Регенерація периферійного нерва за умов застосування нейропептидних засобів (експериментально-морфологічне дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНИЙ ВИЩИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД

ІВАНО-ФРАНКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

14.03.09 Гістологія, цитологія, ембріологія

Регенерація периферійного нерва за умов застосування нейропептидних засобів (експериментально-морфологічне дослідження)

Демидчук Анастасія Сергіївна

Івано-Франківськ 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в національному медичному університеті імені О.О. Богомольця МОЗ України.

Наукові керівники:

член-кореспондент НАМН України, доктор медичних наук, професор Чайковський Юрій Богданович, Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, кафедра гістології та ембріології, завідувач кафедри;

доктор медичних наук, професор Макаренко Олександр Миколайович, ДВНЗ «Переяслав-Хмельницький державний педагогічний університет імені Г. Сковороди» МОН України, кафедра психології, професор кафедри.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Попович Юрій Іларіонович, ДВНЗ «Івано-Франківський національний медичний університет» МОЗ України, курс оперативної хірургії з топографічною анатомією кафедри фтизіатрії, завідувач курсу;

заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Скибо Галина Григорівна, Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України, відділ цитології, завідувач відділу.

Захист відбудеться « 17 » червня 2011 р. об 1100 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 20.601.02 при ДВНЗ «Івано-Франківський національний медичний університет» МОЗ України (76018, м. Івано-Франківськ, вул. Галицька, 2).

Із дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДВНЗ «Івано-Франківський національний медичний університет» МОЗ України (76018, м. Івано-Франківськ, вул. Галицька, 7).

Автореферат розісланий « 13 » травня 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 20.601.02 кандидат медичних наук, доцент О.Г. Попадинець

1. Загальна характеристика роботи

травма сідничний нерв регенерація

Актуальність теми. Проблема травми периферійних нервів залишається однією з актуальних у неврології та нейрохірургії. Їх пошкодження складає майже половину неврологічних захворювань пацієнтів. При цьому слід зазначити, що тривалість відновлювального періоду в значній мірі визначається адекватністю застосованих лікувальних та реабілітаційних заходів (Новіков А.В. та ін., 2000).

Патогенетичною основою дисфункції нервових волокон вважається ішемія, яка слугує початковим сигналом запуску значного каскаду біохімічних реакцій, які, в свою чергу, сприяють формуванню функціональних, а потім і структурних порушень, що призводять до розладів діяльності нейронів. У зв'язку з цим стає очевидним, що розробка ефективних засобів та методів лікування травми нервів, запобігання утворенню рубця та блокування розвитку нейродегенеративних процесів у відтермінованому періоді посттравматичного відновлення є найважливішим аспектом протекторного впливу на структури ПНС. У зв'язку з великою кількістю клінічних проявів, наявністю ряду ускладнень (больових синдромів, рухових, трофічних порушень, контрактур і т.д.), лікування пошкоджень периферійних нервів на цей час не завжди ефективне і все ще залишається складним завданням (Скоромец А.А., 2007; Konig P., 2007).

Сучасні види хірургічних втручань, консервативні методи лікування, що застосовуються на ранніх етапах реабілітації, не гарантують повного відновлення втрачених функцій кінцівок. У післяопераційному періоді особливу групу складають пацієнти з уповільненими темпами регенерації нерва, які потребують повторних оперативних втручань на нервових стовбурах та застосування нових методів реабілітації. Причиною розвитку цих ускладнень вважається формування сполучнотканинних утворень у нервових стовбурах, які виникають у післяопераційному періоді, порушують гемомікроциркуляцію і стимулюють процес нейродегенерації та слугують показанням до проведення повторних оперативних втручань (Белоусов Ю.Б. и др., 2006).

Із метою стимуляції регенераторних процесів у пошкодженому периферійному нерві після його анатомічного відновлення використовуються фармакологічні засоби різних груп та фізіотерапевтичні методи, які активують переважно протизапальну дію (Чайковський Ю.Б. та ін., 1998). У той же час, практично не застосовуються препарати та методи, які б мали нейропротекторні властивості і протизапальну дію, що є важливою складовою відновлювального процесу, зважаючи на довжину периферичного відрізка ушкодженого нерва.

Враховуючи вищезазначене, розробка нових підходів до лікування даного контингенту хворих, базується на оптимізації режимів і методів, які можуть використовуватися при ушкодженні периферійних нервів, є актуальною задачею. В останні роки з'явилися роботи, автори яких використовують дію інших, маловживаних нейропептидних фармакологічних засобів не тільки в експерименті, але і в клінічних умовах для лікування нейропатії лицевого нерва, дистрофії сітківки, черепно-мозкової травми, хвороби Альцгеймера, ішемічного інсульту (Белиничев И.Ф. и др., 2008).

Показано, що полікомпонентні нейропептидні засоби лікування характеризуються трофічною, протизапальною дією, покращують крово- та лімфообіг (Волошин П.В. та ін., 2002; Черний В.И. и др., 2008), позитивно впливають на перебіг відновлювальних процесів у ЦНС (Белоусов Ю.Б. та ін., 2006). Але, разом із тим, було б цікавим вивчити вплив нейропептидних засобів і на відновлювальні процеси в ПНС.

Таким чином, усі вищенаведені факти дають підставу сподіватися, що результати виконаного експериментального дослідження можуть стати передумовою для використання нейропептидних засобів у комплексному лікуванні пошкоджених нервів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом планової науково-дослідної роботи кафедри гістології та ембріології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України «Вивчення нервової, імунної систем та серця за умов дії екзогенних та ендогенних факторів» (№ державної реєстрації 0109U000091). Автор є співвиконавцем даної роботи.

