанолу та кратності екстрагування, а на вихід суми флавоноїдів найбільший вплив чинить концентрація етанолу та співвідношення сировини до екстрагенту. Виділення фенольного комплексу суцвіть липи слід проводити 60% етанолом 3 рази по 80 хвилин при співвідношенні сировина/екстрагент 1:15.

8. Найбільш оптимальним способом очистки спиртових витягів є осадження баластних речовин із випареного кубового залишку шляхом охолодження протягом 2 діб з подальшою обробкою двократним об'ємом 96% етанолу.

9. Досліджено технологічні та фізико-хімічні властивості субстанції ФКСЛ. Виявлено, що вона має дуже високу гігроскопічність та низьку плинність. При аналізі показників якості встановлено, що всі чотири досліджувані серії субстанції відповідали вимогам нормативної документації.

10. Обґрунтовано оптимальний склад готової лікарської форми - сиропу під умовною назвою „Липофен”: ФКСЛ - 4,5 г, ПЕО-400 - 35 г, сахарози - 45 г, кислоти сорбінової - 0,2 г, ароматизатору „Абрикосовий” - 0,2 г, ваніліну-0,02 г, води очищеної - до одержання 100 мл сиропу.

11. Визначено основні параметри режиму приготування сиропу та розроблено промислову технологію виробництва препарату.

12. Встановлено, що органолептичні, фізико-хімічні та мікробіологічні показники різних серій препарату „Липофен” відповідають вимогам нормативної документації. При вивченні стабільності сиропу показано, що його якість практично не змінюється протягом 18 місяців періоду спостереження.

Основний зміст дисертації викладено в публікаціях

1. Бреусова С.В. Дослідження процесу екстракції фенольних речовин із суцвіть Tilia cordata / С.В. Бреусова, В.Г. Дем'яненко, Д.В.Дем'яненко // Вісник фармації. - 2008.- Т. 56, №4. - С. 46-49. (Особистий внесок - експериментальна частина, статистична обробка результатів, оформлення статті).

2. Дем'яненко Д.В. Вивчення технологічних властивостей суцвіть липи серцевидної/ Д.В. Дем'яненко, С.В. Бреусова, В.Г. Дем'яненко // Вісник фармації. - 2009.- Т.59, №3. - С. 41-45. (Особистий внесок - експериментальна частина, статистична обробка результатів, оформлення статті).

3. Пат. 36485 Україна, МПК (2008.01) А61К 36/73. Спосіб комплексної переробки суцвіть липи / В.Г.Дем'яненко, Д.В.Дем'яненко, С.В. Бреусова; заявник і патентовласник Нац. фармац. ун-т. - № u200807084; заявл. 21.05.2008; опубл. 27.10.2008, Бюл. №20. (Особистий внесок - здійснення патентного пошуку, дослідження процесу екстракції ФКСЛ, оформлення патенту).

4. Гламазда А.В. Разработка технологии липофильной фракции из листьев и соцветий липы сердцевидной / А.В.Гламазда, С.В.Бреусова, В.Г. Дем'яненко // Тези доповідей міжвузівської студентської наукової конференції., 27 квітня 2006 р., м. Харків. - Х.: Вид-во НФаУ, -2006. - С. 117.

5. Бреусова С.В. Cодержание биологически активных веществ в листьях Tilia cordata в зависимости от сроков сбора сырья / С.В. Бреусова, Д.В. Демьяненко, В.Г.Демьяненко // Матер. Всеукр. наук.-практ. конф. студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів», 17-18 травня 2007р, м. Харків. - Х.: Вид-во НФаУ, 2007.- С. 40.

6. Бреусова С.В. Изучение процесса экстракции фенольных веществ соцветий Tilia cordata / С.В. Бреусова, В.Г.Демьяненко // Матер. Всеукр. наук.-практ. конф. студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів», 16-17 квітня 2008р, м. Харків. - Х.: Вид-во НФаУ, 2008.- С. 38.

7. Бреусова С.В. Разработка технологии выделения комплекса фенольных веществ из соцветий Tilia cordata / С.В. Бреусова, Д.В. Демьяненко, В.Г.Демьяненко // Тези доповідей Всеукр. конгресу „Сьогодення та майбутнє фармації”, 16-19 квітня 2008 р., м. Харків. - Х.: Вид-во НФаУ, 2008. - С. 248.

8. Знаходження оптимальних умов екстракції фенольних сполук зі шроту Tilia cordata / Є.В.Петренко, С.В.Бреусова, В.Г.Дем'яненко, Д.В.Дем'яненко// Тези доп. Всеукр. наук.-практ. конф. студентів та молодих вчених „Актуальні питання створення нових лікарських засобів”, 23 квітня 2009 р., м.Харків.-Х.: Вид-во НФаУ, 2009. - С.32.

Анотація

Бреусова С.В. Розробка складу та технології сиропу на основі фенольного комплексу із суцвіть липи серцелистої. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.01 - технологія ліків та організація фармацевтичної справи. - Національний фармацевтичний університет, Харків, 2010.

Робота присвячена розробці технології екстрагування та очистки фенольного комплексу суцвіть липи (ФКСЛ), а також створенню нового противиразкового фітопрепарату на основі ФКСЛ у формі сиропу під умовною назвою „Липофен”.

Проведено стандартизацію вихідної сировини, удосконалено методики її якісного аналізу. Вперше розроблено методику кількісного визначення діючих речовин в сировині. Теоретично та експериментально обґрунтовано технологію одержання ФКСЛ. Досліджено вплив різних факторів на ефективність екстракції фенольних речовин із суцвіть липи, вивчено динаміку процесу екстракції. Розроблено технологію очистки фенольного комплексу від баластних речовин. Проведено дослідження технологічних властивостей та основних показників якості одержаної субстанцій.

Вперше в Україні на основі комплексу фізико-хімічних, технологічних та фармакологічних досліджень розроблено склад та технологію сиропу з ФКСЛ „Липофен”, який виявляє противиразкову дію.

Досліджено основні показники якості препарату та його стабільність при зберіганні. Створено проект АНД та технологічного регламенту.

Ключові слова: технологія, „Липофен” (Lypophenum), фенольний комплекс, флавоноїди, сироп, допоміжні речовини, екстракція, липа серцелиста (Tilia cordata).

Аннотация

Бреусова С.В. Разработка состава и технологии сиропа на основе фенольного комплекса из соцветий липы сердцевидной. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела. - Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2010.

Работа посвящена разработке технологии выделения фенольного комплекса из соцветий липы (ФКСЛ) и созданию нового противоязвенного фитопрепарата на основе ФКСЛ в форме сиропа под условным названием „Липофен”.

Изучены технологические свойства соцветий липы сердцевидной и шрота после экстракции измельченного сырья сжиженным дифторхлорметаном. Показано, что все исследуемые показатели закономерно зависят от способа подготовки сырья, и особенно от степени измельчения. Кроме того, обработка соцвет...