Мета та завдання дослідження. Встановити особливості процесів де- та регенерації сідничого нерва щурів при аксотомії за умов застосування нейропептидних засобів.

Завдання дослідження:

1. Вивчити морфологічні та морфометричні показники стану сідничого нерва «псевдооперованих» щурів.

2. Дослідити морфологічні та морфометричні показники стану сідничого нерва щурів у різні терміни після механічного пошкодження без застосування фармакологічних засобів.

3. Встановити морфометричні та морфологічні показники стану сідничого нерва щурів у різні терміни після механічного пошкодження за умов застосування в якості фармакологічного засобу церебролізину.

4. Вивчити морфологічні та морфометричні показники стану сідничого нерва щурів у різні терміни після механічного пошкодження за умов застосування в якості фармакологічного засобу церебралу.

5. Провести порівняльну характеристику ступеня регенерації пошкодженого сідничого нерва щурів без застосування та за умов застосування нейропептидних засобів.

Об'єкт дослідження: регенерація периферійних нервів за умов травми і застосування фармакологічних засобів.

Предмет дослідження: відновлення сідничого нерва після травми та відновлення за умов застосування нейропептидних засобів.

Методи дослідження: загальногістологічні, нейрогістологічні, морфометричні, електронномікроскопічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше вивчені особливості відновлення сідничого нерва в умовах нейротомії з відтермінованою нейрорафією, стан нервових волокон, що проростають у периферичний (дистальний) відрізок нервового стовбура, особливості їх мієлінізації під впливом нейропептидних засобів.

Отримані дані дозволили з'ясувати закономірності процесів регенерації та мієлінізації нервових волокон у різні терміни після пошкодження і залежно від впливу нейропептидних засобів за умов нейротомії з відтермінованою нейрорафією.

Встановлена доцільність використання нейропептидних засобів при відновленні сідничого нерва за умов нейротомії з відтермінованою нейрорафією.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані є важливою передумовою для розробки в клінічній практиці способів покращення процесів відновлення периферійних нервів після їх пошкодження.

Ці результати дають змогу створити передумови удосконалення методик і схем медикаментозної терапії травм нервових стовбурів у людини, надають теоретичне обґрунтування для розробки рекомендацій щодо вибору тактики використання реабілітаційних засобів при зверненні хворих у медичні установи не відразу після травми периферійного нерва, а у відтермінованому періоді захворювання.

Матеріали дисертаційної роботи впроваджені в наукову та навчальну роботу кафедр гістології, цитології та ембріології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького, Харківського національного медичного університету, ДВНЗ «Івано-Франківський національний медичний університет», ВДНЗ України «Українська медична стоматологічна академія» і кафедри гістології та ембріології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є закінченою науково-дослідною роботою. Автором самостійно виконані аналіз наукової літератури за темою дисертації, згідно вимог проведено патентно-інформаційний пошук, у тому числі за допомогою електронних баз даних Національної наукової медичної бібліотеки України. Розроблені теоретичні та практичні положення роботи, методологію експерименту згідно поставлених задач дослідження. Автор самостійно виконала експериментальну частину роботи, макро-, мікроскопічні, морфометричні дослідження та електронномікроскопічний розділ. Здобувачем самостійно проведена первинна статистична обробка отриманих даних, обробка фотодокументів. Усі розділи дисертаційної роботи написані автором особисто. Основні положення, висновки та практичні рекомендації сформульовані автором разом із науковими керівниками.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені на науково-практичній конференції «Прикладні аспекти морфології», присвяченій пам'яті професора Б.В. Шутки (Івано-Франківськ, 2010); науковому конгресі «ІV міжнародні Пироговські читання» (Вінниця, 2010); симпозіумі «Морфогенез органів і тканин під впливом екзогенних факторів» (Сімферополь-Алушта, 2010).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових праць, із них 4 журнальні статті у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 1 патент на корисну модель, 1 тези доповіді на науково-практичній конференції. Структура та обсяг дисертації. Матеріали дисертації викладені на 150 сторінках машинописного тексту (основна частина займає 112 сторінок). Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, двох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій, додатків. Список цитованої літератури містить 274 джерела, серед яких 169 - опубліковані кирилицею та 105 - латиницею. Дисертація ілюстрована 66 рисунками та 6 таблицями.

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Експеримент було виконано на 95 білих щурах масою 175-210 г. Утримання тварин та маніпуляції, які з ними проводилися, здійснені у відповідності до Закону України №3447-ІV від 21.02.06 р. «Про захист тварин від жорстокого поводження», положеннями «Етичного Кодексу лікаря України» і «Гельсінської декларації про гуманне ставлення до тварин».

Експериментальні тварини були розподілені на 4 групи. Перша контроль, «псевдооперовані» тварини (5 щурів); друга 30 щурів, у яких була експериментально відтворена травма периферійного нерва із відтермінованою нейрорафією; третя 30 щурів, у яких була відтворена травма периферійного нерва із відтермінованою нейрорафією, але при використанні церебролізину («Ebewe», Австрія); четверта 30 щурів, у яких була відтворена травма периферійного нерва з відтермінованою нейрорафією при застосуванні церебралу («Дніпрофарм», Україна).

Всі оперативні втручання проводили в умовах тіопентал-натрієвого наркозу, який вводили одноразово щурам за 10-15 хвилин до операції (60 мг/кг, внутрішньоочеревинно).

Контролем експериментів слугували так звані «псевдооперовані» тварини першої групи. У цих щурів здійснювали доступ до лівого сідничого нерва, який мобілізували, але хірургічно не перетинали. Після цього рану пошарово ушивали.

У зв'язку з тим, що в клінічній практиці спостерігається, як правило, поєднана травма периферійного нерва із судинами, сухожилками і, нерідко, кістками, і лікування на першому етапі полягає в зупинці кровотечі та імобілізації кінцівки, в той час, як спеціалізована медична допомога у вигляді реконструктивних та відновлювальних операцій на кровоносних судинах, сухожилках, кістках і нервах надається пізніше (Мусаев А.В и др., 2004), було вирішено розробити експериментальну модель - «нейротомія з відтермінованою нейрорафією».

У тварин другої, третьої та четвертої груп в умовах наркозу виконувався оперативний доступ до лівого сідничого нерва, після чого нерв у ділянці середньої його третини хірургічно перетинався скальпелем, після чого здійснювався гемостаз і рана зшивалась наглухо. Через 10 днів після операції у цих тварин проводилося повторне оперативне втручання, яке полягало в тому, що знаходилися кінці пересіченого нерва, фіксувалися, освіжалися скальпелем і зшивалися двома епіневральними швами на відстані 1-2 мм ниткою (поліамід 6.0 фірми «Ethicon») на атравматичній голці.

Тваринам другої групи на третій день після відтермінованої нейрорафії вводили ізотонічний розчин у кількості 0,1 мл/кг упродовж 3 діб.

Тваринам третьої групи, починаючи з третього дня після оперативного втручання, щодобово впродовж 21 доби внутрішньоочеревинно вводили церебролізин у дозі 0,2 г/кг. Тваринам четвертої групи на третій день після зазначеного оперативного втручання щодобово впродовж 3 діб вводили церебрал у дозі 0,002 г/кг внутрішньоочеревинно.

Матеріалом для досліджень слугували фрагменти сідничого нерва в ділянці регенераційних невром із прилеглими центральним і периферичним відрізками ушкодженого сідничого нерва через 3, 6, 12 тижнів після експериментального відтворення моделі травми периферійного нерва.

Для світлооптичної мікроскопії гістологічний матеріал фіксували у 10%-му розчині нейтрального формаліну, промивали зразки та отримували зрізи на кріостаті, які пізніше імпрегнували розчином азотнокислого срібла за швидким методом імпрегнації елементів периферичної нервової системи (Коломийцев А.К. и др., 1981). Препарати забарвлювались азур II-еозином для вивчення стану сполучної тканини. Для об'єктивного аналізу результатів світлооптичної мікроскопії гістопрепаратів за допомогою методу морфометрії була використана комп'ютерна програма UTHSCSA Image Tool for Windows (Version 2.00). Визначалися такі показники: щільність розподілу нервових волокон у дистальній ділянці травмованого нерва, середній кут відхилення нервових волокон від поздовжньої осі нерва в ділянці регенераційної невроми.

Для виготовлення напівтонких зрізів та виконання електронномікроскопічного дослідження використовувалисчя фрагменти дистальних відрізків сідничого нерва які попередньо фіксували в 2,5% глютаровому альдегіді на фосфатному буфері впродовж 1 години при кімнатній температурі із дофіксацією в 1% розчині чотирьохокису осмію за Міллонінгом упродовж 1 години при температурі 4С. Об'єкти зневоднювали в батареї етанолів зростаючої концентрації, потім в ацетоні і, нарешті, заливали в суміш смол епону з аралдитом за загальноприйнятою методикою. Напівтонкі поперечні та поздовжні зрізи сідничих нервів, виготовлені на ультратомі LКB-8800 (Швеція), забарвлювали розчином толуїдинового синього. Морфометричні дослідження проводили за допомогою напівавтоматичного пристрою для обробки графічних зображень. У ході виконання досліджень визначали таку величину як кількість овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об'єму нерва. Препарати тонких і напівтонких гістологічних зрізів фотографували за допомогою цифрової фотокамери та мікроскопа «Olympus». Ультратонкі зрізи одержували на ультратомі LKB-8800 (Швеція), враховуючи поздовжню та поперечну проекції сідничого нерва щурів. Підготовлені зразки нерва контрастували 2% розчином уранілацетату в 50% 70% етанолі і азотнокислого свинцю впродовж 15 хвилин відповідно. Отримані нами зрізи вивчали та фотографували в електронному мікроскопі ПЭМ-125К. Для поглибленого аналізу матеріалів електронної мікроскопії був використаний метод морфометрії. Використано напівавтоматичний пристрій обробки зображень для визначення товщини мієлінової оболонки регенеруючих нервових волокон.

Обчислювали середні значення величин, середнє квадратичне відхилення, похибку середньої величини, коефіцієнт варіації і коефіцієнт точності визначення середньої відповідно до рекомендацій, що містяться в підручниках з математичної статистики. Додатково аналіз отриманих результатів проводили за допомогою непараметричного критерію Манна-Вітні-Вілкоксона (Мінцер О.П., 2003).

Результати дослідження та їх обговорення. Церебролізин і церебрал в експериментальних дослідженнях показали виражений терапевтичний вплив на різних моделях порушень нервової системи (Григорова И.А. и др., 2006; Макаренко А.Н та ін., 2009). У зв'язку з тим, що травматичне ушкодження нерва супроводжується активацією власних нейротрофічних механізмів та наявністю окремих аспектів подібної дії у досліджуваних препаратах, ми застосували їх із метою посилення регенерації та повноцінного відновлення травмованого сідничого нерва у піддослідних тварин.

Вивчення структури сідничого нерва «псевдооперованих» щурів здійснено з метою отримання контрольних показників і оцінки у подальшому повноти відновлення пошкоджених нервів.

Периферійний нерв (нервовий стовбур) щурів зовні вкритий епіневрієм. Пучки нервових волокон у складі нерва розмежовані між собою тонкими прошарками периневрію. Окремі нервові волокна оточені ендоневрієм. У складі оболонок нерва є густа сітка тонких, розташованих переважно вздовж осі нерва, сполучнотканинних волокон. Між ними присутня помірна кількість клітинних елементів, серед яких переважають фібробласти. В епіневрії зустрічаються артерії та вени малого калібру, а в периневрії переважають артеріоли та венули.

Проведені морфометричні дослідження нервів у «псевдооперованих» тварин показують, що щільність розподілу нервових волокон у ділянці середньої третини сідничого нерва щурів дорівнює 10007,00±48,71/мм2 . Товщина мієлінової оболонки нервових волокон умовної ділянки дистального відрізка сідничого нерва дорівнює 0,66±0,09 мкм. Вищезазначені результати свідчать про те, що структура нервових волокон і кількісні показники у тварин цієї групи відповідають тим же показникам, що притаманні інтактним нервам контрольних тварин (Rochkind S. at al., 1988; Шевелев И.Н. и др., 1989). У зв'язку з цим, було вирішено «псевдооперованих» тварин розглядати в якості умовного контролю.

Отримані нами результати морфологічних досліджень показали, що при травмуванні сідничого нерва щурів виявлялися стійкі порушення його структурної організації, що проявлялося дегенерацією нервових волокон, порушенням процесів регенерації та розвитком фіброзу. Деякі ознаки патологічного стану (наприклад, розвиток сполучнотканинних новоутворень) відмічалися впродовж всього терміну експериментальних досліджень. Отримані результати не суперечать аналогічним літературним даним (Геращенко С.Б. та ін., 2005).

Таким чином, при дослідженні травматичного ушкодження периферійного нерва без застосування фармакотерапії в різні терміни після нейротомії з відтермінованою нейрорафією (3, 6 і 12 тижнів) нами встановлено розвиток певних структурно-функціональних порушень, що відбуваються як після травмування, так і в період посттравматичної регенерації, що збігається з даними літературних джерел (Корсак А.В. та ін., 2006; Раскалєй Д.В., 2008). У процесі раннього відновлення цілісності периферійного нерва відбувається утворення невроми в ділянці травмування, яка представляє собою утворення активно проліферуючих шваннівських клітин та фібробластів. На ранніх етапах спостерігається також травматично індуковане подразнення нервових волокон проксимального відділу та порушення регенерації волокон у ділянці невроми і дистального відділу. Основою патогенезу цих порушень вважається утворення значних ділянок фіброзного рубцювання в зоні ушкодження, що ускладнює регенерацію нервових волокон у дистальний відділ сідничого нерва, в цей період середній кут відхилення нервових волокон від поздовжньої осі нерва становить 43,2±2,5°. Утворення рекурентних волокон та затриманих колб росту підтверджує це твердження. Також відбувається порушення регенерації кровоносних судин. У цей період спостерігаються лише поодинокі судини в ділянках травми та дистального відділу травмованого нерва. Щільність розподілу нервових волокон у периферичному відділі сідничого нерва складає 320,00±14,03 мм2. На 6 тиждень дослідження в дистальному відділі зустрічаються осередки дегенерації нервових волокон у вигляді овоїдів, об'ємна та кількісна щільність яких складає 6,10±0,05 % та 4,4±0,1 мкм3 відповідно. У цей період посттравматичного відновлення кількість судин була незначною і в багатьох із них спостерігали стаз та сладж еритроцитів. Навіть у пізні терміни вивчення (12 тижнів) у дистальному відділі нерва присутні великі скупчення шваннівських клітин та регенерованих волокон і щільність їх розподілу складає 7691,0±28,0 мм2 (р?0,05), це значуще більше відносно попередніх термінів дослідження і свідчить про не до кінця завершений характер регенерації та відновлення травмованого периферійного нерва.

Застосування фармакологічних засобів із метою активації процесів посттравматичного відновлення суттєво вплинуло на інтенсивність процесу і якість регенерації травмованого сідничого нерва. Застосування церебролізину активує ступінь регенерації центрального відділу нерва. Відбувається зменшення кількості подразнених нервових волокон, про що свідчить більш рівномірна імпрегнація нейритів, ніж у тварин без застосування препаратів. У невромі спостерігається більш активний процес регенерації новосформованих нервових волокон і через 3 тижні дослідження середній кут відхилення останніх від поздовжньої осі нерва становить 37,0±0,9° (р?0,05), що значуще менше, ніж у ІІ групі дослідження.

Препарат стимулює процеси регенерації нервових волокон, відбувається поступове відновлення ультраструктурної організації останніх. У дистальному відрізку нерва через 6 тижнів дослідження також спостерігається значуще зменшення об'ємної та кількісної щільності овоїдів дегенерації в порівнянні з ІІ групою і становить 0,35±0,01% (р?0,05) та 0,43±0,01(р?0,05) мм3 відповідно. Відбувається покращення гемомікроциркуляції, що, на нашу думку, позитивно сприяє процесам регенерації та відновлення нервових волокон. Морфометричні дані через 12 тижнів дослідження свідчать, що щільність розподілу нервових волокон у дистальному відділі нерва становить 7961,0±43,4 мм2 (р?0,05), що значуще більше, ніж у групі тварин, яким фармакотерапія не проводилася. Узагальнюючи вище зазначені характеристики і особливості регенерації ушкодженого периферійного нерва, можна стверджувати про позитивний фармакологічний вплив церебролізину на його відновлення. Препарат стимулює процеси регенерації нервових волокон, відбувається поступове відновлення ультраструктурної організації останніх. Також спостерігається збільшення кількості кровоносних судин, особливо на 6 та 12 тижні відновлення, покращення гемомікроциркуляції, що, на нашу думку, позитивно сприяє процесам регенерації та відновлення нервових волокон.

При застосуванні церебралу нами встановлено суттєво більш виражене покращення процесів регенерації та відновлення структурних елементів травмованого нерва. Вже на 3 тиждень дослідження нервові волокна центрального відрізка сідничого нерва щурів характеризуються різним ступенем імпрегнації. Суттєво зростає і васкуляризація епіневрію цього відділу нерва. У невромі спостерігається пришвидшена регенерація кровоносних судин, нервових волокон а кут відхилення останніх складає 31,3±1,3° (р?0,05), що значуще менше, ніж у ІІ та ІІІ групах (рис. 1). Більшість регенеруючих волокон мають чітко орієнтоване спрямування регенерації до дистального відділу нерва. Сполучна тканина в ділянці нейрального рубця характеризується нещільною організацією. Спіралі Перрончіто та затримані колби росту в цих ділянках майже не зустрічаються.

Рис. 1 Середній кут відхилення нервових волокон від поздовжньої осі нерва в невромі сідничого нерва (в градусах)

У дистальному відрізку нерва регенеруючі нервові волокна рівномірно розташовані між групами шваннівських клітин і щільність їх розподілу в цей період складає 1468,0±44,1 мм2, що значуще більше, ніж у ІІ та ІІІ групах. Засіб церебрал також покращує регенерацію інтраневральних кровоносних судин.

На 6 тиждень після травмування регенеруючі нервові волокна набувають характеру практично неушкоджених. Одночасно відмічається розширення діаметру капілярів, що може свідчити і про активацію трофічно-відновлювальних функцій травмованого нерва. У невромі відмічається зменшення активності розвитку фіброзу порівняно із двома попередніми групами. Сполучна тканина представлена локальними острівцями із фібробластами та пучками колагенових волокон, що мають нещільне розташування. Відбувається відновлення ендо- та периневрію, зустрічаються лише поодинокі спіралі Перрончіто.

Ці результати свідчать про відновлення церебралом трофічної підтримки регенеруючих волокон та майже безперешкодне спрямування регенеруючих нервових волокон у дистальний відділ нерва.

Спостерігається значуще зменшення проявів дегенерації відносно ІІ та ІІІ груп дослідних тварин, про що свідчать показники об'ємної та кількісної щільності овоїдів - 3,40±0,09% (р?0,05) та 3,14±0,07 мм3 (р?0,05) відповідно (табл. 1).

Таблиця 1 Об'ємна та кількісна щільність овоїдів у дистальній ділянці травмованого нерва

На 12 тиждень неврома суттєво зменшується в розмірах, а кількість колагенових волокон у пучках є помірною і середній кут відхилення нервових волокон від поздовжньої осі нерва становить 26,5±0,9°(р?0,05), що значуще менше, ніж у попередні терміни дослідження та в ІІ і ІІІ групах (рис. 1). Зберігається значна кількість кровоносних судин у ділянці травми і, відповідно, продовжує збільшуватися кількість регенерованих нервових волокон, спрямованих у дистальний відділ травмованого сідничого нерва. Проте, зустрічаються окремі ділянки нерва із зменшеним рівнем васкуляризації, в яких утворюється фіброзний рубець.

Ці результати свідчать про те, що під впливом церебралу структурна організація ділянки невротомії набуває більш сприятливу для регенерації нервових волокон будову, ніж у тварин попередніх груп. Це суттєво впливає на активність і особливості регенерації нервових волокон у дистальному відділі. Церебрал суттєво збільшує кількість регенеруючих нервових волокон та повноцінність відновлення ультраструктурної організації нерва, аксоскелету регенерованих аксонів.

Шванноцити, що контактують із аксонами, характеризуються високою структурно-функціональною активністю, про що свідчить наявність у їх цитоплазмі розвинутого ендоплазматичного ретикулуму, великої кількості рибосом. У кровоносних судинах відсутні ознаки патологічних змін. Іноді зустрічаються ділянки, в яких нервові волокна мають розшаровані ламели мієлінової оболонки або окремі порушення аксоскелету. В ході досліджень було встановлено, що і в більш пізні періоди продовжуються процеси активної регенерації та відновлення нервових волокон. Останні набувають мієлінові оболонки із щільним розташуванням ламел, при цьому товщина мієлінових оболонок суттєво зростає, спостерігається відновлення ендоневрію і щільність розподілу нервових волокон у цей період складає 9198,0±58,8 мм2 (р?0,05), що значуще більше, ніж у попередні терміни та у ІІ і ІІІ групах тварин (рис. 2). Таким чином, на відміну від церебролізину, застосування церебралу на ранньому етапі травматичного ушкодження нерва більш суттєво впливає на регенерацію нервових волокон та процес їх мієлінізації, відновлення функціонування стромальних елементів (ендоневрію) травмованого нерва і його кровоносної системи.

Рис. 2 Щільність розподілу нервових волокон у периферичному відділі травмованого нерва (1/мм2)

На основі отриманих результатів можна також стверджувати, що фармакологічна корекція нейротомії з відтермінованою нейрорафією церебролізином та церебралом позитивно впливає на характер регенерації ушкодженого сідничого нерва у дослідних тварин. У той же час, порівняльний аналіз дії досліджуваних препаратів підтверджує про більш високу, ніж у церебролізину ефективність впливу церебралу, про що свідчить більш якісна регенерація нервових волокон, збільшення активності новоутворення кровоносних судин та повноцінне відновлення ендоневрію навколо окремих груп нервових волокон.

Висновки

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення актуальної наукової задачі - встановлення закономірностей де- та регенерації нервових волокон травмованого периферійного (сідничого) нерва при аксотомії за умов застосування нейропептидних засобів.

1. Після проведення морфометричних досліджень у «псевдооперованої» групи тварин отримані такі показники: кількісна щільність розподілу нервових волокон у ділянці середньої третини сідничого нерва щурів дорівнює 10007,00±48,71/мм2, товщина мієлінової оболонки нервових волокон умовної ділянки дистального відрізка сідничого нерва в свою чергу дорівнює 0,66±0,09 мкм. Ці дані вказує на те, що структура нервових волокон і кількісні показники відповідають показникам інтактного нерва.

2. У групі тварин, у яких після відтермінованої нейрорафії фармакотерапія не проводилася, відмічалося формування регенераційної невроми з утворенням значних зон фіброзу з недостатньою кількістю кровоносних судин; у цих ділянках відзначалися фігури затримки росту. Морфометричне дослідження показало, що в динаміці відбувається зменшення середнього кута відхилення проростаючих аксонів від поздовжньої осі нерва і через 12 тижнів після пошкодження становить 40,01±1,20° (р?0,05), що є значуще меншим відносно результатів попередніх термінів відновлення, а кількісна щільність розподілу аксонів становить 7691,0±28,0/ммІ (р?0,05), що є значуще більшим показником і свідчить про збільшення їх кількості в порівнянні із попередніми термінами; об'ємна та кількісна щільність овоїдів, яка визначалася через 6 тижнів після пошкодження, складає 4,4±0,1% та 6,1±0,05 мкм3 відповідно.

3. При електронномікроскопічному дослідженні сідничих нервів групи тварин, яким фармакотерапія не проводилася, відмічено, що кількість мієлінових нервових волокон у їх складі з 6-го до 12-го тижня значно збільшується, має місце потовщення мієлінових оболонок і через 12 тижнів їх товщина складає 0,43±0,01 мкм (р?0,05), що значуще більше стосовно попереднього терміну відновлення. Але більшість зрілих мієлінових нервових волокон через 12 тижнів у дослідних тварин деформовані.

4. У тварин, яким після відтермінованої нейрорафії проводили фармакотерапію церебролізином, спостерігали кращі результати і ефективність регенерації травматично пошкодженого нерва у порівнянні з ІІ групою тварин. Про це свідчить зменшення в динаміці кута відхилення новосформованих аксонів від поздовжньої осі нерва в невромі, що через 12 тижнів після пошкодження становить 34,54±0,60° (р?0,05). Це є значуще меншим відносно результатів попередніх термінів відновлення та групи тварин, яким фармакотерапія не проводилася. Спостерігається також збільшення кількісної щільності розподілу аксонів дистального відділу травмованого нерва, що через 12 тижнів після травмування становить 7961,0±43,4/мм2 (р?0,05). Це значуще переважає результати, отримані в попередні терміни, та у тварин, які не отримували лікування. Відзначено зменшення об'ємної та кількісної щільності овоїдів дегенерації, які через 6 тижнів після пошкодження складають 3,43±0,12% та 4,40±0,12 мкм3 (р?0,05) відповідно, що є значуще менше, ніж у групі тварин без лікування.

5. При електронномікроскопічному дослідженні сідничих нервів групи тварин, яким проводилася фармакотерапія церебролізином, були виявлені процеси регенерації нервових волокон, відбувалося поступове відновлення ультраструктурної організації останніх. Також спостерігалося збільшення кількості кровоносних судин, особливо на 6 та 12 тижнях відновлення, покращення гемомікроциркуляції. Відмічалося збільшення товщини мієлінової оболонки на пізніх етапах дослідження. Цей показник складав 0,53±0,01 мкм (р?0,05), що значуще більше відносно результатів попереднього терміну та ІІ групи.

6. Найбільш виражену позитивну дію на регенерацію пошкодженого нерва було встановлено при застосуванні нейропептидного засобу церебралу. При цьому, спостерігалося в динаміці суттєве збільшення кількості регенеруючих нервових волокон і на 12 тиждень дослідження кількісна щільність розподілу аксонів дистального відділу травмованого нерва складала 9182,0±58,8/мм2 (р?0,05), що значуще більше, ніж у попередні терміни відновлення та в ІІ і ІІІ групах тварин. Зменшувався кут відхилення новосформованих аксонів від поздовжньої осі нерва в невромі, який через 12 тижнів після пошкодження становив 26,5±0,9° (р?0,05), що є значуще меншим відносно результатів попередніх термінів відновлення та у ІІ і ІІІ групах тварин, а об'ємна та кількісна щільність овоїдів дегенерації становила 3,14±0,07% та 3,40±0,09 мкм3 (р?0,05) відповідно, що є значуще менше, ніж у ІІ та ІІІ групах тварин.

7. Дослідження ультраструктури дистального відрізка сідничого нерва показало, що поруч із новоутвореними безмієліновими волокнами з'являлася значна кількість волокон із чітко сформованою мієліновою оболонкою і зрілими осьовими циліндрами, чого майже не спостерігалось у тварин інших груп, причому товщина мієлінових оболонок у динаміці збільшується і через 12 тижнів складає 0,600±0,005 мкм (р?0,05), що значуще більше, ніж у попередні терміни відновлення та в ІІ і ІІІ групах тварин.

8. Покращення під впливом церебралу показників, що характеризують регенерацію пошкодженого нерва, дозволяє після проходження відповідних етапів клінічних досліджень рекомендувати застосовування цього фармакологічного засобу в практиці з метою прискорення мієлінізації ушкоджених нервів; зменшення активності процесу неоколагеногенезу і утворення сполучної тканини в ділянці невроми та для пошуку нових способів його застосування в нейрохірургічній та неврологічних клініках.

Практичні рекомендації

1. Проведені дослідження розширюють і поглиблюють відомості про структурні особливості процесів де- та регенерації травмованого сідничого нерва щурів за умов нейротомії з відтермінованою нейрорафією.

2. Отримані дані про особливості морфологічних змін у пошкодженому нервовому стовбурі за умов нейротомії з відтермінованою нейрорафією із застосуванням нейропептидних засобів можуть бути використані для розробки нових методів корекції відновлення периферійного нерва.

3. Одержані результати доцільно використати в хірургічній практиці, курсах лекцій із гістології, патологічної анатомії, неврології; при написанні посібників, підручників.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Демидчук А. С. Ультраструктурні зміни периферійного нерва щурів за умов його пошкодження та застосування нейропептидних засобів / А. С. Демидчук, Ю. Б. Чайковський, Л. О. Стеченко // Вісник Української медичної стоматології. ? 2 010. ? Т.10. - № 1(29). ? С. 25?27. Автором проведено моделювання нейротомії з відтермінованою нейрорафією, забір матеріалу, аналіз та узагальнення отриманих результатів.

2. Демидчук А. С. Вплив нейропептидних засобів на регенерацію периферійного нерва щурів / А. С. Демидчук, Ю. Б. Чайковський, О. М. Макаренко // Вісник морфології. ? 2010. ? №16(1). ? С. 48?52. Автором проведено моделювання нейротомії з відтермінованою нейрорафією, забір матеріалу, аналіз та узагальнення отриманих результатів.

3. Демидчук А. С. Ультраструктурні зміни травмованого периферійного нерва щурів за умов застосування нейропептидних засобів / А. С. Демидчук, Ю. Б. Чайковський, О. М. Макаренко // Труды Крымского государственного медицинского университета им. С.И. Георгиевского. - 2010. - Т. 146, Ч.V. - С. 67-69. Автором проведено моделювання нейротомії з відтермінованою нейрорафією, забір матеріалу, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготовка частини рукопису статті.

4. Демидчук А. С. Ультраструктурні зміни периферійного нерва щурів за умов застосування нейропептидних засобів у віддалений строк після травмування / А. С. Демидчук, Ю. Б. Чайковський, О. М. Макаренко // Загальна патологія та патологічна фізіологія. ? 2010. ? Т.5, №3. ? С.48?51. Автором проведено моделювання нейротомії з відтермінованою нейрорафією, забір матеріалу, аналіз та узагальнення отриманих результатів.

5. Пат. 56460 Україна МПК A 61 K 35/30 Спосіб лікування травматичних ушкоджень периферійного нерва / А. С. Демидчук, Ю. Б. Чайковський, О. М. Макаренко; заявник та патентовласник НМУ імені О.О. Богомольця. - № u201010541; заявл. 31.08.10; опубл. 10.01.11, Бюл. № 1. Автором проведено моделювання нейротомії з відтермінованою нейрорафією, обробка матеріалу, отримання первинної документації.

6. Демидчук А. С. Регенерація периферійного нерва при застосуванні нейропептидних засобів / А. С. Демидчук // Мат-ли наук.-практ. конф. «Прикладні аспекти морфології», присвяченої пам'яті проф. Б.В. Шутки. - Івано-Франківськ, 2010. ? С. 47-48.

Анотація

Демидчук А.С. Регенерація периферійного нерва за умов застосування нейропептидних засобів (експериментально-морфологічне дослідження). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.09 - гістологія, цитологія, ембріологія. ? ДВНЗ «Івано-Франківський національний медичний університет», Івано-Франківськ, 2011.

Дослідження було проведено на білих щурах, розподілених на 4 групи. Тваринам IІ, III та ІV груп в експерименті змодельовано травму сідничого нерва. Після оперативного втручання щури другої групи не отримували фармакологічної корекції. Тварини третьої групи після оперативного втручання отримували церебролізин у дозі 0,2 г/кг щодня впродовж 21 дня. Тварини четвертої групи постоперативно отримували церебрал у дозі 0,002 г/кг щодня впродовж 21 дня. Вивчення травмованого сідничого нерва щурів проводили через 3, 6 і 12 тижнів після травми. Порівняльний аналіз дії досліджуваних препаратів свідчить про більш високу ефективність впливу церебралу, ніж церебролізину, що підтверджує більш якісна регенерація нервових волокон.

Ключові слова: периферійний нерв, регенерація, нейропептиди, церебролізин, церебрал.

Аннотация

Демидчук А.С. Регенерация периферического нерва в условиях применения нейропептидных средств (экспериментально-морфологическое исследование). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.09 - гистология, цитология, эмбриология. - ГВУЗ «Ивано-Франковский национальный медицинский университет», Ивано-Франковск, 2011.

Исследование было проведено на 95 белых крысах. В ходе эксперимента создано 4 группы: первая - «псевдооперированные» животные, контроль (5 животных), вторая - 30 животных, которым была проведена нейротомия с отдаленной нейрорафией, без фармакотерапии, третья - 30 животных, которым была проведена травма периферического нерва с отдаленной нейрорафией и использованием церебролизина в дозе 0,2 г/кг, четвертая - 30 животных, которым была проведена травма периферического нерва с отдаленной нейрорафией и использованием церебрала в дозе 0,002 г/кг. Через 3, 6 и 12 недель после нейрорафии общегистологическими, нейрогистологическими, электронномикроскопическими, морфометрическими и статистическими методами изучали состояние седалищных нервов.

Для проведения морфометрического анализа выбраны следующие показатели: средний угол отклонения нервных волокон от продольной оси нерва в невроме, плотность нервных волокон в дистальном отрезке травмированного нерва, объемная и количественная плотность овоидов в дистальном отрезке нерва, толщина миелиновой оболочки.

Проведенные морфометрические исследования у «псевдооперированных» животных показывают, что плотность распределения нервных волокон в области средней трети седалищного нерва крыс составляет 10007,00±48,71/мм2. Толщина миелиновой оболочки этих нервных волокон условной части дистального отдела седалищного нерва «псевдооперированных» крыс в свою очередь составляет 0,66±0,09 мкм. Вышесказанное свидетельствует о том, что структура нервных волокон и количественные показатели соответствуют тем же показателям интактного нерва. В связи с этим было решено эту группу животных рассматривать в качестве контроля.

Результаты морфологических исследований показали, что при травмировании седалищного нерва крыс происходят стойкие нарушения его структурной организации, что проявлялось дегенерацией нервных волокон, нарушением процессов регенерации и развитием фиброза. Некоторые признаки патологического состояния (например, фиброз) отмечались на протяжении всего срока экспериментальных исследований.

Таким образом, при исследовании травматического повреждения периферического нерва без применения фармакотерапии в разные сроки после нейротомии с отдаленной нейрорафией (3, 6 и 12 недель) установлено развитие определенных нарушений, которые происходят после травмирования и в период посттравматической регенерации.

Применение фармакологических средств с целью активации процессов посттравматического восстановления существенно повлияло и на качество регенерации травмированного седалищного нерва. Применение церебролизина активирует степень регенерации центрального отдела нерва. Происходит уменьшение количества раздраженных нервных волокон, которое характеризуется более равномерной импрегнацией, чем у животных без применения фармакологических препаратов. В невроме наблюдается более активный процесс регенерации новообразованных нервных волокон.

Препарат стимулирует процессы регенерации нервных волокон, происходит постепенное возобновление ультраструктурной организации последних. Также наблюдается увеличение количества кровеносных сосудов, особенно на 6 и 12 неделях восстановления, улучшение гемомикроциркуляции, что, по нашему мнению, положительно способствует процессам регенерации и восстановления нервных волокон.

При применении церебрала установлено более выраженное улучшение процессов регенерации и возобновление структурных элементов травмированного нерва по сравнению со ІІ и ІІІ группами.

Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что под воздействием церебрала структурная организация участка нейротомии приобретает более благоприятное строение для регенерации нервных волокон, чем в предыдущих группах животных. Это существенно влияет на активность и особенности регенерации нервных волокон в дистальном отделе. Церебрал увеличивает количество регенерирующих нервных волокон и полноценность возобновления ультраструктурной организации нерва, аксоскелета регенерируемых аксонов.

На основе полученных результатов можно также утверждать, что фармакологическая коррекция отдаленной нейрорафии церебролизином и церебралом положительно влияет на характер регенерации поврежденного седалищного нерва у подопытных животных. В то же время, сравнительный анализ действия исследуемых препаратов свидетельствует о более высокой, чем у церебролизина, эффективности влияния церебрала, что подтверждает более качественная регенерация нервных волокон, увеличение активности новообразования кровеносных сосудов и возобновление эндоневрия вокруг отдельных групп нервных волокон.

Ключевые слова: периферический нерв, регенерация, нейропептиды, церебролизин, церебрал.

Summary

Demidchuk A.S. Regeneration of the peripheral nerve on condition of using neuropeptides application (experimentally morphological research). - Manuscript.

The dissertation on competition of a scientific degree of the candidate of medical sciences according to speciality 14.03.09 - histology, cytology, embryology. - Ivano-Frankivsk National Medical University, Ivano-Frankivsk, 2011.

Experiment was carried out on white rats, which were divided into 4 groups. In animals of the II, III and IV groups the experimental model of sciatic nerve trauma was done. In postoperative period the rats of the second group got any pharmacological correction. The third group rats received Cerebrolysinum in the dose of 0,2 g/kg daily during 21 days postoperatively. The fourth group animals received Cerebralum in the dose of 0,002 g/kg daily during 21 days postoperatively. The studies of trauma sciatic nerve of rat's stump in 3, 6 and 12 weeks after a trauma. The research conducted testified that in animals which had the pharmacological correction by Cerebralum the process of sciatic nerve regeneration was the most effective.

Key words: peripheral nerve, regeneration, neuropeptides, Cerebrolysinum, Cerebralum.

Размещено на Allbest.ru